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Genetic Technologies: Amplifying, Modifying, and Monitoring DNA KARINA ROSARIO, PAOLA SANTIAGO, LUIS A. QUIÑONES, MANUEL CINTRON, PEDRO RIVERA Objetivos Describir biotecnología y sus aplicaciones Mencionar como se patenta el ADN y sus implicaciones Explicar la técnica de amplificación de ADN Explicar que es ADN recombinante y como se utiliza Describir animales transgénicos y su uso Explicar el monitoreo de expresión de genes Explicar la técnica de silenciar genes ¿Qué es la Biotecnologia? Uso o alteración de moléculas y/o células para aplicaciones especificas Aplicaciones de la biotecnología: - la creación de organismos transgénicos - fermentación de vinos - creación de diferentes medicamentos -Ej: insulina Patentizar ADN Que es una patente? - derecho de un inventor a proteger su producto - otorgado por el gobierno - dura 20 años Que es patentable? - debe ser nuevo, útil y no obvio - Ej: “Un planta de maíz que produzca una proteína que se encuentra naturalmente en habichuelas verdes, pero no en maíz” Patentizar ADN Para poder patentizar ADN: - útil como herramienta de investigación - un producto novel - un producto mejorado “The Patent Thicket” - es un conjunto de patentes - requiere las licencias de las varias patentes en la red - compañías que patentan cada SNP o fragmento de ADN Patentizar ADN Problemas éticos que se enfrentan al patentizar ADN: - baja accesibilidad - costo alto en dinero - la clase alta es favorecida - la clase baja se afecta “Myriad Case” - BRCA1y BRCA2 genes - implicaciones eticas Patentizar ADN Tres propuestas: - “Prohibir la patentes entre las asociaciones de secuencias de ADN y las enfermedades” - “Permitir que se patente el ADN solo para uso en pruebas diagnosticas” - “Exento a los doctores y investigadores de litigación si usan secuencias de ADN patentadas” Amplificación del DNA ¿Como se puede amplificar el DNA? Polymerase Chain Reaction (PCR) Produce grandes cantidades de secuencia específica de DNA Basado Kary en proceso de Replicación de DNA Mullis (1983) Tecnología de DNA Recombinante Amplificación del DNA ¿Cuales son los requisitos para usar PCR? 1. Elegir secuencia de DNA específica 2. “Primers” 3. Nucleótidos (“Building Blocks”) 4. DNA polimerasa resistente a altas temperaturas • Ej. Taq1 Proceso de PCR Amplificación del DNA ¿Cuales son algunas aplicaciones del PCR? Ciencias Forenses Establecer relaciones sanguíneas Identificar restos en una escena de crimen Ayudar a condenar o exonerar un acusado Ciencias Naturales Amplificar el DNA o RNA de patógenos a niveles detectables Amplificación del DNA ¿Cuales es la ventaja y desventaja del PCR? Ventaja Trabaja hasta con muestras crudas de secuencias raras y viejas Desventaja Alta sensibilidad puede resultar en un falso positivo si la muestra esta contaminada DNA recombinante Añadir un gen “Cloning” Febrero 1975, 140 biólogos moleculares Construyendo moléculas de DNA recombinante Requiere enzimas restrictivas Como se logra la molécula: DNA extranjero Gen de interés Transcripción del gen extranjero Traslación de su producto Colectar y purificar Construyendo moléculas de DNA recombinante “Sticky ends” Complementarios Puentes de hidrogeno Tijeras Vectores clonados Natural Molécula recombinante Tamaño en kilo-bases Creación del DNA recombinante Cortar el DNA donador Plásmido isolado y cortado Se mezclan formando los puentes de hidrogeno y “sticky ends” Aislando el gen de interés “Genomic Library” Fragmentos de DNA Intrones Codifica tRNA y rRNA Sonda de DNA- pedazo de DNA complementario que puede unirse a moléculas radioactivas y fluorescentes. cDNA Sustituyente Librería de genes codificantes de proteínas mRNA en células diferenciadas Realización del cDNA Extracción del cDNA de mRNA Hebra complementaria Sintetizan hebras de cDNA con RNA Se forma la doble cadena Seleccionando moléculas recombinantes de DNA Complejidad Identificar y separar células con gen de interés Puede resultar en lo siguiente: Carecen del plásmido Poseen plásmido pero no el gen extraño Poseen plásmido y gen extraño deseado Seleccionando moléculas recombinantes de DNA. Estrategias para distinguir si la bacteria posee o no el plásmido y el gen extraño Gen resistente antibiótico Reacción de cambio en color Color azul Productos de DNA recombinante Insulina 51 aminoácidos/ difiere en 2 Diabetes melitus Interferón β-1b y tPA Mahones azules E. Coli Animales transgénicos Alterados genéticamente Célula es introducida y replicada Altera funciones en su sistema Ejemplo: Vacas Anticuerpos humanos Afectan el promotor Promotor regula la transcripción Producción de leche Introducir DNA a células animales Aberturas tracendientes en membrana plasmática Liposomas cargan DNA, son atrapados en la membrana plasmática Sacudidas de electricidad para entrada Agujas microscópicas Partículas de metal recubiertas con el material genético Animales como modelo Drogas combaten o no No pueden ser animales transgénicos Posibilidad de que empeore la condición ALS en perros Bioremediación Organismos metabolizan sustancia que para otros es una toxina Arbusto de Australia Arboles amarillos transgénicos poplares TNT (trinitrotolueno) Monitoreo de función de genes Situaciones específicas Enfermedades Heridas Exposición a factores ambientales “Microarray” Análisis del “microarray” es computarizado “Microarray” Applicaciones Estudios a bases de genes Enfermedades Cáncer Enfermedades mentales Enfermedades infecciosas Clasificación “Silencing” DNA Beneficioso Oncogenes y enzimas que controlan maduración Tres métodos: RNA “interference” “Antisense Sequences” “Knock-outs from Genes Targeting” RNA “interference” 2006, Premio Nobel de Fisiología o Medicina Cadenas de doble hebra de RNA entran en células y se separan en cadenas simples. Una de ellas se enlaza al mRNA e impide que este se traduzca. “Small Interfering RNA's” (siRNAs) RNA “interference” Antisense Sequences Silencia mutaciones que provocan que los exones se eliminen de cadenas maduras de RNA. Morfolinos (20-25 bases de DNA) que actúan como secuencias complementarias suplentes. Se enlazan a los complementos, no permiten que se lleve a cabo el “splicing” de exones y permiten la producción de proteínas normales. Ejemplo: distrofia muscular en ratones Knockout from Gene Targeting Se reemplaza el DNA por secuencias similares que no pueden ser transcritas y silencian la expresión génica. Desarrollado en 1980 silenciando la expresión génica de un ratón. Se puede utilizar para descubrir la función de los genes. No es utilizada en humanos. Dinamica TENDRAN QUE LLENAR CORRECTAMENTE 10 BLANCOS. Dinámica: 1) Una patente es _____________. 2) Una patente dura __________ efectiva. 3) Una de las polimerasas resistente a altas temperaturas que se usa durante PCR es ______________. 4) El PCR es usado para _____ el ADN. 5) _____ es utilizado como recurso para el análisis de genes en cuanto a sus alrededores. Dinámica: 1) Una patente es un derecho legal al inventor para proteger su producto. 2) Una patente dura 20 años efectiva. 3) Una de las polimerasas resistente a altas temperaturas que se usa durante PCR es Taq1. 4) El PCR es usado para amplificar el ADN. 5) Factores ambientales son utilizado como recurso para el análisis de genes en cuanto a sus alrededores. Dinámica: 6) _________representa normal, mientras que __________ representa infectado. 7) La condición _____________ esta relacionada con el medicamento __________. 8) este medicamento se diferencia del péptido humano por 2 __________ y a su vez un _____________. 9) Los pequeños segmentos de DNA que al entrar en otras células se separan y se enlazan al mRNA para impedir que este se traduzca se conocen como __________. 10) Las moléculas que constan de 20-25 bases de DNA que actúan como secuencias complementarias suplentes se llaman _________. Dinámica: 6) verde representa normal, mientras que rojo representa infectado. 7) La condición diabetes melitus esta relacionada con el medicamento insulina. 8) este medicamento se diferencia del péptido humano por 2 aminoacidos y a su vez un producto genetico. 9) Los pequeños segmentos de DNA que al entrar en otras células se separan y se enlazan al mRNA para impedir que este se traduzca se conocen como siRNA’s ó Small Interfering RNA. 10) Las moléculas que constan de 20-25 bases de DNA que actúan como secuencias complementarias suplentes se llaman morfolinos. Referencias Christina Harrington, C, C Rosenow, and Jacques Retief. "Monitoring gene expression using DNA microarrays." Elsevier Science Ltd., 2000: 285-291. Lewis, Ricki. "Genetic tecnologies: Amplyfing, Modifying And Monitoring DNA." In Human Genetics Concepts & Aplications, 380-396. McGraw-Hill, 2009. michela Curradi, Annalisa Izzo, Gianfranco Badaracco, nicoletta Landsberger. "Molecular Mechanism of Gene Silencing Mediated by DNA methylation." American Society For Microbiology, 2002. "Modern Genetic Analysis." ncbi. 1999. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21407/ (accessed november 2014). "New England BioLabs Inc." neb. n.d. ww.neb.com/applications/dna-amplificationand-pcr (accessed november 2014). Ropp, Anja von der, and Tony Taubman. august 2006. http://www.wipo.int/ (accessed november 2014).