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CAPITULO 18 RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS Y LÍPIDOS DE SUBPRODUCTOS ACUÁTICOS Jacek Jaczynski Yi-Chen Chen Joaquín Rodrigo J. Antonio Torres INTRODUCCIÓN Desde tiempos prehistóricos los productos de la pesca han sido un componente importante de la alimentación de homínidos y posteriormente del Homo sapiens (Stewart, 1984). Una ensalada de pescado en una receta china que data de 1300 a.C., describiendo una carpa marinada y con especias, es la receta de cocina más antigua que se conoce (Zugarramurdi y col., 1995). Los métodos de procesamiento de pescado tales como ahumado, fermentación, y seco salado fueron básicos para la creación de industrias en el imperio romano (McCann, 1988). China tiene una larga tradición en acuicultura y ya en el 2000 a.C., el pescado era cultivado para servir como alimento (Kreuzer, 1974). Esta antigua tradición, y la experiencia acumulada a lo largo de los años, contribuyó probablemente a que en la actualidad China tenga la industria de acuicultura más grande del mundo (Anónimo, 2004). El procesamiento de alimentos inevitablemente genera tanto subproductos como desechos, y la industria de alimentos de origen acuático no es la excepción. De hecho, la utilización de estos subproductos, y la reducción en la cantidad de desechos, son los factores más importantes para determinar la viabilidad económica de esta industria (Gildberg, 2002). En las pesquerías tradicionales y no industrializadas, la mayoría del trabajo es realizado por personal entrenado y experto que se renueva de forma generacional. En ellas, la mayoría del pescado es utilizado para consumo humano, alimentación animal o para fertilizantes agrícolas. Por otro lado, la industrialización de las pesquerías, dirigida a incrementar los beneficios económicos, ha traído importantes desarrollos, pero paralelamente ha incrementado la cantidad de subproductos generados (Gildberg, 2002). Ejemplos típicos de este problema son la pesca por arrastre, el procesado de krill (Euphausia superba) y el fileteado mecanizado de pescado. Durante la captura por arrastre del camarón, langostino y gamba es común encontrar que el 90% de la captura sea fauna de acompañamiento sin valor comercial, por lo que es desechada (Raa y Gildberg, 1982). Por otro lado, en el procesado comercial de krill, el rendimiento de la recuperación de carne es extremadamente bajo, oscilando entre 10 y 15% de su peso (Suzuki, 1981). Finalmente, en el fileteado mecánico de pescado, el rendimiento en filetes fluctúa entre 30 y 40% generando un 60-70% de subproductos (Gildberg, 2002). Si bien la práctica de “moler y sencillamente desechar” este 60-70% de subproductos es frecuente, esta estrategia debe considerarse como una forma irresponsable de aprovechar los recursos disponibles para satisfacer nuestras necesidades nutricionales. Existen serios malentendidos en cuanto a la definición de subproductos de alimentos acuáticos. En los procesos de la industria pesquera, así como en la literatura científica, son tres los términos que frecuentemente se utilizan en forma poco diferenciada para describir los mismos materiales: (1) despojos, (2) desechos y (3) subproductos. Los dos primeros términos implican que dichos materiales no pueden ser utilizados y deben ser eliminados, por lo que tienen una connotación negativa. En cambio, el tercer término sugiere que si se le trata de forma adecuada se podría recuperar algún componente con valor, y por lo tanto es positivo. Actualmente, la definición más común es denominar subproducto a cualquier material, comestible o no, que resulte del procesado del producto principal. Un ejemplo típico es el fileteado de pescado, donde el filete es el producto principal y la piel, cabeza e intestino serían los subproductos. Es un error denominar a estos subproductos como “desechos” ya que la carne que queda en la piel y en la cabeza es de buena calidad (Strom y Eggum, 1981). Si se aplica de forma exitosa una tecnología de recuperación de esta carne, esto añade valor al proceso y además reduce la contaminación ambiental. Los subproductos pueden ser procesados para la obtención de cuatro clases de producto: (1) fertilizantes agrícolas, (2) alimentos para animales, (3) alimentos para el hombre con valor agregado y (4) ingredientes especiales. En general, la conversión a fertilizantes resulta en un menor valor comercial, mientras que su transformación en alimentos para el hombre o ingredientes especiales consigue el mayor valor añadido a los subproductos. Se ha estimado que el valor añadido a los subproductos resultante de su transformación hacia alimentos para el hombre incrementará cinco veces en la próxima década (Gildberg, 2002). SITUACIÓN GLOBAL DE PESQUERÍAS Y SUBPRODUCTOS Existe buena información sobre la captura mundial de pesca y la producción de piscifactorías en el Departamento de Pesquerías de la Organización para la Agricultura y Alimentos (FAO por sus siglas en inglés) de las Naciones Unidas. Sin embargo, la cantidad de subproductos sólo puede ser estimada (Anónimo, 2004). Si bien la captura mundial de pesca se ha mantenido estable en los últimos veinte años, y se pronostica que no incrementará en el futuro, el sector de acuicultura incrementó su producción en un 27% en el mismo periodo (Tabla 1) y actualmente contribuye con un 50% de las capturas de pescado (Vannuccini, 2004). La FAO predice que el aumento futuro en la demanda de alimentos acuáticos sólo puede ser satisfecho por un incremento en la producción de las piscifactorías. Por otro lado, en el 2002, cerca del 76% de la producción pesquera mundial fue utilizada para consumo humano directo y el 24% restante se destinó a la producción de harina y aceite de pescado, la cual genera pocos subproductos. Sin embargo, y a pesar de utilizar una cuarta parte de los recursos pesqueros, esta industria contribuye sólo con un 3.8% al valor económico de la industria pesquera (Anónimo, 2004). < TABLA 1 > Alrededor de 100 millones de toneladas son capturadas para consumo humano directo, pero solo una fracción de este enorme recurso es utilizado. Por ejemplo, en el fileteado comercial de bacalao, salmón, trucha, tilapia, dorada, abadejo y otras especies comerciales se genera un 60-70% como subproducto. La cantidad de carne de pescado y aceite remanente en este subproducto varía ampliamente, pero en función del peso total del pescado procesado fluctúa típicamente de 20-30% y 5-15%, respectivamente. El aceite de pescado es altamente poliinsaturado (alto contenido de ácidos grasos omega-3), y por lo tanto es muy susceptible a la oxidación , resultando en desarrollo de rancidez. Si se recupera eficientemente el aceite del subproducto y es utilizado para consumo humano, la harina remanente y libre de grasa se puede destinar a la producción de alimento balanceado para animales. Los 100 millones de toneladas capturadas para consumo humano no incluyen la fauna de acompañamiento y la pesca descartada, estimada aproximadamente en unos 30 millones de toneladas, los que representan recursos disponibles no utilizados (Zugarramurdi y col., 1995). Otro recurso no utilizado a gran escala comercial para consumo humano es el krill que solamente se utiliza para la producción de alimento para piscicultura. El krill podría contribuir en forma importante a satisfacer las necesidades nutricionales humanas de proteínas, y por lo tanto evitar problemas ambientales asociados a la sobrepesca, así como prevenir la extinción de algunas especies marinas. Este enorme recurso, estimado entre 400 y 1550 millones de toneladas, podría ser capaz de sostener entre 70 y 200 millones de toneladas anuales en captura de krill (Suzuki y Shibata, 1990). La biomasa de krill disponible para consumo humano es comparable a la biomasa de todas las demás especies acuáticas capturadas por el hombre, y es probablemente la mayor de cualquier especie animal multicelular en el planeta (Nicol y Endo, 1999). El krill es poco utilizado para consumo humano debido a la falta de una tecnología eficaz para la recuperación de su carne. Los krill son pequeños crustáceos que se asemejan a camarones (Figura 1) pero contienen enzimas proteolíticas extremadamente activas. Durante la cosecha, estas enzimas son liberadas, de tal forma que literalmente licuan su carne a velocidades muy rápidas (Kolakowski y Lachowicz, 1982). < Figura 1 > OPORTUNIDADES El volumen de la biomasa de los subproductos acuáticos y especies subutilizadas es asombroso. Al mismo tiempo, la sobrepesca, el agotamiento y otros problemas medioambientales asociados con el procesado de alimentos acuáticos, son cada vez más importantes en los medios populares. La población mundial está incrementando, y en el futuro será aún más difícil cubrir sus necesidades nutricionales, principalmente las de proteínas y lípidos, utilizando recursos acuáticos. Aunque la acuicultura puede aliviar estos problemas, es muy importante desarrollar tecnologías más eficientes para mejorar los rendimientos de productos destinados al consumo humano y al mismo tiempo reducir la cantidad de subproductos. El desafío es también encontrar usos adecuados para los productos recuperados, de forma que al final el proceso sea económicamente viable y ecológicamente sostenible. El desarrollo de tecnologías de recuperación más eficientes requiere el estudio de algunas propiedades fundamentales de las materias primas, pues sólo así es posible manipular su comportamiento, y de ese modo incrementar el rendimiento de recuperación de los procesos industriales. Por definición, carne es la porción comestible obtenida a partir de tejidos musculares y es una mezcla principalmente de agua, proteínas y lípidos intramusculares. Por lo tanto, para desarrollar nuevas tecnologías, es necesario conocer el comportamiento de estos tres componentes. PROPIEDADES DEL AGUA EN LOS ALIMENTOS El contenido de agua de un producto de la pesca depende de la especie y puede variar ampliamente alcanzando incluso hasta el 90%. En el producto final, el agua no sólo controla su peso y por lo tanto los beneficios económicos, sino que también influye en en las propiedades organololepticas percibidas por el consumidor. Desde el punto de vista de la nutrición humana, el agua no contribuye en calorías, y por ello cuanto mayor sea su cantidad, más dietético (menos calorías) será el producto. Sin embargo, cuando el agua es añadida al producto, se necesitan componentes que la retengan para prevenir pérdidas por escurrido. Las proteínas de la carne (músculo) tienen buena capacidad de retención del agua (WHC por sus siglas en inglés) si el producto no es maltratado, particularmente desde el punto de vista térmico. Por ejemplo, las proteínas del músculo de krill tienen muy buena WHC, sin embargo, son muy sensibles al abuso de temperatura (Suzuki, 1981). En los sistemas de carne, el agua proporciona un medio de reacción en el cual otros componentes tales como proteínas y lípidos están suspendidos o disueltos. Por ello, es de vital importancia conocer la forma en la que el agua interacciona con estos componentes. La molécula de agua es un dipolo debido a la ligera carga eléctrica negativa y positiva que poseen los átomos de oxígeno e hidrógeno, respectivamente (Figura 2). Esto ocurre debido a que el oxígeno atrae electrones de los dos átomos de hidrógeno provocando una ligera electronegatividad en el oxígeno y dejando al hidrógeno ligeramente positivo. Esto significa que la molécula de agua tiene una ligera carga electrostática que le permite formar puentes de hidrógeno con otras moléculas cargadas (Figura 2). Esta propiedad es muy importante en tecnología de alimentos, porque algunos componentes tales como las proteínas pueden estar cargadas y por lo tanto formar puentes de hidrógeno. Por esta razón, los componentes de la carne son solubles en agua si están cargados para que así sea posible su interacción con el agua a través de enlaces de hidrógeno. < FIGURA 2 > PROPIEDADES BÁSICAS DE LAS PROTEÍNAS Y LÍPIDOS DEL PESCADO Proteínas del pescado Hay dos tipos de músculos en alimentos acuáticos, el músculo estriado, que tiene un aspecto franjeado característico, y el músculo liso que no muestra estas franjas. El músculo estriado es el principal componente en la carne de pescado y animales terrestres, mientras que el músculo suave es característico de la carne de moluscos. El músculo de pescado también puede ser dividido en músculo blanco y oscuro. El músculo oscuro recorre el cuerpo del pescado por debajo de la piel. Las proteínas del músculo pueden clasificarse en: (1) Proteínas miofibrilares Son proteínas solubles en soluciones salinas concentradas, siendo la actina y la miosina las más abundantes y de mayor importancia por su funcionalidad. En el proceso de contracción muscular son también importantes la tropomiosina y troponina que actúan como proteínas reguladoras, iniciando o terminando el proceso contráctil de la actina y la miosina. Estos agentes contráctiles conforman los haces de miofibrillas del tejido muscular unidos por el tejido conectivo o proteínas del estroma. En general, la carne de pescado tiene menos tejido conectivo que la de animales terrestres (pescado – 3-5%, vacuno – 1628%) (Suzuki, 1981). (2) Proteínas sarcoplásmicas Son proteínas solubles en soluciones salinas diluidas y corresponden al miógeno y globulinas. En el músculo, la mioglobina cumple una función similar a la de la hemoglobina de la sangre. Ambas forman un complejo con el oxígeno, pero sus funciones son diferentes. La mioglobina es esencialmente un mecanismo de almacenamiento de oxígeno en las células. Es una proteína conjugada con una globina (cadena peptídica) y una parte no proteica, el hemo de hierro compuesto por un átomo de hierro y porfirina. (3) Proteínas del tejido conjuntivo Son proteínas insolubles en soluciones salinas concentradas a bajas temperaturas, pero al calentarlas en agua a 60 ó 70 °C las fibras de colágeno se contraen a un tercio o un cuarto de su longitud inicial. A 80 °C, el colágeno se transforma en gelatina y es soluble en agua. A diferencia del colágeno, la reticulina no se transforma en gelatina al hervir. La fuerza iónica (IS por sus siglas en inglés) es un factor importante en la solubilidad en agua de las proteínas. La IS representa el estado de electrolitos o sales ionizadas presentes en un sistema. Generalmente, cuanto mayor es la fuerza iónica, mayor es la concentración de sales en el sistema. La miosina y actina son solubles en agua a valores de IS extremadamente bajos o por encima de 0,6. Por ello, a la IS fisiológica del músculo en el pescado, alrededor de 0,05 para trucha arco iris, estas proteínas son insolubles en agua. Las proteínas del estroma son completamente insolubles en agua mientras que las sarcoplásmicas son bastante solubles pero disminuye al aumentar la IS (Lanier y col., 2005; Suzuki, 1981). Las proteínas, incluidas las del músculo de pescado, contienen alrededor de veinte aminoácidos (AA). Todos los AA son indispensables para el crecimiento y mantenimiento de procesos metabólicos en el ser humano, pero a nueve de ellos se les clasifica como “esenciales” (EAA por sus siglas en inglés), pues el organismo humano no puede sintetizarlos y deben de estar presentes en la dieta. El valor biológico (BV por sus siglas en inglés) de una proteína mide su eficiencia para satisfacer las necesidades del organismo. Las proteínas del huevo se consideran como una fuente de referencia y se les asigna un BV de 100, lo cual significa que el 100% del nitrógeno es absorbido y retenido. Las proteínas de la leche, vacuno, pescado, maíz y arroz tienen un BV de 93, 75, 75, 72 y 59, respectivamente (Whitney y Rolfes, 2005; Murano, 2003). El BV de las proteínas del krill es ligeramente superior al de las proteínas de la leche (Suzuki y Shibata, 1990). Los AA tienen un grupo amino y uno ácido (carboxilo) unidos a un carbono central, que al reaccionar para formar proteínas, forman enlaces denominados peptídicos (Figura 3). Al diferencia de los puentes de hidrógeno, que mantienen los dipolos de agua, o que resultan de las interacciones entre proteína y agua, el enlace peptídico es mucho más fuerte. En soluciones, los grupos amino y ácido terminales pueden estar cargados electrostáticamente, y participan en interacciones agua-proteína vía puentes de hidrógeno (Figura 3). Aunque la energía del enlace de los puentes de hidrógeno es baja, cuando se presentan en gran número, estabilizan de forma eficiente la compleja estructura tridimensional de las proteínas. < FIGURA 3 > Las diferentes cadenas laterales de los AAs otorgan una gran diversidad de características a las proteínas. Mientras que las cadenas hidrofóbicas limitan su solubilidad en agua, las polares o hidrofílicas (cargadas) pueden resultar en una considerable interacción de agua-proteína a través de los puentes de hidrógeno. La interacción con agua es esencial para la solubilidad de las proteínas así como para su capacidad de retención de agua, mientras que la interacción débil hidrofóbica, puede resultar sin embargo en interacciones proteína-proteína y producir su agregación seguida de una precipitación. La cadena lateral del AA cisteína contiene un grupo sulfidrilo (–SH) que cuando es oxidado, por ejemplo durante un tratamiento térmico, forma un enlace covalente llamado enlace disulfuro (–S-S–). La fuerza de los enlaces –S-S– en combinación con las interacciones débiles entre AA hidrofóbicos son esenciales en la gelificación de las proteínas de pescado, y por ello responsables de la textura de productos con gran valor agregado como el surimi. Las cadenas laterales también pueden ser modificadas químicamente, dando como resultado a proteínas con propiedades funcionales diferentes. Aunque estas modificaciones químicas pueden producir proteínas no permitidas para consumo humano, ellas pueden ser interesantes aplicaciones no convencionales de las proteínas recuperadas de subproductos. Las condiciones a las cuales las proteínas son sometidas afectan la carga electrostática de la cadena lateral de sus AA, modificando la solubilidad de las proteínas (Figura 4). Añadiendo ácido a una solución, éste se disocia donando iones hidrógeno (es más riguroso decir que son iones hidronio H3O+), neutralizando las cargas negativas de las proteínas y dando como resultado una mayor carga positiva global. Añadiéndole una base a la solución, la proteína eventualmente tendrá una mayor carga negativa (Figura 4). Conforme la proteína adquiere una carga global positiva o negativa, comienza gradualmente a haber una interacción electrostática con los dipolos del agua. A medida que aumentan las interacciones proteína-agua, las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína disminuyen. Por lo tanto, a la vez que la proteína se hace más polar (cargada) su solubilidad en agua se incrementa. < FIGURA 4 > Es posible ajustar el pH de la solución de proteína a un valor tal que el número de cargas negativas en su superficie sea igual al número de cargas positivas, y así, la molécula de la proteína adopta una carga electrostática global cero o neutra. El pH al cual esto ocurre se denomina punto isoeléctrico (pI) (Figura 4). El punto isoeléctrico es específico para una proteína y es muy importante desde el punto de vista tecnológico, pues conforme disminuyen las cargas de la superficie de las proteínas también lo hacen las interacciones proteína-agua y por consecuencia su solubilidad en agua. La hidrofobicidad producida por las interacciones proteína-proteína son mayores en el pI, y por ello a este pH las proteínas precipitan fácilmente. Este comportamiento de las proteínas permite modificar su solubilidad para inducir su precipitación ajustando el pH. Como aparte del agua, las proteínas son el mayor constituyente del pescado, esta propiedad puede ser utilizada para recuperarlas a partir de subproductos. Mientras que las proteínas de la carne sean solubles, favorecidas por la interacción proteína-agua, las impurezas (espinas, piel, escamas, etc.) son insolubles y pueden ser separadas fácilmente por precipitación o centrifugación. Las proteínas se recuperan a continuación ajustando el pH a su pI lográndose su precipitación debido a interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, las proteínas de la leche (caseína) y de la soya se recuperan por medio de la aplicación de este principio. En la fabricación del queso, la caseína de la leche precipita a pH 4,6, separándose la cuajada de la leche (queso) y el suero como subproducto. Las proteínas del pescado, al igual que otras proteínas, pierden su funcionalidad si ocurre una desnaturalización, un fenómeno físico-químico complejo que produce realineamientos espaciales de la estructura tridimensional de la proteína nativa, principalmente por rotura de los enlaces de hidrógeno que la estabilizan. Si esta estructura es modificada significativamente, la proteína perderá solubilidad, WHC, ó formará geles más débiles. El alimento tendrá una textura pobre y presentará desprendimiento de agua. La desnaturalización puede ser reversible o no, dependiendo de la proteína y del nivel o intensidad del agente desnaturalizante. Una desnaturalización típica es la inducida por abusos térmicos, como durante el almacenamiento en congelación del pescado por tiempos excesivos o a temperaturas no adecuadas. En general, las proteínas derivadas de pescados de aguas frías son más sensibles al daño por temperatura que sus homólogos de aguas más calidas. Las radiaciones ionizantes y el pH son otros ejemplos de agentes desnaturalizantes. Lípidos del pescado La grasa del músculo de pescado varía ampliamente con la especie, edad, estación de desove, alimentación y región anatómica. El contenido de proteína del músculo del pescado es relativamente variable, pero el de la grasa es por lo general inversamente proporcional a su contenido de agua. Esto significa que cuanta más grasa contenga la carne del pescado, menor será su contenido de agua. Los depósitos de grasa se encuentran esparcidos por toda la estructura muscular, pero la concentración de células grasas parece ser más elevada cerca de las miocomatas y en las regiones entre el músculo blanco y el oscuro (Kiessling y col., 1991). El músculo oscuro contiene algunos triglicéridos dentro de las células musculares, incluso en peces magros, dado que este músculo es capaz de metabolizar lípidos directamente para la obtención de energía. Por ello, el músculo oscuro contiene más grasa que el blanco, más suministro de oxígeno sanguíneo para metabolizar grasas, mayor concentración de mioglobina pro-oxidativa, y además debemos considerar la presencia de las mitocondrias, los organelos celulares que oxidan sustratos para producir energía. Estas características que permiten al músculo oscuro utilizar directamente los lípidos para la obtención de energía (Kiessling y col., 1991), tienen que ser consideradas desde el punto de vista de su conservación pues la oxidación de esas grasas, en su mayoría poliinsaturadas, podrían desarrollar olores desagradables, incluyendo rancidez (Hultin y col., 2005). Las células del músculo blanco dependen del glucógeno como fuente de energía para el metabolismo anaeróbico. Por estas razones, la carne de pescado blanco es preferida por los consumidores, pero sería beneficioso desde el punto de vista económico, desarrollar una tecnología para eliminar el aceite de pescado del músculo oscuro, y así añadir valor a un producto con poco valor económico. Los lípidos más importantes de la masa muscular, los triglicéridos utilizados para producir los aceites de pescado, son químicamente una molécula de glicerol unida covalentemente a través de enlaces tipo ester a tres cadenas de ácidos grasos (AG) de diferente longitud y niveles de saturación (Figura 5). Las propiedades funcionales de los aceites de pescado dependen de la composición de los AG unidos al glicerol. En general, los lípidos son hidrofóbicos y por ser de menor densidad específica que el agua, tienden a coalescer o aglutinarse y flotar en la superficie de una solución acuosa si se espera el tiempo suficiente, o se aplica una centrifugación adecuada. Al contrario que las proteínas del músculo, los triglicéridos de pescado no tienen cargas eléctricas y no forman enlaces de hidrógeno con el agua. Por esta razón son frecuentemente llamados componentes apolares o hidrofóbicos. Debido a su carácter hidrofóbico, los lípidos pueden interaccionar con cadenas laterales (R) hidrofóbicas de los AA de las proteínas del músculo de pescado, formando enlaces hidrofóbicos débiles lípidoproteína. < FIGURA 5 > El aceite de pescado, en estado líquido a temperatura ambiente, suele ser procesado a temperaturas más frías que lo vuelven más viscoso. Para facilitar la separación del aceite de las mezclas de carne de pescado, el productor podría elevar ligeramente la temperatura, pero sólo lo necesario para hacer el aceite un poco menos viscoso. Esta estrategia es utilizada en la industria de la leche donde se la calienta ligeramente para la producción de crema, aunque es necesario señalar que los AG en leche son en su mayoría saturados, y por lo tanto menos susceptibles a la oxidación. Otro tipo de lípidos, probablemente más importantes que los triglicéridos para un tecnólogo pesquero, son los fosfolípidos, componentes integrales de las membranas celulares. Este compuesto tiene dos AG covalentemente unidos a través de enlaces tipo ester con una molécula de glicerol. El tercer grupo formando un enlace con la molécula de glicerol es un fosfato cargado positivamente y a su vez unido a otro grupo cargado, que en la mayoría de los casos es un grupo colina (Figura 6). Debido a estos grupos cargados y a sus dos AG, los fosfolípidos tienen propiedades lipo e hidrofílicas, por lo que son frecuentemente denominados compuestos anfifílicos. Los fosfolípidos pueden crear enlaces hidrofóbicos con otras sustancias y al mismo tiempo pueden interactuar con agua y proteínas cargadas (Figura 6). Por ello, los fosfolípidos, que pueden utilizarse como emulsificantes en la formulación de alimentos, dificultan la separación del aceite de pescado del agua y las proteínas. Las estrategias comunes para controlar la oxidación lipídica, causada por esta mala separación, son el envasado al vacío, almacenamiento bajo congelación, así como el uso de antioxidantes (tocoferoles, vitamina E, etc.) y de absorbentes de oxígeno. < FIGURA 6 > Los fosfolípidos de membrana suelen tener un mayor grado de insaturación, mayor área que los triglicéridos del músculo, y están relacionados con procesos prooxidantes como los producidos en la mitocondria. Además, son parte de las membranas celulares semipermeables, que requieren un cierto nivel de fluidez para su funcionamiento, el cual está en función del punto de fusión de los AG de los fosfolípidos que depende de su longitud y nivel de insaturación. Por ello, los fosfolípidos de membrana son más susceptibles a la oxidación que los triglicéridos intramusculares, y aunque su contenido en el músculo de pescado es menor que el de triglicéridos, ellos contribuyen más al desarrollo de rancidez (Hultin y col., 2005). El problema es complejo, pues los fosfolípidos son difíciles de separar de las suspensiones de pescado por sus características anfifílicas. A diferencia de los productos de fuentes de origen terrestre, las reacciones de oxidación son un problema más frecuente en los productos de pescado graso debido al alto nivel de insaturación de sus lípidos. Aunque los AG poliinsaturados (PUFA por sus siglas en inglés) han sido correlacionados con una buena salud cardiovascular, los PUFA son altamente susceptibles a la oxidación lipídica. La mayor parte de estos beneficios han sido relacionados con el ácido eicosapentaenoico (EPA por sus siglas en inglés, 20:5ω-3) y el docosahexaenoico (DHA por sus siglas en inglés, 22:6ω-3), lo cual ha originado como productos de alto valor añadido a diferentes suplementos alimentarios comercializados por su contenido de estos AG. La nomenclatura omega-3 (ω-3) se refiere a que el primer doble enlace (C=C) aparece en el tercer átomo de carbono de la cadena del AG, contando desde el extremo con el grupo metilo (Figura 5). En los Estados Unidos de América (EUA), el DHA es comúnmente utilizado en el enriquecimiento de fórmulas infantiles, siendo el pescado y sus productos una excelente fuente natural de estos AG. Ambos, DHA y EPA, son ejemplos de AG omega-3 (ω-3) considerados AG esenciales (AGE) desde el punto de vista de la nutrición humana, porque al igual que los EEA, los AGE no pueden ser sintetizados por el cuerpo humano, y por ello deben estar presentes en la dieta. RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS FUNCIONALES Y LÍPIDOS DE SUBPRODUCTOS Aspectos generales El principio del punto isoeléctrico (pI) ha sido utilizado ampliamente en la elaboración de queso y separación de proteínas de soja. En la elaboración del queso, por acidificación o acción de las bacterias ácido lácticas (LAB por sus siglas en inglés), la leche alcanza un pH 4,6 donde la principal proteína, la caseína, precipita a su pI produciéndose la cuajada. El pI de las proteínas del músculo de pescado es de 5,5, por lo que precipitan a este pH y se vuelven gradualmente más solubles conforme el pH es más ácido o básico que este valor. Hay que recordar también la importancia de la IS como factor en la solubilidad de las proteínas. La solubilización y precipitación isoeléctrica de las proteínas del músculo de pescado, junto con la separación del aceite de pescado, fue recientemente patentado por tecnólogos de alimentos de la Universidad de Massachussets (Hultin y Kelleher, 1999, 2000, 2001, 2002). Desde entonces diferentes laboratorios han realizado investigación en esta área. En general, hay cinco etapas en la separación de proteínas y lípidos basada en esta estrategia (Figura 7). La primera etapa es homogeneizar, lo que se logra al moler los subproductos en agua utilizando una relación en peso de 1:6. En la segunda etapa, las proteínas del músculo de pescado presentes en el subproducto son solubilizadas a pH ácido o básico. Como se explicó anteriormente (Figura 4), conforme el pH se desplaza del pI, las proteínas del músculo de pescado presentan mayor carga electrostática negativa o positiva en su superficie, dependiendo de si se usa un pH bajo o alto, respectivamente. Estos cambios de carga debilitan las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína, y aumentan la repulsión electrostática proteína-proteína, favoreciendo las interacciones proteína-agua que permiten la solubilidad de la proteína en agua. Cuando las proteínas comienzan a interactuar con el agua, se produce un drástico aumento de la viscosidad, que disminuye tan pronto como las proteínas se hacen solubles. El incremento de viscosidad al comenzar la solubilización es un parámetro importante del procesado que puede producir problemas en la homogeneización creando gradientes de pH, diferencias en la solubilidad de proteínas y formación de espuma. Esta limitante se reduce manteniendo la solución a un pH controlado, lo que se facilita en los sistemas continuos de recuperación de proteínas y lípidos. <FIGURA 7> La tercera etapa comienza cuando las proteínas del músculo están completamente solubilizadas. Por centrifugación, se separa la solución en las fracciones ligera, media y pesada, correspondientes al aceite de pescado, las proteínas solubilizadas y las impurezas libres de grasa (huesos, piel, escamas, proteínas insolubles de la piel, etc.), respectivamente (Figura 7). Aunque los triglicéridos son hidrofóbicos, y relativamente fáciles de separar, los fosfolípidos de membrana no lo son debido a sus características anfifílicas La tercera etapa genera un aceite crudo de pescado rico en PUFA ω-3 provenientes de la fracción ligera, y puede ser utilizado para numerosas aplicaciones no sólo en alimentos. La fracción pesada es la mayor, tiene contenido bajo en grasa y es rica en minerales como Ca, Mg y P. Por lo tanto puede ser el componente principal en el desarrollo de pienso para alimentación animal así como para la comida de mascotas. En la etapa cuatro, el pH de la fracción media con las proteínas solubles del músculo de pescado, es ajustado hasta el pI de las proteínas del músculo de pescado (5,5). A este pH las proteínas precipitan debido al incremento de las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína y un descenso en las interacciones proteína-agua, así como en la repulsión electrostática proteína-proteína. Al igual que en el ajuste del pH de la etapa 2, conforme las proteínas comienzan a disminuir su interacción con los dipolos de agua, la viscosidad de la solución incrementa significativamente y la solución a este problema es la misma, mantener el pH a 5,5. Las proteínas ya precipitadas se separan por centrifugación, y en los sistemas continuos, el agua recuperada, normalmente tan clara como la añadida en la primera etapa, puede ser reutilizada. Durante todo el proceso, la temperatura se mantiene entre 1 y 8 °C para reducir la degradación de lípidos y proteínas. Las proteínas mantienen sus propiedades funcionales, incluyendo la capacidad de formar geles, por lo que pueden ser utilizadas como ingrediente activo en alimentos como el surimi, que en EUA es consumido preferentemente como sucedáneo de carne de cangrejo y langosta. Proteínas y lípidos del músculo de pescado Las curvas de solubilidad de las proteínas del músculo de pescado en función del pH muestran que el mayor grupo de proteínas, las miofibrilares, son solubles en agua a pH ácidos y básicos (Figura 8). La menor solubilidad, es decir la máxima precipitación de proteína, se produce entre pH 5 y 6. Sin embargo, la fuerza iónica de la solución tiene un papel muy importante en la solubilidad en agua de la miosina. Cuando la IS es ajustada a 0.2, el pH para la solubilidad mínima de las proteínas miofibrilares cambia aproximadamente en una unidad y la precipitación se produce en condiciones de mayor acidez. Esta diferencia es importante si se utiliza un sistema de recuperación continuo de proteínas y lípidos. Después de utilizar un ácido en el primer ajuste de pH (Etapa 2), se necesitará una base para ajustar el pH a 5,5 en la Etapa 4 y lo opuesto ocurre cuando se utiliza una base primero. En ambos casos, los ajustes de pH incrementarán la IS. En los sistemas continuos de recuperación el agua de proceso es reciclada y por lo tanto se puede producir una acumulación de sal, afectando al pH al cual las proteínas miofibrilares precipitan. < Figura 8 > El segundo grupo mayor de proteínas, las proteínas sarcoplásmicas, son solubles tanto a pH ácido como básico (Figura 8). Estas proteínas no precipitan con las miofibrilares entre pH 5 y 6, pero la IS también juega un papel importante en su precipitación y conforme aumenta la IS, comienzan a precipitar a pH 5,5. Por lo tanto en un sistema continuo, la recuperación de las proteínas sarcoplásmicas podría mejorar conforme se acumula sal. La solubilización y precipitación isoeléctrica consigue una recuperación relativamente alta de proteínas, incluso en procesos en lotes a nivel piloto, utilizando un sistema estacionario de frascos independientes y separación por centrifugación. Al contrario de los procesos en lotes, es probable que un sistema continuo con reciclaje de agua sea incluso más eficiente que el mostrado por un sistema estacionario de recipientes independientes con separación por centrifugación (Tabla 2, Hultin y col., 2005). En general, el rendimiento de recuperación de proteína parece ser ligeramente superior cuando la solubilización es llevada a cabo a pH ácido en comparación con un medio básico (Tabla 2). El mejor rendimiento de recuperación se alcanza cuando las proteínas son precipitadas a pH 5,5, y es peor cuando son precipitadas a pH 5 que cuando lo son a pH 6. Esto se debe a que la solubilidad de las proteínas miofibrilares aumenta más rápidamente a pH ácido que a pH básico (Figura 8). < Tabla 2 > El primer paso en el proceso de recuperación de proteínas por solubilización y precipitación isoeléctrica es la homogeneización de los subproductos. Típicamente, un homogeneizador de carne (por ejemplo un MCH-10, Stephan Machinery, Columbus, OH, EUA) se utiliza para reducir el tamaño de partícula por debajo de 0.2 mm para así aumentar el área superficial y facilitar la solubilización. Después del fileteado, el porcentaje del contenido de hueso, piel, escamas y otros residuos es más alto que en el pescado entero. Por ello, es importante determinar la fracción en la que se acumulan estas impurezas, siendo su contenido de cenizas un buen indicador. Cuanto mayor es el contenido de cenizas en una fracción, mayor es el contenido de impurezas en ella. El contenido de cenizas en base seca en el subproducto remanente de trucha después de su fileteado y en krill entero es de 13,9 y 17,4%, respectivamente, mientras que el de los filetes de trucha sin espinas ni piel y el de carne de cola de krill es de 5,5 y 11,1%, respectivamente (Tabla 3). En el caso de las proteínas de krill y trucha recuperadas por solubilización y precipitación isoeléctrica este contenido varía entre 4,3-6,0 y 0,9-2,1 %, respectivamente. Por lo tanto, las proteínas recuperadas por solubilización y precipitación isoeléctrica parecen contener menos impurezas (espinas, piel, escamas, etc.) que los filetes sin espinas y piel y la carne de la cola de krill. Por otro lado en la fracción pesada, las impurezas libres de grasa recuperadas en la Etapa 3 (Figura 7), contienen 41.1% de cenizas (Tabla 3). Esta fracción es mucho más alta en minerales importantes como Ca, P y Mg, y por lo tanto, puede ser utilizada en piensos para alimentación animal y de mascotas. Como esta fracción contiene una cantidad mínima de aceite de pescado, ella no confiere olor a pescado ni otorga problemas de rancidez a la carne de los animales alimentados con esta fracción. < Tabla 3 > Si las proteínas recuperadas son para ser utilizadas en productos para alimentación humana, su caracterización nutricional es esencial (Tabla 4). El contenido de EAA para las proteínas de krill y trucha recuperadas por solubilización y precipitación es comparable con el de las de soja desgrasada, y con el patrón de EAA para proteínas de alto valor biológico establecidas por el Consejo de Investigación en Alimentos y Nutrición (FNB por sus siglas en inglés) (Hui, 1999). Las proteínas de soja son el típico ejemplo de proteínas vegetales que pese a ser una excelente fuente de EAA, son más bajas en contenido de metionina del que recomienda la FNB, y también la lisina es menor que en las proteínas de origen animal. Las proteínas de krill y trucha recuperadas por solubilización y precipitación son una excelente fuente de metionina y lisina. Aunque las proteínas de krill y trucha recuperadas por solubilización y precipitación son inferiores en algunos EAA cuando los comparamos con los patrones de FNB, estos productos no son utilizados para la alimentación humana directa sin algún proceso de formulación, y por ello pueden ser una muy buena fuente nutritiva para la alimentación humana. < Tabla 4 > Aunque la solubilización a pH ácido generalmente resulta en mayores porcentajes de recuperación comparándolos con los obtenidos a pH básico (Tabla 2), la calidad de la textura de los geles de proteínas hechos con proteínas recuperadas a pH básico es mejor que la de los elaborados con proteínas recuperadas a pH ácido (Figura 9, Hultin y col., 2005). Los geles de proteínas recuperadas a pH básico son más firmes, y también tienen mayor blancura, que los de proteínas recuperadas a pH ácido (Hultin y col., 2005). Por lo tanto, y a pesar de tener la recuperación a pH básico un menor rendimiento, la mayor calidad de las proteínas recuperadas es un aspecto importante a considerar para el productor. Sin embargo, esta característica particular dependerá de la aplicación final y del precio de las proteínas recuperadas. < Figura 9 > La concentración de lisina es también crítica en algunas aplicaciones que no son alimentarias. Las proteínas pueden ser químicamente modificada para hacer hidrogeles biodegradables súper absorbentes (SAH por sus siglas en inglés) en los que una alta concentración de lisina es esencial (Damodaran, 2004). Alrededor de 1 g de estos SAH es capaz de atrapar 400 g de agua o solución salina en una red de gel, y podrían ser una alternativa para los SAH basados en hidrocarbonos no degradables utilizados en pañales, toallas de papel y otros productos con gran mercado. El krill tiene una actividad proteolítica endógena alta (Kolakowski y Lachowicz, 1982), lo cual ha impedido hasta cierto punto su desarrollo tecnológico hacia productos alimentarios (Suzuki, 1999). La Figura 10 muestra la viscoelasticidad (G’) de proteínas recuperadas de músculo de krill usando la solubilización y precipitación isoeléctrica. Conforme la pasta de proteína de krill es sometida a rampas lentas de calentamiento (1°C/min) en un reómetro dinámico, las proteínas comienzan a formar un gel lo cual resulta en un aumento de la elasticidad y un descenso de la viscosidad de la pasta (aumenta G’). Las proteínas del plasma bovino (BPP por sus siglas en inglés), han sido utilizadas como inhibidores de la proteasa en la industria del surimi cuando se utilizan especies con tendencia a la proteólisis enzimática, tales como la merluza del Pacifico. Cuando la pasta de proteína de krill es formulada sin BPP y calentada lentamente en un reómetro dinámico, se produce una proteólisis extensiva hasta los 60 °C y las proteínas no forman un gel. Sin embargo, cuando se añade 1% de BPP (peso/peso, base húmeda) a la pasta de proteína de krill y es calentada a la misma rampa de temperatura, las proteínas recuperadas gelifican (Figura 10). Por lo tanto, parece que la proteasa del krill responsable de la degradación es retenida con las proteínas recuperadas por solubilización y precipitación, al igual que la catepsina L en la merluza del Pacifico durante los lavados con agua utilizados en la elaboración de surimi (Choi y col., 2005). Además del BPP, existen diferentes inhibidores de actividad proteasa disponibles comercialmente, y su utilización es muy recomendable en las formulaciones con proteínas de krill. Otra alternativa podría ser el calentamiento rápido tipo óhmico. < Figura 10 > Desde el punto de vista económico la recuperación rápida de proteína es importante. La separación durante la Etapa 5 (Figura 7) es relativamente lenta debido al pequeño tamaño de partícula de las proteínas del músculo que fueron primero solubilizadas y posteriormente precipitadas. Por lo tanto, se necesita una fuerza de centrifugación relativamente alta y un largo tiempo de residencia en el decantador para conseguir esta separación. El tamaño de las partículas puede aumentarse incrementando el tiempo en la Etapa 4, usando preferiblemente alrededor de 24 h, para así incrementar las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína después del ajuste de pH. Es importante que la temperatura durante este periodo sea controlada entre 1 y 8°C para así minimizar la desnaturalización de proteína y el crecimiento de microorganismos. De acuerdo con la ley de Stoke (Ecuación 1), la velocidad (S) de una partícula bajo centrifugación depende de cuatro variables: (1) densidad diferencial entre las fases (∆ρ), (2) viscosidad (µ), (3) fuerza centrífuga (g) y (4) tamaño de la partícula expresado como diámetro equivalente (D). S= ∆ρ * g * D 2 µ (1) La única variable para un sistema de recuperación utilizando una centrífuga con velocidad dada, es el tamaño de la partícula. Si el tamaño de la partícula se aumenta en tres veces, la velocidad aplicada a la partícula aumentará nueve veces. El tamaño de la partícula de proteína no sólo puede ser aumentado proporcionando un mayor periodo de interacción hidrofóbica proteína-proteína, sino que también puede ser logrado por la adición de floculantes. Los floculantes son comúnmente utilizados en la industria de alimentos y en el tratamiento de agua de bebida con la finalidad de clarificar soluciones, existiendo por ello muchas alternativas comerciales (Figuras 11 y 12). El segundo ajuste de pH (Etapa 4) necesita normalmente 10 min en un sistema de recuperación continuo. El floculante puede ser inyectado en un reactor biológico (Etapa 4) para inducir floculación de proteínas y por lo tanto incrementar la eficiencia de separación de la siguiente etapa. El floculante no debe tener efectos adversos en el color o propiedades gelificantes de las proteínas recuperadas y debe estar aprobado por las autoridades locales correspondientes. < Figura 11 y 12 > Los lípidos recuperados en la Etapa 3, como fracción ligera, son ricos en PUFA ω-3 tales como DHA, EPA y ácido alfa linolénico (ALA), y gracias a su reconocido efecto beneficioso sobre la salud humana, son ingredientes de alto valor comercial para la producción de alimentos funcionales. La solubilización y precipitación isoeléctrica se producen a pH relativamente extremos, lo cual puede causar degradación de estos AG que son muy sensibles a la oxidación. La degradación de los AG es mínima si se controla la temperatura y el tiempo de exposición al pH extremo durante la etapa de solubilización (Etapa 2) y primera separación (Etapa 4) es corto (Figura 13). Por lo tanto, este aceite de pescado crudo puede ser refinado y utilizarse en suplementos dietéticos, alimentos funcionales, nutracéuticos y en aplicaciones no alimentarias tales como cosméticos y aceites industriales para pinturas. < Figura 13 > Importancia del surimi en la industria pesquera El surimi es un proceso comercial basado en múltiples lavados con agua que permite recuperar principalmente las proteínas miofibrilares del músculo de pescado. Sin embargo, el procesado de pescado fresco utilizando esta tecnología, recupera sólo las proteínas miofibrilares (Lee, 1999), mientras que la solubilización y precipitación isoeléctrica permite la recuperación del 77.7 al 91.3% de todas las proteínas (Tabla 2). La baja eficiencia de la tecnología del surimi significa que las proteínas no recuperadas se acumulan en el agua de lavado. Incluso más importante que este bajo rendimiento de recuperación, es el consumo de grandes cantidades de agua limpia, alrededor de 20 veces el peso de la carne sin espinas (Lee, 1999). El agua de descarte generada por el proceso surimi en enormes cantidades tiene una alta demanda biológica de oxígeno (BOD por sus siglas en inglés) y por lo tanto, necesita de un tratamiento antes de ser eliminada. Su baja eficiencia, alto consumo de agua fresca y el daño medioambiental que pueden causar, han generado una presión política para que en algunas regiones se demande que estas plantas sean cerradas. En la actualidad existe una demanda legal del Centro Nacional de Regulación Medioambiental (NELC por sus siglas en inglés) en contra de los propietarios y operadores de una planta de surimi localizada en Warrenton City, OR. NELC alega que la planta ha estado violando la Ley de Aguas Limpias (Clean Water Act en inglés) de forma sistemática, degradando los acuíferos locales y poniendo en peligro las poblaciones de salmón plateado y salmón cabeza de acero” (NELC, 2003). Se ha propuesto recientemente un tratamiento con quitosano-alginato por parte de la Universidad Estatal de Oregon, como una nueva tecnología alternativa para reducir la demanda biológica de oxígeno (DBO) en el agua de descarte de las plantas procesadoras de surimi (Figura 14). El agua de lavado del surimi (SWW) puede ser tratada de forma efectiva con el complejo quitosano-alginato, utilizándose en la proporción de mezcla de 0.2 (w/w) y con una concentración del complejo de 0.1 kg/ton de SWW (Savant y Torres, 2000, 2003; Wibowo, 2003; Wibowo y col., 2005a,b). El quitosano, derivado deacetilado de la quitina, es un subproducto del procesado de crustáceos, particularmente del camarón, langostino y la gamba. Posteriormente a la extracción de la carne, los caparazones son desmineralizados usando ácido clorhídrico, lavados y secados para obtener la quitina, que entonces es deacetilada química o enzimáticamente. El alginato, por otra parte, es un polisacárido extraído de las paredes celulares de algas pardas y usado en la industria de alimentos como espesante, estabilizador o agente gelificante. <FIGURA 14> El contenido en proteína cruda de los sólidos insolubles recuperados, utilizando la tecnología del complejo quitosano-alginato, excede el 70% (Wibowo, 2003; Wibowo y col., 2005b), mientras que las cantidades de proteína recuperada varían con la concentración existente en las SWW, que fluctúa entre 0.5 y 2.3 % (Lin y Park, 1996; Morrissey y col., 2000). Después del tratamiento con el complejo polimérico, las proteínas son recuperadas por centrifugación y pueden ser enviadas a zonas para desecho, incorporadas al surimi, o venderse como componente para piensos. La recuperación de proteínas de las SWW genera también agua para su potencial reutilización en la planta. Los sólidos recuperados de las SWW, mediante el complejo quitosano-alginato, contienen proteínas con una alta concentración de EAA. Sustituyendo un 15% de la proteína de la dieta de animales de laboratorio con estos sólidos (el nivel máximo de sustitución recomendado por los productores comerciales de piensos para animales) se demostró que no tienen impacto fisiológico negativo y son de un valor nutricional equivalente a la caseína utilizada en la dieta control. Este estudio no mostró diferencias en el índice de crecimiento y la observación post-mortem de órganos internos no mostró daños producidos por la dieta experimental, lo que fue confirmado por análisis sanguíneo. Estudios posteriores demostraron que incluso la substitución del 100% de la proteína de la dieta por la de SWW no tiene impacto fisiológico negativo y es nutricionalmente equivalente o superior a otras fuentes de proteínas, mostrando una mayor relación de eficiencia proteica (PER por sus siglas en inglés) y relación neta de proteína (NPR por sus siglas en inglés) que la caseína utilizada como control. Este resultado tiene fuertes implicaciones para la región donde la planta de surimi se encuentre localizada. Por ejemplo en Oregon, que no es un productor importante, se necesitan 100 mil toneladas de pienso para mantener la producción avícola anual, lo que representa una excelente oportunidad de mercado local para las proteínas SWW. Se han utilizado muchas proteínas para modificar las propiedades mecánicas de los geles de surimi, siendo las de la clara de huevo y los concentrados del suero de la leche las más frecuentemente empleadas. Otras fuentes, como los extractos de leguminosas y las proteínas del plasma porcino, también han sido propuestas. Estas proteínas son añadidas para inhibir el fenómeno Modori (la degradación proteolítica de la miosina del pescado cuando los geles se incuban a temperaturas de 60 ºC), o para mejorar el fenómeno de setting (la mejora de las propiedades mecánicas por la acción de las enzimas transglutaminasas endógenas ó añadidas) (An y col., 1996; GarcíaCarreño, 1996; Sánchez y col., 1998; Benjakul y col., 2001). Cuando se añaden al surimi bajas concentraciones de proteínas de SWW, se mejoran sus propiedades mecánicas con un impacto mínimo en el color. Consideraciones de equipamiento En la Etapa 1 se utiliza un homogeneizador continuo que reduce el tamaño de partículas de los subproductos por debajo de 0,2 mm, pero lo suficientemente grande como para permitir la separación en la Etapa 3. Después de la homogenización, el producto resultante es bombeado hasta el Bioreactor 1 (Figura 15) para la reacción de solubilización que requiere unos 10 min. El bioreactor está equipado con una sonda que continuamente monitoriza el pH de la solución en el tanque y proporciona información al centro de control, que es programable y permite establecer el valor de pH al cual se quiere mantener el Bioreactor 1. Como el homogeneizado entrante tiene un pH cercano a neutro, típicamente 6,6-7,0, y como además este bioreactor de solubilización está programado para mantener el pH ácido o básico, se requiere una bomba anexa al tanque para ajustar rápidamente el pH. Una vez que el llenado inicial del bioreactor ha sido finalizado, se establece un equilibrio (homeostasis) y el bioreactor funcionará continuamente bajo control automático de pH. < Figura 15 > Los bioreactores en los sistemas de recuperación continua de proteínas y lípidos están equipados con agitadores, que permiten una mezcla adecuada para eliminar gradientes de pH y la excesiva entrada de aire que podría crear espuma. Además de las bombas para regular el flujo de ácido/base, hay otras para la inyección de aditivos de uso alimentario que controlan la formación de espuma y la separación de la emulsión. El sistema experimental ilustrado en la Figura 15 tiene control de temperatura y trabajando a 300 L/h, puede procesar alrededor de 43 kg/h de materia prima. Los bioreactores a escala piloto están fabricados de cristal Pirex y acero inoxidable, pero en los de nivel industrial se emplea polietileno (PE) de resistencia industrial, el cual soporta los valores de pH utilizados en la solubilización y precipitación isoeléctrica, a las condiciones de operación de una planta procesadora de pescado. Basado en el diseño piloto del sistema mostrado en la Figura 15, se ha diseñado un sistema bioreactor modular de 600 L para procesar 11 ton/día de materia prima. El uso de PE en este sistema modular es competitivo y parece factible para su empleo industrial. Finalmente, es necesario tener precauciones especiales de manejo con el bioreactor ya que en la Etapa 2 se manejan ácidos y bases de alta concentración. Después de 10 min para el ajuste de pH en la Etapa 2, la solución es bombeada al decantador para su separación (Figura 16). Normalmente, los decantadores industriales permiten fuerzas centrifugas por debajo de 4000 x g. En cuanto al pH, el decantador sólo funciona bajo condiciones extremas en la Etapa 3, en la que es necesario tener previstos protocolos de seguridad. Si el sistema de recuperación funciona de forma continua, los flujos de todas las etapas deberán ser calibrados apropiadamente. Además, si la descarga del bioreactor es de 300 L/h, los decantadores deben de ser capaces de manejar los mismos volúmenes. Los decantadores que normalmente se utilizan en las plantas de proceso del surimi no funcionan bajo condiciones extremas de acidez o basicidad, y deben ser evaluados apropiadamente antes de ser usados para la tecnología aquí propuesta. < Figura 16 > La Figura 17 muestra ejemplos de material recuperado a partir de subproductos de pescado. En la Etapa 3, el aceite de pescado (Figura 17 a), rico en ω-3 PUFA, es recuperado además de las impurezas libres de grasa (Figura 17 b) que son ricas en minerales. En la Etapa 5, las proteínas funcionales del músculo (Figura 17 c y d) son recuperadas junto con el agua que es reciclada para ser nuevamente utilizada en la Etapa 1. < Figura 17 > CONCLUSIONES La cantidad de subproductos generados por el procesado de los alimentos acuáticos así como el volumen de las sobrecapturas, descartes y pescado de bajo valor comercial, es enorme. Al mismo tiempo, la sobrepesca de algunas especies comerciales de pescado es un problema ecológico que las autoridades de gobierno están tratando de controlar con políticas que tienen un fuerte impacto en la rentabilidad de la industria pesquera. La acuicultura ha experimentado un gran crecimiento durante los 25 últimos años, suplementando de forma efectiva recursos naturales decrecientes. Sin embargo, esta industria tiene impactos en el medio ambiente y por ello es posible que su velocidad de crecimiento se vea disminuida. Por ello, es indudable que el reto tecnológico más importante es la optimización del procesado del pescado, que no ha cambiado esencialmente en muchos años y que contribuye en forma significativa a los problemas de contaminación en las zonas pesqueras. La nueva tecnología de solubilización de proteínas para el tratamiento de subproductos proporciona a la vez una gran oportunidad, así como un reto de implementación comercial a gran escala. La solubilización y precipitación isoeléctrica de las proteínas del músculo de pescado ha sido utilizada por mucho tiempo para recuperar proteínas de la leche y de soja. Conociendo bien las proteínas del músculo de pescado y su comportamiento, podremos ser capaces de desarrollar esta tecnología a nivel industrial para incrementar significativamente la eficiencia de la industria de alimentos de origen acuático. En el caso particular de la industria del surimi, la nueva tecnología basada en el complejo polimérico quitosano-alginato para el tratamiento del agua de descarte ofrece una gran oportunidad para aliviar los problemas medioambientales y de bajo rendimiento que caracterizan a esta industria. Además de la investigación básica, será necesario desarrollar aplicaciones para los productos recuperados. Probablemente se podría usar un modelo similar al de la industria láctea y el procesado de la soja. Las agencias del gobierno, así como las académicas, deben también estar comprometidas y colaborar en este esfuerzo. PREGUNTAS DE REPASO 1) ¿Han incrementado significativamente las capturas pesqueras en los pasados cinco años? 2) ¿Cuál es el porcentaje aproximado de subproductos (ej., cabeza, vísceras, estructura, etc.) al filetear el pescado (usando por ejemplo bacalao, salmón, trucha, tilapia, dorada, abadejo)? 3) ¿Cuál es la biomasa estimada sostenible de krill que puede estar disponible para consumo humano anualmente en comparación con el consumo humano de otros alimentos acuáticos? 4) ¿Cómo definiría subproductos de pescado? 5) ¿Por qué las moléculas de agua son llamadas dipolos? 6) ¿Qué propiedad tiene que tener una proteína para ser soluble en agua? 7) ¿Qué son los enlaces peptídico y tipo ester? 8) ¿Por qué ciertos lípidos son anfifílicos? ¿Cuál es su nombre genérico? Defina sus grupos moleculares principales. 9) ¿Por qué los lípidos de membrana del pescado son difíciles de eliminar de una solución? 10) ¿Cómo definiría el punto isoeléctrico de las proteínas? 11) Describa las semejanzas entre la elaboración del queso y la tecnología de recuperación de lípidos y proteínas descritas en este capítulo. 12) Enumere y justifique dos ejemplos de cómo incrementaría el tamaño de partícula de las proteínas. Explique como este incremento podría contribuir a aumentar la velocidad de sedimentación en el centrifugado. 13) Defina surimi, describa un producto comúnmente consumido en EUA y enumere los problemas actuales de industria del surimi. 14) Describa la solución aquí propuesta para mejorar la eficiencia de la producción de surimi y reducir los problemas medioambientales que causa. BIBLIOGRAFIA An, H., Margo, Y.P., Seymour, T.A. 1996. Roles of endogenous enzymes in surimi gelation. Trends in Food Science and Technology 7: 321-326. Anónimo. 2004. 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[PhD dissertation], Corvallis, OR: Oregon State Univ. 142 pp. Wibowo, S., Savant, V., Cherian, G., Savage, T.F., Torres, J.A. 2005a. Evaluation as a feed ingredient of surimi wash water protein recovered using a chitosan-alginate complex. Journal of Aquatic Food Products Technology 14(1): 55-72. Wibowo, S., Velazquez, G., Savant, V., Torres, J.A. 2005b. Surimi wash water treatment for protein recovery: effect of chitosan-alginate complex concentration and treatment time on protein adsorption. Bioresource Technology 96: 665–671. Zugarramurdi, A., Parin, M.A., Lupin, H.M. 1995. Economic engineering applied to the fishery industry. Food and Agriculture Organization Fisheries Technical Paper 351. Rome (Italy). Tabla 1. Producción y utilización pesquera global en millones de toneladas y estimación de aporte a la alimentación humana. Fuente: Adaptada de Anónimo. 2004. Estado de acuicultura y pesquerías mundiales. Organización para la Agricultura y Alimentos. Roma (Italia). 1998 1999 2000 2001 2002 2003 Captura 87.7 93.8 95.5 92.9 93.2 90.3 Acuicultura 30.6 33.4 35.5 37.8 39.8 41.9 Total 118.2 127.2 131.0 130.7 133.0 132.2 Consumo humano 93.6 95.4 96.8 99.5 100.7 103.0 Uso no alimentario 24.6 31.8 34.2 31.1 32.2 29.2 5.9 6.0 6.1 6.1 6.2 6.3 15.8 15.9 15.9 16.2 16.2 16.3 Población (miles de millones) Aporte alimentación per capita, kg Figura 1. La biomasa sostenible anual de krill disponible para consumo humano ha sido estimada como mayor a la suma de todas las demás especies acuáticas en explotación comercial. ESTOMAGO HEPATOPANCREAS INTESTINO CORAZON COLA AGALLAS Menor actividad proteolítica Mayor actividad proteolítica Figura 2. Las moléculas de agua son dipolos eléctricos con una función importante en la solubilidad de los componentes de un alimento. (a) Oxígeno del dipolo agua cargado negativamente (2δ–) con respecto a los dos hidrogeniones positivos (δ+) (b) Representación esquemática de como los dipolos de agua forman puentes de hidrógeno (a) (b) 2δ δ– Polo negativo del dipolo O δ+ H H Polos positivos del dipolo δ+ Los puentes de hidrogeno mantienen los dipolos de agua juntos y también interaccionan con otras moléculas cargadas del alimento permitiendo su solubilidad en el agua H2O H +NH 3 C COOH R Átomo de carbono central H NH2 C COO– R Dos aminoácidos Figura 3. Las proteínas son polímeros de aminoácidos formados por un carbono central unido a un grupo amino (+NH3), un grupo ácido (COO–) y una cadena lateral (R) única para cada aminoácido. Dependiendo de las propiedades de la cadena, las proteínas participan en interacciones hidrofóbicas proteína-proteína y forman enlaces de hidrógeno proteína-agua. Grupo amino (cargado positivamente) +NH 3 H C –R Dipolo de agua O H C N Enlace peptídico covalente fuerte H C Grupo ácido o carboxílico (cargado negativamente) COO– R+ Las cadenas laterales pueden tener carga positiva o negativa y permitir interacciones proteínaagua mediante puentes de hidrogeno Dipolo de agua Péptido: dos aminoácidos unidos por enlace peptídico La cadena lateral puede ser hidrofóbica y mediar interacciones proteína-proteína a través de enlaces hidrofóbicos débiles Al añadir una base, la proteína se vuelve más electronegativa + + –– H – + + + + + Las interacciones proteínaagua son numerosas y la proteína es soluble en agua + + + – – – (a) Añadiendo un ácido las proteínas se vuelven más electropositivas Las interacciones proteína-proteína mediante enlaces hidrofóbicos débiles son favorecidas + + + (c) Condiciones ácidas + En el pI, las interacciones proteína-agua (solubilidad en agua) son mínimas y la proteína precipita – – La carga neta de la proteína en su pI es cero – – (b) – + OH – – + Dipolo de agua Condiciones básicas Figura 4. El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al cual su carga electrostática neta es cero. (a) La proteína está a su pI, y por ello la interacción proteína-agua es mínima, se produce un máximo número de interacciones hidrofóbicas débiles del tipo proteínaproteína y la proteína precipita. (b y c) La proteína está en condiciones más ácidas o básicas que su pI, y por ello las interacciones proteína-agua son numerosas y la proteína es soluble. Interacciones proteínaagua mediante enlaces de hidrogeno débiles Figura 5. Los lípidos más importantes de la masa muscular, los triglicéridos, están compuestos por un glicerol unido a tres ácidos grasos (AG) mediante enlaces covalentes fuertes. Molécula de glicerol del triglicérido H2O H HC Carboxilo terminal del AG Terminal metilo del AG O O H H OC O HC O C HC H O C AG ω-3 son los de doble enlace en el 3er carbono desde el metilo terminal C4 C3 C2 CH3 CH3 O Enlace covalente fuerte del tipo éster une la molécula de glicerol con cada AG CH3 ácidos grasos del triglicérido Figura 6. Los fosfolípidos, al igual que los triglicéridos, pueden interaccionar hidrofóbicamente con moléculas apolares. Por sus grupos cargados pueden interactuar también con moléculas cargadas como las proteínas y con dipolos como el agua, lo que permite su solubilidad en agua. Porción colina CH3 3HC fosfato Molécula de glicerol O H N+ CH2CH O P O C H CH3 2 O– Las cargas positivas y negativas de la colina y el fosfato, respectivamente, permiten interacciones con moléculas cargadas como proteínas y agua Porción de AG O HC O C CH3 HC H O C CH3 O Las cadenas de AG hidrofóbicas permiten interacciones con moléculas hidrofóbicas como proteínas y triglicéridos Figura 7. Diagrama general para la recuperación de proteínas y lípidos usando solubilización y precipitación isoeléctrica. Los materiales enmarcados son las fracciones que se recuperan para incorporar en alimentos y el desarrollo de otras aplicaciones. Etapa 1. Homogenización de subproductos en agua (1:6, peso/peso) Fracción ligera, agua Fracción pesada, proteínas precipitadas Etapa 2. Primer ajuste de pH para solubilizar las proteínas en agua Etapa 5. Segunda separación Etapa 4. Segundo ajuste de pH para precipitar proteínas Etapa 3. Primera separación Fracción ligera aceite de pescado Fracción pesada, impurezas libres de grasa Fracción media, solución de proteínas Figura 8. Solubilidad en función del pH y la fuerza iónica (IS) de las proteínas más importantes del músculo de pescado clasificadas en proteínas miofibrilares y sarcoplásmicas. 2.5 100 IS=0.01 IS=0.05 80 Proteína miofibrilar (g/L) IS=0.14 IS=0.51 1.5 60 IS=1.08 IS=2.91 1.0 40 Miofibrilar, sin ajuste de IS 0.5 Miofibrilar, IS = 0.2 20 Sarcoplásmica, sin ajuste de IS Sarcoplásmica, con ajuste de IS 0.0 1 2 3 4 5 6 7 pH 8 9 10 11 12 13 0 Solubilidad de proteínas (%) 2.0 Tabla 2. Recuperación de proteína a partir de subproductos de trucha usando solubilización y precipitación isoeléctrica. Los rendimientos se calcularon en base seca como (concentración de proteína cruda en subproductos/concentración de proteína cruda en fracción recuperada) x 100. % pH Recuperación (solubilización/precipitación) de proteína 2.5/5.5 89.0 2.5/5.0 81.9 2.5/6.0 85.9 2.0/5.5 91.3 3.0/5.5 86.2 12.5/5.5 84.4 12.5/5.0 77.7 12.5/6.0 83.4 12.0/5.5 82.9 13.0/5.5 88.1 Tabla 3. Las proteínas recuperadas de subproductos de krill y trucha por solubilización y precipitación isoeléctrica tienen un bajo contenido en cenizas, lo cual implica que la fracción impurezas libres de grasa (Etapa 3, Figura 7) retiene cenizas procedentes de espinas, piel, escamas, aletas, y otros. El % de ceniza reportado está en base seca. % ceniza Carne cola krill 11.1 Filete de trucha sin piel y espinas 5.5 Krill entero 17.4 Subproducto trucha después de su fileteado 13.9 Fracción impurezas libres de grasa 41.1 2.5 2.1 3.0 1.6 12.0 0.9 12.5 1.4 13.0 2.1 2.0 6.0 2.5 4.3 3.0 4.0 12.0 4.9 12.5 5.7 13.0 5.7 Proteínas solubilizadas a pH Proteínas solubilizadas a pH % ceniza Tabla 4. Las proteínas del músculo, recuperadas por solubilización y precipitación isoeléctrica de subproductos de krill y trucha, son ricas en aminoácidos esenciales (EAA). En esta tabla aparece también el contenido de EAA de las proteínas aisladas de soja, junto con los patrones de EAA para proteínas de alto valor biológico que satisfacen los requerimientos de humanos según lo establecido por el Consejo de Investigación para la Nutrición y Alimentación (FNB por sus siglas en inglés) Fuente: Adaptado de Hui, Y.H. 1999. Soybean and soybean processing. En: Wiley Encyclopedia of Food Science and Technology (2nd ed.). Francis, F.J. (ed.). John Wiley and Son, Hoboken, NJ). Abreviaturas: Tr - treonina, Val - valina, Met - metionina, Ile - isoleucina, Leu - leucina, Fe - fenilalanina, His - histidina, Lis - lisina, Trp - triptófano. Proteínas Krill solubilizadas a pH Proteínas de trucha solubilizadas a pH Aminoácidos esenciales Tr Val Met Ile Leu Fe His Lis Trp Total Subproducto trucha después de fileteado 1.8 2.2 1.4 1.8 3.1 1.6 1.2 3.5 0.5 17.2 2.0 3.7 4.6 2.6 3.9 6.6 3.4 2.1 7.4 1.0 35.3 2.5 3.4 4.3 2.2 3.6 6.0 3.1 1.9 6.7 0.9 32.3 3.0 3.7 4.7 2.6 4.0 6.6 3.4 2.1 7.3 0.9 35.2 12.0 3.8 5.0 2.6 4.2 6.9 3.5 2.3 7.6 1.1 37.2 12.5 3.9 4.9 2.6 4.1 6.9 3.5 2.2 7.6 1.1 36.9 13.0 4.1 5.1 2.6 4.3 7.1 3.7 2.3 7.8 1.2 38.2 Krill entero 2.2 2.6 1.5 2.5 4.0 2.2 1.1 4.4 0.7 21.2 2.0 4.8 6.0 2.9 5.5 9.0 5.0 2.6 9.2 1.5 46.6 2.5 4.5 5.8 3.2 5.7 8.9 4.9 2.5 9.2 1.6 46.3 3.0 4.8 5.9 3.3 5.9 9.2 5.2 2.6 9.6 1.6 48.1 12.0 4.6 5.8 3.4 5.7 8.8 5.1 2.7 9.2 1.7 47.0 12.5 4.5 5.6 3.2 5.5 8.6 5.0 2.5 8.9 1.5 45.3 13.0 4.4 5.5 3.1 5.5 8.4 4.8 2.5 8.7 1.5 44.3 soja 3.9 4.6 1.1 4.6 7.8 5.0 2.6 6.4 1.4 37.4 FNB 3.5 4.8 2.6 4.2 7.0 7.3 1.7 5.1 1.1 37.3 Media 17.2 34.3 37.4 47.0 45.5 Figura 9. Las proteínas recuperadas a pH básico de la trucha (después de su fileteado) presentan una mejor textura cuando se las compara con las obtenidas a pH ácido. Esfuerzo de corte (Pa x 103) 13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 2.5 3 12 12.5 pH de solubización de la proteína 13 Figura 10. Las proteínas de músculo de krill recuperadas por solubilización y precipitación isoeléctrica presentan una pobre capacidad para formar geles, debido principalmente a la alta actividad de las proteasas endógenas. Las proteínas del plasma bovino (BPP por sus siglas en inglés) inhiben esta actividad y permiten una buena gelificación. G', viscoelasticidad (Pa x 10-3) 30 Con BPP 25 20 15 Sin BPP 10 5 0 0 20 40 60 Temperatura (°C) 80 100 Figura 11. El tamaño de partículas de las proteínas de músculo de pescado precipitadas en la etapa 4 (Figura 7) puede incrementarse mediante floculantes iónicos de alto peso molecular. Después de 10 min de reacción con un floculante iónico de alto peso molecular (poliacrilamida aniónica tipo A 150HMW, Cytec Industries Inc., West Paterson, NJ), la separación puede realizarse a flujos mayores y el sobrenadante resultante logra una densidad óptica comparable a la del agua limpia. Fuente: Adaptada de Taskaya L, Jaczynski J. 2005. Flocculation-enhanced protein recovery from trout processing by-products by isoelectric solubilization/precipitation. 7th Joint Meeting 50th Annual Atlantic Fisheries Technology Conference and 29th Annual Control 2.5 50 mg/l 80 mg/l 100 mg/l 125 mg/l Densidad óptica (595 nm) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 10 20 30 40 Tiempo (min) 50 60 70 80 Figura 12. La utilización de floculantes mejora la separación de proteínas en el decantador de la Etapa 5 (Figura 7). La baja densidad óptica del agua después de este tratamiento permite su re-utilización en el sistema de recuperación. (a) Ejemplo de proteínas precipitadas sin floculante. (b) Las mismas proteínas después de incubación por 10 min con un floculante iónico de alto peso molecular (poliacrilamida aniónica tipo A-150HMW, Cytec Industries Inc., West Paterson, NJ, Taskaya y Jaczynski, 2005). (a) (b) Contenido de acido graso en los acidos grasos totales (%) Figura 13. Los ácidos grasos ω-3 (n3) y ω-6 (n6) no se degradan significativamente por efecto del sistema de recuperación por solubilización y precipitación isoeléctrica. Por lo tanto, estos componentes deseables para la salud cardiovascular se pueden utilizar en suplementos dietéticos y alimentos funcionales. control 25 2.0 2.5 3.0 12.0 EPA DHA pH para solubilización de las proteínas 12.5 13.0 20 15 10 5 0 n3 total n6 total n3/n6 LN Acido graso L AN Figura 14. Mediante ajuste del pH a 6 y el complejo polimérico quitosano-alginato, preparado con una proporción en peso de 0.2, adicionado al agua de lavado de surimi (SWW por sus siglas en inglés) a la razón de 0.1 kg/ton, se logra la precipitación de las proteínas solubles e insolubles. En la figura se presenta la muestra no tratada (a), ajustada a pH 6 (b), y con la adición del complejo a las concentraciones de 0.05 (c), 0.1 (d), 0.2 (e) y 0.3 (f) kg/ton SWW. Control pH 6 (a) (b) pH 6 + 0.05 kg/ton (Chi-Alg) (c) pH 6 + 0.1 kg/ton (Chi-Alg) (d) pH 6 + 0.2 kg/ton (Chi-Alg) (e) pH 6 + 0.3 kg/ton (Chi-Alg) (f) Figura 15. Los bioreactores son capaces de ajustar el pH en forma continua y automática. Además homogenizan y ajustan la temperatura de la muestra, bombean producto de entrada y salida del reactor, y dosifican en forma precisa los inhibidores de emulsiones, floculantes de proteínas, agentes antiespumantes y otros aditivos permitidos. El bioreactor, en el primer plano de esta figura, se utiliza para la solubilización de proteínas, y el que se muestra al fondo se utiliza para la precipitación isoeléctrica. En medio de ambos aparece el panel de control de esta unidad de laboratorio. Los lípidos, las proteínas en solución y las impurezas insolubles son separados en un decantador antes de que la solución de proteínas sea bombeada para su precipitación. Este sistema trabaja en modo continuo a un flujo de 300 L/h. Figura 16. Las centrífugas decantadoras son equipos normalmente utilizados en la industria pesquera y pueden ser empleados con fines de separación en sistemas pilotos de recuperación de proteínas y lípidos por solubilización y precipitación isoeléctrica continuos. (Ilustraciones son cortesía de Alfa Laval). (a) Ejemplo de unidad comercial (b) Vista transversal del contenedor de la centrífuga decantadora. (a) (b) Alimentación procedente del bioreactor Tubo de alimentación Caja de cambios Puerto de descarga Pared del contenedor Fase líquida pesada Cinta transportadora Fase líquida ligera Distribuidor de entrada Terminal cónica Sólidos Figura 17. Mediante la solubilización y precipitación isoeléctrica se obtienen de los subproductos de pescado productos importantes. Además, después de la separación de proteínas en la Etapa 5, el agua (no mostrada) se utiliza nuevamente (reciclada) en la Etapa 1. (a) Aceite de pescado recuperado en la Etapa 3 (b) Impurezas libres de grasa (espinas, piel, escamas, aletas, proteínas insolubles, etc.) recuperadas en la Etapa 3 (c) Proteínas funcionales recuperadas en la Etapa 5 (d) Geles de las proteínas recuperadas en la Etapa 5 como demostración de un producto con alto valor agregado Aceite de trucha recuperado de subproductos (a) Subproductos de trucha (b) Proteína de músculo recuperada de subproductos del fileteado de trucha (c) Geles obtenidos de proteína de músculo recuperada Humedad = 85% pH = 5.5 Sal = 2% (d)