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Proteínas
ENZIMAS
CATALIZADORES
¿Que es un catalizador?
¿Que es un catalizador?
“Un catalizador es un compuesto que aumenta la velocidadde
una reacción química sin ser destruido o incorporado al
producto” (IUPAC)
• Ejemplo:
O
H3C C OH + C2H5OH
H+
O
H3C C OC2H5 + H2O
Reacciones unimoleculares
¿Cómo se define la velocidad de reacción?
¿De qué depende?
¿Cuánto vale?
¿Cómo y cuando se calcula?
¿Qué unidades tiene?
Molar
.02 .03
Tres casos
100
 d[S ]
v
dt
pendiente de la tangente a
la curva = -D[S]/Dt
40
.01
d [ P]
v
dt
60
20
0
S→P
% S remanente
80
0
0
0
10
10
20
Tiempo (min)
20
30
30
minutos
- El Plegamiento proporciona un “andamio” que permite
a ciertos aminoácidos (catalíticos) estar en la posición
espacial adecuada para llevar acabo su función, además,
genera un medio ambiente adecuado para la captura de
los sustratos.
La posición espacial
relativa de los
elementos catalíticos
se mantiene aunque
la secuencia de
aminoácidos cambie.
TIM barrels
Cholinesterase
Dienelactone hidrolase
Lipase/Cutinase
Thioestearase
Serine Carboxypeptidase
Prolyl Imino/Oligo peptidase
Bromoperoxidase
Haloalkane dehalogenase
Fluoroacetate dehalogenase
Epoxide hydrolase
Hydroxynitrile lyase
C-C Hydrolase
2,4-Dioxygenase
Amilasa
- Flexibilidad: La “tapa” del sitio activo de algunas enzimas
presenta mobilidad.
- Sitios Alostéricos: Otros sitios pueden activar a la proteína
desde regiones alejadas del sitio activo.
- Cambios conformacionales: pueden suceder al unir un
sustrato.
Glucocinasa
Glucosamina 6-Fosfato-desaminasa
El tamaño de una enzima en relación con su función
- Aminoácidos catalíticos: Son los involucrados en la función.
- Están directamente involucrados en la catálisis.
- Ejercen un efecto en otro residuo o molécula de agua que
está directamente relacionado con la catálisis.
- Estabilizan el estado de transición.
- Ejercen algún efecto en el sustrato o cofactor que ayuda a
la catálisis.
- Aminoácidos del sitio activo no catalíticos: Participan en el
reconocimiento del sustrato y lo colocan en la orientación correcta.
Sitio Activo de la Tiamina Fosfato Sintasa
Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que
estabilizan al Pirofosfato.
Mg++
Aminoácidos
catalíticos
Arg59, Ser130,
Lys 159
Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que
estabilizan a los sustratos.
Lipases catalyse the hydrolysis of triglycerides:
O
H2C O
HC O
H2C O
O
O
R
R
H2C OH
lipase
HC OH
H2O
R
O
+ 3
HO
R
H2C OH
The active site of lipases contain 3 essential amino acids:
asp, his and ser.
Lipases have ~250 other amino acid residues. Why?
Tripeptide asp-his-ser enhances the hydrolysis rate of
triglycerides by a factor 2-10; lipases by a factor 108-1012
How do they do that?
Why are lipases such active enzymes?
• Exact alignment of the asp, his and ser side
chains
• Stabilisation of the intermediate C-O
• Ensure the correct charges @ asp, his and
ser
• Stabilise against proteolysis and
denaturation
La triada catalítica SER-HIS-ASP
Serinproteasa de
Bacillus
lentus
Ejemplo de Catálisis, una Serina proteasa
Analysis of Catalytic Residues
in Enzyme Active Sites
JMB (2002) 324, 105-121
Conclusiones:
- Los aminoácidos mayoritariamente catalíticos son histidina,
cisteina, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina.
- Están muy poco expuestos al solvente, a pesar de su
polaridad.
- Casi todos están formando puentes de hidrógeno.
- Tienen una movilidad muy baja en comparación con los
demás aminoácidos.
- La función de un aminoácido catalítico es estabilizar un
intermediario del estado de transición, actuar como nucleófilo
o ser donador o aceptor de protones.
•Catálisis: Leyes Generales de la Catálisis
•Catalizadores biológicos
•Velocidades más elevadas de reacción
•Condiciones de reacción mas suaves
•Mayor especifidad de reacción
•Capacidad para la regulación
Sin
enzima
Nivel de energía
Energía de activación
(sin enzima)
Reactivos
Con
enzima
Energía de activación
(con enzima)
Productos
(S) C12H22O13 + H2O
(G) C6H12O6 + (F) C6H12O6
Reaction equations and reaction rate
A reaction like A  B
may run via route 1;
the rate is determined by the
magnitude of Ea(1)
1
Ea(1)
2
E
3
A
B
Alternatively, the reaction runs via an intermediate, like 2.
The rate is determined by the slowest step (= the one with the
highest Ea).
Alternatively, the reaction can run via more intermediates,
like 3
Features of a catalyst:
Makes an alternative reaction path in which less activation
energy is needed.
Equally increases the rate of the back and forth reaction
reaction  catalysis has no effect on equilibrium position!
S
k1
k--1
v = k1 S – k-1P
v = 0 = k1 Seq – k-1Peq
P
Enzimática
k1/k-1 = Peq/Seq = Keq
Keq = k1/k-1
k1 = 10 min-1
k-1 =
10-1
min-1
No Enzimática
k1 = 10-3 min-1
k-1 = 10-5 min-1
¿POR QUE SUCEDE UNA REACCIÓN?
Teoría de las colisiones.
• En gas y líquidos, frecuencias muy altas:
A(g) + B(g)
A
A+B
A+B+C
@ 1 Atm y 25 C
1028 colisiones /seg cm3
menor frecuencia
de colisiones
• Explica la proporcionalidad entre velocidad y concentración
Arrhenius (1889) Sólo las que alcanzan cierto nivel de energía.
Las activadas o exitadas; sólo las que adquieren…..
T
E cinética
velocidad
de las moléculas
choques
v a S
v  kS
v  kS
n
Donde k es la constante de velocidad de reacción y n es el orden de la
reacción.
Orden y molecularidad: ¿es lo mismo? ¿Unidades de la constante de
velocidad?
Example: hydrolysis of alkyl bromides
R-Br + OH–  R-OH + Br–
(SN2 reaction)
Reaction takes place by collision of the particles RBr and
OH–, implying that the reaction rate is directly proportional
to [RBr] and [OH–].
v = k (R-Br)(OH-)
Alternative:
slow
R+ + BrR-Br
OH-
ROH + Br-
(SN1 reaction)
These are the most common reaction situations:
- bimolecular:
2 particles collide and react
- monomolecular:
1 particle dissociates or reacts
v = k1(R-Br)
k2 + R-Br
Moléculas
T2
Energía de activación
T1
Energía Cinética
k = A e -DG++/RT
ln k = ln A – DG++
RT
Las energía de activación (DG++)
de las reacciones enzimáticas son del orden
de 6000 a 15,000 cal/mol
Las energía de desactivación o desnaturalización (DG++)
de activación una enzima son del orden
de 50,000 a 150,000 cal/mol (a bajas temperaturas
son estables pero al aumentar la T rápidamente se
desactivan.
k
¿En cuanto aumenta la velocidad de reacción del proceso de
Descomposición del peróxido de hidrógeno,
H2O2
H2O + O2
si la energía de activación de la reacción natural es
de 76 KJ/mol, mientras que la reacción con catalasa es de
30 KJ/mol?
Si una reacción tiene una energía de activación de 6,000 cal/mol
y otra de 60,000 cal/mol ¿Cómo influye en cada una de ellas el
aumento de la temperatura? (cada 10oC)
Temperatura (oC)
10
0
20
40
60
Velocidad relativa Velocidad relativa
6,000 cal/mol
60,000 cal/mol
1
1.55
3.24
6.31
11.4
1
79.4
126,000
1 x 108
3.6 x 1010
El caso de la orotidina-5´-monofosfato decarboxilasa
Determination of reaction rates
Determination of the concentration of a compound (substrate,
product), as a function of time.
The method used depends on the properties of the compound.
• Chromatography
– Example:
O
O
+ H2C
OH
menthol
(racemic)
CH 3
H
vinyl acetate
Candida rugosa
lipase
iPr2O
O
O
(1R,2S,5R)menthyl acetate
+
CH 3
OH
(1S,2R,5S)menthol
GC analysis of the esterification of racemic menthol with vinyl acetate, catalysed by
Candida rugosa lipase, in diisopropyl ether as the solvent. I.S., internal standard
(decane). An enantioselective GC column is used, so the enantiomers are separated.
There is only one product peak because the reaction is stereoselective.
Another example: the chlorination of barbituric acid (1) by
chloroperoxidase from Caldariomyces fumago
O
HN
O
H
H
N
H
barbituric acid
(1)
O
chloroperoxidase
H2O2, Cl-, pH 2.7
O
HN
O
Cl
H
N
H
O
monochlorobarbituric acid
(2)
chloroperoxidase
H2O2, Cl-, pH 2.7
O
HN
O
Cl
Cl
N
H
O
dichlorobarbituric acid
(3)
t (min) 
• UV spectroscopy
•Example: chlorination of 1 by chloroperoxidase
A
Can be done quantitatively through Lambert-Beer’s law: A = e.c.d
• IR spectroscopy
•Example: oxime formation
OH
O
N
O-
H3C
+ H2N OH
H3C
O
IR (in D2O)
 max =1710 cm-1
OO
 max =1400 cm-1
Problem: not quantitative
• Polarimetry (only for chiral compounds)
•Example: hydrolysis of sucrose:
C12H22O11 + H2O  C6H12O6 +
C6H12O6
sucrose + water  glucose +
fructose
[a]D20 = +66,5°
[a]D20 = +52°
[a]D20 = –92° (together [a]D20 = –40°)
Can be done quantitatively
• Titration
• Example: ester hydrolysis
Ester + water  acid + alcohol
Excellent for quantitative
measurements; hooked
up to computer.
ml base added vs time;
slope = reaction rate
¿Que tipo de reacciones catalizan?
EC
EC
EC
EC
1._._._
2._._._
3._._._
4._._._
EC 5 . _ . _ . _
EC 6 . _ . _ . _
1ª Ley de la Termodinámica:
La energía total de un sistema y sus alrededores es constante
DE = Ef – Ei = Q (calor absorbido - W (trabajo realizado)
por el sistema)
DE = DH - P DV En sistemas biológicos DV=0
DE = DH
La entalpía es una medida del contenido de calor de una sustancia. Cada sustancia pura posee entalpía,
o sea, una cierta cantidad de energía asociada en un estado particular de P y T
Es la energía que puede ser transferida en forma de calor cuando el proceso se realiza a presión
constante.
Lo que puede determinarse es el cambio en el contenido de calor de las substancias: DH = H (final) – H
(inicial) Los signos matemáticos aplicados a los cambios en entalpía se interpretan como sigue:
DH positivo; se añade calor al sistema (proceso endotérmico)
DH negativo; el sistema libera calor (proceso exotérmico)
Por lo general, los valores de DH se reportan a 25oC y 1 atmósfera de presión. Esto es lo que se conoce
como un estado a condiciones estándar y se representa por el símbolo DHo.
El calor de reacción es el cambio en entalpía asociado a esa reacción y equivale a:
DHo reacción = SH productos – SH reactivos
NO SON CRITRIOS DE ESPONTANEIDAD
ES UN PRINCIPIO DE CONSERVACIÓN.
Es energía potencial que se libera al transformar sustratos en productos.
Reacciones endotérmicas
X*
DHd < 0
DHa > 0
Producto
Activación endotérmica
Sustrato
DHr > 0
Reacciones exotérmicas
DHr < 0 exotérmico
DHa > 0 activación endotérmica
DHd < 0 exotérmico
DHr = DHa - DHd
X*
Sustrato
DHa > 0
DHd < 0
Activación endotérmica
DHr < 0
Producto
DHr > 0 endotérmico
DHr < 0 exotérmico
Pero no es un criterio de espontaneidad de la reacción: La ley que prescribe la
dirección del flujo de energía es la segunda ley de termodinámica.
El Concepto de Entropía
• Una definición amplia de entropía es que ésta es una medida del grado de
desorden de un sistema. Esto se puede interpretar también en términos de
probabilidad: un estado de desorden es más probable que un estado
ordenado.
• El caso de la caja de canicas blancas y la de canicas negras. El calor no
fluye entre dos objetos a menos que estén a diferentes temperaturas.
DS univ = DS sistema + DS alrededores
Si DS univ > 0 El sistema procede de manera espontánea del estado “a” al
estado “b”. La entropía del universo tiende a aumentar
Si DS univ = 0 El sistema está en equilibrio y no se moverá de ahí
espontáneamente.
Si DS univ < 0 El sistema procede espontáneamente pero en la dirección
inversa, es decir de “b” a “a”
Una reacción ocurre por la tendencia a buscar un estado de mínima
energía y por la tendencia a buscar aumentar el desorden.
El Concepto de Energía Libre
El DHr es el cambio de energía que acompaña a una reacción –
medida por calorimetría-.
¿Cuál es la máxima cantidad de energía que podemos extraer de la
reacción? La Energía disponible: DG reacción
Si DG > DH o DG < DH ¿se cumple la primera ley?
1878 Gibbs: Una nueva función que resulta de la 1a y la 2a leyes:
DG = DH – TDS
El cambio de energía = cambio de energía – cambio de energía
Libre (a P y T ctes)
total
de organización
eg.
AgNO3 + HCl
AgCl (s) + HNO3
(los sólidos tienen una estructura más ordenada)
DH 15.7 Kcal/mol
DG= 13.2 Kcal/mol
DH - DG = -2.5 Kcal/mol
Esta es energía que no puede usarse para generar trabajo, pues no esta
disponible; es usada para aumentar el orden: TDS (el cambio de entropía
en el proceso es negativo)
Si DS > 0 mayor desorden
Si DS < 0 mayor orden
DG < DH (aporte entrópico a la energía disponible)
DG > DH (consumo de energía para ordenamiento)
Es la combinación de DG y DH lo que determina la espontaneidad
Criterio de espontaneidad:
DG < 0 proceso espontáneo
DG = 0 proceso en equilibrio
DG < 0 proceso no espontáneo
Para una reacción A + B
C+D
en cualquier momento:
DG = DGo + RT ln [C][D]/[A][B]
donde: DGo es la energía libre estandar (pH 7, 1atm, 25oC) y función de la naturaleza
de los reactivos.
En el equilibrio: DG = 0 de donde: DGo  - RT ln [C]eq[D]eq/[A]eq[B]eq
DGo  - RT ln Keq
DGo
Kcal/mol KJ/mol
6.82
28.53
4.09
17.11
1.36
5.69
0.0
0.0
-1.36
-5.69
-4.09
-17.11
-6.82
-28.53
Keq
105
103
101
1
10
103
105
Catálisis ácido-básica
•
La catálisis ácida general consiste en la
transferencia de un protón desde un
residuo de la enzima, que se comporta
como un ácido de Bronsted, al sustrato o
intermediarios
de
la
reacción,
disminuyéndose así la energía libre del
estado de transición
•
La catálisis básica general consiste en la
transferencia de un protón desde el
sustrato o intermediarios de la reacción
a un residuo de la enzima, que se
comporta como una base de Bronsted,
disminuyéndose así la energía libre del
estado de transición
•
Si se dan ambos tipos de catálisis se tiene
una catálisis ácido-básica concertada
Muchas reacciones de importancia
bioquimica son suceptibles a catálisis
ácido/ base: hidrólisis de peptidos y
de ésteres, del grupo fosfato,
tautomerizaciones, adiciones de
grupos carbonilo….
Tautomerización ceto-enol
a)
b)
c)
Sin catalizar
B)Catális ácida general
Catális básica general
Catálisis electrostática
•
Ocurre cuando la enzima estabiliza intermediarios o estados de transición de la reacción por
neutralización de cargas gracias a la disposición espacial en el sitio activo de residuos con carga
opuesta
•
En otros casos la distribución de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o
polares a sus sitios de unión
•
Es llevada a cabo por metaloenzimas que contienen iones metálicos fuertemente unidos (
metales de transición como Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+) o por enzimas activadas por
metal que fijan débilmente a los inoes metálicos en solución (iónes metálicos alcalinos como
Na+, K+, Mg2+ o Ca2+)
•
La funcion de los iones metálicos en la catálisis enzimática es
– Mediar reacciones de óxido-reducción
– Unir y orientar de los sustratos
– Estabilizar cargas negativas
– Promover la catálisis nucleofílica mediante la ionización del agua
Sitio activo de la anhidrasa
carbónica humana. La flecha
apunta hacia la cavidad del
sitio activo
Las moléculas ligadas
de agua, tienen un carácter
mas ácido.
Catálisis covalente
•
En este caso se incrementa la velocidad de la reacción por la formación transitoria de un
enlace covalente entre un residuo de aminoácido de la enzima y el sustrato.
•
La catálisis covalente consiste en tres estadíos sucesivos:
– Ataque nucleofílico de la enzima sobre el sustrato (formación del enlace covalente)
– Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formación del producto)
– Separación del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por
hidrólisis)
Mecanismo de reacción de la amiloglucosidasa
El más importante:
Catálisis a través de la fijación de un estado de transición a
la enzima, con mayor afinidad a la enzima que el sustrato o
el producto.
En conjunción con los mecanismos antes descritos.
La enzima distorsiona al sustrato hasta llevarlo a la geometría
del estado de transición, en la que no encajaría el sustrato sin
distorcionar.
Resumen sobre las estrategias de las
enzimas como catalizadores
Reducen la energía de activación de la
reacción.
i.
Optimizan la posición de los residuos
catalíticos respecto al sustrato.
ii. Promueven la proximidad entre
reactantes.
iii. Desestabilizan los estados basales.
iv. Estabilizan el estado de transición.
What kinds of catalysts are there around?
• Organic
• Inorganic
• Biological (biocatalyst)
Other way of subdivision:
• Homogeneous = freely dissolved in solution
– organic catalyst
– organometallic complex
– enzyme in water
• Heterogeneous = solid, in liquid or gaseous environment
– inorganic catalyst (e.g. zeolite)
– immobilised enzyme
– enzyme in an organic solvent