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TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA EL ANÁLISIS MASIVO DE EXPRESIÓN DE GENES Y SU APLICACIÓN PARA EL TRATAMIENTO PERSONALIZADO DEL PACIENTE CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA 2010-2011 ACTUALIZACIONES EN EL LABORATORIO CLÍNICO Nº 6 I.S.S.N.- 1988-7477 Título: Actualizaciones en el Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: abril 2011 Técnicas de Biología molecular para el análisis masivo de expresión de genes y su aplicación para el tratamiento personalizado del paciente Dra. Trinidad Caldés Llopis.- Facultativo Especialista de Área, PhD Jefe del Laboratorio de Oncología Molecular. Hospital Clínico San Carlos. Madrid. 1. Introducción 2. Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes 2.1 Matrices Tisulares 2.2 SNPs 2.3 Matrices de Hibridación Genómica Comparada (Arrays de CGH) 2.4 Matrices de cDNA y oligonucleótidos 2.5 PCR Cuantitativa 2.6 Detección de proteínas como marcadores séricos 2.7 Detección de fosfo proteínas en células individuales 2.8 Aplicaciones en Farmacogenómica 3. Bibliografia 595 1. INTRODUCCIÓN Durante los últimos años se ha experimentado un gran avance en el conocimiento de la Biología y la Medicina poniendo a nuestro alcance gran información que crece de manera exponencial. Este avance en el conocimiento se ha podido desarrollar gracias a la aplicación de grandes técnicas de Biología Molecular. Como bien dijo Sydney Brenner en 1980 “El progreso en la ciencia depende de nuevas técnicas, nuevos descubrimientos y nuevas ideas” probablemente en este orden (Figura 1). Figura 1: Sydney Brenner 1980 Merece especial mención la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa conocida como PCR, descubierta por Kary B Mullis el 8 de septiembre de 1983, y reconocido su descubrimiento con el Premio Nobel de Química en el año 1993. Esta técnica ha sido crucial para el conocimiento y secuenciación del genoma (fig 2). Las nuevas y revolucionarias herramientas, han hecho avanzar la investigación Biomédica y ahora más que nunca, la innovación terapéutica se presenta como la clave para conseguir nuevos tratamientos eficaces y seguros. 596 Figura 2: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hecho histórico. Entre estas herramientas, podemos hablar de la biotecnología la cual nos permite mediante manipulación genética la creación de nuevos fármacos, siguiendo un diseño determinado para mejorar sus propiedades terapéuticas. La biotecnología cubre hoy muchos campos de la investigación médica como por ejemplo en el campo del diagnóstico, en el descubrimiento de nuevas dianas celulares, y en la mejora de tratamientos previos que permiten aumentar su eficacia y tolerabilidad. Un buen ejemplo ha sido el desarrollo de anticuerpos totalmente humanizados o pequeñas moléculas que actúan sobre dianas terapéuticas. Otras herramientas importantes que han hecho avanzar el conocimiento del genoma humano son las técnicas de análisis masivo de la expresión de genes. 597 Los conocimientos del genoma humano hacen posible la utilización de tecnologías en genómica y proteómica capaces de analizar la complejidad de cada tipo de cáncer y están encaminadas al diagnóstico molecular de tumores, identificando genes relevantes en cáncer esporádico y familiar (1). Este análisis molecular masivo tiene un interés especial en el estudio de la predicción de respuesta a los tratamientos, ya que se puede predecir que pacientes van o no a responder a dichos tratamientos (2-5) evitando por tanto toxicidades innecesarias. Estos análisis tienen en común que el resultado es diferente según la plataforma utilizada, el centro donde se han hecho y el especialista (4,6). 2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO DE LA EXPRESIÓN DE GENES 2.1 Matrices Tisulares Las matrices de tejidos permiten estudiar un marcador en muchos tumores al mismo tiempo. Para ello se tiene que construir un nuevo bloque de parafina en el que se ponen en posiciones definidas tres cilindros de cada uno de los tumores en parafina ya existentes y en los que se quiere hacer el estudio. En la figura 3 vemos un esquema de la construcción de una matriz de tejidos. Mediante este sistema se pueden estudiar uno o varios marcadores en muchas muestras. Esta matriz es aplicable a técnicas de inmunohistoquímica, de hibridación in situ y de histología (Figura 3) representa la Inmunohistoquímica de las proteínas reparadoras del ADN hMLH1, hMSH2, hMSH6 y hPMS2). Estas matrices son también muy útiles para confirmar los resultados que se obtienen en los estudios de micro-matrices de ADN complementario. Otras indicaciones de esta técnica son el control de calidad, análisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de cánceres de tamaño pequeño y 598 establecimiento de modelos predictivos basados en la expresión de proteínas. En estos estudios, es posible digitalizar y cuantificar la expresión de los marcadores, abriendo por tanto el uso de estas matrices titulares (7,8). Figura 3: Construcción de una matriz de tejidos y su utilidad en el estudio de inmunohistoquímica de hMLH1, hMSH2, hMSH6 y hPMS2 2.2 SNPs Los polimorfismos son variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debidas a la sustitución de una base. Hoy en día se conocen más de 3 millones de SNPs y existen en el mercado distintas plataformas para su estudio como 599 la de Illumina, Affimetrix, Applied Byosistems etc. En estas plataformas se pueden estudiar desde 7000 a 1,8 millones de SNPs. La mayoría de los SNPs se encuentran en zonas no codificantes ya que sólo se han descrito unos 60.000 en exones. Se supone que el número de polimorfismos por individuo está en el rango de 10 a 15 millones (9,10). El análisis de SNPs nos permite hacer estudio de casos controles con el fin de ver si hay asociación de riesgo para una determinada enfermedad. Otra aplicación es estudiar genes modificadores de riesgo y para ello se hacen estudios complejos denominados GWAS (estudios de asociación genómica), estos estudios nos valen también para localizar nuevos locus implicados en determinadas patologías. Por último, otra aplicación de estos estudios está en el análisis de resistencia a fármacos y de sensibilidad/toxicidad a drogas (9,10). Figura 4: Micromatrices para el estudio de polimorfismos (SNPs) 600 Los estudios de SNPs como hemos dicho antes se pueden hacer en plataformas (Figura 4), pero también se pueden estudiar cuando se trata de un nº pequeño, de forma individual y las técnicas que se utilizan son la secuenciación directa del trozo del genoma donde se encuentra el SNP o bien se pueden estudiar por metodología TaqMan en equipos de PCR cuantitativa. 2.3 Matrices de Hibridación Genómica Comparada (Arrays de CGH) Estas matrices se pueden hacer a partir de BACs o de oligonucleótidos. Los BACs son cromosomas artificiales humanos que contienen secuencias de ADN entre 100 y 200 Kb. Actualmente hay secuencias para todo el genoma. Su uso permite la detección de deleciones, duplicaciones, inserciones y reordenamientos (11). Para ello se realiza una hibridación comparativa entre el ADN de un paciente y el ADN de un control sano. Recientemente, se ha publicado un trabajo de P Lichter (12) con una matriz de BACs específica para LLC-B (leucemia linfocítica crónica). Existen también micromatrices comerciales de CGH basadas en oligonucleótidos, con mayor resolución que los BACs y mayor poder en investigación y diagnóstico (13). 2.4 Matrices de cDNA y oligonucleótidos Una matriz de ADN es un sistema en miniatura en el que fragmentos de ADN se inmovilizan en soportes sólidos. Según sea el tamaño del ADN inmovilizado (que servirá como sonda complementaria), hay dos tipos de micromatrices: las micromatrices de ADN complementario que presentan sondas de cientos de bases y micromatrices de oligonucleótidos con sondas de 20¬25 bases o de 50¬80. 601 Figura 5: Micro matrices de ADNc o de oligonucleótidos Estas micro matrices o chips consisten en un soporte sólido sobre el cual un robot ha impreso de manera ordenada miles de ADNs complementarios o de oligonucleótidos representantes de otros tantos genes (fig 5). Un chip puede ser hibridado al mismo tiempo con dos sondas de ADNc (marcadas con dos fluorocromos diferentes por ejemplo Cyanina 3 y Cyanina 5) generadas a partir de ARN mensajero de las muestras a comparar (por ejemplo tejido tumoral y normal), o bien ser marcado por un único fluorocromo. Después de la hibridación, los chips se lavan para eliminar restos de reactivos, y se mide con un scanner las intensidades de cada uno de los puntos donde se ha producido dicha hibridación, siendo el nivel de la señal proporcional al número de copias de RNA mensajero en la muestra: de modo que el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constituye una medida de la expresión génica diferencial relativa al ADNc representado en el chip (Figura 6). Con esta técnica se pueden obtener muchos valores, y la convierte en una herramienta importante para trabajos de genómica funcional. El gran volumen de datos obtenidos, hace imprescindible el análisis de los resultados con métodos bioinformáticos y por personal especializado (14, 15). 602 Figura 6: Agrupación por expresión diferencial de genes en una matriz de ADNc 2.4.1 Análisis de los resultados Los datos generados mediante esta técnica, como hemos dicho antes, necesitan ser analizados por un bioinformático que llevará a cabo las diferentes formas de agrupar los resultados: Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada Identificar genes que se asocien a algún hecho específico Asignar función biológica a los genes resultado del experimento 603 Simplificar series de genes al mínimo número de datos posibles Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos 2.4.2 Limitaciones de las micromatrices de ADN Como todas las técnicas usadas en investigación, las micromatrices tienen limitaciones, como: 1. Secuencias no verificadas. Este error no ocurre en las micro matrices comercializadas pero si en las fabricadas de forma casera. 2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. Los niveles altos de expresión de un mensajero, no implican necesariamente una activación funcional del gen preciso, ya que lo que puede ocurrir y de hecho es más corriente es una pérdida de la función. Por este hecho todos los resultados obtenidos mediante matrices, deben ser verificados experimentalmente 3. Ruido biológico. Se ha comprobado que la variabilidad inter-experimental es debida al azar o a otras razones de oscilaciones cíclicas no relacionadas con el objeto del experimento. 4. Falta de estandarización de técnicas de análisis. La mayoría de las plataformas usadas para análisis genómicos son muy robustas, pero todavía no tienen una reproductibilidad. Esto se ha visto porque cuando se comparan los resultados obtenidos por distintas plataformas, estos son distintos entre sí. 2.5 PCR Cuantitativa La PCR a tiempo real es hoy por hoy una técnica de referencia para el estudio de expresión de genes. Tiene una gran sensibilidad, especificidad y reproducibilidad. Existe también la posibilidad de utilizar plataformas para un número determinado de 604 genes aunque este es menor que el utilizado en las matrices, sin embargo es mucho más sensible y reproducible. Esta metodología tiene además la ventaja que si se hace un diseño adecuado del tamaño de los amplicones, puede ser utilizada para muestras de tejido parafinado. A este tipo de tarjetas, se les llama chips de baja densidad. La gran reproducibilidad de sus resultados, permite su uso en la clínica y nos sirve también para verificar los hallazgos encontrados en los chips de alta densidad. Así en la actualidad hay varios ensayos clínicos que utilizan esta metodología para estudiar las distintas variables que nos van a ser útiles para predecir la respuesta a una terapia determinada. Expresión gen diana Expresión gen endógeno 2.6 Detección de proteínas como marcadores séricos El objetivo de muchos grupos de investigación es la identificación de marcadores séricos informativos de riesgo de contraer una determinada enfermedad o que nos sirvieran para el seguimiento de la enfermedad mínima residual (16). La obtención del suero es una técnica no invasiva y nos permitiría monitorizar los cambios antes, durante y después. Los primeros resultados hechos en ovario, páncreas y próstata usando el SELDI¬TOF¬MS parecían prometedores. Sin embargo estos estudios han 605 demostrado poca reproducibilidad y muchos falsos positivos con lo cual no se pueden utilizar como técnica de análisis rutinario (17, 18). 2.7 Detección de fosfo proteínas en células individuales Tanto el mecanismo de acción de drogas como la sensibilidad a las mismas, se puede ver por el análisis de proteínas inducidas por la acción de estas drogas. Por ejemplo, agentes que dañan el ADN inducen fosforilación de sensores de daño a ADN, mientras que agentes cuya diana está constituida por rutas de traducción de señal inducen cambios en el estado de fosforilación de proteínas críticas en estas rutas. La disponibilidad de anticuerpos contra los estados funcionales de estas proteínas permite utilizar la citometría de flujo como técnica de análisis de estos cambios (19-21). 2.8 Aplicaciones en Farmacogenómica Las matrices de ADN complementario permiten establecer el perfil geonómico del fármaco o firma molecular del mismo y establecer firmas moleculares predictivas de sensibilidad /resistencia. Desde el punto de vista clínico es más útil identificar al principio aquellos marcadores que van a ser útiles para un determinado tratamiento es decir nos van a dar la información de si es útil o no ese tratamiento. A pesar de ser un objetivo difícil debido a la acción múltiple de la mayoría de las drogas, hoy en día se han conseguido gracias a los estudios de las vías moleculares de actuación de las drogas, algunos marcadores predictivos de respuesta a determinados tratamientos y que la FDA obliga a su estudio antes de iniciar dicho tratamiento. Entre estos marcadores tenemos: El estudio de mutaciones en el codon 12, 13 y 61 del gen K-ras, para el tratamiento de cáncer colorrectal metastásico en primera y segunda línea con 606 Cetuximab, un anticuerpo monoclonal contra el EGFR. Se ha visto que aquellos pacientes con mutaciones en K-ras no responden al Cetuximab (22). El estudio de las mutaciones en el dominio Tirosina Kinasa del gen c-Kit, para el tratamiento de los tumores de tipo gastrointestinal (GIST) con el Imatinib un inhibidor del dominio Tirosina Kinasa. Este tratamiento se utiliza también para la Leucemia Mieloide Crónica (23). En el adenocarcinoma de pulmón tenemos hoy en día también un marcador predictivo de respuesta al tratamiento con un inhibidor del dominio tirosina kinasa del receptor EGFR como el Gefitinib o el Erlotinib. Los pacientes con mutaciones en EGFR, responden mejor al tratamiento (24). La sobreexpresión o amplificación génica del receptor HER2 también es factor predictivo de respuesta al tratamiento de cáncer de mama con Trastuzumab (25). Otros marcadores nos sirven para predecir la toxicidad a un fármaco. El gen de la UGT1A1 tiene un polimorfismo en su zona promotora UGT1(TA)7, a este alelo normal se le denomina UGT1A1*1, pero puede ocurrir una inserción de TA con lo cual serían 8 (TA) y al alelo se le denomina UGT1A1*28, esta inserción produce una pérdida de expresión y menor actividad enzimática y como resultado produce toxicidad del fármaco Irinotecan (Egapp Recomendation Statement) (26). Por último podemos mencionar que la pérdida de expresión del gen de la Dihidro Pirimidin Dehidrogenasa, enzima encargada de metabolizar las Fluoropirimidinas como el 5FU, produciría toxicidad al tratamiento. 607 La investigación llevada a cabo en relación con el diagnóstico y tratamiento tiene todavía mucho trabajo por delante. Desde los años 1980 al 2000 en los que al principio sólo se contaba con la Hematoxilina/Eosina, posteriormente la Inmunohistoquímica y el FISH. Estas técnicas, nos valían sólo para la predicción de genes aislados. A finales del siglo pasado y en este siglo 21, se nos está permitiendo gracias a las técnicas de genómica y proteómica lograr un avance significativo en el conocimiento de la carcinogénesis humana. Al mismo tiempo nos ha servido para diseñar nuevos tratamientos contra dianas moleculares que se localizan en vías de traducción de señales, proliferación, diferenciación, apoptósis, y reparación del ADN. Y por último, estas técnicas nos han servido y sirven para localizar nuevos factores predictivos de respuesta, que son diferentes para cada individuo pudiendo por tanto personalizar el tratamiento. 608 3. BIBLIOGRAFIA 1. Ponder BA. Cancer genetics. Natura. 2001; 411:336-341. 2. Bittner M, Meltzer P, Chen Y, et al. 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