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ELABORACION DE AUTOVACUNAS
FRENTE A DISENTERIA
Iñaki Albizu Rafael Baselga
www.exopol.com • [email protected]
EXPERIENCIA FRENTE A DISENTERIA PORCINA
Hampson y cols en Australia (Aust. Vet. J. 70,1,18) demostraron la efectividad de las
vacunas frente a la Disentería producida por Brachyspira hyodysenteriae. Análogamente
Diego y cols en España (Vaccine, 13,7 663) también concluyeron su efectividad en animales
de cebo a través del crecimiento (tabla 1), la sintomatología clínica y la excrección de
Brachyspiras. Phillips y cols también la han demostrado utilizando como antígeno una
proteína aislada de Brachyspira hyodysenteriae.
Del mismo modo Hampson y cols (Vet Microbiol. 2000
Apr 4;73(1):75-84), también han demostrado la
efectividad de las vacunas frente a Brachyspira pilosicoli.
SEMANAS
VACUNADOS
NO VACUNADOS
1-3
150
115
3-6
371
375
6-8
141
165
8-9
117
111
9 -10
59
41
10 - 11
134
138
11 - 12
111
91
Tabla. 1 Ganancia de peso, en gramos, en cerdos
vacunados y no vacunados en el periodo de cebo
(Adaptado de Diego y cols. Vaccine, 13,7 663)
En nuestra experiencia, el uso de autovacunas es
muy efectivo (http://www.disenteria.info/opinion.html),
y además económicamente resulta muy ventajoso,
tal y como se puede comparar en
http://www.disenteria.info/coste.html, porque la
autovacuna sólo se aplica en madres, con una dosis
de recuerdo en cada parto.
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PROTOCOLOS DE APLICACIÓN
DE LAS
AUTOVACUNAS
Los protocolos de aplicación dependen de la fase en que aparezca la Disentería.
Si la DISENTERIA aparece en MADRES:
Vacunar 3 veces en sábana a todas las cerdas con tres semanas de intervalo entre cada dosis.
Vacunar de recuerdo cada 4 meses o 15 días antes de cada parto.
Incorporar este plan vacunal a la reposición.
Administrar tratamiento antibiótico en agua o pienso hasta dos semanas después de la
administración de la 3º dosis. Después, normalmente, se puede retirar el antibiótico.
Los animales mas afectados deberán recibir además tratamiento inyectado.
Si la DISENTERIA aparece en POSTDESTETE:
Aplicar el protocolo anterior en madres.
Vacunar y revacunar lechones 15 y 30 días antes de la aparición de los síntomas.
Dejar de vacunar lechones cuando estos procedan de madres que han recibido las 3 dosis.
Si la DISENTERIA aparece en CEBO:
Aplicar el mismo protocolo anterior en madres.
Vacunar y revacunar lechones en el destete y 30 días después.
Dejar de vacunar lechones cuando estos procedan de madres que han recibido las 3 dosis.
Los animales mas afectados deberán recibir tratamiento inyectado.
En todos los casos en que se usan autovacunas recomendamos
mejorar las medidas de control y bioseguridad.
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TOMA DE MUESTRAS
El diagnóstico Brachyspira hyodisenteriae y pilosicoli se hace por aislamiento a partir de
heces, colon o ileon, o hisopos rectales. Conviene tomar heces de 4-5 animales de un
mismo parque en un sólo bote y enviar muestras de 3-4 parques. El diagnóstico se puede
demorar hasta 21 días por la dificultad de eliminar contaminaciones con Campylobacter u
otras Espiroquetas.
COMO SE HACEN
LAS
AUTOVACUNAS
Los tiempos del protocolo indicado son aproximados porque no todas las cepas de
Brachyspira hyodysenteriae y/o pilosicoli necesitan el mismo tiempos de crecimiento.
Además, en muchos de los pasos no lo indicamos porque son procesos que sólo llevan
unas horas y que pueden, o no, realizarse en un mismo día.
Al recibir un pedido por fax, teléfono o a través de la web
se pide confirmación firmada al veterinario, ya que una
autovacuna necesita una receta como cualquier otro
medicamento veterinario.
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ELABORACION
DE AUTOVACUNAS
DIA 1
Vial de congelación. Las cepas se guardan
congeladas e identificadas en viales de
congelación durante al menos 5 años.
Cuando el veterinario nos solicita una autovacuna, descongelamos
la cepa conservada y la sembramos en medios de crecimiento
sólidos. Muchas veces las bacterias acaban de ser aisladas porque
las muestras se han enviado con el propósito de elaborar una
autovacuna y evitamos el tiempo empleado en descongelar las cepas.
La gran mayoría de las cepas congeladas crecen en 48-72 horas y
podemos visualizar las colonias en agar sangre como una beta
hemólisis característica. Se comprueba que el inóculo incial que se
emplea no está contaminado y es una Brachyspira.
El mismo día preparamos y esterilizamos un pequeño volumen de
crecimiento, el cultivo iniciador, que servirá para iniciar el cultivo final
y un volumen de medio de crecimiento suficiente para fabricar las
dosis solicitadas, aunque la concentración final de antígeno se
estandariza después de realizar el recuento final de bacterias. Estos
medios de crecimiento llevan suplementos muy especializados que no
se esterilizan con autoclave.
Para iniciar la vacuna se utiliza el crecimiento de una cepa de
Brachyspira hyodysenteriae en agar sangre y un caldo de cultivo
especialmente diseñado para su crecimiento.
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DIA 3
La cepa de Brachyspira se
recoge con un asa de siembra
para inocular un volumen de
100 ml de caldo de cultivo.
Se inocula una suspensión del cultivo original en sólido al cultivo
iniciador. Para ello una masa de bacterias del cultivo inicial en agar
sangre se siembra en el medio líquido. El medio se incubará a 37º C.
durante 48 horas en anaerobiosis.
Para conseguir que una bacteria crezca en anaerobiosis (ausencia
de oxígeno) tenemos que eliminar el oxígeno no sólo del ambiente
donde multiplicamos la bacteria sino también del medio líquido en el
que crecerá.
Inoculación del caldo de cultivo con
la cepa de Brachyspira recogida de
la placa de agar sangre.
Las botellas
inoculadas
se incuban a
42ºC
durante 2448 horas.
Detalle de la cepa de Brachyspira recogida
con asa de siembra sobre agar sangre
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Cultivo de
Brachyspira en 100
ml de caldo de
cultivo tras 24-48
de incubación a
42ºC. Obsérvese la
turbidez.
DIA 5
El cultivo iniciador se utiliza para iniciar el cultivo final en el
volumen total necesario.
Botella con crecimiento de Brachyspiras (izda) comparada
con una botella sin inocular. Se observa turbidez y cambio
de color del medio, indicadores de un crecimiento masivo y
abundante que se cuantificará mediante citometria de flujo.
1400000000
1200000000
En las primeras horas después de la siembra las
bacterias se multiplican de un modo exponencial cada
pocas horas, justo hasta que consumen la mayoría de
los nutrientes del medio. En la gráfica se ve como el
número de bacterias aumenta muy rápidamente.
Cuando la mayoría de los nutrientes han sido
consumidos la velocidad de multiplicación es mucho
menor, pero es ahora cuando en muchas especies
bacterianas aumenta la producción de exopolisacáridos
bacterianos.
1000000000
Serie1
800000000
Serie2
600000000
Serie3
400000000
200000000
En nuestro caso es importante determinar el
momento en el que se inactiva el cultivo porque
tenemos que maximizar el crecimiento de la
Brachyspiras y al mismo tiempo impedir que las
bacterias que comienzan a degradarse contaminen el
medio con ADN y proteínas intracelulares.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
Gráfica: Crecimiento de bacterias y producción de exopolisacáridos.
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DIA 7
Inactivamos las bacterias añadiendo formalina al medio de
crecimiento donde se han multiplicado y dejamos que el formol actúe
durante otras 18-24 horas antes de comenzar con la purificación de
los antígenos. Antes de inactivar el cultivo nos aseguramos de la
pureza y ausencia de contaminación del cultivo.
Observación en microscopía de campo oscuro
del cultivo de Brachyspiras. Permite verificar la
ausencia de otras bacterias y comprobar la
vitalidad.
DIA 8
Después de la inactivación y utilizando una alicuota hacemos el
recuento total de las bacterias mediante citometría de flujo. Esto nos
permite ajustar las concentraciones bacterianas de modo que en las
autovacunas utilizamos cantidades análogas y reproducibles de
antígeno.
En el protocolo de Disentería separamos parcialmente los
exopolisacáridos de los cuerpos bacterianos. Por un lado
concentramos los cuerpos bacterianos mediante filtración tangencial y
lavamos las células descartando proteínas, restos de ADN, restos
metabólicos, etc. Por otro lado procesamos los exopolisacáridos
bacterianos siguiendo los protocolos ya descritos (Vet Microbiol 1994
Apr;39(3-4):195-204).
Recuento de bacterias en citómetro.
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LIPOSOMAS
Los liposomas son pequeñas vesículas de
lípidos que incorporan en su interior
(hidrosolubles) o en su membrana
(liposolubles) los antígenos con los que se
mezclan.
Los liposomas de la autovacuna se han fabricado
independientemente. Los liposomas son pequeñas vesículas de
lípidos que después de la liofilización encerraran en su interior el
antígeno purificado de las Brachyspiras. Los liposomas se elaboran
con una mezcla de lípidos que se conserva congelada.
Antes de la liofilización mezclamos los liposomas con una
suspensión de antígeno, que liofilizamos. En la liofilización
congelamos la muestra y extraemos el agua, de modo que los
liposomas se rompen. Al resuspender la autovacuna, los liposomas
se cierran de nuevo incorporando el antígeno en su interior.
El proceso de elaboración de los liposomas se ejemplifica
aquí. Las vesículas de lípido se rompen en la liofilización
y al reconstituirlas con agua atrapan al antígeno.
Liofilizador trabajando. En su interior se observan viales con
liposomas liofilizándose.
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ELABORACION
DE AUTOVACUNAS
DIA 10
Los viales se retiran del liofilizador y se confirma que están bien.
Se hacen los ensayos para confirmar la ausencia de contaminación.
La autovacuna se envía
liofilizada, lo que facilita su
conservación.
El producto final se ensaya en diferentes medios para
confirmar la total ausencia de contaminación.
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Recepción
del pedido
(telefono,
web)
Preparación
estéril
de liposomas
Preparación
del medio de
crecimiento
en
volúmenes
adecuados
Descongelación
de cepas
AUTOVACUNAS FRENTE A DISENTERIA
Receta
Veterinaria
Multiplicación
bacteriana, inicial
Día 3
Día 4
Multiplicación
bacteriana final
Día 5
Día 6
Control de
calidad
Día 7
Inactivación
Recuento de bacterias
Citometría de Flujo.
Estimación de la carga
antigénica. Ajuste
al número de dosis.
Mezcla de los
liposomas con los
exopolisacáridos
capsulares
Día 1
Día 2
Separación de los
exopolisacáridos
capsulares
Liofilización
de la mezcla
Día 8
Separación
de los
cuerpos
bacterianos
Envasado
bacterina
Día 9
Producto
acabado
Día 10
Fin Control
Calidad
Día 11
.
Día 15
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