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ANTIBIOGRAMAS EN DISENTERIA
Aleida Villa Espinosa, Rafael Baselga, Ana Fernández, Elena Gracia, Iñaki Albizu
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ABRIL 2005
DETERMINACION
DE SENSIBILIDAD
Para determinar la sensibilidad a los antibióticos se utiliza:
Difusión en agar con discos
Se utiliza para determinar la sensibilidad de bacterias aerobias de
crecimiento rápido y, en condiciones estándar, el diámetro del halo de
inhibición es inversamente proporcional a la Concentración Mínima
Inhibitoria (MIC). Los resultados son orientativos, es cualitativa y no
es válida para Brachyspiras.
Prueba de las diluciones (MIC)
Antibiograma en agar Mueller
Hinton incubado a 37º C 18 h.
Los discos contienen diferentes
concentraciones de antibióticos
que difunden al medio
impidiendo el crecimiento
bacteriano.
La MIC es la menor concentración de antibiótico en la que no hay
crecimiento. La forma adecuada de expresar la MIC es refiriéndose al
50% (MIC50) y al 90% (MIC90) de las cepas ensayadas (mínimo 50
cepas) y es la concentración a partir de la cual el 50% (o el 90%) de
las cepas no crecen. Pone de manifiesto el grado de resistencia de la
población, la sensibilidad de cada especie y de cada cepa.
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ABRIL 2005
CRITERIOS
DE UTILIZACION DE LOS ANTIBIOTICOS
Los antibióticos a los que las bacterias son medianamente sensibles, no se deben utilizar,
a no ser: (1) que normalmente alcancen mayor concentración en el foco de infección, o (2)
que no se disponga de otro agente antimicrobiano, en cuyo caso se deben administrar las
mayores dosis posibles.
1
2
3
Sensible: Cuando el microorganismo infectante se inhibe por las
concentraciones que un antibiótico alcanza en los tejidos administrado a las
dosis usuales. Un microorganismo es considerado sensible si la MIC de este
es inferior a la mitad de la concentración media alcanzada en la sangre, o es
inferior a la cuarta parte de la cifra media de las concentraciones máximas.
Medianamente sensible: Si el microorganismo sólo es inhibido por las
concentraciones que el antibiótico alcanza en la sangre o en los tejidos cuando
se administra la mayor dosis posible del mismo
Resistente: Si el microorganismo no resulta afectado por las concentraciones
que normalmente se alcanzan en el organismo, y son toleradas por él.
Estos conceptos establecen una relación entre la concentración que los distintos fármacos
alcanzan en los tejidos y la MIC, la cual constituye el parámetro de referencia para
determinar la sensibilidad.
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ABRIL 2005
RESULTADO CLINICO
Los resultados pueden ser no válidos para pronosticar el resultado clínico:
a
Factores dependientes de las bacterias:
Es posible "in vivo" las bacterias sean más sensibles porque pierdan factores
de virulencia.
b
Factores dependientes del hospedador:
Es posible que las bacterias sensibles no resulten afectadas debido a su
localización intracelular, su fase metabólica, presencia de pus, o productos de
necrosis, etc.
c
Factores dependientes del fármaco:
Se incluyen: la administración de dosis insuficientes, la utilización de una
vía de administración incorrecta, el empleo de un fármaco no apropiado, la
inactivación del fármaco, tanto in vivo como in vitro y la escasa penetración
del fármaco en los tejidos, debida a la existencia de barreras fisiológicas o
de extensas zonas de necrosis.
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ABRIL 2005
ANTIBIOTICOS SELECCIONADOS
DIGESTIVOS EN CEBO*
ANTIMICROBIANO
L.
Intracellularis.
B.
Hyodysenteriae
PARA EL
B.
Pilosicoli
CONTROL DE LOS PROCESOS
C.
Perfringens
E. coli
Salmonella
sp.
Yersinia
Tilosina
B
M
mod.
B
M
M
M
Lincomicina
B
mod
B
B
M
M
M
Tiamullina
B
B
B
B
M
M
M
Valnemulina
B
B
B
B
M
M
M
Clortetraciclina
B
M
M
M
M
mod
mod
Espectinomicina
B
M
M
M
mod
mod
mod
Apramicina
M
M
M
M
B
B
B
mod
M
M
M
B
B
B
Sulfamidas/Trimetropin
M
M
M
mod
B
B
B
Amoxicilina
M
M
M
B
mod
M
mod
Penicilina
M
M
M
B
M
M
M
Neomicina
B. Bueno, M. Malo, mod. Moderado
*(Burch, D.G.S., http://www.octagon-services.co.uk/articles/ileitis.pdf)
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ABRIL 2005
ABSORCION RELATIVA, O CONCENTRACIONES INTESTINALES
DE VARIOS ANTIBIÓTICOS*
ANTIMICROBIANO
ABSORCIÓN
APROXIMADA
Lincomicina 110 ppm
Moderada (50%)
Lincomicina 220 ppm
Tiamulina 110 ppm
CONCENTRACIÓN
EN ILEON (µG/ML)
CONCENTRACIÓN
EN COLON (µG/ML)
48
35
25
101
Alta (>90%)
2.8
Tiamulina 220 ppm
Valnemulina 75 ppm
8
Alta (>90%)
-
Valnemulina 200 ppm
1.7
5.2
Tilosina 100 ppm
Baja (<20%)
-
50
Clortetraciclina
Baja (<20%)
-
-
Espectinomicina
Baja (<20%)
-
-
Apramicina
Baja (<20%)
-
-
Neomicina
Baja (<20%)
-
-
*(Burch, D.G.S., http://www.octagon-services.co.uk/articles/ileitis.pdf)
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ABRIL 2005
ESQUEMA DE TRABAJO CON BRACHYSPIRAS
Esquema de trabajo para determinar la sensibilidad de
Brachyspira sp. a los agentes antimicrobianos utilizando la
prueba de las diluciones y lectura en Citometría de Flujo.
En las placas de ensayo de 96 pocillos de un ml de capacidad se ponen los
medios de crecimiento (1 ml; BHI con 10% de Suero Fetal Bovino) donde se
multiplicarán las Brachyspiras.
En otras microplacas de 96 pocillos se preparan las 8 diferentes concentraciones
decrecientes (1/2) de cada antibiótico (Lincomicina, Tiamulina, Tilosina,
Valnemulina).
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ABRIL 2005
Los antibióticos concentrados se añaden a
las microplacas donde se prepararan las
diluciones de los antibióticos.
Las diluciones dobles de los antibióticos se realizan pasando
consecutivamente 150µl con una pipeta multicanal a otro pocillo con 150µl
del medio de crecimiento sin antibiótico. La placa con las diferentes
concentraciones de antibiótico queda lista. En cada placa se dejan pozos
control con medio sin antibiótico para los controles de pureza y la
evaluación del crecimiento de la población a 0 y 48 h.
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ABRIL 2005
Las diluciones de antibiótico preparadas se
traspasan a las placas de ensayo.
En cada pocillo de
las placas de ensayo
tenemos una
concentración y un
antibiótico diferente,
tal y como se van a
ensayar.
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Las cepas se
preparan a partir
de un cultivo de
48 horas a 42ºC
en agar
Columbia.
ABRIL 2005
Se deposita 1,5
ml de BHI sin
suero sobre las
placas con los
cultivos antes de
recoger las
bacterias con el
asa sobre las
áreas de
hemólisis.
La suspensión bacteriana se mezcla bien y
se distribuye en los microtubos de las placas
de ensayo.
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ABRIL 2005
Las placas de
ensayo se incuban
en anaerobiosis
para permitir el
crecimiento de las
Brachyspiras.
Se confirma la pureza
del inóculo a partir de
uno de los microtubos
de control.
Para realizar la lectura objetiva de los pocillos, las bacterias que se han
multiplicado se diluyen en PBS antes de contarlas en el citómetro. Un
citómetro cuenta el número de bacterias presentes en un vólumen
determinado al hacerlas pasar por un microcapilar.
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ABRIL 2005
La lectura de los datos se realiza en un citómetro de flujo de un
modo totalmente objetivo, comparando el crecimiento y viabilidad de
las bacterias en cada uno de los pocillos (un pocillo por cepa y
dilución de antibiótico) y su viabilidad con el crecimiento y viabilidad
promedio que se obtiene en los pocillos control.
El citómetro lee cada una de las bacterias
presentes en el medio de crecimiento (cada
punto es una bacteria) y además de contarlas
para estimar su concentración, utilizando Ioduro
de Propidio como marcador estima su viabilidad.
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ABRIL 2005
ANTIBIOGRAMA FRENTE A BRACHYSPIRAS
Aislamiento: Brachyspira hyodysenteriae
Antibiograma: Se utilizó un método cuantitativo de microdilución en caldo BHI
enriquecido con el 10% de Suero Fetal Bovino y se analizo por Citometría de Flujo
después de 48 horas de incubación a 42ºC frente a un panel de 4 antibióticos y 8
diluciones de cada uno de ellos.
Punto de corte: El punto de corte estimado corresponde al 50% de inhibición del
crecimiento contra el control de la misma cepa sin antibiótico.
CONCENTRACIONES ENSAYADAS EXPRESADAS EN µG/ML:
1
2
3
4
5
6
7
8
Lincomicina
64
32
16
8
4
2
1
0,5
Tiamulina
4
2
1
0,5
0,3
0
0,1
0
256
128
64
32
16
8
4
2
4
2
1
0,5
0,3
0
0,1
0
Tilosina
Valnemulina
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ABRIL 2005
RESULTADOS
SENSIBILIDAD IN VITRO:
ANTIBIÓTICO
ATB A
Sensible
ATB B
Sensible
ATB C
Sensible
ATB D
Sensible
Todos los antibióticos son capaces
de inhibir el crecimiento de las
bacterias en alguna de las
concentraciones ensayadas
Sensibilidad Clínica: Valor obtenido en la menor concentración por debajo del punto de
corte (50% de inhibición) multiplicado por 3. Este valor se compara con las
concentraciones que se alcanzan en intestino.
Valor
punto
SENSIBILIDAD CLÍNICA:
de corte
Concentración
intestino
en
A
16
34,51
B
<0.031
2,16
C
32
N.D.
D
<0.031
1,68
CONCLUSIONES: La cepa estudiada no presenta ninguna resistencia frente a ATB B y
el ATB D, mientras que tanto frente a la ATB A como frente a ATB C podemos sospechar
que estamos muy cerca del límite de sensibilidad clínica.
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