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PAPEL DE LOS ENZIMAS DE MACERACIÓN EN LA
EXTRACCIÓN DE TANINOS DE LAS SEMILLAS
Jiménez-Pascual, E.; Busse-Valverde, N.; Gómez-Plaza, E.; López-Roca,
J.M.; Bautista-Ortín, A.B.
Departamento de Tecnología de Alimentos, Nutrición y Bromatología,
Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Campus de Espinardo,
30071, Murcia.
* [email protected], tel. 34968367323, fax 34968364147
RESUMEN
Los taninos se encuentran en los hollejos y en las semillas de las uvas
y son importantes en la calidad del vino tinto, ya que participan en las
sensaciones de astringencia y amargor y en la estabilización del color. Los
enzimas de maceración se han utilizado tradicionalmente para mejorar la
extracción de compuestos fenólicos de los hollejos y no se ha determinado el
papel que pueden jugar en la degradación de las semillas y extracción de
sus compuestos fenólicos. En este trabajo se muestra el efecto de distintas
actividades enzimáticas puras y un enzima comercial en la liberación de
taninos de las semillas de uvas de las variedades Monastrell y Cabernet
Sauvignon.
Los resultados obtenidos muestran que los enzimas de
maceración parecen favorecer la degradación de las paredes celulares de
las semillas favoreciendo la salida de los taninos.
PALABRAS CLAVE: taninos, semillas de uva, maceración, enzimas de
maceración.
ABSTRACT
Tannins are localized in the grape skins and seeds and are important
for red wine quality since they participate in astringency, bitterness and color
stabilization. The maceration enzymes have been traditionally used to
improve the extraction of phenolic compounds from skins, but their role on
1
the seed degradation and the phenolic compounds release have not been
determined.
This work shows the effect of different pure enzyme activities
and a commercial enzyme in the release of tannins from seeds of Monastrell
and Cabernet Sauvignon grape varieties. The results demonstrate that the
maceration enzymes seem to favour the degradation of seed cell walls,
promoting the diffusion of tannins.
KEYWORDS: tannins, grape seeds, maceration, maceration enzymes
INTRODUCCIÓN
Los taninos están localizados en los hollejos y semillas de la uva y su
concentración y composición dependen del tejido donde se encuentren
(Bourzeix et al., 1986; Ricardo da Silva et al., 1991). Las semillas contienen
mayor concentración de taninos que los hollejos y mayor proporción de
unidades galoiladas (Labarbe et al., 1999; Prieur et al., 1984), mientras que
los hollejos contienen subunidades de epigalocatequina en su estructura
(Labarbe et al., 1999; Souquet et al., 1996) y presentan mayor grado de
polimerización que los taninos de las semillas (Cheynier et al., 1997;
Moutounet et al., 1996).
En el hollejo, los taninos se encuentran en las vacuolas como taninos
condensadas, ligados a la membrana proteofosfolipídica e integrados en la
pared celular (Amrani Joutei y Glories 1994). En las semillas, los taninos
ocupan una posición de defensa del embrión, estando presentes en la
epidermis, la parte media del tegumento externo y la capa interna del
tegumento interno (Cadot et al., 2006). Los flavanoles monoméricos están
concentrados en el tegumento externo, por tanto, estos compuestos
deberían ser particularmente extraídos durante el proceso de elaboración del
vino. Cadot et al. (2006) indicaron que la zona que se encuentra entre la
cutícula y las capas internas lignificadas del tegumento externo son, tal vez,
las más importantes en cuanto a la concentración de polifenoles, ya que
ellas contienen la mayor parte de compuestos solubles. La presencia del
tegumento medio, el cual es impermeable y muy duro, podría impedir la
extractabilidad de los compuestos fenólicos del tegumento interno durante el
proceso de elaboración del vino.
2
Durante el proceso de maceración, estos compuestos pasan al mostovino. La extracción de taninos del hollejo, al igual que para los antocianos,
requiere la degradación de las paredes celulares y están presentes en el
mosto-vino desde el inicio de la maceración. Se trata esencialmente de un
proceso de difusión y la extensión del mismo depende de su concentración,
de la composición de las paredes celulares y el método de elaboración
(Ortega-Regules et al., 2006;
Busse-Valverde et al., 2010). En cambio,
parece ser, que los taninos de las semillas solo serán extraídos hacia el final
del proceso de maceración, cuando los lípidos de las semillas sean
eliminados (Glories y Saucier, 2000) por la presencia de altos contenidos de
etanol.
Los taninos son importantes en la calidad del vino tinto, ya que ellos
participan en las sensaciones de astringencia y amargor (Gawel, 1998; Vidal
et al., 2003) y en la estabilización del color (Cheynier et al., 2006). Estas
sensaciones dependen del grado medio de polimerización de los taninos, es
decir del tamaño medio de estos compuestos, y especialmente de la
composición de los mismos, de tal manera que la astringencia es mayor al
incrementar el grado medio de polimerización y el porcentaje de galoilación
de los taninos (Llaudy et al., 2004). En cambio, la presencia de unidades de
epigalocatequina en los taninos parece disminuir esta percepción en el vino
(Vidal et al., 2003; Fernández et al., 2007). Por ello, los taninos de los
hollejos se han considerado mejores organolépticamente que los taninos de
las semillas y la utilización de diferentes técnicas de elaboración han
buscado ayudar a modular la proporción de taninos de hollejos y semillas en
los vinos.
Una de estas técnicas de elaboración es el uso de enzimas de
maceración. El efecto de estos enzimas sobre los antocianos y el color de
los vinos tintos ha sido ampliamente estudiado, aunque a veces los
resultados han sido contradictorios (Canal-Llaubères y Pouns, 2002; Pardo
et al., 1999; Revilla y Gonzalez-Sanjose, 2002; Watson et al., 1999; BautistaOrtín et al., 2005). Por el contrario, apenas se ha estudiado su papel en la
extracción de taninos, aunque algunos autores han encontrado un aumento
de estos compuestos en vinos donde se han utilizado enzimas de
maceración (Bautista-Ortín et al., 2005, Romero-Cascales et al., 2008; GilMuñoz et al., 2009; Ducasse et al., 2010), resultados que se han atribuido a
3
una mayor degradación de las paredes celulares del hollejo, ya que la acción
de los enzimas sobre la extracción de polifenoles de las semillas no ha sido
todavía demostrada.
El objetivo de este estudio pretende conocer si las actividades
enzimáticas normalmente presentes en los enzimas de maceración
comerciales, así como un producto comercial que integra varias de estas
actividades, actúan en la liberación de los taninos de las semillas de uvas de
las variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon.
MATERIALES Y MÉTODOS
El material vegetal de estudio ha sido semillas de uvas de las
variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon, cultivadas en secano en una
parcela de la D. O. de Jumilla, pertenecientes a la bodega Finca Omblancas.
Las uvas presentaban un grado de maduración entorno a 15 º Be.
0.5 g de semillas de ambas variedades fueron maceradas con 15 mL
de dos soluciones modelo: una acuosa (5 g/L de ácido tartárico) y otra
hidroalcohólica (12,5% etanol y 5 g/L ácido tartárico), ambas ajustadas a pH
3,6. La extracción se llevó a cabo en un agitador magnético a 700 rpm y a
temperatura ambiente durante 48 horas, todo ello en oscuridad. Transcurrido
el tiempo de extracción, el sobrenadante fue separado y filtrado usando
filtros de Nylon de 0,2 μm. Posteriormente, 4 mL del extracto filtrado fueron
concentrados en un centrivap (Labconco, USA) a 50º C durante 8 horas. El
extracto seco obtenido fue redisuelto en 0,8 mL de metanol.
También se realizaron ensayos con diferentes enzimas, 4 puros y un
enzima comercial, usado normalmente en el proceso de elaboración de los
vinos tintos, para poder comprobar si este tiene algún efecto en la extracción
de taninos de las semillas: xilanasa, celulasa, poligalacturonasa y
pectínmetilesterasa (Sigma Aldrich) y Enozym vintage (Agrovin, Alcazar de
San Juan) con actividad poligalacturonasa, pectínliasa, pectínesterasa y βglucanasa. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.
Para poder tener información sobre el contenido, porcentaje de
galoilación y grado medio de polimerización de los taninos (GPm) en
semillas de uva se ha utilizado el método de la fluoroglucinolisis propuesto
por Kennedy y Jones (2001). Este método está basado en la ruptura de los
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enlaces interflavánicos en medio ácido y en presencia de un agente
nucleofílico (fluoroglucinol), seguido de un análisis por cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC) de los productos de reacción según el método
propuesto por Busse-Valverde et al. (2010).
El tratamiento estadístico de los datos se ha realizado utilizando el
paquete estadístico Statgraphics 5.0 Plus.
RESULTADOS
Las Tablas 1 y 2 muestran el contenido y composición de los taninos
en las soluciones control; acuosa (SA) e hidroalcohólica (SH) tras el proceso
de maceración de las semillas de las variedades Monastrell y Cabernet
Sauvignon y el papel de las diferentes actividades enzimáticas. Los
resultados muestran que se obtienen altos contenidos de taninos tras el
proceso macerativo, incluso cuando el medio extractante no contiene etanol,
demostrándose que no es crucial la presencia de etanol en el medio para
que se extraigan los compuestos fenólicos de las semillas, contrariamente a
lo comentado por otros autores (Singleton y Draper, 1964; Llaudy et al.,
2004; Cerpa-Calderón y Kennedy, 2008). De todas formas, se observa que
en presencia de alcohol se consigue extraer mayor cantidad de
proantocianidinas de las semillas, siendo dicho incremento del 43% para
Monastrell y del 80% para Cabernet Sauvignon. El alcohol favorece la
eliminación de los lípidos que recubren la semilla (Glories y Saucier, 2000),
promoviendo además, una mayor degradación de la cutícula y de las
paredes celulares de las células donde se encuentran presentes los taninos
y favoreciendo la difusión de los mismos al medio. González-Manzano et al.
(2004), en estudios realizados con soluciones modelo, observaron también
una ligera extracción de taninos de bajo grado de polimerización de las
semillas en ausencia de alcohol, incrementándose la cantidad liberada
notablemente con el tiempo de contacto y la concentración de etanol en el
medio. En la misma línea, De Freitas et al. (2000) también encontraron un
incremento importante de los taninos de las semillas en vinos de Cabernet
Sauvignon tras la etapa de maceración post-fermentativa como resultado de
un mayor contacto de las mismas con el alcohol obtenido durante el proceso
de fermentación.
5
Los contenidos de taninos obtenidos en este estudio son mucho más
grandes que los encontrados por Cosme et al. (2009) para vinos de
Cabernet Sauvignon a lo largo de tres vendimias (289-776 mg/L) o por
Romero-Cascales (2008) y Busse-Valverde et al. (2010) para vinos de
Monastrell (489 y 835 mg/L) y de Cabernet S. (757 y 845 mg/L). Es posible
que la continua agitación aplicada en los diferentes ensayos haga que la
extracción de estos compuestos sea más efectiva que bajo las condiciones
de elaboración en bodega, periodo durante el cual sólo una pequeña
fracción de taninos, tanto de las pieles como de las semillas de la uva, es
extraída. Además, la retención de taninos, sobre todo de aquellos de mayor
peso molecular en las paredes celulares de la pulpa, pueden causar una
menor presencia de los mismos en el vino (Bindon et al., 2010).
El grado medio de polimerización de los taninos (GPm) es mayor en
semillas de Monastrell que en las de Cabernet Sauvignon, incrementándose
en ambos casos con la presencia de alcohol. Este resultado puede ser
debido a que el etanol produzca una mayor extracción de taninos de las
paredes celulares, lugar donde se encuentran las más polimerizadas (Geny
et al., 2003). Por el contrario, el estudio de Del Llaudy et al. (2008) con
soluciones modelo, no encontraron diferencias en los valores de GPm de los
taninos extraídos de semillas de Cabernet Sauvignon maceradas con
diferente contenido de alcohol, aunque sí en la astringencia de los mismos.
Estos autores indicaron que esto podía ser debido a que el GPm no
representa el porcentaje de las diferentes fracciones de diferente tamaño
que componen a los taninos y por tanto, con el mismo GPm, la proporción de
oligómeros puede ser diferente, viéndose afectada tanto la astringencia
como el amargor.
En el caso del porcentaje de galoilación, en solución acuosa es similar
para Monastrell y Cabernet Sauvignon, pero en presencia de etanol, la
galoilación de los taninos se incrementa, sobre todo para Cabernet
Sauvignon. González-Manzano et al. (2004) también encontraron un
incremento en el contenido de derivados galoilados con el aumento del
porcentaje de etanol en el medio. Busse-Valverde et al. (2010) encontraron,
en vinos, valores de galoilación más bajos a los encontrados en este estudio,
lo cual puede ser debido a la contribución de los taninos extraídos del
6
hollejo, que tienen porcentajes de galoilación más bajos que los taninos de
semilla.
Tras la aplicación de enzimas, en el caso de Monastrell y en medio
acuoso (Tabla 2) se observa un aumento importante en la extracción de
taninos con los diferentes enzimas utilizados, excepto en el caso de los
enzimas xilanasa y pectínmetilesterasa, al mostrar valores de taninos no
significativamente diferentes respecto a la solución testigo sin enzima. En el
caso de los enzimas puros, la poligalacturonasa consigue triplicar el
contenido de taninos y la celulasa duplicarlo, mientras que el complejo
enzimático consigue cuadriplicar en el medio los valores de estos
compuestos. La pared celular de las células de las semillas está compuesta
por hemicelulosa, celulosa y pectinas, por tanto, es de esperar que la
celulasa y la poligalacturonasa y el complejo enzimático consigan
incrementar el contenido de taninos en el medio, tras una mayor degradación
de ésta. Estos resultados fueron previamente intuidos en los estudios de
Passos et al. (2009ab), ya que comprobaron que un pretratamiento previo de
las semillas de uvas con cócteles enzimáticos a base de celulasa,
hemicelulasa, poligalacturonasa y proteasas incrementaba notablemente la
extracción de aceite de las semillas, debido a su acción en la destrucción de
la organización celular y subcelular de los tejidos de las semillas, tales como
las paredes celulares y el citoplasma (Sineiro et al., 1998).
El grado medio de polimerización de los taninos se incrementa
ligeramente con la adición de enzimas, aunque sólo se observan diferencias
significativas
respecto
al
testigo
con
los
enzimas
xilanasa
y
pectínmetilesterasa. Esto puede ser debido a que estos enzimas actúen sólo
sobre las paredes celulares de las células de las semillas, lugar donde se
encuentran los taninos más polimerizados (Geny et al., 2003), mientras que
el resto de enzimas también pueden llegar hasta zonas más internas de las
células, favoreciendo la salida de taninos menos polimerizados, viéndose de
esta manera compensado el tamaño de los mismos.
Respecto al porcentaje de galoilación, este aumenta significativamente
con la presencia de cualquiera de los enzimas, excepto en el caso de
pectínmetilesterasa y xilanasa. El complejo enzimático y poligalacturonasa
dan lugar a la mayor presencia de taninos galoilados, seguidos de celulasa.
Geny et al. (2003) encontraron que la proporción de (-)-epicatequina-3-O7
galato era mayor en la fracción de las paredes celulares que en la fracción
interna de las células de las semillas, por lo que una mayor degradación de
dichas paredes por parte de estos enzimas podría favorecer una mayor
liberación de taninos más galoilados.
Con la presencia de alcohol, los enzimas también consiguen una
mayor difusión de taninos al medio. La celulasa, poligalacturonasa y
pectínmetilesterasa (que no tenían efecto en medio acuoso) consiguen
triplicar el contenido de taninos, mientras que con el enzima comercial los
valores son incrementados aproximadamente sobre seis veces. Estos
resultados parecen indicar que la presencia de alcohol facilita aún mas la
acción de los enzimas y principalmente de pectínmetilesterasa y Enozym
vintage.
El medio hidroalcohólico es comparable con un vino, y entre los pocos
estudios que hay sobre la influencia de enzimas de maceración en la
extracción de taninos (Sun et al., 1998; Romero-Cascales et al., 2008 y GilMuñoz et al., 2009) los resultados han mostrado normalmente un incremento
de taninos en el vino, atribuido siempre a la mayor degradación de las pieles
por parte de hemicelulasas y celulasas presentes en los enzimas de
maceración, proporcionando vinos con más cuerpo y estructura (Watson,
2000). Nosotros demostramos en este estudio, que ese incremento de
taninos no es solamente atribuible a los taninos de los hollejos puesto que
también se produce la degradación de las semillas.
El grado medio de polimerización de los taninos es menor con el
enzima comercial y la pectínmetilesterasa. También son observadas
diferencias significativas en el caso del porcentaje de galoilación,
consiguiendo
taninos
más
galoilados
con
el
enzima
comercial
y
poligalacturonasa, seguidos de celulasa. Hay que destacar que los taninos
presentes en la solución testigo sin enzima presentan valores de este
porcentaje similares a aquellos obtenidos en medio acuoso, indicando que el
alcohol no consigue llegar, en el caso de Monastrell, hasta los taninos que se
encuentran en la fracción interna de las células de las semillas.
Para semillas de Cabernet Sauvignon y en solución acuosa (Tabla 2),
sólo
con
celulosa
y
Enozym
vintage
se
consigue
incrementar
significativamente los valores de taninos en el medio, mientras que en medio
alcohólico, xilanasa y el enzima comercial son los únicos enzimas que no
8
muestran ningún efecto. El grado medio de polimerización de los taninos es
mayor con xilanasa y menor con celulasa, poligalacturonasa y el enzima
comercial en medio acuoso y con la presencia de alcohol, solo
poligalacturonasa afecta de forma importante al tamaño de estos
compuestos.
En cuanto al porcentaje de galoilación, en ausencia de alcohol, o bien
no se ve prácticamente afectado, como es el caso de celulasa,
poligalacturonasa
y
el
enzima
comercial,
o
bien
disminuye
con
pectínmetilesterasa y xilanasa y en presencia de éste, al igual que ocurre
con el grado medio de polimerización, sólo incrementa de forma más
significativa con poligalacturonasa.
El grado medio de polimerización y el porcentaje de galoilación de los
taninos afectan a las características organolépticas del vino, principalmente
a las sensaciones de astringencia y amargor, y parece que estas
sensaciones son más potenciadas en presencia de alcohol y con algunos de
los enzimas empleados tanto para Monastrell como para Cabernet
Sauvignon.
El diferente comportamiento observado de los enzimas con semillas
de Cabernet Sauvignon, respecto al obtenido con semillas de Monastrell en
el mismo medio, puede ser indicativo de la existencia de diferencias a nivel
estructural y composición entre las semillas de ambas variedades. Dichas
diferencias ya fueron encontradas por Ortega-Regules et al. (2008) a nivel
del hollejo.
Estos resultados indican que los taninos de las semillas pueden ser
difundidos al mosto-vino ya desde el inicio de la maceración en ausencia de
alcohol, aunque su extracción va a ser más importante cuando el alcohol esté
presente. Los enzimas de maceración utilizados normalmente en el proceso
de elaboración de los vinos tintos para incrementar el color también pueden
incrementar la extracción de los taninos de las semillas (y no solo los del
hollejo), estando su efecto más o menos marcado por el tipo de actividad
presente en los mismos y la variedad de uva. Esto es importante tenerlo en
cuenta, sobre todo cuando la uva llega poco madura a bodega, ya que, en
estas condiciones, el uso de enzimas de maceración es bastante común para
favorecer la extracción de color, pero estos productos enológicos podrían
degradar más fácilmente las paredes celulares de las células de las semillas,
9
al estar menos lignificadas, favoreciendo una mayor salida de taninos al
mosto-vino, incrementando el cuerpo, pero sobre todo las sensaciones de
astringencia y amargor en el vino.
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Tabla 1. Concentración, grado medio de polimerización (GPm) y porcentaje de galoilación
de los taninos en semillas de Monastrell en solución acuosa e hidroalcohólica tras la adición
de diferentes enzimas.
Taninos mg/L
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV
GPm
%Galoilación
Solución acuosa
1126a
8,9a
9,0a
2402b
9,5ab
10,6b
3345c
9,1a
14,7c
1535ab
10,3c
10,6b
1168a
9,9bc
7,9a
4622d
9,0a
15,4c
Solución hidroalcohólica
1616a
9,1cd
10,2a
4851c
8,9c
13,1b
4501c
9,2cd
15,4c
2444b
9,3d
10,8a
4603c
7,7a
10,3a
7727d
8,3b
15,7c
Abreviaciones: PG: Poligalacturonasa; PE: Pectínmetilesterasa; EV: Enozym vintage. Letras
diferentes en una misma columna y para cada medio significa diferencias estadísticamente
significativas según el test LSD (P<0,05).
Tabla 2. Concentración, grado medio de polimerización (GPm) y porcentaje de galoilación
de los taninos en semillas de Cabernet Sauvignon en solución acuosa e hidroalcohólica tras
la adición de diferentes enzimas.
Taninos mg/L
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV
GPm
%Galoilación
Solución acuosa
2572ab
7,0c
3897d
5,5a
2872bc
5,9ab
2254a
7,8d
3135bcd
6,4bc
3464cd
6,2ab
Solución hidroalcohólica
4659a
8,6d
5751d
5,4a
5161bc
8,2cd
4525a
8,0bcd
5452cd
7,2b
4883ab
7,4bc
9,2c
9,2c
8,8bc
6,7a
8,1b
9,5c
10,8a
11,0ab
11,4b
11,6c
10,9ab
11,0ab
Abreviaciones: PG: Poligalacturonasa; PE: Pectínmetilesterasa; EV: Enozym vintage. Letras
diferentes en una misma columna y para cada medio significa diferencias estadísticamente
significativas según el test LSD (P<0,05).
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