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CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Y AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS La tecnología del ADN recombinante incluye una serie de procedimientos que permiten generar, cortar y pegar fragmentos de ADN, lo que posibilita fabricar secuencias de ADN que tengan interés científico o terapéutico. Para poder manipular el ADN, primeramente hay que aislarlo de los tejidos o células. Existen diferentes métodos para aislar ADN (y ARN); los métodos clásicos se basan en su mayoría en una primera separación mediante una extracción en fases orgánicas seguida de una precipitación de los ácidos nucleicos presentes en la fase acuosa resultante, mediante soluciones alcohólicas. Una vez obtenido el ácido nucleico, es importante analizarlo para verificar su calidad. Un método rápido y ampliamente extendido para tal propósito es la electroforesis en geles de agarosa (fig. e2-1). Estos geles están constituidos por matrices porosas en las que se introduce la muestra de ácido nucleico, se aplica una diferencia de potencial (voltaje) a lo largo de la matriz y, en virtud de la carga negativa que poseen tanto el ARN como el ADN, estos migran a través de dicha matriz. En el caso del ADN, debido a su gran longitud, debe ser fragmendo previamente mediante enzimas de restricción (v. más adelante), para que pueda tener lugar la migración. Los fragmentos de ADN generados mediante PCR (v. «Reacción en cadena de la polimerasa») pueden ser sometidos directamente a electroforesis, ya que sus tamaños son compatibles con la migración a través del gel. Debido al tamaño de los poros del gel (que es del orden de magnitud del de las propias moléculas de ácido nucleico), se da un fenómeno de separación de los distintos ácidos nucleicos en función de su tamaño (fenómeno llamado «movilidad electroforética»). Determinar que el tamaño de los fragmentos de ADN/ARN analizados es el esperado es una prueba importante para asegurar su calidad y comprobar que se ha obtenido el fragmento adecuado. La aparición de especies de tamaño menor del esperado puede indicar degradación de la muestra. La visualización de los ácidos nucleicos en los geles se logra con el colorante bromuro de etidio (que se une de forma estequiométrica a los ácidos nucleicos de doble cadena) y la aplicación de luz ultravioleta. También es importante la cuantificación de la cantidad FIGURA E2-1 Electroforesis en gel de agarosa para la observación del ADN. A. Esquema de la técnica. El ADN se carga en unos pocillos realizados en el gel y, tras someterlo a un campo eléctrico, se desplaza a través del gel. La longitud recorrida en el gel depende del tamaño de cada una de las especies de ADN. B. Imagen de un gel de agarosa observado en un transiluminador tras teñirlo con bromuro de etidio (foto superior) y tras obtener una foto del mismo (imagen inferior). 27.e1 Biología celular biomédica 27.e2 de ácido nucleico obtenido. Para ello se utiliza la propiedad física de la absorbancia, ya que las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos absorben luz con una longitud de onda de 260 nm. Realizando la medición de absorbancia de una solución de ácido nucleico a 260 nm, se puede estimar con mucha precisión la concentración de este. Para cortar el ADN se utilizan las llamadas «endonucleasas de restricción» o, en general, enzimas de restricción. Estas enzimas de origen bacteriano son capaces de cortar el ADN cuando reconocen una secuencia concreta de nucleótidos. Las secuencias que la mayor parte de las enzimas reconocen tienen de 4 a 6 nucleótidos, y se caracterizan por un tipo especial de simetría interna: se llaman secuencias palindrómicas, es decir, secuencias que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección contraria (fig. e2-2). Existen gran cantidad de enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas. Los cortes originados por algunas enzimas dejan extremos escalonados (o cohesivos) de ADN con un pequeño fragmento monocatenario que puede unirse a otra molécula semejante de ADN para restaurar la doble cadena. Otras enzimas de restricción cortan las dos hebras a la misma altura, generando lo que se llaman fragmentos de restricción de extremos romos. Para unir los fragmentos de ADN se utilizan enzimas denominadas ligasas. El corte y empalme del ADN permite clonar genes para obtener múltiples copias del mismo. Existen dos formas principales de clonar un gen: la clonación celular y la clonación acelular. En la clonación celular se utilizan organismos (normalmente bacterias) para producir billones de copias de nuestro fragmento de ADN (cuya cantidad inicial suele ser muy escasa). El ADN se introduce en bacterias en forma de plásmido modificado (al que se denomina vector) y estas, mediante su crecimiento normal, multiplican las copias del plásmido (v. fig. e2-2). La clonación acelular sucede en un tubo de ensayo. El método principal de este tipo de clonación es la PCR (v. «Reacción en cadena de la polimerasa»). Mediante esta reac ción se puede multiplicar millones o incluso billones de veces la cantidad de una determinada secuencia de ADN. La clonación permite crear vectores con genes de uso terapéutico que pueden ser utilizados en terapia génica o para producir proteínas recombinantes. Un ejemplo de la aplicación de la tecnología del ADN recombinante y la clonación es la producción de insulina. El FIGURA E2-2 A. El ADN puede ser cortado por diversas enzimas de restricción. En el ejemplo se muestra el corte de un plásmido y de ADN genómico por la enzima EcoR1. El corte produce extremos cohesivos (escalonados) en el ADN, lo que permite la unión por hibridación del ADN del plásmido linearizado con fragmentos del ADN genómico, con la ayuda de una ADN ligasa. B. Mediante este procedimiento se pueden clonar genes de interés en plásmidos que pueden ser introducidos en bacterias y multiplicados durante su crecimiento normal. CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular gen de la insulina humano se corta y pega en un vector adecuado que permitirá la producción de grandes cantidades de la proteína en bacterias o células de mamífero, con vistas a su uso terapéutico en pacientes con diabetes de tipo I. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA En el año 1985, el investigador norteamericano Kary Mullis desarrolló el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) por el que recibió el premio Nobel de Química en 1993. La técnica se basa en multiplicar de forma exponencial un segmento determinado de ADN, a partir de una muestra muy pequeña (menos de 1 mg de ADN). Previamente, es necesario conocer la secuencia de los nucleótidos correspondientes a los extremos del fragmento que se desea amplificar para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de ADN complementarios a las secuencias de sus extremos 3’. Estos oligonucleótidos cebadores (primers) tienen una extensión promedio de 20 nucleótidos. El desarrollo de esta técnica ha supuesto un enorme avance en biomedicina, ya que la PCR tiene innumerables aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Amplificación del ADN La reacción tiene tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión. La desnaturalización consiste en la separación de las dos hebras del ADN por ruptura de los puentes de hidrógeno intercatenarios, generando moléculas de ADN en forma de cadena simple. Esto se logra por un aumento de la temperatura (90-94 °C) durante unos 5 min para asegurar la desnaturalización total de todas las moléculas de ADN; en caso contrario, el ADN tenderá a renaturalizarse, dificultando la etapa siguiente. En el paso de hibridación se disminuye la temperatura de la reacción hasta 40-60 °C para permitir la unión por complementariedad entre los cebadores (primers en inglés) y las secuencias que flanquean el fragmento que se desea amplificar. La temperatura de hibridación debe ser unos 5-8 ºC menor que la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores. La Tm depende de la longitud de los cebadores y el porcentaje de CG de su secuencia. Si la temperatura de hibridación es inferior a la óptima, los cebadores se unirán inespecíficamente, y si la temperatura es superior, disminuirá la eficiencia de la reacción. La Tm puede aproximarse para cebadores de 18 a 24 bases con la fórmula de Wallace, que contempla la proporción de bases del oligonucleótido: Tm = 2(A + T) + 4(G + C) Finalmente, la extensión ocurre a 72 °C y consiste en la adición de los desoxirribonucleótidos a partir de los extremos 3’ de los cebadores, utilizando el ADN como molde y por acción de la polimerasa Taq. Esta enzima, llamada así porque se aisló de la bacteria termófila Thermus aquaticus, es resistente a la desnaturalización por calor, lo que le permite ejercer su actividad aun a altas temperaturas. Normalmente una extensión de 20 s es suficiente para fragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 s para fragmentos por encima de 1,2 Kb. Tras este primer ciclo se obtienen dos moléculas bicatenarias del fragmento de interés (fig. e2-3). En cada repetición del ciclo se produce un aumento exponencial del número de copias de la secuencia específica (2n, siendo n el número de ciclos), ya que las moléculas amplificadas en el ciclo anterior sirven de molde para el próximo ciclo. Por lo tanto, tras 20 ciclos se obtienen un millón de copias de la molécula molde (fig. e2-3). La mezcla de reacción contiene el ADN que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (cebadores o primers: P1 y P2) que servirán como cebadores, una ADN polimerasa termoestable (Taq), los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), una solución tamponada y el cofactor de la Taq polimerasa (magnesio). La reacción se lleva a cabo de forma rápida y automatizada con un termociclador, que básicamente consiste en un bloque térmico que FIGURA E2-3 Esquema de la reacción de PCR. Cada ciclo incluye una desnaturalización de la doble cadena del ADN, hibridación de los cebadores sintéticos (P1 y P2) y extensión de las cadenas. Al finalizar un ciclo, comienza otro tomando a las cadenas recién sintetizadas como molde, por lo que la amplificación es exponencial. 27.e3 Biología celular biomédica aumenta y disminuye la temperatura de acuerdo a las condiciones programadas por el operador. El producto de la amplificación se analiza por electroforesis en gel de agarosa, colocando además un marcador de peso molecular y, por comparación, se comprueba si el producto amplificado tiene el tamaño esperado. Finalmente, se puede secuenciar el producto de amplificación (v. más adelante), con el fin de verificar su correspondencia con la secuencia de ADN estudiada. Variantes del procedimiento 27.e4 La PCR anidada consiste en la amplificación de una secuencia dentro de otra secuencia previamente amplificada, lo que permite aumentar la especificidad del producto obtenido. En la PCR multiplex se amplifican varios fragmentos simultáneamente. Se aplica para la detección de posibles mutaciones o polimorfismos en un gen grande, y es muy útil cuando se requiere la identificación de varios patógenos en la sangre u otros fluidos corporales. La PCR-RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) (v. más adelante) amplifica regiones con posibles polimorfismos genéticos que, al ser tratados con enzimas de restricción específicas, producen fragmentos de ADN de diferentes longitudes según la presencia o ausencia de determinados polimorfismos. La RT-PCR es una variante de la PCR que utiliza la enzima transcriptasa inversa (o retrotranscriptasa) para obtener ADN complementario (ADNc) a partir del ARN. El ADNc es luego utilizado como molde en la PCR. De esta forma se puede evaluar la cantidad de ARN mensajero (ARNm), es decir, la expresión de un gen concreto en un tejido o incluso en una única célula, lo que equivaldría (aunque no siempre es así) a conocer la cantidad de esa proteína. Esto puede ser de gran utilidad cuando se quieren analizar variaciones en la expresión génica debidas a situaciones patológicas. Actualmente se utiliza la PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR, del inglés quantitative PCR). A diferencia de la PCR convencional, donde se detecta el producto acumulado al cabo de cierto número de ciclos, en la qPCR el producto se mide a medida que se va formando. Para ello se utilizan sondas o reactivos fluorescentes que, a medida que el producto se amplifica, emiten un nivel de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ADN (o ADNc) presente en la muestra. Aplicaciones biomédicas Son numerosas las aplicaciones biomédicas derivadas de la PCR. A partir del ADN genómico humano, generalmente obtenido de linfocitos, se puede detectar la presencia de mutaciones y polimorfismos asociados con enfermedades hereditarias (talasemias, hemofilias, deficiencia de antitripsina, distrofias musculares y muchas otras), o con la predisposición a distintas enfermedades (como los polimorfismos de ciertos genes asociados a la aparición de algunos tumores malignos). También permite diagnosticar la presencia de gérmenes patógenos, bacterianos o víricos con una alta sensibilidad, gracias al elevado poder de amplificación de esta técnica. El ADN o ARN del microorganismo puede ser detectado antes de la producción de anticuerpos específicos («período ventana» o estado seronegativo de las enfermedades infecciosas), e incluso antes de la aparición de síntomas. Por ejemplo, es habitual utilizar la PCR para la detección e identificación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (fig. e2-4). Además de su utilidad en el seguimiento de las terapias retrovíricas, esta técnica permite la detección precoz del virus en bancos de sangre o en neonatos de madres seropositivas. La técnica consiste en detectar secuencias específicas de los genes víricos gag, env o pol, ya sea de ARN vírico o del ADN provírico inserto en las células del hospedador. El ARN vírico se detecta en muestras de plasma sanguíneo mediante RT-PCR; es decir, primero se hace la retrotranscripción de ARN vírico a ADNc y luego se amplifican las secuencias de interés. Existen diversos productos comerciales para detectar las secuencias de interés diagnóstico, FIGURA E2-4 Ejemplo de amplificación por RT-PCR del gen env del VIH-1 a partir de plasma de pacientes portadores del virus (calles 2, 3 y 4) y no portadores del virus (calles 5 y 6). La calle 1 es el marcador de peso molecular y las calles 7 y 8 son controles positivos (muestras que dan a conocer el resultado positivo de la RT-PCR). (Imagen procedente de: Dra. A. M. Suburo. Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral.) CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular que generalmente utilizan qPCR por proporcionar resultados cuantitativos. FINGERPRINT DE ADN La huella genética o fingerprint de ADN permite la identificación de diferentes individuos dentro de una misma especie o población. Aunque en una misma especie los genomas poseen una secuencia común, también poseen regiones variables que son propias de cada sujeto. Estos polimorfismos pueden ser utilizados para la identificación de personas, ya que es poco probable que dos seres humanos no relacionados tengan los mismos polimorfismos. El conjunto de polimorfismos espe cíficos de cada persona se conoce como perfil genético y es único e invariable a lo largo de la vida. Actualmente se conoce la ubicación física (locus), en cada cromosoma, de las distintas secuencias codificantes o no codificantes que componen el genoma. Cada locus cromosómico puede tener una o más variantes de esa secuencia, conocidas como alelos. En la población pueden existir múltiples alelos, pero cada célula diploide solo tiene dos alelos de cada gen: uno de origen materno y otro de origen paterno. El polimorfismo se define como la existencia simultánea, en una población, de genomas con distintos alelos para un locus determinado. Los polimorfismos pueden encontrarse tanto en regiones codificantes como no codificantes del genoma. Cuando el polimorfismo afecta a un único nucleótido se denomina polimorfismo de nucleótido único (SNP, del inglés single-nucleotide polymorphism). Por ejemplo, en el gen del receptor tipo 1 de TGF-b (TGFBR1) se describen diversas variantes polimórficas. Una de ellas es la Int7G24A, denominación que indica que la G24 del intrón 7 puede estar reemplazada por una A (fig. e2-5). Para determinar la presencia de una u otra variante, la zona del ADN genómico correspondiente al TGFBR1 es amplificada por qPCR. Existen diversos tipos de polimorfismos, como las secuencias repetidas VNTR-minisatélites (del inglés variable number of tandem repeats) y las STR (del inglés short tandem repeats) que difieren en el número de repeticiones. El análisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés restriction fragment length polymorphism) fue la primera técnica utilizada para evaluar estas variantes en 1985 por Sir Alec Jeffreys. Como se mencionó en el apartado de la PCR, el fragmento que se va a estudiar se amplifica previamente y luego es digerido por enzimas de restricción, que producen fragmentos diferentes según la secuencia amplificada. Actualmente existen diversas técnicas más eficientes y rápidas, como las amplificaciones de secuencia por PCR multiplex y la separación de los fragmentos por electroforesis capilar o ensayos comerciales de amplificación por qPCR. En el caso de los SNP, puede utilizarse la secuenciación (v. más adelante) para verificar las bases modificadas. Los polimorfismos son de gran utilidad en medicina forense, ya que el análisis de restos humanos (especialmente en casos de incendios, accidentes o desastres), mediante fingerprint de ADN permite la identificación de sospechosos de delitos y puede utilizarse también en pruebas de paternidad o parentesco. Otros polimorfismos se asocian con determinadas patologías, ya que indican susceptibilidad a presentar determinadas enfermedades como cáncer, enfermedades cardiovasculares, diabetes o patologías del sistema nervioso. También se conocen polimorfismos asociados a la distinta respuesta a fármacos. Este es un campo novedoso, aunque sujeto a controversias, de desarrollo cada vez más acelerado, ya que se intenta llegar a FIGURA E2-5 Secuenciación para determinar el polimorfismo Int7G24A del TGFBR1 en pacientes con cáncer colorrectal. Los esquemas muestran las secuencias de tres pacientes, un homocigoto para la variante G (G/G), un heterocigoto (G/A) y un homocigoto para la variante A (A/A). (Imagen procedente de: Castillejo et al. BMC Cancer 2009;9:406.) 27.e5 Biología celular biomédica una medicina personalizada, donde los métodos de diagnóstico y el tratamiento se adecúen al genoma de cada individuo. El ADN mitocondrial (ADNmt) también puede ser utilizado para el análisis de individuos. Las mitocondrias contienen ADN circular que codifica para 37 genes y que es de herencia materna. El uso del ADNmt es ventajoso, ya que en cada célula existen hasta 1.000 copias, superando enormemente a las dos copias del ADN genómico. Esto permite la obtención de ADN aun en casos de muestras muy escasas, con ADN degradado o que sufrieron el paso del tiempo (p. ej., restos esqueléticos). Además puede resultar útil para determinar la filiación por vía materna. Las STR del cromosoma Y son muy convenientes para estudiar el patrón genético de un individuo masculino. Por ejemplo, en los casos de agresión sexual, permiten identificar pequeñas cantidades de ADN masculino en presencia de grandes cantidades de ADN femenino. También se pueden usar para determinar el parentesco de varones a través de la vía paterna. 27.e6 SECUENCIACIÓN DE ADN Junto con la PCR, la secuenciación del ADN es, sin duda, otro gran pilar en el campo de la biología molecular y del diagnóstico médico. Secuenciar el ADN significa determinar la secuencia de nucleótidos (A, T, G, C) que conforma una hebra de ADN (y, por lo tanto, su complementaria) en el orden correcto. Algunos ejemplos de los usos que tiene la secuenciación del ADN son el diagnóstico genético, las pruebas forenses, el desarrollo de medicamentos basados en la tecnología del ADN recombinante, el desarrollo de terapias génicas, etc. Durante las décadas de los sesenta y setenta del siglo xx se desarrollaron diversos métodos para la se cuenciación del ADN. Sanger y sus colabora dores crearon un método que se estableció como referencia y en el cual se han basado otros sistemas de secuenciación posteriores. Los se cuenciadores de alto rendimiento de final del siglo xx (que permitieron, entre otros hitos, se cuenciar el genoma humano) se basan en la tec nología desarrollada por Sanger. El método de secuenciación de Sanger se fundamenta en el concepto de «interrupción de la cadena». Se trata de una reacción de PCR especial. A esta PCR se añaden desoxirribonucleótidos dA, dC, dT y dG como en las PCR rutinarias, pero además se añade una versión modificada de cualquiera de los cuatro nucleótidos ddA, ddC, ddT o ddG (aquí dd significa «didesoxi-»). Se realizan cuatro reacciones de secuenciación. En ellas, la PCR sigue su curso normal, pero cuando la polimerasa añade un nucleótido dd a la cadena sintetizada, la reacción se para. Los nucleótidos dd son suficientemente parecidos químicamente a los d, que son los verdaderos componentes del ADN, como para ser reconocidos por la polimerasa y añadidos a la hebra de ADN, pero la carencia de un grupo hidroxilo 39 imposibilita la unión covalente del siguiente nucleótido en la secuencia, parándose entonces la reacción. Puesto que en la reacción coexisten los nucleótidos d y los dd, la inclusión de unos u otros en la cadena se produce al azar. Por lo tanto, en la reacción se generan productos de PCR de todos los tamaños posibles. Mediante electroforesis de ADN, se pueden analizar estos fragmentos y determinar la secuencia. Una modificación que sufrió esta técnica fue la adición de marcadores fluorescentes de distintos colores a los didesoxirribonucleótidos; de este modo, en vez de cuatro reacciones, se pasó a un único tubo y se posibilitó en análisis automático informatizado de los resultados de la electroforesis (fig. e2-6). Existen otras técnicas de secuenciación que han sido desarrolladas recientemente y que, basándose en distintos principios, alcanzan una mayor eficacia en la secuenciación a precios más asequibles (lo cual es importante debido a la gran longitud de los genomas). A estas tecnologías se les denomina secuenciación de nueva generación. Algunos ejemplos son la pirosecuenciación, SOLiD o Solexa. En un futuro próximo, estos tipos de secuenciación irán sustituyendo la metodología basada en la reacción de Sanger, que sigue siendo actualmente el método más utilizado. HIBRIDACIÓN IN SITU DE ÁCIDOS NUCLEICOS La técnica de hibridación in situ (ISH) permite localizar una secuencia específica de ácidos nucleicos en cortes de tejidos. Actualmente, se ha convertido en una herramienta muy útil en cualquier laboratorio de investigación dedicado a la biología molecular y celular. La hibridación in situ se aplica para estudiar la expresión génica diferencial o las alteraciones genómicas en distintas patologías. Esta técnica se basa en la complementariedad de bases de los ácidos nucleicos, de modo que un polinucleótido marcado denominado sonda hibridará con una secuencia complementaria (diana) localizada en una sección CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular FIGURA E2-6 Esquema del proceso de secuenciación del ADN. La reacción de PCR incluye los desoxirribonucleótidos empleados para construir la cadena normal de ADN, junto con didesoxirribonucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) marcados con sustancias fluorescentes. La introducción al azar de cualquiera de estos didesoxirribonucleótidos en la hebra de ADN en formación interrumpe la adición de un nuevo nucleótido. Esto hace que se formen especies de ADN con todos los tamaños posibles: desde las que contienen todos los nucleótidos hasta las que solo han incorporado uno; esto permite conocer la secuencia del ADN. histológica, en células aisladas o en cromosomas (fig. e2-7). En función de las moléculas implicadas, podemos encontrar tres tipos de uniones: ADNADN, ADN-ARN y ARN-ARN. La técnica de ISH permite detectar cambios estructurales en el genoma (ADN-ISH), o cambios en los niveles de expresión del ARN (ARN-ISH). El marcaje de la sonda puede ser radiactivo (algunos átomos de los nucleótidos se sustituyen por isótopos radiactivos como 32P, 33P, 3H, 35S, 125I) y no radiactivo (unión a los nucleótidos de moléculas no radiactivas como la biotina, digoxigenina o fluorocromos). Las moléculas marcadoras se pueden detectar posteriormente por una reacción antígeno-anticuerpo. Cuando la molécula marcadora es un fluorocromo, la técnica se denomina hibridación in situ fluorescente (FISH) y la reacción se puede visualizar directamente en un microscopio de fluorescencia. En la detección de ARN se pueden usar sondas de ARN o ADN, aunque el empleo de sondas de ARN (ribosondas) es más frecuente, ya que la unión ARN-ARN es más estable que la unión ARN-ADN, y las sondas de ARN hibridan mejor in situ que las de ADN. A pesar de las numerosas ventajas de las ribosondas, su obtención es laboriosa y requiere el empleo de diferentes técnicas de biología molecular. Además, el manejo y la conservación del ARN son delicados debido al carácter ubicuo de las ARNasas, enzimas de difícil inactivación. Las ribosondas se obtienen mediante transcripción in vitro a partir de una secuencia de ADN clonada en un vector que posea los promotores para su transcripción. El marcaje de los transcritos se realiza mediante la incorporación de nucleótidos marcados en la reacción de transcripción. Para localizar secuencias de ADN se utilizan sondas de ADN. En el protocolo es necesario incluir un paso de desnaturalización del ADN para que pueda tener lugar la hibridación de la sonda diana. También existen sondas LNA y PNA, constituidas por análogos de ácidos nucleicos, que hibridan con mayor especificidad y estabilidad. Las aplicaciones de la ISH en el diagnóstico clínico se centran principalmente en dos aspectos: ● Detección de la expresión de ARNm en patologías. Se emplea por ejemplo en tumores 27.e7 Biología celular biomédica 27.e8 FIGURA E2-7 Hibridación in situ de ácidos nucleicos. A. Esquema simplificado de la técnica. La hibridación in situ implica la fabricación de una sonda marcada cuya secuencia es complementaria a la que se quiere detectar en el ADN problema. La molécula marcadora permitirá detectar la unión de la sonda solo en las células en las cuales está presente la secuencia problema. B. Imagen de hibridación in situ que muestra un ganglio linfático con células infectadas por el virus Epstein Barr (en color azul oscuro). En este caso, la sonda hibrida específicamente con una secuencia del genoma viral. (Imagen procedente de: Dra. Jackeline Agorreta, Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.) neuroendocrinos para confirmar que las células del tumor son las responsables de un aumento del nivel de alguna hormona en sangre, pero el tumor es negativo por inmunohistoquímica. Asimismo, la técnica de ISH se emplea en el diagnóstico de tumores hepáticos y linfomas de células B. ● En virología, esta técnica se utiliza tanto para identificar una infección vírica como para deter minar su extensión. Se usa para el análisis de diversas infecciones como las del virus del papiloma humano, virus de la hepatitis B y C y virus Epstein Barr (v. fig. e2-7). La combinación de la técnica de ISH con la inmunohistoquímica permite localizar los lugares de infección activa y detectar infecciones víricas ocultas en pacientes inmunodeprimidos. TERAPIA GÉNICA Como hemos indicado con anterioridad, la tecnología del ADN recombinante permite la manipulación y transferencia de genes entre distintos organismos. Tras su desarrollo, no tardó mucho en plantearse el empleo de dicha tecnología en el campo de la medicina. La terapia génica consiste en tratar enfermedades mediante la introducción en el organismo de genes terapéuticos, es decir, genes «sanos» que reemplacen los genes que están alterados o ausentes en una determinada enfermedad. Por lo tanto, en vez del uso clásico de fármacos, consistiría en corregir el defecto genético que da lugar a esa enfermedad, mediante la aplicación exógena de genes (fig. e2-8). Actualmente se investiga sobre la posibilidad de aplicar la terapia génica en un gran número de enfermedades, pero, por desgracia, solo un pequeño porcentaje de ellas están siendo tratadas con éxito en humanos. No obstante, el campo de la terapia génica sigue mirando con optimismo al futuro, y va incorporando nuevos avances técnicos de la biología molecular para solventar las dificultades de bioseguridad que en su momento impidieron la aplicación eficaz de estrategias terapéuticas concretas. Dependiendo del defecto genético causante de la patología, la estrategia de la terapia génica será distinta. En el caso de que una enfermedad sea causada por la falta de un gen concreto, la introducción del gen permite que se produzca la proteína. En cambio, en otros casos la causa molecular es la mutación de un gen que genera una proteína anómala que causa la enfermedad. En este caso, la terapia génica intenta corregir dicha mutación o eliminar las variantes mutantes. Las alternativas terapéuticas de la terapia génica son fundamentalmente las siguientes: CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular 27.e9 FIGURA E2-8 Esquema de la terapia génica ex vivo. El gen terapéutico se inserta en un virus modificado para que no se produzcan efectos adversos. Las células patológicas extraídas del paciente (médula ósea, sangre, etc.) se infectan con el virus y el gen terapéutico corrige su defecto. Posteriormente las células se reintroducen en el paciente. ● ● ● ● ● Terapia de aumento génico (GAT, del inglés gene augmentation therapy): consiste en introducir el gen terapéutico del cual carece el tejido enfermo. Corrección de mutaciones. Eliminación selectiva de las células patológicas, mediante la transferencia de genes «tóxicos». Activación del sistema inmunitario contra el tejido enfermo mediante estrategias de terapia génica, como vacunación con ADN recombinante o transferencia de ADN codificante para citoquinas inmunoestimuladoras. Inhibición génica: mediante estrategias con ácidos nucleicos «antisentido» o de ARN de interferencia. La terapia génica puede realizarse tanto directamente sobre el individuo enfermo (in vivo) como sobre tejidos previamente aislados de este para su posterior reimplantación (ex vivo). Un ejemplo de método ex vivo es la extracción de sangre o médula ósea de un paciente, su cultivo en el laboratorio (durante el cual se introduce el gen o ADN recombinante de interés) y la posterior reinfusión en el paciente (v. fig. e2-8). La terapia génica puede clasificarse en somática o germinal. En la terapia somática se tratan células del organismo adulto, pero el defecto genético no es corregido en las células germinales, por lo que no sería transmitido a la descendencia. La terapia génica germinal acarrea serios problemas éticos al modificar la información genética de la línea germinal de un individuo. Por ejemplo, podría aplicarse con vistas a la mejora genética, por lo que su uso no está permitido. De modo teórico, muchas enfermedades podrían ser corregidas mediante terapia génica. La principal dificultad que encuentra su aplicación es el desarrollo de métodos eficaces y 27.e10 Biología celular biomédica selectivos para la introducción del gen en las células adecuadas en cada caso. Muchas veces no se consigue introducir el factor terapéutico en el suficiente número de células enfermas. En otras ocasiones, la introducción del factor terapéutico en células sanas puede resultar peligrosa (un gen puede curar a un tipo celular pero afectar gravemente a otro). Por todo esto, los mayores esfuerzos en el campo de la terapia génica se centran en el desarrollo de vehículos (vectores) que transfieran el factor terapéutico a las células deseadas de un modo selectivo. Los principales vectores empleados en terapia génica son virus que causan enfermedades en mamíferos. Estos virus son modificados de modo que dejen de ser peligrosos y patógenos, pero mantengan su capacidad de penetrar en células de mamífero. En el genoma de estos virus se incluye la secuencia terapéutica que se quiere introducir en la célula enferma, eliminando las secuencias que permiten la replicación vírica (v. fig. e2-8). Se pueden utilizar diferentes tipos de virus, cada uno de ellos con ventajas e inconvenientes. La elección de uno u otro depende de la patología, de la estrategia terapéutica que se quiera utilizar y del tejido diana. Los adenovirus y virus adenoasociados son virus frecuentemente utilizados en terapia génica. Otro tipo de virus (cuyo genoma se integra en el genoma del hospedador) es el retrovirus, pero la aparición de tumores en varios pacientes durante los ensayos clínicos los ha descartado por el momento para la terapia génica. Además de los virus, existen otras alternativas para introducir ADN recombinante en células. En general, los principales métodos que se están probando en terapia génica son: ● Virus: adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus del herpes simple y lentivirus. ● Microbalas: consiste en recubrir diminutas partículas de metal con el ADN recombinante. Mediante una pistola especial (pistola génica), se lanzan las partículas contra el tejido diana. ● Reactivos químicos: existen reactivos químicos capaces de transportar el ADN e introducirlo a través de la membrana celular. ● Anticuerpos: mediante un anticuerpo se puede vehiculizar un complejo que contenga el factor génico terapéutico para que entre en la célula diana. Existen muchas circunstancias que hacen que una patología pueda ser más o menos tratable mediante terapia génica. Las más importantes son las siguientes: ● Complejidad genética de la enfermedad: las enfermedades genéticas monogénicas son, en principio, mejores candidatas para la terapia génica que las complejas, en las que están involucrados varios defectos genéticos. ● Dominancia y penetrancia del defecto genético: los defectos genéticos recesivos y/o poco penetrantes auguran mayor probabilidad de éxito que los dominantes. ● Tipo de defecto: la falta de un gen es más fácilmente tratable que el exceso o la mutación. La carencia de un gen se puede tratar mediante terapia de aumento génico, y en muchas ocasiones no requiere la transferencia del factor a todas las células enfermas. En cambio, cuando el defecto incluye la presencia de un gen alterado, es complicado eliminarlo o corregirlo totalmente, algo que, por lo general, incluiría un acceso de la terapia a todas las células portadoras del defecto. El primer caso célebre de terapia génica fue la introducción en 1990 del gen ADA (adenosina desaminasa) ex vivo en la sangre de dos niñas con inmunodeficiencia combinada severa (causada por la falta de dicho gen). Tras ser reinfundida la sangre en la que se corrigió el defecto genético, las niñas comenzaron a desarrollar las funciones inmunológicas de las que carecían. Hoy en día se investiga profusamente en modelos animales la aplicación de terapias génicas aplicadas a un gran número de patologías humanas. Existen actualmente ensayos clínicos para enfermedades genéticas hereditarias (inmunodeficiencia combinada severa, fibrosis quística o hipercolesterolemia familiar), cáncer, desórdenes inmunológicos, Parkinson o SIDA. MICROARRAYS Y MICROCHIPS PARA ESTUDIOS GENÓMICOS DE EXPRESIÓN A GRAN ESCALA Fundamento de la técnica Muchos procesos biológicos ocurren por cambios en la expresión de diversos genes, lo que desencadena una modificación en la fisiología celular. Para investigar estos cambios, tradicionalmente se han utilizado técnicas como el northern blot, RTPCR (ambas destinadas a conocer la cantidad de ARNm para un gen concreto presente en un tejido o célula) o Western blot (para el caso de proteínas; v. más adelante). Pero estas tecnologías permiten el análisis de pocos ARNm/proteínas en cada CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular ensayo. La técnica de microarrays proporciona métodos rápidos y proporcionalmente asequibles desde el punto de vista económico para el estudio de la expresión de miles de genes en un solo ensayo, lo que permite una visión global de la actividad celular. Los microarrays consisten generalmente en fragmentos de ADN inmovilizados en puntos definidos de una manera ordenada y precisa, en un soporte físico (fig. e2-9). Los soportes están fabricados de vidrio, silicona o plástico, donde se depositan las sondas, que consisten en fragmentos de ADN con una secuencia de nucleótidos que hibridará con un gen concreto. El ADN sonda de los microarrays puede tratarse de: ● Oligonucleótidos (de una longitud de 20-65 pares de bases): se emplean frecuentemente en experimentos de genotipado con el fin de detectar mutaciones o polimorfismos, así como en experimentos para evaluar la expresión génica. ● ADNc completo o parcial (500-5.000 pares de bases): se emplean para el análisis de la expresión génica. ● ADN genómico (50.000 pares de bases): su uso está destinado principalmente al estudio de pérdidas o ganancias génicas (arrays de CGH, véase más adelante). En los microarrays de expresión, las muestras de ARNm se preparan a partir de células en cultivo o tejidos de interés. Se procede a la obtención del ADNc a partir del ARNm mediante retrotranscripción, utilizando nucleótidos marcados con sustancias fluorescentes, para conseguir ADNc marcado. El ADNc se deposita sobre el microarray para su hibridación con las sondas. Una vez se ha producido la hibridación, se procede a eliminar el ADNc no hibridado y a la cuantificación de cada una de las sondas hibridadas del microarray mediante programas informáticos. Habitualmente, el ADNc de la muestra patológica, marcada con una sustancia fluorescente (p. ej., con un fluorocromo de color rojo) se mezcla en la hibridación con el ADNc de la muestra normal (marcada, p. ej., con un fluorocromo de color verde). Por lo tanto, si la cantidad de ARNm expresada por un gen se encuentra incrementada en la muestra patológica con respecto a la muestra normal, el color resultante en el punto donde se localizaba la sonda correspondiente será el rojo. Si, por el contrario, hay una mayor cantidad de ARNm en la muestra normal, el color resultante será el verde. Una expresión equivalente de un gen en la muestra normal y en la patológica daría lugar a un color amarillo. Este patrón de colores se utiliza para valorar y cuantificar los datos de los microarrays y poder interpretar los resultados de expresión (v. fig. e2-9). FIGURA E2-9 A. Esquema de la preparación de muestras para un microarray de expresión. El ARNm de muestras sanas y patológicas se convierte mediante retrotranscripción en ADNc marcado con un fluorocromo que emite luz verde (para la muestra sana) o rojo (para la patológica). A continuación, estos ADNc se hibridan competitivamente con sondas específicas para cada gen situadas en cada uno de los puntos del microarray. Dependiendo de la cantidad de ADNc «verde/rojo» para cada gen en la muestra sana/patológica se obtendrá un color distinto, que se relaciona con la cantidad de expresión (cantidad de ARNm) que tenía cada muestra. B. Imagen de un microarray de expresión hibridado. 27.e11 27.e12 Biología celular biomédica Aplicaciones biomédicas Aunque la tecnología de los microarrays todavía no se utiliza con fines diagnósticos de modo rutinario, es una técnica con un gran potencial en este sentido. Las aplicaciones posibles de los microarrays son muy diversas: ● Conocimiento de los cambios globales en la expresión génica de tejidos patológicos. ● Descubrimiento de nuevos genes causantes de enfermedades. ● Estimación de la evolución de una enfermedad. El estudio de genes asociados con la evolución de los pacientes tras la aplicación de una terapia podría predecir el pronóstico de dicha enfermedad. ● Farmacogenómica: gracias a la identificación de genes centinelas (o biomarcadores) que demuestran una expresión alterada en una célula o tejido determinado tras la aplicación de un fármaco, se podría determinar si dicho fármaco va a ser efectivo y no va a causar toxicidad en un paciente. TRANSFERENCIA DE ADN A CÉLULAS Y EMBRIONES DE MAMÍFEROS. DESARROLLO DE ANIMALES TRANSGÉNICOS Y KNOCK OUT La capacidad de introducir genes de nuestro interés en una célula y expresarlos en grandes cantidades (o, por el contrario, disminuir artificialmente su expresión basal) permite conocer mejor la función de dichos genes. Por otro lado, la terapia génica se basa también en la capacidad de transferir determinados genes en células alteradas. El proceso de introducción de ADN exógeno en células se llama transfección, cuando se hace de modo directo, y transducción cuando se introduce mediante infección vírica. Existen varios métodos de transfección, entre los que citaremos: a) la electroporación, por el que las células se incuban con ADN en unos tubos de ensayo especiales que contienen electrodos y se aplica una pequeña corriente eléctrica que hace que en la membrana se creen poros por los que se introduce el ADN, y b) el uso de liposomas, pequeñas esferas de membrana artificial donde se puede meter el ADN por determinados métodos químicos. Los liposomas se fusionan con la bicapa lipídica de la membrana celular e introducen el ADN en el citoplasma. Estos métodos permiten modificar genéticamente las células para ver cómo cambian sus propiedades o para la creación de animales transgénicos y knock out. Para la creación de animales transgénicos (habitualmente ratones), primero hay que fabricar un vector adecuado que contendrá la secuencia de ADN de interés, la cual lleva el gen codificante para la proteína que se quiere introducir. La expresión de este gen puede estar controlada por un promotor específico de tejido o por un promotor genérico que permitirá la expresión del gen en todas las células del organismo. En ambos casos, el promotor está situado en la región 5 de dicho gen introducido en el vector. El vector se transfiere a un cigoto, donde el ADN se integrará en los cromosomas y, tras su implantación en una hembra preparada para la gestación, se obtendrán animales que llevarán en todas sus células ese transgén. Pero eso no quiere decir necesariamente que todas sus células vayan a expresar o a producir la proteína codificada por el transgén, porque como se puede utilizar un promotor específico, solo se expresará en células del tejido que sea capaz de activar al promotor (fig. e2-10). Los ratones knock out (KO) son ratones alterados genéticamente en los que, utilizando técnicas de ingeniería genética, se elimina uno de sus genes. Si en los ratones transgénicos lo que se intenta es aumentar la expresión de un gen concreto, en los ratones KO se elimina la función de un gen. El propósito es ver qué papel tienen dichos genes en el organismo; si se elimina un gen y no ocurre nada, es que ese gen no es vital para el ratón, pero si observamos un fenotipo patológico podremos conocer en qué funciones fisiológicas participaba ese gen. El primer paso para generar estos ratones es construir un fragmento de ADN con una secuencia modificada que reemplace a la secuencia original del gen, con el fin de inactivarlo. Este fragmento debe incluir una secuencia «de selección» (que va a expresar un gen de resistencia frente a un agente tóxico) flanqueada por secuencias idénticas a la del locus del gen que se quiere inactivar, para que pueda tener lugar la recombinación homóloga. Tras la recombinación entre el ADN exógeno y el ADN genómico, se cultivan las células con el agente tóxico cuyo gen de resistencia lleva el vector (p. ej., la neomicina); solo sobrevivirán entonces las células que lo hayan incorporado (fig. e2-11). A partir de un blastocisto de ratón (un embrión temprano, formado por una masa esférica de células indiferenciadas rodeada por células extraembrionarias) se aíslan las células madre embrionarias (ES, del inglés embryonic stem) que se cultivan in vitro. En estas células se transfiere el fragmento de ADN que hemos generado para que tenga lugar la recombinación homóloga. El ADN exógeno se CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular 27.e13 FIGURA E2-10 A. Esquema simplificado de la generación de ratones transgénicos. En la región 5’ del transgén (en este caso el oncogén antígeno T) se introduce un promotor que permitirá la expresión del mismo en un tejido específico, como por ejemplo la glándula mamaria. Tras la transferencia del ADN a un cigoto e introducción del mismo en una ratona preparada hormonalmente para la gestación, se obtendrá una progenie que lleva en todas sus células el transgén, pero que solo lo expresa en el tejido específico. B. Fotografías de ratones transgénicos C3(1)/Tag hembras donde la expresión del antígeno T en la glándula mamaria genera tumores. (Imágenes procedentes de: Dr. A. Calvo. Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.) integrará en el genoma mediante recombinación homóloga con el ADN genómico de la célula, de tal manera que se sustituye la secuencia original por la del ADN exógeno. Pero la frecuencia de recombinación es muy baja, y en la mayoría de las células se recombina uno solo de los alelos. Por lo tanto, las células modificadas son heterocigóticas para ese gen. Las células que han incorporado el transgén se seleccionan mediante la adición del agente tóxico que va a permitir que solo sobrevivan las que han incorporado esta secuencia de ADN. En este momento tenemos células embrionarias con uno de los alelos deficientes para el gen que queremos eliminar. ¿Cómo conseguir, a partir de esto, un ratón en el cual todas las células de su organismo tengan las dos copias deficientes para ese gen? Para ello hay que recurrir a determinadas técnicas genéticas. Supongamos que las células ES se obtuvieron de un ratón marrón; en este caso, las células ES con una copia deficiente de nues- tro gen de interés se introducen en un blastocisto de un ratón cuyo pelaje sea de otro color (p. ej., negro). Los blastocistos se implantan entonces en el oviducto de una ratona a la que se ha preparado hormonalmente para que pueda llevar a cabo la gestación. Los blastocistos contienen en este momento dos tipos de células madre: las originales, que provienen de la ratona portadora de color negro, y las modificadas, provenientes de una ratona de color marrón. Los ratones que nazcan serán quimeras, porque parte del cuerpo se ha desarrollado a partir de células madre originales de la ratona negra, y otra parte de las células que nosotros les hemos inyectado (de la ratona marrón). El pelaje de estos ratones tendrá, por lo tanto, zonas negras y zonas marrones. Los ratones quiméricos solo nos sirven si sus células germinales (las de las gónadas) han incorporado también las células que nos interesan (las que llevan un alelo mutado, provenientes de la Biología celular biomédica 27.e14 FIGURA E2-11 Primeras etapas de la generación de un ratón knock out (KO) para un gen concreto. 1, aislamiento de células embrionarias (ES) de blastocisto de ratón; 2, cultivo; 3, inyección del ADN exógeno (transgén) que lleva el gen alterado, el cual sufrirá recombinación homóloga con el gen que se quiere eliminar presente en las células. El transgén lleva incorporado el gen de resistencia Neor; 4, inyección de las células modificadas en un blastocisto de un ratón con pelaje distinto al original e introducción en una ratona preparada para la gestación; 5, la descendencia dará lugar a ratones quimera. ratona marrón), ya que podrán transmitir este gen a la descendencia. Solo si esto es así, tras cruzar los ratones quimera con otros negros se obtendrá una progenie no quimérica marrón (fig. e2-12). Los ratones obtenidos de este modo aún contienen solo una copia funcional del gen (son heterocigóticos) en todas las células de su organismo. Estos ratones tienen que someterse a un cruzamiento endogámico posterior para producir un ratón que no lleve ninguna copia funcional del gen que se quiere inactivar, consiguiendo así una homocigosis de ese alelo. Por lo tanto, el cruce de los ratones marrones heterocigóticos para el transgén con otros del mismo tipo dará lugar a una descendencia en la que el 25% de los ratones serán homocigóticos para el gen alterado. Tras este largo procedimiento obtenemos ratones KO para nuestro gen de interés. Esta técnica es valiosa, pero tiene algunas limitaciones; aproximadamente un 15% de los genes que se eliminan son letales para el desarrollo, por lo que los embriones genéticamente alterados no pasan a adultos. Esto indica que son genes impres- cindibles para la vida, pero no podemos estudiar qué ocurre en los ratones adultos. Empleando esta tecnología se han conseguido ratones que sirven como modelos para estudiar el cáncer, la obesidad, la diabetes, la ansiedad, el Parkinson o el envejecimiento. Actualmente se están desarrollando tecnologías novedosas como la técnica CRISPR/Cas9, que permite «editar» el genoma de una manera muy precisa, introduciendo las modificaciones que sean de nuestro interés científico. TÉCNICAS CITOGENÉTICAS Las técnicas citogenéticas tienen como objetivo estudiar los cromosomas en el contexto celular. Son técnicas de desarrollo reciente, que en los últimos años han experimentado un crecimiento exponencial. Se pueden clasificar en dos grupos: técnicas de análisis convencional y técnicas de análisis molecular. El análisis citogenético convencional consiste en el estudio de los cromosomas metafásicos presentes en las células de interés, obtenidos tras el cultivo in vitro del tejido. CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular 27.e15 FIGURA E2-12 Segunda parte de la generación de un ratón KO. A. Los ratones quimera se cruzan con otros de color negro. Los ratones quimera que tengan células germinales procedentes de las células que llevaban el transgén (que venían de un ratón negro) generarán una descendencia de ratones negros heterocigóticos para el gen que se quiere eliminar; 6, el cruce endogámico de estos ratones producirá una descendencia con un 25% de ratones negros con deleción homocigótica para el gen de interés. B. Ejemplo de ratones wild type (WT) (con fenotipo salvaje; ratón de la izquierda) y ratones obesos (los dos de la derecha) generados por la eliminación de genes que controlan la obesidad. (Imagen procedente de: Sakkou et al. Cell Metabolism 2007;5:450-63.) Fundamento de la técnica El protocolo básico para conseguir cromosomas en metafase de una célula conlleva los siguientes pasos (v. también capítulo 7): ●Cultivo in vitro del tejido (sangre, médula ósea, piel, un tumor, etc.) con un medio de cultivo específico a 37 °C y con fitohemaglutinina para inducir la mitosis celular. ● Interrupción de la división celular mediante la adición de un agente antimitótico como la colchicina, que detiene la división en la metafase. ● Tratamiento de la suspensión celular con una solución hipotónica para romper las membranas celulares, fijación de las estructuras obtenidas y tinción de los cromosomas para la obtención de un patrón de bandas específico. ● Recuento y análisis de la estructura de los cromosomas para el estudio de las posibles alteraciones. La técnica de tinción más utilizada en citogenética convencional es la tinción de bandas G. Consiste en el tratamiento de los cromosomas con tripsina y tinción con el colorante Giemsa. De esta manera, los cromosomas aparecen teñidos con un patrón de bandas claras y oscuras que es específico de cada cromosoma, puesto que es reflejo de la secuencia de ADN presente en cada uno de ellos. La disposición ordenada de los cromosomas presentes en la célula, denominada cariotipo (fig. e2-13), permite detectar tanto alteraciones numéricas (monosomías, trisomías, etc.) como estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones, etc.). Esta es la técnica más utilizada para el estudio citogenético, debido a que, de forma rápida y económica, 27.e16 Biología celular biomédica FIGURA E2-13 Imagen de cariotipo humano. permite llevar a cabo un análisis de todo el genoma célula a célula. Sus principales inconvenientes son: la necesidad de disponer de tejido fresco para poder cultivar las células de interés, y su resolución, ya que no son detectadas alteraciones que afectan a regiones de un tamaño menor de 5 Mb. Las técnicas de citogenética molecular están basadas en la hibridación in situ fluorescente (FISH), que consiste, como se ha comentado previamente, en la hibridación de un fragmento de ADN o ARN con secuencia conocida (sonda), marcada con una sustancia fluorescente (fig. e2-14). El esquema básico de la técnica de FISH convencional es el siguiente: ● ● ● ● ● Preparación de la sonda: marcaje fluorescente del fragmento de ADN que actúa como sonda. Preparación del ADN diana, que puede tratarse de cromosomas en metafase o núcleos en interfase. Desnaturalización de las moléculas de ADN (tanto de la sonda como de la diana) e hibridación de las secuencias. Procesos de lavado para eliminar las uniones inespecíficas de la sonda. Análisis mediante el microscopio de fluorescencia. La técnica de FISH ha revolucionado el mundo de la citogenética desde sus primeras aplicaciones a finales de la década de los ochenta del siglo xx, ya que permite llevar a cabo el estudio cromosómico sin la necesidad de tener células en cultivo. Es capaz de detectar no solo ganancias y pérdidas génicas, sino también translocaciones e inversiones en interfase. Además, dado que permite el análisis célula a célula, puede describir la posible heterogeneidad celular de la muestra. Su principal desventaja es que no se trata de una técnica de cribado, porque requiere conocer de antemano cuál es la región genética que se va a estudiar para poder disponer de la sonda adecuada. La visualización de los resultados resulta laboriosa, puesto que implica contar señales fluorescentes, célula a célula. En la actualidad existen algunos equipos capaces de automatizar el análisis de FISH. Con el fin de resolver las principales limitaciones de la técnica de FISH, se han ido desarrollando nuevas metodologías derivadas de ella; una de las más importantes es la hibridación genómica comparada (CGH) (v. capítulo 7). La técnica de CGH consiste en mezclar dos ADN en cantidades equimoleculares (un ADN problema y un ADN normal de referencia) marcados con fluorocromos diferentes (rojo y verde). Estos ADN compiten por hibridar sobre un ADN diana normal en forma de cromosomas en metafase o, más recientemente, chips con miles de secuencias genómicas que pueden llegar a diferenciarse en un único nucleótido (microarray-CGH y microarray-SNP). La diferencia de material genómico entre el ADN problema y el de referencia se manifiesta en una diferencia de intensidad rojo-verde en cada punto del micro array. La imagen obtenida en el microscopio de CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular FIGURA E2-14 Técnica FISH para la detección de la amplificación del gen ERBB2 en una muestra de tumor de mama. La sonda de color rojo identifica el gen ERBB2 y la sonda de color verde, el centrómero del cromosoma 17, donde se localiza este gen. Las flechas rojas indican células tumorales con ganancia génica (5-10 copias del gen), y la flecha blanca señala una célula normal con dos copias del gen y del centrómero del cromosoma. (Imagen procedente de: Servicio de Análisis Genéticos de la Universidad de Navarra.) fluorescencia o en un escáner es cuantificada por un programa informático que calcula el cociente de las intensidades de cada fluorocromo en cada región, dando información de la ganancia o pérdida de material genómico para dicha región. La gran ventaja de la técnica CGH es que, al igual que la citogenética convencional, describe las alteraciones presentes en todo el genoma, pero con una elevada resolución. Su principal inconveniente reside en no ser capaz de detectar reordenaciones equilibradas que no supongan un cambio en la cantidad de material genómico. Aplicaciones biomédicas Las diversas técnicas anteriormente descritas permiten estudiar alteraciones presentes en enfermedades tanto congénitas como adquiridas. Las enfermedades congénitas son aquellas que afectan al individuo desde el nacimiento. Muchas de ellas tienen un origen cromosómico. Tras el examen clínico, su diagnóstico citogenético se lleva a cabo obteniendo el cariotipo principalmente a partir del cultivo de sangre periférica del paciente. En ocasiones, es necesario además recurrir a la técnica de FISH para describir el mosaicismo de la enfermedad (presencia de clones celulares con dotaciones cromosómicas diferentes). Para algunas enfermedades causadas por microdeleciones, la resolución del cariotipo no es suficiente, por lo que se recurre al análisis mediante FISH utilizando una sonda específica de la región delecionada y/o microarrays de CGH. Recientemente se están haciendo grandes esfuerzos para identificar las alteraciones que causan retraso mental. En muchas ocasiones, el cariotipo de los pacientes es normal, y sus características clínicas y fenotípicas no permiten identificar la enfermedad que pueda ser estudiada mediante una sonda de FISH. En estos casos, la técnica de microarrays de CGH ha posibilitado la identificación de alteraciones que afectan a regiones de menos de 3 Mb, características de este tipo de enfermedades. En la tabla e2-1 se presentan algunas de las enfermedades congénitas más importantes y las alteraciones cromosómicas asociadas a ellas. En cuanto a las enfermedades adquiridas, el análisis citogenético se ha incorporado en los laboratorios de genética como una técnica que complementa el diagnóstico morfológico e inmunofenotípico de neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La citogenética no solo aporta valor diagnóstico, sino que además permite: ● Definir el pronóstico del paciente: por ejemplo, en las leucemias agudas linfoides tipo B, 27.e17 27.e18 Biología celular biomédica TABLA E2-1 Ejemplos de enfermedades congénitas en relación a sus alteraciones citogenéticas Enfermedades congénitas Alteración citogenética Trisomías Down Edwards Patau Klinefelter +21 +18 +13 47,XXY Monosomías Turner 45,X Alteraciones estructurales Cri du chat Prader-Willi y Angelman DiGeorge Williams Wolf-Hirschhorn del 5p15.2 del 15q11-13 del 22q11.2 del 7q11.23 del 4p16.3 Inestabilidad cromosómica Región de fragilidad Ataxia-telangiectasia Síndrome de X frágil 11q22-23 Xq27.3 del, deleción, pérdida de un fragmento cromosómico; p, brazo corto del cromosoma; q, brazo largo del cromosoma. la hiperdiploidía de más de 50 cromosomas y la presencia de la translocación t(12;21)/ ETV6-AML1 definen un pronóstico favorable, mientras que la casi haploidía (23-28), la presencia de la t(9;22) y la t(4;11)/AF4-MLL indica un pronóstico desfavorable. ● Definir la respuesta que va a tener a un determinado tratamiento: por ejemplo, la presencia de la t(15;17) en la leucemia aguda promielocítica permite seleccionar a los pacientes que son susceptibles de ser tratados con ácido retinoico. ● Controlar la progresión de la enfermedad. ● Controlar el éxito de un trasplante de médula ósea. La lista completa de alteraciones cromosómicas descritas en neoplasias hematológicas puede consultarse en la siguiente base de datos: http:// www.ncbi.nml.nih.gov/CCAP. En la rutina diagnóstica, la técnica de FISH es la técnica de elección para el estudio de tumores sólidos, debido a las dificultades encontradas en la obtención de cariotipos de calidad en este tipo de tumores. Los ejemplos más representativos del diagnóstico citogenético en tumores sólidos son los siguientes: ● Análisis de translocaciones en distintos tipos de sarcoma: utilizando FISH, junto con otras técnicas de genética molecular como la PCR, se pueden identificar translocaciones que caracterizan distintos subtipos de sarcoma; así, una translocación entre el cromosoma 11 y 22, t(11;22)(q24; q12), que produce la fusión de los genes EWS y FLI1, caracteriza a los sarcomas de Ewing. La translocación t(X;18)(p11;q11) (fusión de los genes SYT/ SSX) caracteriza a los sarcomas sinoviales y las translocaciones t(2;13)(q35;q14) y t(1;13) (p36;q14) a los rabdomiosarcomas. ● Análisis de la amplificación del gen ErbB2 (o Her-2) en cáncer de mama y del gen EGFR (Her-1) en cáncer de pulmón: los genes de la familia de Her son receptores de membrana encargados de transmitir señales de proliferación celular al interior de la célula. Alrededor del 30% de los tumores de mama y el 80% de los carcinomas de pulmón de células no pequeñas sobreexpresan ErbB2 y EGFR, respectivamente. El estudio mediante FISH de la amplificación de ambos oncogenes está resultando de gran utilidad como complemento al análisis de la sobreexpresión de la proteína, no solo para caracterizar el peor pronóstico de los pacientes, sino también para definir el subgrupo que puede beneficiarse de tratamientos basados en fármacos diseñados para bloquear estos receptores. El enorme desarrollo tecnológico y bioinformático de los últimos años en el ámbito de la CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular secuenciación masiva hace prever una nueva revolución en el campo de la citogenética, con el desarrollo de plataformas que permitirán diagnosticar y pronosticar el curso de una enfermedad, así como poder predecir la respuesta de cada paciente a tratamientos cada vez más individualizados. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES Para obtener anticuerpos específicos contra una proteína de nuestro interés, lo primero que hay que conseguir es aislar y purificar la proteína (o sintetizar un péptido de esa proteína contra el cual se quieren dirigir los anticuerpos). Pongamos por caso una proteína de la cápside del virus de la hepatitis C. Esa proteína, cuando se inyecte en un animal, constituirá un antígeno (Ag), ya que es una sustancia extraña que, introducida en un mamífero, provoca una respuesta inmunitaria que estimula la producción de anticuerpos. Los Ag tienen diversos epítopos o determinantes antigénicos: regiones concretas del Ag que estimulan la producción de anticuerpos. Un mismo antígeno puede tener distintos epítopos. Como se describe con detalle en el capítulo 17, los anticuerpos (o inmunoglobulinas) son glucoproteínas producidas por los linfocitos B en respuesta a una estimulación antigénica. Están constituidos por la asociación de cuatro cadenas polipeptídicas (dos pesadas y dos ligeras) unidas por puentes disulfuro. A su vez, cada cadena posee una región variable, cuya secuencia de aminoácidos es característica de cada anticuerpo y constituye la región del mismo que reconoce y se une al epítopo correspondiente; y otra región constante, con la misma secuencia para cada clase de inmunoglobulina de una especie. Mediante digestión con papaína se obtienen dos fragmentos Fab (antigen binding), que contienen las regiones variables (y, por lo tanto, las que se unen al antígeno), y un fragmento Fc (región constante). La inyección del Ag en el animal causa la producción de un conjunto de anticuerpos que provienen de diferentes clones de linfocitos B y, por lo tanto, tienen diferente especificidad para reconocer diferentes epítopos de ese Ag. Esta es una respuesta policlonal, ya que implica la diferenciación de varios clones de linfocitos B (uno por cada epítopo). Si se obtiene el suero de ese animal, se consigue un suero policlonal, rico en una mezcla de anticuerpos que reconocen los diferentes epítopos del Ag (fig. e2-15). El suero poseerá además muchos otros anticuerpos que 27.e19 FIGURA E2-15 Representación de la unión de anticuerpos policlonales a distintos epítopos del antígeno (A) y de anticuerpos monoclonales a un único epítopo del antígeno (B). Cada uno de los tipos de estructura geométrica representa un determinante antigénico. reconocen proteínas generadas en otras respuestas inmunes. Por medio de diversas técnicas, se puede purificar la fracción sérica que es rica en nuestro anticuerpo de interés. Muchas veces, en las técnicas inmunohistoquímicas y en otras aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas interesa poder utilizar anticuerpos que solo se dirijan contra un epítopo, es decir, que sean monoclonales (v. fig. e2-15), ya que todos provienen de un único clon de linfocitos B. El ais- 27.e20 Biología celular biomédica lamiento y mantenimiento en cultivo de un linfocito B productor de un determinado anticuerpo permitiría la obtención de grandes cantidades del mismo, con idénticas características y con la misma afinidad por el Ag. Sin embargo, los linfocitos B no pueden mantenerse en cultivo durante un tiempo suficiente para obtener una cantidad adecuada de anticuerpos. Para solucionar este problema se fusionan los linfocitos B con células de mieloma (células cancerosas que, al ser tumorales, pueden crecer en placas de cultivo de modo indefinido). La fusión celular se consigue mediante polietilenglicol, una sustancia que favorece la fusión de las membranas. Las células de mieloma poseen una deficiencia genética que les impide crecer en un medio de cultivo llamado «HAT» (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Por lo tanto, solo van a crecer en cultivo aquellas células de mieloma que se hayan fusionado con linfocitos B (hibridomas), pero no las de mieloma que no se hayan fusionado, debido a que no pueden replicar su ADN en este medio. Los hibridomas se diluyen entonces hasta que se obtiene solo una célula por pocillo de cultivo. Los anticuerpos que estas células generan se analizan entonces por ELISA (v. más adelante) para comprobar que se produce el anticuerpo que nos interesa en grandes cantidades (fig. e2-16). ¿Cuáles son las ventajas de utilizar anticuerpos monoclonales sobre los policlonales? La obtención de gran cantidad de sueros policlonales implicaría inyectar numerosas veces el antígeno en animales. Esto da lugar a distintas respuestas inmunológicas de diferente intensidad, por lo que la cantidad de anticuerpo y su especificidad pueden ser bastante variables. En el caso de anticuerpos monoclonales, como se ha aislado un clon celular productor del anticuerpo de interés, mediante el cultivo in vitro de dicho clon podemos tener una fuente ilimitada de anticuerpos con una especificidad definida. Al reconocer un único epítopo, se reduce la posibilidad de reacciones cruzadas y, por lo tanto, de que el anticuerpo reconozca otras proteínas que no son las que interesa identificar. No obstante, el procedimiento técnico para obtener anticuerpos monoclonales es bastante más caro y laborioso que el de los anticuerpos policlonales. Las aplicaciones biomédicas de los anticuerpos monoclonales se comentan en el capítulo 17. ELISA El ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) es una técnica basada en el reconocimiento antígenoanticuerpo, muy empleada en los laboratorios de diagnóstico, con la que se puede cuantificar una proteína en un fluido o en un extracto de tejido (fig. e2-17). El modelo más habitual es el llamado «ELISA sándwich». Imaginemos que se quiere conocer si un paciente tiene en la sangre concentraciones altas de una determinada proteína. Si tenemos dos anticuerpos monoclonales que reconocen dos regiones distintas de la proteína, se puede unir covalentemente uno de ellos al fondo de cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos (por la región Fc). Se añaden entonces a cada pocillo de la placa muestras de suero de pacientes diferentes (alguno de los cuales contendrá la proteína que se quiere cuantificar). En los pocillos en los que haya suero de los pacientes con concentraciones detectables de la proteína, esta se unirá al anticuerpo (por la región Fab). A continuación se añade el segundo anticuerpo monoclonal, previamente ligado a una enzima capaz de transformar una molécula concreta (sustrato) en un producto coloreado. Finalmente se añade el sustrato de la enzima ligada al segundo anticuerpo monoclonal. En las muestras en las que haya mucha proteína, habrá quedado retenido mucho anticuerpo y, por lo tanto, habrá una cantidad equivalente de enzima capaz de transformar el sustrato en la molécula coloreada. Así, los pacientes cuyos sueros se añadieron en los pocillos que han quedado coloreados contienen niveles elevados de la proteína estudiada. La intensidad del color en cada pocillo tiene, por lo tanto, una relación directa con la cantidad de proteína presente en el suero del paciente. La sencillez y rapidez de esta técnica la convierten en una de las aplicaciones de los anticuerpos más empleada en los laboratorios de investigación y de rutina clínica. WESTERN BLOT El Western blot es un método para la detección de proteínas en extractos de tejido o células que implica una separación electroforética de dicha proteína y una identificación mediante interacción antígeno-anticuerpo (fig. e2-18). Con esta técnica se puede identificar la naturaleza de las proteínas presentes en una muestra, así como su cantidad. Las proteínas, debido a su composición de aminoácidos, suelen tener una carga neta positiva o negativa, de modo que si aplicamos un campo eléctrico a un extracto de proteínas, estas migrarán hacia el polo positivo o negativo (dependiendo de su carga), y lo harán más rápido cuanto menores sean su tamaño y su complejidad estructural. La separación electroforética de proteínas se realiza en una matriz sólida de poliacrilamida, compuesta por monómeros de acrilamida entrelazados entre sí, dejando unos poros que variarán de tamaño CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular 27.e21 FIGURA E2-16 Esquema del proceso de producción de anticuerpos monoclonales. (Dibujos procedentes de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.) dependiendo de la proporción de acrilamida presente en la matriz. Al aplicar un campo eléctrico a esta matriz, las proteínas migrarán dependiendo de su carga neta. Si se quisiera determinar tamaños de proteínas, esto sería un problema, puesto que habrá proteínas de distintos tamaños y cargas, que migrarán de forma distinta. Por ello, el Western blot utiliza una modificación de esta electroforesis denominada electroforesis en gel de acrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE, Biología celular biomédica FIGURA E2-17 Ilustración del procedimiento del ELISA para la determinación de la cantidad de proteína en un fluido o extracto de tejido. del inglés sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis). Las proteínas se colocan en una solución que contiene el dodecil sulfato sódico (SDS), un potente detergente con carga negativa. El SDS es capaz de unirse a regiones hidrófobas presentes en las proteínas, de forma que la carga neta que poseían queda neutralizada y las proteínas adquieren una carga neta negativa otorgada por el SDS. De esta forma, al aplicar un campo eléctrico, las proteínas migrarán ahora al polo 27.e22 FIGURA E2-18 Procedimiento para la realización del Western blot. Las proteínas tratadas con SDS y calentamiento se separan según su peso molecular mediante electroforesis en un gel de acrilamida; posteriormente se transfieren del gel a una membrana para su incubación con anticuerpos específicos (primarios) y secundarios marcados con una molécula cromógena (p. ej., una enzima o un fluorocromo). Tras el revelado y obtención de la imagen se observan las bandas positivas situadas a una altura correspondiente al peso molecular de la proteína que se quiere identificar. El esquema muestra un ejemplo de Western blot para detectar la proteína Id1 (imagen superior) y b-actina en células tumorales. Los números indican la masa molecular en kDa. (Imagen procedente de: I. Manrique. CIMA, Universidad de Navarra.) CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular positivo, con una velocidad que dependerá solo de su tamaño. Para evitar interacciones debidas a la estructura terciaria de las proteínas, la muestra se calienta a altas temperaturas para desnaturalizar las proteínas. Así, cuanta más masa tenga una proteína, más lenta será al migrar por los poros del gel de poliacrilamida. A partir de esta separación de las proteínas de una muestra, en función de su tamaño, podemos identificar una proteína concreta mediante la unión específica antígeno-anticuerpo. Para poder enfrentar estas proteínas a un anticuerpo, se realiza primero una transferencia de las mismas a un soporte más adecuado (una membrana de nitrocelulosa) mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel (blotting). Una vez que las proteínas están en la membrana, se puede proceder a la incubación de esta con un anticuerpo primario específico para la proteína de interés; posteriormente se aplica un anticuerpo secundario (que se une a la fracción Fc del anticuerpo primario) marcado con un cromógeno que permita detectar la banda correspondiente a la proteína en estudio. La técnica de Western blot no se aplica normalmente para el diagnóstico, pero se utiliza habitualmente en investigación biomédica para el descubrimiento y caracterización de nuevas proteínas, y para el estudio de las alteraciones debidas a patologías (cantidades anormales, diferencias en tamaños, etc.). CITOMETRÍA DE FLUJO La citometría de flujo es una técnica de análisis del número, tamaño y forma de una suspensión celular. También sirve para cuantificar el número de determinadas poblaciones celulares marcadas específicamente con sustancias fluorescentes y para aislar poblaciones celulares. Por el hecho de analizar suspensiones celulares, esta técnica es especialmente útil para el estudio y evaluación de muestras normales y patológicas de sangre y médula ósea. También se pueden analizar muestras procedentes de tejidos, pero hay que hacer previamente un procesamiento de los mismos para separar las células entre sí y para separarlas también de la matriz extracelular. El citómetro contiene las siguientes partes: ● Un sistema fluídico de transporte de células. Un sistema óptico de iluminación de las partículas mediante láser. Se suele utilizar un láser de argón, ya que la luz que emite es capaz de excitar más de un fluorocromo. ● Un detector electrónico que convierte la luz en señal digital. Las señales ópticas son con● vertidas en señales eléctricas y analizadas en una computadora. En el citómetro de flujo las células se hacen pasar por un capilar muy fino, de tal modo que pasan de una en una, en fila (fig. e2-19). Según van pasando, el rayo láser impacta sobre ellas y se produce una distorsión del rayo que es registrada por el detector. Este sistema de análisis cuantifica el número de eventos (células) que son impactados por el láser, pero también es capaz de analizar la forma y complejidad interna de las células. El grado de alteración que se produce cuando el láser atraviesa los límites celulares da lugar a una dispersión frontal (FSC, del inglés forward scatter), que se relaciona con el tamaño celular (a mayor tamaño, mayor dispersión frontal). La complejidad interna de las células produce una dispersión lateral u ortogonal (SSC, del inglés side scatter). Por lo tanto, las células granulares o complejas producirán mayor dispersión lateral. Por ejemplo, si se hace pasar una población de glóbulos blancos por el citómetro y se representa tamaño frente a complejidad, obtenemos unas nubes de puntos correspondientes a cada una de las poblaciones celulares, que sitúa a estas en diferentes regiones de la gráfica en función de estos parámetros. Los linfocitos, células pequeñas y con escasa complejidad interna, quedan situados hacia el borde inferior izquierdo, mientras que los neutrófilos aparecen en el lado superior derecho (v. fig. e2-19). Otra posibilidad es marcar una población celular específicamente con un fluorocromo para identificarla en el citómetro. Un fluorocromo frecuentemente utilizado es el isotiocianato de fluoresceína (FITC), que absorbe luz cerca de los 490 nm y emite luz de 525 nm. Un ejemplo que ilustra la utilidad de esta técnica es la incubación de células sanguíneas con un anticuerpo antiCD19 (presente solo en las membranas de los linfocitos B, y no en las de linfocitos T o NK). Cuando el láser impacta con un linfocito B se genera información para estimar la FSC y la SSC y, además, se capta la señal debida a la fluorescencia. De este modo, se puede distinguir un linfocito B de uno T o de uno NK. Esto último sería imposible solo con los parámetros FSC y SSC, dado que todos los linfocitos aparecen como una población celular única en función de estos parámetros. La presencia de un número anormalmente alto de células CD19 positivas puede ser indicativo de una leucemia. Habitualmente, se emplean otros marcadores de superficie celular para aseverar una patología neoplásica concreta. 27.e23 27.e24 Biología celular biomédica FIGURA E2-19 Esquema del funcionamiento de la citometría de flujo. A. Las células se hacen pasar por un fino capilar (de una en una), donde son impactadas por un rayo láser; la distorsión lumínica es recogida en un detector. B. El grado de distorsión frontal (FSC, forward scatter) indica el tamaño de la célula y el grado de distorsión lateral (SSC, side scatter), su complejidad interna. C. Representación del patrón observado mediante citometría de flujo de leucocitos. Otro ejemplo de uso frecuente en clínica es la detección de linfocitos CD4 positivos para monitorizar la carga vírica de los pacientes infectados con el VIH. La proteína CD4 se encuentra en la membrana de los linfocitos T cooperadores (helper en inglés) y es utilizada por el virus VIH para infectar dichas células. La infección va reduciendo progresivamente el número de linfocitos CD4+, provocando inmunodepresión en el paciente. Mediante el marcaje fluorescente de anticuerpos anti-CD4 y análisis de la sangre de pacientes infectados en el citómetro se puede hacer una cuantificación de la población de linfocitos CD4+ y, por lo tanto, un seguimiento de la evolución de la enfermedad. En este caso, se puede hacer una representación de tipo histograma de la intensidad de fluorescencia frente al porcentaje de células analizadas (fig. e2-20). La población de la izquierda de la gráfica corresponde a células no marcadas, mientras que la población de la derecha (población que emite la fluorescencia) pertenece a las células fluorescentes CD4+. Se pueden realizar también dobles o múltiples marcajes fluorescentes. Para ello habría que utilizar diferentes anticuerpos, cada uno conjugado con un fluorocromo concreto. Entre los fluorocromos frecuentemente utilizados en cito- metría están (aparte del FITC), la ficoeritrina (PE; absorción a 480-565 nm, emisión a 578 nm), y la aloficocianina (APC; absorción a 650 nm, emisión a 661 nm). Imaginemos que queremos responder a la siguiente pregunta: ¿cuántos linfocitos CD4+ expresan interferón g (INF-g)? Esta pregunta nos puede interesar porque el INF-g es una citoquina reguladora de la respuesta inmunitaria, que interviene, entre otras cosas, en la activación de los macrófagos y las células NK. Para responder a esta pregunta, lo que habría que hacer es realizar un inmunomarcaje con anticuerpos anti-CD4 conjugados con un fluorocromo (p. ej., FITC, que produce fluorescencia en el verde) y anticuerpos anti-INF-g marcados con otro fluorocromo (p. ej., APC, que produce una fluorescencia en el rojo). En este caso podemos hacer una representación de intensidad de fluorescencia en el verde frente a intensidad de fluorescencia en el rojo. Observaríamos así cuatro nubes de puntos diferentes, correspondientes a cuatro poblaciones celulares. La población A corresponde a células que no se han marcado con ninguno de los anticuerpos (CD4−/INF−). La población B es la que emite fluorescencia en el verde pero no en el rojo (CD4+/INF−), al contrario de lo que ocurre con la C (CD4−/INF+). CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular FIGURA E2-20 A. Representación en forma de histograma de una población de linfocitos positivos para el marcador CD4. La población de la derecha indica el porcentaje (44,46%) de linfocitos positivos. B. Representación en forma de nube de puntos tras el marcaje de linfocitos con doble inmunofluorescencia (anti-CD4, en color verde; anti-INF-g, en color rojo). La población positiva para ambos marcadores corresponde a la D (CD4+/INF+) (v. fig. e2-20). Los citómetros «clásicos», de un solo rayo láser, permiten el análisis de cinco parámetros al mismo tiempo: FSC, SSC y tres canales de fluorescencia. Hoy en día existen aparatos que contienen hasta 18 canales de fluorescencia, lo que constituye un total de 20 parámetros analizables al mismo tiempo, para cada célula. Esto es algo asombroso si tenemos en cuenta que se analizan miles de células por segundo. Con estos equipamientos se puede encontrar una célula con características propias entre una población de cientos de miles, o incluso de millones de células. La tecnología de la citometría de flujo continúa avanzando. El campo principal es el desarrollo de más y mejores fluorocromos, que permitan obtener señales más nítidas y más fuertes, con lo que se potenciaría la capacidad analítica de la técnica. Además de su conjugación con anticuerpos para encontrar proteínas en una célula, el citómetro puede analizar muchas otras funciones y características celulares, como la apoptosis, necrosis, número de mitocondrias, cantidad de ADN, actividad de una determinada enzima, presencia de un determinado metabolito, etc. Algunos citómetros, además de todo esto, permiten el aislamien- to de las células analizadas, lo que posibilita una investigación posterior más profunda con otro tipo de técnicas. El campo donde más se ha desarrollado la citometría de flujo es la hematología, donde constituye una técnica diagnóstica esencial. Los distintos tipos de leucemias y tumores hematológicos se pueden clasificar en muchos casos mediante la citometría de flujo. Además, continuamente aparecen publicaciones científicas en las que se describen nuevas subpoblaciones celulares caracterizadas por la presencia de un grupo especial de marcadores celulares, lo cual puede ser importante de cara al diagnóstico o pronóstico de estas enfermedades. CULTIVOS CELULARES Fundamento de la técnica Una de las herramientas más utilizadas para el estudio de la biología de las células, tanto normales como tumorales, son los cultivos celulares. Las células cultivadas in vitro provienen de un órgano o un tejido normal o tumoral. Estas células se mantienen en medios de cultivo de composición conocida y condiciones de temperatura y oxigenación controladas. De esta forma, se asegura 27.e25 27.e26 Biología celular biomédica su supervivencia y propagación, lo que ofrece una fuente ilimitada de células para el estudio. El origen de los cultivos celulares se remonta al siglo xix, cuando se realizaron los primeros ensayos de supervivencia de células fuera de organismos. Actualmente, en el laboratorio se cultivan células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. Los cultivos celulares pueden ser de dos tipos: cultivos primarios y líneas celulares. 1. Cultivos primarios: cuando el cultivo proviene de células, tejidos y órganos tomados directamente del paciente o de un animal, recibe el nombre de cultivo primario. Una de las ventajas del cultivo primario es que las células mantienen las características del órgano del que provienen, lo que es fundamental en el campo de la ingeniería de tejidos. En ciertas patologías, como el infarto de miocardio o algunas lesiones hepáticas, las células dañadas se pueden reemplazar por células sanas cultivadas in vitro procedentes del propio paciente (v. capítulo 18). En el caso del tratamiento de quemados, se han desarrollado métodos de cultivo de piel con los que se generan grandes superficies de este tejido en muy poco tiempo, que sirven para regenerar la piel con gran eficacia. 2. Líneas celulares: cuando las células del cultivo primario adquieren capacidad ilimitada de multiplicación y son líneas puras (es decir, sin contaminación de otros tipos celulares) reciben el nombre de línea celular (fig. e2-21). Las líneas celulares son una herramienta de trabajo FIGURA E2-21 Células tumorales en cultivo. (Imagen procedente de: Dra. J. Agorreta. Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.) de fácil manipulación y ofrecen una fuente ilimitada y homogénea de células fácilmente caracterizables. El desarrollo y estudio de las líneas celulares ha sido uno de los mayores logros técnicos de la biología celular, y ha servido como herramienta para el análisis de una gran variedad de funciones celulares: la actividad intracelular (replicación y transcripción de ADN, síntesis de proteínas), el ciclo celular, la diferenciación, las interacciones célula-célula, los análisis genéticos, etc. La mayoría de las células normales son capaces de dividirse un número finito de veces, tras el cual entran en senescencia y no son capaces de dividirse más. El proceso de senescencia está relacionado con el acortamiento progresivo de los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas. Las células somáticas humanas tienen inactivada la enzima responsable del mantenimiento de los telómeros, la telomerasa, por lo que en cada división celular se produce el acortamiento de los telómeros hasta que la célula entra en el proceso de senescencia. Para obtener una línea celular continua («inmortalizada») es necesario realizar ciertas modificaciones genéticas que confieran a las células capacidad ilimitada de división; por ejemplo, la introducción del gen de la telomerasa, o inactivación de genes de control del ciclo celular como P53. La derivación de líneas celulares a partir de muestras tumorales es una tarea más sencilla a priori, ya que las células tumorales ya poseen modificaciones genéticas que alteran los puntos de control del ciclo celular. No obstante, CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular el estrés al que se ven sometidas en el cultivo in vitro impide a veces el crecimiento de las mismas. Habitualmente, el objetivo principal del cultivo celular es reproducir las condiciones existentes in vivo. Sin embargo, existen ciertas limitaciones inherentes a esta técnica. Las células cultivadas in vitro no se comportan exactamente igual que en el tejido de origen, debido al cambio en las condiciones de crecimiento de las células. Se pierde la estructura tridimensional típica de cada tejido, existen diferencias en las interacciones célulacélula y célula-matriz extracelular, y la disponibilidad de oxígeno y nutrientes se ve fuertemente alterada. Asimismo, las células en cultivo suelen sufrir procesos de desdiferenciación o pérdida de las características típicas del tejido del que se aislaron. Estas limitaciones hacen necesaria una cuidadosa interpretación de los resultados obtenidos mediante esta técnica. Aplicaciones biomédicas En un principio se aislaron líneas celulares para profundizar en el conocimiento de muchos aspectos de su fisiología. Posteriormente, el campo de los cultivos celulares se encaminó hacia el desarrollo de la virología. Las células eucariotas en cultivo son el sustrato perfecto para la replicación de los virus, lo que permite conocer nuevos aspectos de la biología de estos microorganismos, así como el desarrollo de medidas preventivas a través de la producción de vacunas. Igualmente, el desarrollo de las técnicas de fusión y cultivo celular permitió la creación de los anticuerpos monoclonales, contribuyendo así al progreso de la inmunología. Una de las prioridades de la medicina es la comprensión de la biología de la célula tumoral. Actualmente se cuenta con líneas celulares de la mayoría de los tumores conocidos; de hecho, la primera línea celular de origen humano se derivó a partir de un carcinoma de cérvix en 1952 (células HeLa). Esto, junto con el desarrollo de las técnicas de transferencia de material genético en células en cultivo, ha hecho que las líneas celulares sean el modelo más utilizado en el estudio del cáncer. En este sentido, el cultivo primario de células de un determinado tumor podría dar una información muy valiosa acerca de la sensibilidad del paciente frente a ciertos fármacos utilizados en quimioterapia, lo que permitiría dar un tratamiento más personalizado. El desarrollo de las técnicas de aislamiento y cultivo de células madre ha abierto un nuevo campo de tratamiento de muchas enfermedades mediante la terapia celular e ingeniería de tejidos (v. capítulo 18). Las aplicaciones de la terapia celular se extienden a áreas tan diversas como las enfermedades cardiovasculares (regeneración de tejido cardíaco después de un infarto), la oftalmología (regeneración de la córnea) o la traumatología (regeneración de cartílago). FRACCIONAMIENTO CELULAR Y CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL Si se desea estudiar la composición química y la función de orgánulos y otras partículas subcelulares, necesitamos separarlos del resto de los componentes citoplasmáticos y nucleares. Para ello habría que romper la membrana plasmática, lo que permitiría obtener una suspensión con todos los componentes subcelulares. Existen diversos métodos para romper las células. Uno de ellos es el choque hipotónico. Al sumergir las células en un medio con menor cantidad de solutos que el citoplasma, el agua entra y las células se hinchan, rompiéndose fácilmente. También se utilizan homogeneizadores mecánicos, basados en la aplicación de presión, ultrasonido y otras fuerzas. La homogeneización se realiza en soluciones isotónicas a bajas temperaturas. Un homogenado típico es una suspensión de orgánulos, componentes celulares y macromoléculas, que podemos separar mediante la centrifugación. Centrifugación Las partículas o células en suspensión tienden a sedimentar debido a la fuerza de la gravedad. La velocidad de sedimentación de las partículas pequeñas es muy lenta, pero aumenta si utilizamos un campo centrífugo. Cuando un cuerpo se somete a centrifugación se genera una fuerza que tiende a escapar del centro de rotación (fuerza centrífuga). Los aparatos que utilizan este tipo de fuerza cuentan con un rotor (donde se ubican las muestras) que puede girar a altísimas velocidades. La fuerza centrífuga aplicada a una partícula es proporcional a la velocidad de rotación del rotor (en revoluciones por minuto) y a su distancia con respecto al centro de rotación (en centímetros). La fuerza centrífuga relativa (RCF, del inglés relative centrifugal force), que se expresa en relación con la fuerza gravitacional g, se calcula como: RCF = 1.119 × 10−5 × r (cm) × V 2 (rpm) La constante 1.119 depende de la aceleración gravitacional y la RCF se expresa en unidades × g. Por ejemplo, una fuerza centrífuga relativa de 500 × g significa que se aplica una fuerza 500 veces mayor a la fuerza gravitacional. La velocidad 27.e27 Biología celular biomédica con la que sedimentan las partículas depende de su masa y de su densidad, así como de la densidad y viscosidad del medio en el que se encuentran. La sedimentación de una partícula será directamente proporcional a su masa y densidad, e inversamente proporcional a la densidad y viscosidad del solvente. Las moléculas y las estructuras subcelulares se pueden definir por un coeficiente de sedimentación que se expresa en unidades Svedberg (S) (1 S = 10−13 s). Habitualmente se definen para la sedimentación en agua a 20 °C. El coeficiente refleja no solo su masa, sino también su forma, superficie expuesta y densidad. Esto explica por qué el coeficiente de sedimentación de determinadas partículas celulares, como el ribosoma (80 S), no es igual a la suma de los coeficientes de sus dos subunidades (60 y 40 S, respectivamente). Centrifugación diferencial La centrifugación diferencial aprovecha la propiedad de las partículas de mayor tamaño o 27.e28 FIGURA E2-22 Esquema de una centrifugación diferencial. El homogenado es sometido a sucesivas centrifugaciones. En cada paso se centrifuga el sobrenadante de la centrifugación anterior, pero con mayor velocidad y durante más tiempo. En la figura se muestra la obtención de las cuatro fracciones crudas. densidad para sedimentar más rápido que aquellas de menor tamaño o densidad. Se basa en sucesivas centrifugaciones a velocidades crecientes (fig. e2-22). En el primer precipitado, obtenido a bajas velocidades, aparecen los núcleos y restos de células sin fragmentar. El sobrenadante se centrifuga con velocidad media, precipitando entonces los orgánulos citoplasmáticos de mayor tamaño, como las mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y cloroplastos. Cuando el segundo sobrenadante es centrifugado a mayor velocidad, precipita la denominada fracción microsómica, que contiene fragmentos del retículo endoplasmático y de la membrana. La centrifugación del tercer sobrenadante permite la precipitación de los ribosomas, mientras que en el sobrenadante quedan las moléculas solubles del citosol (v. fig. e2-22). Cuando se requieren fuerzas superiores a 20.000 × g, se utilizan ultracentrífugas que trabajan en vacío para evitar el sobrecalentamiento de la muestra y del equipo. CAPÍTULO 2 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular Este método tiene poco poder de resolución y las fracciones pueden incluir varios orgánulos con la misma velocidad de sedimentación. Aunque cada fracción cruda (nuclear, mitocondrial, microsómica y ribosómica) está enriquecida en un tipo de estructura u orgánulo, contiene contaminantes que deben ser eliminados mediante la resuspensión del precipitado obtenido tras una nueva centrifugación, o bien aplicando la centrifugación en gradientes de densidad. Para asegurar la pureza de las distintas fracciones se evalúa el enriquecimiento en determinadas moléculas características de cada orgánulo, mediante procedimientos enzimáticos, inmunocitoquímicos o microscópicos. Algunos ejemplos de marcadores son la presencia de ADN (núcleo), citocromo oxidasa (mitocondrias), hidrolasa (lisosomas), catalasa (peroxisomas), a-manosidasa (aparato de Golgi), adenilato ciclasa (membrana plasmática) y lactato deshidrogenasa (citosol). Centrifugación en gradientes de densidad La fuerza centrífuga aplicada a las partículas es contrarrestada por fuerzas de fricción y de flotación. La primera depende de la viscosidad del medio, mientras que la segunda es proporcional a la densidad del medio. La partícula no se mueve cuando su densidad es igual a la del medio (isopícnica). Esta propiedad se refleja en diversos métodos de sedimentación isopícnica (igual densidad) o de equilibrio, que permiten purificar las fracciones crudas. El homogenado o, más frecuentemente, el sobrenadante posnuclear o posmitocondrial, se aplica a un gradiente de osmolaridad, viscosidad o densidad, continuo o discontinuo, cuya mayor densidad se encuentra en el fondo del tubo. Después de cierto tiempo de centrifugación, las partículas forman una banda en la zona del gradiente que tiene la misma densidad que las partículas. Este método se conoce como sedimentación isopícnica o de equilibrio (fig. e2-23, A). 27.e29 FIGURA E2-23 A. Ilustración de la separación isopícnica de la fracción mitocondrial cruda en un gradiente de sacarosa. La densidad de las partículas que se deben separar está comprendida dentro del rango de densidades del gradiente y, al cabo de 2 h de centrifugación, los lisosomas, mitocondrias y peroxisomas se encuentran en bandas situadas en niveles de distinta densidad. B. Ilustración de la centrifugación zonal en gradiente de densidad. La densidad de las partículas que se deben separar es mayor que la del medio. Al centrifugar, las partículas migran más o menos según su coeficiente de sedimentación. La centrifugación debe ser detenida antes de que las más rápidas lleguen al fondo. 27.e30 Biología celular biomédica En la sedimentación zonal, la densidad de las partículas que se deben separar es mayor que la densidad del medio de separación. La fracción que debe purificarse se coloca sobre la solución o gradiente. Al centrifugar, las moléculas se desplazan con una velocidad determinada por su coeficiente de sedimentación. Dado que todos los componentes tienen mayor densidad que la sustancia del gradiente, es indispensable detener la centrifugación cuando las partículas se hayan acumulado en zonas diferentes del tubo (v. fig. e2-23, B). Si la centrifugación es demasiado prolongada, todas las partículas sedimentarán en la base del tubo. Los gradientes se preparan con diferentes sustancias. La sacarosa es una de las más utilizadas, en concentraciones variables desde 5% (1,017 g/ml) hasta 50% (1,23 g/ml). El cloruro de cesio es el componente preferido para la separación de ácidos nucleicos (ADN, ARN). La centrifugación diferencial también puede aplicarse a suspensiones de células enteras. En estos casos suelen utilizarse gradientes de Ficoll, Percoll o Nicodenz.