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Árbol de la Biotecnología
¿Cuál es la relación entre
Biotecnología y la Genética?
• La Biotecnología moderna considera la
aplicación comercial de organismos vivos y
sus productos, a través de la manipulación
deliberada de sus moléculas de ADN y
genes mediante ingeniería genética.
Aplicaciones de Ingeniería
genética para biotecnología
Proteínas
recombinantes
Terapia
génica
Animales y
plantas
transgénicos
Modificación
genética de vías
Ingeniería
genética
metabólicas
vacunas
Temario general
• Bases moleculares de la genética
• Técnicas de Ingeniería Genética
• Aplicaciones de Ingeniería Genética
Proceso de expresión de los genes
= información
= mensaje
= función
CONCEPTO MOLECULAR DE GEN
Promotor
Gen
Terminador
DNA
RNA polimerasa
mRNA
polipéptido
Existen 20 aminoácidos naturales
que forman las proteínas
PROTEÍNA
mRNA
(AGGCUUAGACCGAGU, etc)
¡ TRADUCCION
USANDO EL
CODIGO
GENETICO !
Proteínas
(Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu, etc)
OPERÓN BACTERIANO
• Conjunto de genes vecinos y que se
transcriben juntos, bajo la orden de un
promotor.
• Todos los genes de un operón participan en
una misma vía metabólica.
• Por ejemplo, genes del operón lactosa
(codifican para enzimas de la degradación
del azúcar lactosa).
Operón bacteriano
RNA
polimerasa
Gen 1
promotor
gen 2
gen 3
terminador
1 solo mRNA
Tres proteínas
diferentes que
participan en la
degradación del
azúcar lactosa
-galactosidasa
permeasa acetilasa
Genes de
eucariontes son
interrumpidos
por secuencias
no codificantes
(intrones)
Transcripción
mRNA
maduro
PROCESO DE EXPRESIÓN GÉNICA: DIFERENCIAS
ENTRE PROCARIONTES Y EUCARIONTES
PROCESO DE EXPRESIÓN GÉNICA:
DIFERENCIAS ENTRE PROCARIONTES Y
EUCARIONTES
Procariontes
• Transcripcion y
traducción en el mismo
compartimento
• Transcripción y
traducción acopladas
• Genes organizados en
operones
• No existen intrones en
procariontes
Eucariontes
• Transcripción nuclear y
traducción citoplasmática
• Transcripción y
traducción separadas en el
tiempo
• Genes individuales
• Genes interrumpidos por
intrones
Técnicas de Ingeniería Genética
Endonucleasas de restricción
• Son enzimas que rompen el enlace fosfodiéster del
DNA (endonucleasas), producidas por bacterias
• Reconocen secuencias de nucleótidos específicas
en el DNA, de tamaños que oscilan entre 4 y 8
pares de bases
• Forman parte de un sistema de modificaciónrestricción de las bacterias , utilizado para
defenderse de la invasión de DNA exógeno (restos
de DNA, virus, etc)
Endonucleasas de restricción
permiten fragmentar el DNA
Secuencias de
reconocimiento
son palíndromes
Generan extremos
cohesivos o romos
Otras
enzimas de
restricción
ELECTROFORESIS DE DNA: TÉCNICA PARA LA SEPARACIÓN
DE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMAÑO
Electroforesis en geles de agarosa para separar
fragmentos de DNA de acuerdo a su tamaño
Gel de agarosa
(-)
Cámara de electroforesis
(+)
Los fragmentos mas
pequeños migran mas
rápido en el gel, los mas
grandes lo hacen mas
lentamente.
Mapa de
restricción
Ordenamiento
de los sitios de
restricción en
un fragmento
de ADN
Los fragmentos de
DNA producidos
por corte con una
misma enzima de
restricción pueden
ser ligados para
formar moléculas
de DNA
recombinante !!
Clonamiento de un gen
• Para clonar un gen o un fragmento de DNA
en general, se requiere introducirla en una
molécula “vector”.
• Un vector en ingeniería genética, es una
molécula que sirve para transportar a otra
hasta el interior de una “célula huésped”.
¿Cuáles son los vectores mas
comúnmente usados?
• Plasmidos (DNA extracromosomal
existente naturalmente en bacterias y
levaduras, que se replica autónomamente)
• Virus bacterianos (bacteriófagos), o virus
animales.
Los plasmidios son DNA circulares
extracromosomales que se replican en
forma autónoma
Uso de vectores para el clonamiento de un
fragmento de DNA
Célula huésped
Fragmento de DNA en un
vector de clonamiento
cromosoma
División celular
Al dividirse las células, también se duplica el DNA
clonado en el vector, lo que permite propagar y
amplificar la cantidad de DNA clonado
Transformación de bacterias con
DNA plasmidial
Sin embargo el procedimiento de transformación no es
100 % eficiente, por lo tanto se requiere un método para
seleccionar e identificar las bacterias realmente
transformadas con el plasmidio
12 h a 37 ºC
Crecimiento de colonias de
bacterias resistentes al
antibiótico, que por lo tanto
tienen el plasmidio
Clonamiento
de DNA en
un plasmidio
Características de un vector de clonamiento
Sitios de corte por enzimas
de restricción
Gen de resistencia a
ampicilina
Origen de
replicación
Gen de resistencia a
tetraciclina
Usos de un DNA recombinante
Generar copias de un gen o
fragmento de DNA
Producir la proteína producto de un gen
clonado
•Construir bancos de genes
•Estudiar la proteína
•Secuención
•Producción de proteínas
recombinantes para biotecnología
(hormonas, vacunas, enzimas de
uso industrial, etc)
•Mutagénesis
•Terapia génica
Bacteriófagos como vectores
de clonamiento
CELULAS USADAS COMO HUESPEDES
DE CLONAMIENTO
1. Células procariontes:
 Ventajas: crecimiento rápido, cultivo barato, fisiología
y genética bien conocida.
 Ej: Escherichia coli, Bacillus subtilis
2.
Células eucariontes:
 Ventajas: estas células realizan modificaciones posttraduccionales (ej. Fosforilaciones y glicosilaciones) que
son importantes para la actividad de muchas proteínas de
eucariontes.
 Ej. Levaduras, hongos, células de mamíferos en cultivo,
células de insecto en cultivo.
Formas de introducir DNA
exógeno en células huesped
• Transformación por electroporación en
bacterias y en células eucariontes
• Infección en el caso de vectores virales
• Biobalística en el caso de plantas
• Fusión de liposomas en eucariontes
• Microinyección directa al núcleo
El problema: ¿Cómo es posible identificar y
aislar un gen determinado desde un genoma que
contiene miles de genes?
Gen X
Desnaturación de DNA
Hibridización de DNA: Dos moléculas de
ácidos nucleicos de una hebra que tienen
secuencias complementarias pueden hibridizar:
formando un complejo de doble hebra estable.
¿ Qué características debe
tener una sonda de Ácidos
Nucleicos ?
• Una sonda debe tener
complementariedad de bases con el DNA
blanco
• Puede ser de un organismo relacionado una sonda heteróloga.
Otra forma de obtener una sonda:
Traducción reversa de la secuencia de
aminoácidos de una proteína
Hibridización de DNA
Sonda de
DNA marcada
Marcación radiactiva de DNA
para generar “sondas”
Desnaturación (90-100ºC)
partidor
+
Rx de síntesis de DNA (DNA
polimerasa
dATP, dGTP, dTTP, dCTP (32P)*
* * *
+
SONDA
“Southern blotting”
La técnica de Southern blot
sirve para identificar genes
Electroforesis de DNA
genómico de diferentes
cepas de Clamydomona
Resultado de la
hibridización del DNA con
una sonda para un gen X
Resultado: sólo algunas de estas cepas tienen el gen X
El problema: ¿Cómo es posible identificar y
aislar un gen determinado desde un genoma que
contiene miles de genes?
Gen X
Clonamiento de un gen
X desde un genoma
Genoteca:
conjunto de clones
que contienen la
totalidad de un
genoma
Cada colonia
representa un
clon de
bacterias
genéticamente
idénticas.
Cada colonia es un conjunto de
bacterias que tienen el mismo
fragmento del genoma clonado
Identificación de un clon que contiene
Sonda
el gen de interés
Genoteca
radiactiva
Reacción
de
hibridiza
ción
autorradiografía
Creación de una genoteca
de cDNA
Genotecas de cDNA:
Se usan para clonar genes de
organismos eucariontes, para
aislar sólo las partes
codificantes de genes
(exones).
Métodos de secuenciación
• Basados en la reacción de síntesis de DNA por
una DNA polimerasa en presencia de un
partidor.
• Objetivo: determinar la secuencia de
nucleótidos en el DNA.
• En la síntesis se incorpora desoxinucleótidos
(dNTP).
• Uso de un análogo de nucleótido
didesoxinucleótidos (ddNTP).
• Análisis de los productos de la reacción
mediante electroforesis en acrilamida
didesoxinucleótido
Partidor marcado
radiactivamente
DNA clonado
El DNA clonado, ¿es o no
el gen que me interesa?
Identificación de la
secuencia del DNA clonado
ACGTGGAGCATGGTC
ATTAACGTAACGATC
GATCGAGGCATGCG
¿ Hay similitud con otras
proteínas que tengan la
función de la proteína de
interés?
No
Si
Predicción de la secuencia
de aminoácidos, de acuerdo
al código genético
Comparación con
secuencias almacenadas en
los bancos de datos
Expresión para producir
la proteína
Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)
Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)
Si el gen que que
quiero aislar está en
el DNA cromosomal
Fragmento que se
desea aislar
REQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE
PCR
• Una secuencia de DNA "blanco".
• Dos oligonucleótidos sintéticos, complementarios a
los extremos del DNA blanco que se desea
amplificar
´5'
3'
3'
5'
• Una enzima DNA polimerasa termoestable
• Los cuatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP).
Aplicaciones de la técnica de
PCR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Aislamiento de genes DNA para aplicaciones en
clonamiento
Diagnóstico de infecciones virales, bacterianas o
parasitarias
Diagnóstico de enfermedades genéticas,
Identificación de individuos,
Análisis forense,
Monitoreo ambiental
APLICACIÓN
DE PCR EN
MEDICINA
FORENSE
Un vector de expresión: usado para
producir proteínas recombinantes
Tu gen favorito
operador
Por qué se requiere un sistema con
promotor regulado?
La sobreexpresión de una proteína impone un
estrés metabólico a las células, bajando la
velocidad de crecimiento.
Algunas proteínas recombinantes pueden ser
“tóxicas” para las bacterias.
Por lo tanto, se requiere separar la fase
de crecimiento de las células huéspedes de
la fase de expresión del gen heterólogo.
El sistema de control del operón LAC
(Promotor/Operador) es uno de los mas
usados para la expresión regulada de PR
PLAC OLAC
Tu gen favorito
Terminador
IPTG = Isopropil -D galactósido
Análogo de la lactosa
N de céls/ml
Prot recombinante
IPTG
tiempo