Download estandarizacion de la tecnica hplc/ms para la determinación de

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XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA
Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
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Guanajuato, Gto.
ESTANDARIZACION DE LA TECNICA HPLC/MS PARA LA DETERMINACIÓN
DE CUATRO METABOLITOS DE NITROFURANOS FURALTADONA (AMOZ),
FURAZOLIDONA (AOZ), NITROFURAZONA (SEM), NITROFURANTOÍNA
(AHO), EN CARNE DE BOVINO EN NUEVO LEÓN MÉXICO
Cantú-Martínez M. A.a*, Avalos-Ramírez R.b , Roig-Sagués A. X.c, Pérez-Fernández B.d ,
Morales-Loredo A.e. Silva Páez M. L.f,
a*, b, f
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Nuevo
León, México Av. Francisco Villa s/n Col. Ex Hacienda el Canadá Escobedo, Nuevo León,
México C. P. 66050 .
C, d
Departament de Ciència Animal I dels Aliments, Facultad de Medicina Veterinaria de la
Universidad Autónoma de Barcelona España Bellaterra 8193 Cerdanyola del Vallès,
Campus de la UAB Edificio V
e
Laboratorio Central Regional de Monterrey Comité de fomento y Protección Pecuaria
Terrenos de la Exposición Ganadera Guadalupe, Nuevo León C. P. 67100
* [email protected]
RESUMEN:
Los nitrofuranos han sido una preocupación a nivel mundial por su impacto en la salud
pública debido al potencial efecto carcinogénico de los metabolitos de Nitrofuranos. La
detección y el monitoreo de nitrofuranos en tejido de bovinos es muy importante. Sin
embargo, los límites de detección para estos nitrofuranos en tejido animal no están
Normatizado en México. El objetivo del trabajo, es poner a punto la determinación
cuantitativa de los metabolitos de nitrofuranos AMOZ, AHD, AOZ y SEM mediante HPLC-MS
y para la detección de metabolitos en muestras de músculo de bovino.
Se normalizó el procedimiento del HPLC-MS encontrándose que el tiempo de retención de
los analitos fue para AMOZ de 1.34 a 1.38 min, para AHD 2.19 a 2.23 min, mientras que para
AOZ y SEM fueron 2.54 a 2.59 min y 2.05 a 2.10 min respectivamente; Los valores de
linealidad fueron superiores a 0.995 con alta reproducibilidad. La técnica HPLC-MS fue
rápida, sensible y altamente repetible.
La técnica, se aplico a 32 muestras de músculo de bovino de 32 lotes de engordas
diferentes. Las muestras, fueron de rastros TIF de Nuevo León. Los resultados fueron
negativas a los derivados de nitrofuranos. Demostrando tener una baja frecuencia.
ABSTRACT:
Nitrofurans have been a global concern for its impact on public health due to the potential
carcinogenic effect of metabolites of nitrofurans. The detection and monitoring of
nitrofurans in tissue of cattle is very important. However, the detection limits for these
nitrofurans in animal tissue are not normalized in Mexico. The aim of this work is to develop
the quantitative determination of metabolites of nitrofuran AMOZ, AHD, AOZ and SEM by
HPLC-MS and detection of metabolites in samples of bovine muscle.
The procedure was standardized HPLC-MS was found that the retention time of analytes was
for AMOZ 1.34 to 1.38 min for AHD 2.19 to 2.23 min, while for AOZ and SEM were 2.54 to 2.59
to 2.10 min and 2.05 min respectively ; linearity values were higher than 0995 with high
reproducibility. HPLC-MS technique was rapid, sensitive and highly repeatable.
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The technique was applied to 32 bovine muscle samples of 32 different feedlots. The
samples were traces of Nuevo Leon TIF. The results were negative for nitrofuran derivatives.
Proving to have a low frequency.
Palabras clave: Estandarización, Nitrofuranos, Cromatografía, HPLC MS/MS,
INTRODUCCIÓN
En México, la detección de estos compuestos en animales destinados para
consumo humano no está regida por la Normas Mexicanas, sea cual sea su límite.
La falta de control sobre su uso, su aplicación de forma fraudulenta,
indiscriminada, abusiva y sin atender los principios básicos de la buena práctica
veterinaria posibilita el riesgo de aparición de residuos de estos medicamentos o
sus metabolitos en el animal y en productos y subproductos consumibles por el
humano. (Pérez et al, 1999)
Los nitrofuranos han sido ampliamente utilizados en producción animal para el
tratamiento de infecciones bacteriana del ganado bovino, porcino y aves de corral
y además como aditivos, entre este grupo se encuentran Nitrofurazona (SEM),
Furazolidona (AOZ), Furaltadona (AMOZ), Nitrofurantoína (AHO), Nifuraldezona,
Nifupirazina.(L. Meyer Jones, 1969 Sumano, 1999).
Estudios toxicológicos, realizados in vivo e in vitro, en el año 1993 demostraron el
riesgo potencial de los nitrofuranos para la salud pública. Las características
observadas incluyeron su potencial como agentes mutagénicos, carcinogénicos y
teratogénicos. No obstante, los metabolitos de nitrofuranos son difícilmente
identificables y cuantificables dada su naturaleza de permanecer ligados a otras
moléculas por largos periodos (European Commission 2003, Anónimo 2008). La
Unión Europea, y la Organización Mundial de la Salud (OMS), establece tolerancia
CERO para estos compuestos y sus metabolitos a través del reglamento 2377/90
EC, Anexo IV, considerándose violatoria la aparición de residuos en cualquier
matriz biológica (RPE 1990). Dado lo anterior, los objetivos del presente trabajo
fueron en primera instancia poner a punto la determinación cuantitativa de los
metabolitos de nitrofuranos AMOZ, AHD, AOZ y SEM mediante HPLC-MS/MS y la
aplicación subsecuente de esta técnica para la detección de estos metabolitos en
muestras de músculo de bovino sacrificados en mataderos “Tipo Inspección
Federal” de Nuevo León.
METODOLOGÍA
El estudio se realizó en el Laboratorio Regional del Comité para el Fomento y
Protección Pecuaria para el Estado de Nuevo León A. C. Se estandarizó el
método de Cromatografía Liquida de Alta Resolución con detector de masa (HPLC
MS/MS) para la determinar la presencia de Nitrofuranos y sus metabolitos
(Nitrofurazona (SEM), Nitrofurantoína (AHD), Furaltadona (AMOZ), Furazolidona
(AOZ),). Además, se analizaron 32 muestras de músculo de bovino obtenidos de
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diferentes mataderos Tipo Inspección Federal (TIF) del estado de Nuevo León y
procedentes de 32 distintos lotes de engorda; El muestreo se realizó al azar, de
acuerdo al sistema de números aleatorios indicado en el apéndice C de la NOM004-ZOO.
La preparación de la muestra y su procedimiento se baso en la técnica de
extracción recomendada por la FDA U.S. (2004) Food and Drug Administration
para la determinación de metabolitos de Nitrofuranos en muestras de camarón, y
en los procedimientos descritos por Pereira et al. (2004), Kelly et al (2005).
Se peso 1 + 0.01g de tejido previamente molido dentro de un tubo de
centrifugadora de polietileno de 15 ml. Se preparo un blanco de vidriería, un
blanco de solventes, y un blanco de tejido. Además se preparó una curva de
estándares pero sin matriz, con cada serie se fortificaron con 0.30, 0.50, 1.0, 2.0,
4.0 ng/ml. Se preparo dos recuperaciones, las cuales se fortificaron con la
concentración de 1.0 ng/ml (ppb). Se le adicionó a todas las muestras 20 µl de la
mezcla de estándares de trabajo (estándar interno AMOZ d5 AOZ, SEM, AHD)
con una concentración de 0,05 ng/µl. Se le agregó 5 ml de la solución de Ácido
Clorhídrico (HCl) 0,2 M a cada tubo. Posteriormente se le adicionó 50 µl del
derivatizante Nitrobenzaldehído (NBA) 100 mM. Se agitaron por 10 minutos. Se
incubaron los tubos A 370C. ± 20 C. durante un periodo de 16 h. después se le
agregó a cada tubo 2 ml de solución de Fosfato de Potasio (K2 HPO4 0,3 M) y se
agitaron, luego se lleva a un pH de 7 con la solución de Hidróxido de Sodio
(NaOH) 2M. Se le adicionó a cada tubo 4 ml de Acetato de Etilo y se mezcló en el
agitador por 30 min. Se centrifugaron a 3,500 rpm durante 10 min. y se transfirió la
fase orgánica a otro tubo de vidrio, luego se llevo a evaporar a sequedad en un
evaporador de nitrógeno con baño de maría a 450C, posteriormente se disolvió el
residuo seco con 500µl de la solución para reconstituir (10 ml. de Acetonitrilo en
100 ml. con agua HPLC con 0,1 ml. de Ácido Acético Glacial) después se agito en
un vortex durante 20 s. y se transfirió la muestra a un tubo Eppendorf de 2 ml y se
centrifuga a 4,000 rpm durante 10 min a una temperatura de 50C (solo las
muestras con matriz). Después se tomo la fase no turbia de la muestra con una
jeringa de 1 ml y se paso la muestra a través de un filtro PTFE de 13mm y 0,45µm,
y se recolecto en un vial de 2 ml con un inserto y se inyecto al Cromatógrafo de
líquidos de alta resolución con detector de masas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las condiciones cromatografías se basaron en la utilización de diferentes fases
móviles compuestas de una mezcla de solventes A y B. El tiempo de la carrera
total para la determinación de los analitos de nitrofuranos se fijo a 8 minutos y con
una temperatura de 300C en el termostatizador de columna con un volumen de
flujo de inyección de 0,3ml/min.
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Se utilizó un flujo constante de 0,3 ml /minuto utilizando una gradiente de la fase
móvil A de 60% y 40% de la fase móvil B en el tiempo de 1.34–1.38 minutos
apareció el pico correspondiente a Furaltadona 3-amino-5-morpholinomethyl-1,3oxazolidin-2-one (AMOZ). Con un coeficiente de correlación de r= 0.995019. por
otro lado con el Flujo de 0,3 ml /minuto con un flujo de fase móvil de la solución A
de 50% y 50% de la solución de la fase B se encontró que en el tiempo de 2.19–
2.23 minutos apareció Nitrofurantoína 1-aminohydanto (AHD). Encontrándose un
coeficiente de correlación de r= 0.997701. Con el mismo flujo constante de 0,3 ml
/minuto con un fase móvil de A de 50% y 50% de la fase móvil B con un tiempo de
2.54–2.59 minutos apareció Furazolidona 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ).
Encontrando un coeficiente de correlación de r= 0.99642. a si mismo con un flujo
constante de 0,3 ml /minuto con una fase móvil A de 50% y 50% de la fase móvil B
se encontró que en el tiempo de 2.05 – 2.10 minutos apareció Nitrofurazona
Semicarbacida (SEM). Teniendo un coeficiente de correlación de r= 0.993629.
En el presente estudio se encontró que el tiempo de retención de los analitos fue
para AMOZ de 1.34 a 1.38 min, para AHD 2.19 a 2.23 min, mientras que para AOZ
y SEM fueron 2.54 a 2.59 min y 2.05 a 2.10 min respectivamente ver tabla 1;
mientras que en el estudio realizado por Verdon et al (2007) los tiempos de
retención variaron de 7.8 a 9.1 min para los mismos analitos. Posiblemente las
variaciones observadas en tiempos de retención se deban o están influenciados
por el tipo de fase y la gradiente que se uso en el presente estudio.
Tiempos de retención de los analitos de Nitrofuranos
Analito
Fase móvil 0,3 ml/min
Tiempo de retención del analito
A%
60
B%
40
1.34 a 1.38 minutos
Nitrofurantoina AHD
50
50
2.19 a 2.23 minutos
Furazolidona AOZ
50
50
2.54 a 2.59 minutos
Semicarbacida SEM
50
50
2.05 a 2.10 minutos
Furaltadona AMOZ
Tabla 1 tiempo de retención de los analitos de nitrofuranos en minutos y el porcentaje de
fase que se utiliza
Pereira et al (2004) en su estudio de análisis de tres metabolitos de Nitrofuranos
en carne de pollo determino que la linealidad de su curvas de calibración con 5
niveles (n = 5), y utilizando los rangos de entre 0.3 - 5 ng/g, encontró un rango de
los coeficientes de correlación entre R2> 0.980 a 0.997. de los cuales r2> 0.997
correspondió para AMOZ. r2> 0.936 para SEM y r2>0.980 para AHD. Bock et al
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(2007) encontraron parámetros similares en muestras de camarón y pollo, en
AMOZ, SEM, AHD y AOZ (r2 de 0.99 a 0.98).
En el presente estudio, utilizando igualmente cinco niveles (n= 5) pero con rangos
de 0.3 – 4 ng/g, se determinaron coeficientes de correlación (r) de 0.9975 para
AMOZ, 0.9974 para AHD, 0.9901 para AOZ y 0.9905 para SEM. ver figura 1 Estos
resultados muestran que el método aquí empleado mostró una sensibilidad
comparable a lo obtenido por otros investigadores, mismos que se encuentran
dentro de los parámetros que menciona la Organización de las Naciones Unidas
para la Agricultura y la Alimentación (FAO) en su proyecto TCP/RLA/3013 (A).
Figura 1 Representación de la linealidad de los diferentes analitos de nitrofuranos
REPRODUCIBILIDAD:
La reproducibilidad del método se realizo como lo indica la FAO TCP/RLA/3013(A)
(2005), se hicieron varias reproducciones de las curvas en distintos tiempos (2
curvas el primer día, 1 el tercer día y 2 curvas el quinto día) encontrándose un
coeficiente de correlación para cada una de las curvas en sus cinco niveles (0.3,
0.5, 1.0, 2.0, 4.0 ng/ml). El promedio del coeficiente de correlación (r) es de 0.9975
para AMOZ, un 0.9974 para AHD, un 0.9957 para AOZ y un 0.9952 para SEM ver
tabla 2.
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Tabla 2.- Linealidad de las curvas 1, 2, 3, 4, 5, para demostrar la reproducibilidad de la
prueba con promedios de coeficiente de correlación superior a 0.99
Se realizo un muestreo de 32 lotes distintos de dos rastros TIF que existen en el
Estado de Nuevo León, encontrándose que las 32 muestras de músculo fueron
negativas a la presencia de los cuatro analitos de Nitrofuranos (Nitrofurazona
(SEM), Furazolidona (AOZ), Furaltadona (AMOZ), Nitrofurantoína (AHO)).
Previamente, en un estudio realizado en el 2006 por la Secretaria de Agricultura,
Ganadería, Desarrollo, Rural, Pesca y Alimentos en su programa Mexicano de
Monitoreo y Control de Residuos Tóxicos y Contaminantes en Alimentos de Origen
Animal (PMMCRT 2007), encontraron una prevalencia muy baja en diferentes
especies animales mientras que en bovinos de 300 muestras tomadas a nivel
Nacional de Músculo de bovinos, 8 fueron positivas a Nitrofuranos (AMOZ),
mientras que en otro estudio realizado en el 2006 por el National Residue Program
Data de la “Food SAFETY and Inspection Service” publico, de 21,479 muestras
analizadas se encontró 1 muestra positiva a nitrofuranos. Así mismo, Chedy
(2005), en Chile encontró 157 bovinos, 25 porcinos, 25 aves, 15 pavos, 4 ovejas,
dando un total de 226 animales, positivos a residuos de Nitrofuranos. Un año
después (2005) el Ministerio de Agricultura y Ganadería en su Programa de
Control de Residuos del Gobierno de Chile, encontró a 180 bovinos, 25 aves y 15
pavos dando un total de 220 animales positivos a Nitrofuranos (PCR 2005).
Esto muestra que aparentemente el uso de nitrofuranos en bovinos de lotes de
engorda de esta región es muy limitado, también puede ser que las explotaciones
ganaderas cumplen con los programas de buenas prácticas de manejo e
inocuidad alimentaria. No obstante es necesario realizar subsecuentes estudios
para validar las observaciones mostradas en este trabajo.
CONCLUSIONES
La Cromatografía Liquida de Alta Resolución con detector de Masa (HPLCMS/
MS), permite el análisis simultáneo de cuatro metabolitos del Nitrofuranos (AOZ,
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AMOZ, AHD y SEM) en un tiempo relativamente rápido y con alto nivel de
confiabilidad.
Este método puede usarse como método de prueba diagnostica para determinar
residuos de nitrofuranos en musculo de bovino así como de otros animales.
La presencia de nitrofuranos en músculo de bovinos en los rastros TIF
aparentemente tiene una baja frecuencia, lo que implica que estos compuestos no
son empleados o su uso es muy limitado. No obstante será necesario realizar
análisis posteriores para determinar la existencia en otros rastros que no cuenten
con la inspección federal para saber la presencia de los analitos de nitrofuranos.
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