Download Genetic Technologies: Amplifying, Modifying, and Monitoring DNA

Genetic Technologies:
Amplifying, Modifying,
and Monitoring DNA
KARINA ROSARIO, PAOLA SANTIAGO,
LUIS A. QUIÑONES, MANUEL CINTRON, PEDRO RIVERA
Objetivos

Describir biotecnología y sus aplicaciones

Mencionar como se patenta el ADN y sus implicaciones

Explicar la técnica de amplificación de ADN

Explicar que es ADN recombinante y como se utiliza

Describir animales transgénicos y su uso

Explicar el monitoreo de expresión de genes

Explicar la técnica de silenciar genes
¿Qué es la Biotecnologia?

Uso o alteración de moléculas y/o células para
aplicaciones especificas

Aplicaciones de la biotecnología:
- la creación de organismos transgénicos
- fermentación de vinos
- creación de diferentes medicamentos
-Ej: insulina
Patentizar ADN

Que es una patente?
- derecho de un inventor a proteger su producto
- otorgado por el gobierno
- dura 20 años

Que es patentable?
- debe ser nuevo, útil y no obvio
- Ej: “Un planta de maíz que produzca una proteína que
se encuentra naturalmente en habichuelas verdes, pero
no en maíz”
Patentizar ADN

Para poder patentizar ADN:
- útil como herramienta de investigación
- un producto novel
- un producto mejorado

“The Patent Thicket”
- es un conjunto de patentes
- requiere las licencias de las varias patentes en la red
- compañías que patentan cada SNP o fragmento de
ADN
Patentizar ADN

Problemas éticos que se enfrentan al patentizar ADN:
- baja accesibilidad
- costo alto en dinero
- la clase alta es favorecida
- la clase baja se afecta

“Myriad Case”
- BRCA1y BRCA2 genes
- implicaciones eticas
Patentizar ADN

Tres propuestas:
- “Prohibir la patentes entre las asociaciones de
secuencias de ADN y las enfermedades”
- “Permitir que se patente el ADN solo para uso en
pruebas diagnosticas”
- “Exento a los doctores y investigadores de litigación si
usan secuencias de ADN patentadas”
Amplificación del DNA
¿Como se puede amplificar el DNA?

Polymerase Chain Reaction (PCR)
 Produce
grandes cantidades de secuencia
específica de DNA
 Basado
 Kary

en proceso de Replicación de DNA
Mullis (1983)
Tecnología de DNA Recombinante
Amplificación del DNA
¿Cuales son los requisitos para usar PCR?
1.
Elegir secuencia de DNA específica
2.
“Primers”
3.
Nucleótidos (“Building Blocks”)
4.
DNA polimerasa resistente a altas temperaturas
•
Ej. Taq1
Proceso de PCR
Amplificación del DNA
¿Cuales son algunas aplicaciones del PCR?

Ciencias Forenses
 Establecer relaciones sanguíneas
 Identificar restos en una escena de crimen
 Ayudar a condenar o exonerar un acusado

Ciencias Naturales
 Amplificar el DNA o RNA de patógenos a niveles
detectables
Amplificación del DNA
¿Cuales es la ventaja y desventaja del PCR?

Ventaja
 Trabaja hasta con muestras crudas de secuencias
raras y viejas

Desventaja
 Alta sensibilidad puede resultar en un falso positivo si
la muestra esta contaminada
DNA recombinante

Añadir un gen

“Cloning”

Febrero 1975, 140 biólogos moleculares
Construyendo moléculas de DNA
recombinante

Requiere enzimas restrictivas

Como se logra la molécula:

DNA extranjero

Gen de interés

Transcripción del gen extranjero

Traslación de su producto

Colectar y purificar
Construyendo moléculas de DNA
recombinante


“Sticky ends”

Complementarios

Puentes de hidrogeno

Tijeras
Vectores clonados

Natural

Molécula
recombinante

Tamaño en kilo-bases
Creación del DNA recombinante

Cortar el DNA donador

Plásmido isolado y
cortado

Se mezclan formando los
puentes de hidrogeno y
“sticky ends”
Aislando el gen de interés

“Genomic Library”

Fragmentos de DNA

Intrones

Codifica tRNA y rRNA

Sonda de DNA- pedazo de DNA complementario que
puede unirse a moléculas radioactivas y fluorescentes.

cDNA

Sustituyente

Librería de genes codificantes de proteínas

mRNA en células diferenciadas
Realización del cDNA

Extracción del cDNA de
mRNA

Hebra complementaria

Sintetizan hebras de
cDNA con RNA

Se forma la doble
cadena
Seleccionando moléculas
recombinantes de DNA

Complejidad

Identificar y separar células con gen de interés

Puede resultar en lo siguiente:

Carecen del plásmido

Poseen plásmido pero no el gen extraño

Poseen plásmido y gen extraño deseado
Seleccionando moléculas
recombinantes de DNA.

Estrategias para distinguir si la bacteria posee o
no el plásmido y el gen extraño

Gen resistente antibiótico

Reacción de cambio en color

Color azul
Productos de DNA recombinante

Insulina

51 aminoácidos/ difiere en 2

Diabetes melitus

Interferón β-1b y tPA

Mahones azules

E. Coli
Animales transgénicos

Alterados genéticamente

Célula es introducida y replicada

Altera funciones en su sistema

Ejemplo: Vacas

Anticuerpos humanos

Afectan el promotor

Promotor regula la transcripción

Producción de leche
Introducir DNA a células animales

Aberturas tracendientes en membrana plasmática

Liposomas cargan DNA, son atrapados en la membrana
plasmática

Sacudidas de electricidad para entrada

Agujas microscópicas

Partículas de metal recubiertas con el material genético
Animales como modelo

Drogas combaten o no

No pueden ser animales transgénicos

Posibilidad de que empeore la condición

ALS en perros
Bioremediación

Organismos metabolizan sustancia que para otros es
una toxina

Arbusto de Australia

Arboles amarillos transgénicos poplares

TNT (trinitrotolueno)
Monitoreo de función de genes

Situaciones específicas
 Enfermedades
 Heridas
 Exposición

a factores ambientales
“Microarray”
 Análisis
del “microarray” es computarizado
“Microarray”
Applicaciones

Estudios a bases de genes
 Enfermedades
 Cáncer

 Enfermedades
mentales
 Enfermedades
infecciosas
Clasificación
“Silencing” DNA

Beneficioso

Oncogenes y enzimas que controlan maduración

Tres métodos:

RNA “interference”

“Antisense Sequences”

“Knock-outs from Genes Targeting”
RNA “interference”

2006, Premio Nobel de Fisiología o Medicina

Cadenas de doble hebra de RNA entran en células y se
separan en cadenas simples. Una de ellas se enlaza al
mRNA e impide que este se traduzca.

“Small Interfering RNA's” (siRNAs)
RNA “interference”
Antisense Sequences

Silencia mutaciones que provocan que los exones se eliminen
de cadenas maduras de RNA.

Morfolinos (20-25 bases de DNA) que actúan como
secuencias complementarias suplentes.

Se enlazan a los complementos, no permiten que se lleve a
cabo el “splicing” de exones y permiten la producción de
proteínas normales.

Ejemplo: distrofia muscular en ratones
Knockout from Gene Targeting

Se reemplaza el DNA por secuencias similares que no
pueden ser transcritas y silencian la expresión génica.

Desarrollado en 1980 silenciando la expresión génica de
un ratón.

Se puede utilizar para descubrir la función de los genes.

No es utilizada en humanos.
Dinamica
TENDRAN QUE LLENAR CORRECTAMENTE 10 BLANCOS.
Dinámica:

1) Una patente es _____________.

2) Una patente dura __________ efectiva.

3) Una de las polimerasas resistente a altas temperaturas
que se usa durante PCR es ______________.

4) El PCR es usado para _____ el ADN.

5) _____ es utilizado como recurso para el análisis de
genes en cuanto a sus alrededores.
Dinámica:

1) Una patente es un derecho legal al inventor para
proteger su producto.

2) Una patente dura 20 años efectiva.

3) Una de las polimerasas resistente a altas temperaturas
que se usa durante PCR es Taq1.

4) El PCR es usado para amplificar el ADN.

5) Factores ambientales son utilizado como recurso para
el análisis de genes en cuanto a sus alrededores.
Dinámica:
6) _________representa normal, mientras que __________
representa infectado.
 7) La condición _____________ esta relacionada con el
medicamento __________.
 8) este medicamento se diferencia del péptido humano
por 2 __________ y a su vez un _____________.
 9) Los pequeños segmentos de DNA que al entrar en
otras células se separan y se enlazan al mRNA para
impedir que este se traduzca se conocen como
__________.
 10) Las moléculas que constan de 20-25 bases de DNA
que actúan como secuencias complementarias
suplentes se llaman _________.

Dinámica:

6) verde representa normal, mientras que rojo
representa infectado.

7) La condición diabetes melitus esta relacionada con el
medicamento insulina.

8) este medicamento se diferencia del péptido humano
por 2 aminoacidos y a su vez un producto genetico.

9) Los pequeños segmentos de DNA que al entrar en
otras células se separan y se enlazan al mRNA para
impedir que este se traduzca se conocen como siRNA’s
ó Small Interfering RNA.

10) Las moléculas que constan de 20-25 bases de DNA
que actúan como secuencias complementarias
suplentes se llaman morfolinos.
Referencias
Christina Harrington, C, C Rosenow, and Jacques Retief. "Monitoring gene
expression using DNA microarrays." Elsevier Science Ltd., 2000: 285-291.
Lewis, Ricki. "Genetic tecnologies: Amplyfing, Modifying And Monitoring DNA." In
Human Genetics Concepts & Aplications, 380-396. McGraw-Hill, 2009.
michela Curradi, Annalisa Izzo, Gianfranco Badaracco, nicoletta Landsberger.
"Molecular Mechanism of Gene Silencing Mediated by DNA methylation."
American Society For Microbiology, 2002.
"Modern Genetic Analysis." ncbi. 1999. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21407/
(accessed november 2014).
"New England BioLabs Inc." neb. n.d. ww.neb.com/applications/dna-amplificationand-pcr (accessed november 2014).
Ropp, Anja von der, and Tony Taubman. august 2006. http://www.wipo.int/
(accessed november 2014).