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Métodos espectroscópicos en bioquímica • • • • • • Sensibilidad Especificidad Complementariedad Velocidad Accesibilidad Precio Citocromo c Estructura de rayos X Lisozima Estructura de RMN Estructuras por RMN Átomos de la cadena para los residuos 72-145 de las estructuras en disolución de apo-BsCopAb (a) y Cu(I)BsCopA(73-151) (b) Representados como un tubo de radio variable proporcional al valor del desvío estándar de la posición de cada residuo. Se muestran también las cadenas laterales del Cys85, Cys88 y el ion Cu(I). J. Mol. Biol. (2002) 317, 415429 Representación esquemática de las características de las proteínas globulares que pueden seguirse durante el plegamiento. Aunque no hay una sola forma de seguir todos los detalles estructurales de un intermediario del plegamiento el uso de sondas múltiples y complementarias puede brindar una imagen detallada de la distribución de confromaciones que componen los transitorios del plegamiento Current Opinion in Structural Biology 1996, 6:630-636. Despliegue de guanilato kinasa inducido por cloruro de guanidinio medido por fluorescencia con excitación a 282 nm J. BIOL. CHEM. (1997) 272; 19343–19350 290 nm Espectros de RMN 19F del despliegue de DHFR marcada con 6-19F-triptofano al pasar de 0 a 5 M urea con mezcla rápida a 22 ºC. Intensidad de picos de resonancia asignados a W30 y W47 en la proteína desplegada. Hay una primera fase demasiado rápida para registrar con este método. Constantes de velocidad y amplitudes para el despliegue de DHFR marcada con 6-19Ftriptofano en urea 5 M. A1 k1 (s-1) A2 k1 (s-1) Fluorescencia 0.205 0.727 0.795 0.014 Dicroísmo circular 0.199 0.499 0.801 0.014 RMN: Trp 22 0.237 ND 0.763 0.010 RMN: Trp 30 + 47 0.225 ND 0.775 0.015 RMN: Trp 74 0.252 ND 0.748 0.020 RMN: Trp 133 0.438 ND 0.562 0.015 Método Espectros FTIR en la región de 1700 a 1540 cm-1. A, Proteína hp8 (no fosforilada, línea continual), y PKAhp8 (fosforilada (línea punteada). B, porcentajes calculados de estructura secundaria en las muestras no fosforiladas (barras blancas) y fosforiladas (barras negras) J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751 Intercambio de protones de amida para hp8 luego de 5 minutos de incubación con D2O a 25 ºC. J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751 Espectro Raman de elastina bovina (en sólido) en la región de 500 a 1750 cm-1 y asignaciones propuestas. Descomposición de las bandas amida I de elastinas bovinas a, BE; b, BE-K. Perfiles experimentales (línea continua) y calculados (línea punteada). Asignaciones HW, agua de hidratación; a, hélice a; b, hebra b; U, conformaciones no identificadas (giros + ovillo). J. BIOL. CHEM. (1995) 270; 26099–26103 Análisis y ajuste de los espectros de FTIR (región de amida I) registrados en 1H 0 de los péptidos g-T-5K (A) y b-T2 8K (B). En cada caso la línea continua representa los datos experimentales. El espectro ajustado (línea punteada) está superpuesto. Se presentan también las bandas de los componentes. J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771–777 a-T-4K g-T-5K Resumen de resultados de estructura secundaria derivados de dicroísmo circular: Los porcentajes se obtuvieron por descomposición espectral en espectros básicos reportados. Otra indica estructuras desordenadas o no asignadas b-T-8K (M2-M3) b-T-10K (M1-M2-M3) a-T-4K (M4) g-T-5K (M4) Hélice a 85 80 87 80 hoja b — — — — Giro b 15 20 13 11 Otra — — — 9 J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771–777 Espectros de FTIR en el tiempo y análisis cinético. (a) Espectros de absorción a tiempos de 1.1, 3.4, 5.7, 10.2, 21.6 y 103 ms. Espectro antes de mezclar (negro) con trifluoroetanol y espectro final (verde). (b) Segunda derivada de los espectros de a (líneas continuas y los resultados de un ajuste exponencial de tres estados (punteado). (c) Los tres espectros básicos resultantes del ajuste. (d) Curso temporal de los tres estados deducidos del ajuste. PNAS (2001) 98; 6646–6649 Plegamiento por NMR Superficie de energía libre (F) para el plegamiento de la lisozima. La trayectoria amarilla es una “vía rápida” en que se pueblan los dominios a y b en forma conjunta. La trayectoria roja es una “vía lenta” en que la cadena queda presa en un intermediario de vida larga con estructura formada sólo en el dominio a. Los residuos cuyos hidrógenos de amida están protegidos de intercambio con el disolvente aparecen en rojo o amarillo. Las regiones de estructura nativa se siguen por el desarrollo de protección respecto al intercambio de hidrógeno. TIBS 25 (2000); 331-339 Autoquenching Cinética de plegamiento de citocromo c en presencia y ausencia de imidazol por dilución de desnaturalizante químico. Se mide la emisión total de fluorescencia a l > 320 nm FRET TIBS (2000) 25; 631-637 Espectro visible de citocromo aa3 de P. denitrificans oxidado (a) y reducido con ditionito (b). La línea c es el espectro diferencial de la forma reducida unida a CO menos la forma reducida J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568 Espectros de resonancia raman de citocromo aa3 de P. Denitrificans reducido (a) mutante Y280H (b). Los espectros c y d corresponden al complejo con 12CO y 13CO respectivamente. El espectro diferencial 12CO 13CO aparecen en e. J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568 (A) Cobalamina(II) en solución ; (B) Complejo enzima + Cobalamina(II) (C) Complejo enzima + Cobalamina (II) + 5´desoxiadenosina Biochem. J. (2001) 355, 131-137 Tiempos de correlación Espectro de EPR del aducto MNP/Hb a partir de la reacción de Hb con peroxinitrito y comparación con los aductos MNP/péptido (A) Hb + ONOO- + MNP (C) Igual que A + 0.5 mg/mL de pronasa. (E) Péptido GGYR (10 mM) + ONOO- + MNP. Biochemistry (1999) 38; 2078-2087 Técnica Fluorescencia (i) Intrínseca (ii) unión de ANS (iii) Unión de sustrato (iv) FRET (v) Anisotropía Dicroísmo circular (i) UV lejano (ii) UV cercano Ingeniería de proteínas Escala de tiempo ns–s Ambiente de Trp y Tyr Exposición de superficie hidrofóbica Formación del sitio activo Distancias entre residuos Tiempo de correlación ns–s Depende del método de detección Dispersión de rayos X en ángulo pequeño Absorbancia (UV cercano) > ms ns–s FTIR RMN (i) (ii) ns–s tiempo real Dinámica intercambio de hidrógeno (HX) (i) Estado nativo (ii) HX Pulsado NMR (iii) HX Pulsado ESI MS Espectroscopía de fuerza atómica (AFM o tenaza ópticas) Parámetro estructural observado ms–s 250 s min–meses ms–s ms–s s Formación de estructura secundaria Formación de estructura terciaria Función de cada residuo en la estabilidad de los intermediarios y los estados de transición Dimensiones y forma del polipéptido Ambiente de residuos aromáticos y cofactores Formación de estructura secundaria Ambiente de residuos individuales Análisis de forma de líneas dan velocidades de plegamiento-despliegue en las cercanías del equilibrio Estabilidad global y estados metaestables Fomación de enlaces de hidrógeno en residuos específicos Poblaciones plegadas Fuerzas de despliegue y velocidades de despliegue de moléculas únicas TIBS 25 (2000);611-618