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Existen flujogramas, para la identificación bacteriana, mediante
pruebas bioquímicas de microorganismos.
Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo,
facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos indica
la presencia de una enterobacteria, para determinar su género
podemos seguir el siguiente esquema.
• Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en
microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios
facultativos.
• Procedimiento: Hacer una suspensión del microorganismo con
solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un
disco (disco comercial de papel impregnado de tetrametil-paradifenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.
• Interpretación: Un cambio de color del disco a rosado o violeta
= prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es
oxidasa negativo.
Consideraciones Esta prueba no puede
realizarse con colonias que provengan de
medios de cultivo que no contenga hidratos
de carbono ni indicadores, por lo que si se
la va a realizar se debe incubar los
microorganismos en un placa de AS o bien
un TSA (tripteina-soya-agar)
NEG
POS
• Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o
fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización.
Se usa el medio O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e
hidratos de carbono en una relación 1:5. Al ser menor la
concentración de peptonas, hay menor producción de productos
de oxidación a partir de los AA que tienden a elevar el pH y
pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los
microorganismos no fermentadores.
• Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la
siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno
de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con
vaselina estéril.
• Interpretación:
• Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo
abierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el
tubo expuesto al aire atmosférico cambia su color original a
amarillo.
• Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2
tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo.
• Bacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su
pH alcalino después de la incubación, conservando su color
original.
• Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen βgalactosidasa y permeasa, dos enzimas necesarias para la
formación de ácidos a partir de la lactosa
• La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa
ingrese en la célula bacteriana.
• Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por
carecer de permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en
realidad son lactosas (+).
• Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa ()
Procedimiento: Hacer un inóculo con SF
estéril, agregar un disco de papel
comercial, se agita y antes de los 2 minutos
se debe leer.
Interpretación: Un color amarillo intenso
nos indica que el microorganismo es
productor de β-galactosidasa= prueba
(+).
Consideraciones
Se hace un inóculo del microorganismo en
solución fisiológica estéril, se agrega un
disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC
durante 24hs.
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Citrato
Ureasa
Voges-Proskauer
Rojo de metilo
Sulfuro Indol Movilidad (SIM)
Movilida, Indol, Ornitina (MIO)
Triple azúcar Herro (TSI)
Agar Lisina Hierro (LIA)
Fenilalanina
COLOR: VERDE
INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL
SUSTRATO PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO
Es una sal del acido cítrico.
Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas de
la fermentación de los hidratos de carbono, con el citrato como
única fuente de carbono.
La medición de esta característica es importante para identificar
muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier
medio usado para detectar la utilización del citrato por las
bacterias que se van a probar debe carecer de proteínas e
hidratos de carbono como fuente de carbono.
La utilización del citrato por la bacteria
que se va a probar se detecta en el
medio de citrato por la producción de
subproductos alcalinos.
El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única
fuente de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de
nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato también
pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de
amoniaco (NH+), lo que produce la alcalinización del medio por
conversión del NH a hidróxido de amonio (NH4OH).
El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por
encima de pH 7,6.
El medio para citrato utilizado
con mayor frecuencia es la
formula de Simmons.
El medio se coloca en tubos
inclinados (agar en pico de
flauta).
Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de
aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de
flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato.
El tubo se incuba a 35 °C
durante 24 a 48 horas.
La prueba positiva esta representada
por la producción de color azul oscuro
en el termino de 24 a 48 horas, que
indica que el microorganismo en
prueba ha sido capaz de utilizar el
citrato contenido en el medio, con
formación de productos alcalinos.
• La prueba también puede considerarse positiva
sin que haya color azul, si hay desarrollo visible
en la estría de siembra. Esto es valido porque
para que el desarrollo sea visible, el
microorganismo debió haber ingresado en la
fase logarítmica de crecimiento, lo que solo es
posible si ha asimilado carbono y nitrógeno.
Ureasa
COLOR: ROSADO
INDICADOR: ROJO FENOL
SUSTRATO PRINCIPAL: UREA
Es una diamida del acido carbónico
Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación
de amoniaco y dióxido de carbono.
El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato
de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH
del medio.
El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por
probar.
La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estría con el
microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24
horas.
Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden
producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos
activas pueden requerir 3 días o mas. Las reacciones son las
siguientes:
1. Caldo de Stuart:
Un color rojo en todo el medio
indica alcalinización e hidrolisis
de la urea.
2. Agar de Christensen:
Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio.
Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo solo en
el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.
3. Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio
conserva su color amarillo original.
VogesProskauer
Voges-Proskauer es un epónimo doble, en honor de dos
microbiólogos que trabajaron a principios del siglo xx.
Estos investigadores fueron los primeros en observar la
reacción de color rojo producida en medios de cultivo
adecuados después del tratamiento con hidróxido de
potasio. Luego se descubrió que el producto activo del
medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil
metil carbinol, producto de la vía del butilenglicol.
• El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la
producción de acetoina (acetil metil carbinol).
• Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-HafniaSerratia producen acetoina como producto metabólico final
principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades
pequeñas de ácidos mixtos.
• En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al
40%, la acetoina se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve
de catalizador para producir un complejo de color rojo.
El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-Voges-Proskauer
(MR/VP) según la formula de Clark y Lubs.
A. Caldo VP/RM
• Polipeptona 7g
• Glucosa 5 g
• Fosfato dipotasico 5 g
• Agua destilada 1 L
• pH final = 6,9
B. Reactivos
• oc-naftol al 5%. intensificador de color
• a-naftol 5 g
• Alcohol etilico absoluto 100 mL
• Hidroxido de potasio al 40%, agente
oxidante
• Hidroxido de potasio 40 g
• Agua destilada 100 mL
Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar.
Incubar 24 horas a 35 °C.
Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio. Agregar
0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%.
Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo
para exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a
15 minutos.
Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o mas después del agregado de los
reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de la
acetoina.
La prueba no debe leerse mas allá de una hora después de dejar los tubos en reposo,
porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se
puede interpretar como un positivo falso.
Rojo de
Metilo
El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El
pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho mas bajo que el pH
correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por
lo tanto, para provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir
grandes cantidades de acido del sustrato de hidratos de carbono que se utilice.
La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la producción de acido, que
requiere que los microorganismos positivos produzcan ácidos fuertes (lactico, acetico,
formico) de la glucosa.
El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-Voges-Proskauer
(MR/VP) según la formula de Clark y Lubs.
A. Caldo VP/RM
• Polipeptona 7g
• Glucosa 5 g
• Fosfato dipotasico 5 g
• Agua destilada 1 L
• pH final = 6,9
B. Reactivos
• Indicador de pH rojo de metilo.
• Rojo de metilo, 0,1 g en 300 ml de
alcohol etílico al 95%.
• Agua destilada, 200 ml.
1.
Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del
microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C
durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas).
2. Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo
de rojo de metilo directamente al caldo.
Positivo: El desarrollo de color rojo
estable en la superficie del medio
indica la suficiente producción de
acido como para disminuir el pH a
4,4.
• Negativo: Como otros
microorganismos pueden producir
pequeñas cantidades de acido del
sustrato probado, puede observarse
un color naranja, intermedio entre
amarillo y rojo. Esto no indica una
prueba positiva.
Indol
SIM: Sulfuro indol movilidad
MIO: Movilidad indol ornitina
Es uno de los productos de degradación metabólica del
aminoácido triptófano.
La prueba del indol se basa en la formación de un complejo de
color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del pdimetilaminobenzaldehido.
En la practica se utilizan medios combinados, como el medio de
sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol
omitina (MIO) o el medio indol nitrato.
• Determinar si un organismo es móvil o
inmóvil, si es capaz de liberar ácido
sulfhídrico por acción enzimática de los
aminoácidos
que
contienen
azufre
produciendo una reacción visible de color
negro y por último la capacidad de
desdoblar el indol de la molécula de
triptófano.
• Producción de ácido
sulfhídrico
• Producción de Indol
• Movilidad
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de reducción
que da un sulfito y un sulfato.
El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para
producir un precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.
El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para
formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético.
La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de
fermentar los hidratos de carbono.
Caldo triptofano (triptofano al 1%)
• Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g
• Cloruro de sodio 0,5 g
• Agua destila da 100 ml
Reactivo de Kovac
• Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml
• p-dimetilaminobenzaldehido 10 g
• HCI concentrado 50 ml
Reactivo de Ehrlich
• p-dimetilaminobenzaldehido 2 g
• Alcohol etílico 190 ml
• HCI concentrado 40 ml
Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e incubar a 35 °C
durante 18 a 24 horas.
Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se
deslicen por la pared del tubo.
Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1
mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.
Ácido sulfhídrico:
Positivo: ennegrecimiento del medio
Negativo: Sin ennegrecimiento
Indol:
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio
Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficie del medio indica
desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor de la formación
de indol.
La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba completa.
Si el cultivo de 24 hrs es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la
prueba.
Movilidad
Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el
medio provocando turbiedad.
Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.
Composición del medio:
• Extracto de levadura
• Peptona
• L-Ornitina
• Dextrosa
• Agar
• Agua
• Indicador de pH: púrpura de bromocresol
• Ácido: amarillo pH 5.2
• Alcalino: Púrpura pH 6.8
• Medio no inoculado: Púrpura intenso brillante pH 6.0
El MIO se utiliza para la identificación de enterobacterias sobre
la base de movilidad, la producción de ornitina descarboxilasa e
indol.
1. Descarboxilación de ornitina
2. Producción de indol
3. Movilidad
• Descarboxilación de ornitina: mide la
capacidad enzimática de un organismo
para descarboxilar un aminoácido para
formar una amina, con la consiguiente
alcalinidad.
• Producción de indol: El triptófano es un
aminoácido que puede ser oxidado por
ciertas bacterias para formar tres
metabolitos principales: indol, escatol e
indolacético.
Inoculación: picadura en forma vertical
Tiempo: 28-48 hrs
Temperatura 35 -37°C
Ornitina descarboxilasa
Positivo: color púrpura del medio
Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpura al final
Indol:
Positivo: anillo rojo en la superficie del medio
Negativa: No se Produce color / Color naranja en la superficie del medio, indica
desarrollo de escatol
Movilidad:
Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el
medio provocando turbiedad.
Negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.
TSI: Triple azúcar
Hierro
Determina la capacidad de un organismo de
atacar un hidrato de carbono específico
incorporado en un medio de crecimiento
básico, con producción o no de gases, junto
con la determinación de posible ácido
sulfhídrico.
La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones
aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior)
El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y concentración 10
veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadores de
glucosa comienzan metabolizando este azúcar.
Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato, este se metaboliza
por el ciclo de Krebs formando productos finales ácidos.
El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol.
A 6 horas de la incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo tendrán un color
amarillo (fermentador de glucosa)
Si el fondo permanece rojo, no hay variación de pH (no fermentador de glucosa)
Si el color rojo es mas intenso que el original, hay alcalinización (no es miembro de la
familia enterobacteriaceae)
Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa.
Después de 18-24 hrs, el medio permanece amarillo, reacción ácido sobre ácido
(A/A). Fermentador de lactosa.
La producción de gas romperá el agar o lo empujara hacia arriba. Reacción A/A más
gas.
Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos.
El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el
oxígeno es abundante.
18-24 hrs de incubación: zona inclinada roja fondo del agar amarillo (metabolismo
anaerobio de glucosa inicial). Reacción alcalina sobre ácido K/A.
Las bacterias que fermentan glucosa también pueden formar productos alcalinos a
partir de la utilización de la peptona, sobre la zona inclinada. Reacción K/K.
Inoculación: picadura y estría en pico de flauta.
Tiempo: 18-24 hrs
Temperatura:35-37°C
K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad ácida).
Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como Shigella.
A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad ácida).
Característicos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter.
K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad
alcalina). Característico de bacterias no fermentadoras como Pseudomas aeruginosa
LIA: Agar Lisina
Hierro
COLOR: LILA
INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESOL
SUSATRATPOS PRINCIPALES: LISINA Y HLUCOSA
Mide la capacidad enzimática de un organismo para
descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para
formar una amina con la consiguiente alcalinidad.
Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano.
Temperatura: 35-37°C
Tiempo 18-24 hrs
A: ácido
K: alcalino
N: neutra
R: Rojo (desaminación oxidativa)
• K/K: Azul de Prusia/azul de Prusia. Desaminación
oxidativa/descarboxilación.
• K/A: azul de Prusia/lila. No desaminación.
• Producción de H2S: Enegrecimiento del medio
• Producción de gas: burbujas o levantamiento del medio
de cultivo de las paredes del tubo.
• Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la
enzima FENIL-ALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un pico de flauta
largo, pues la lectura se hace sobre la superficie del medio de cultivo.
• Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del medio solamente, se incuba 24 hs a
35º C, se revela con cloruro férrico.
• Interpretación: El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de la
enzima, al agregar sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de manifiesto, dando
a la superficie un color verde intenso.
Fenilalanina
(-)
(+)