Download “Técnicas Básicas de la Biología Molecular”.

UNIVERSIDAD CATÓLICA
DE CUENCA
UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, INDUSTRIAL,
ALIMENTOS, BIOMOLECULAR, BIOCOMBUSTIBLES Y
BIOFARMACIA
FACULTAD DE BIOFARMACIA
“Técnicas Básicas de la Biología
Molecular”.
Monografía previa a la
obtención del título de
Químico Farmacéuta.
INVESTIGADOR:
MARCELA PATRICIA VALVERDE PERALTA
DIRECTOR:
ING. RENÉ SARMIENTO
CUENCA - ECUADOR
2010
Universidad Católica de Cuenca
Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia.
Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
DEDICATORIA:
El presente trabajo dedico con sincero cariño y humildad
a Dios por haberme dado la vida y haberme permitido
culminar mis estudios lo que he conseguido con esfuerzo
y abnegación; esfuerzo que también ha costado a mis
padres por lo que este trabajo también dedico de todo
corazón a Tarquino y Nancy pilar fundamental en mi vida
y de manera muy especial a mi hija Daniela Xiomara que
es el centro de mi vida y la razón para seguir luchando
con más ahincó.
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
AGRADECIMIENTO
“Mi reconocimiento y gratitud:”
A Dios por haberme dado la fuerza y perseverancia para
culminar este trabajo.
A
la
“Universidad
Católica
de
Cuenca”,
UNIDAD
ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, INDUSTRIAL,
ALIMENTOS, BIOMOLECULAR, BIOCOMBUSTIBLESY
BIOFARMACIA, Facultad de Biofarmacia, en la persona
de su decano Ing. Santiago Gómez y a sus maestros; por
haberme abierto las puertas de este prestigioso Centro
Educativo y así posibilitar mi profesionalismo como
Químico Farmaceuta.
A mi Director de monografía, Ing. René Sarmiento por su
acertada dirección, que supo proporcionarme para la
culminación exitosa de esta investigación.
A mis padres que de una y otra forma me apoyaron y
confiaron en mí en el transcurso de mis estudios para
culminar el sueño de mi profesión.
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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JUSTIFICACIÓN
El tema planteado es de gran relevancia pues hoy en día hay un gran desconocimiento
acerca de las técnicas básicas de la Biología Molecular, pudiendo ser de gran utilidad
en la medicina moderna, el conocimiento de esta tecnología es necesario ya que es
la base de la investigación, diagnóstico, pronóstico y tratamiento de muchas
enfermedades, siendo uno de los temas que actualmente está tomando la punta ya
que tiene mucha relevancia, tanto en el campo científico, humano y contemporáneo.
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
PRELIMINARES_______________________________________PÁGINAS
CARÁTULA……………………….…………………………………………………………………….……………………I
DEDICATORIA………..…..…………………………………………………………………….………….................II
AGRADECIMIENTO……………………………………..…………………………………………………………….III
ÍNDICE……………………………………………………………………………………………………………………...IV
INTRODUCCIÓN…………..…………………………………………………………………………………………VIII
OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………….…..X
CAPÍTULO ‘I’.......................................................... .¡Error! Marcador no definido.
CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR¡Error!
definido.
Marcador
no
1.1. HISTORIA Y ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.¡Error! Marcador no
definido.
1.1.1. LOS PRIMEROS PASOS...................... ¡Error! Marcador no definido.
1.1.2. ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR¡Error!
definido.
Marcador
no
1.2. DISCIPLINAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ¡Error!
Marcador no definido.
1.3. INFORMACIÓN GENÉTICA Y EL GENOMA. ¡Error! Marcador no definido.
1.3.1. EL GENOMA ....................................... ¡Error! Marcador no definido.
1.3.2. MATERIAL GENÉTICO ..................... ¡Error! Marcador no definido.
1.3.3. CROMATINA Y LOS CROMOSOMAS ¡Error! Marcador no definido.
1.3.4. LOS GENES ........................................ ¡Error! Marcador no definido.
1.4. TIPOS Y COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS.¡Error! Marcador no
definido.
1.4.1. ÁCIDO NUCLÉICO ............................. ¡Error! Marcador no definido.
1.4.2. NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS ... ¡Error! Marcador no definido.
1.4.3. LOS DINUCLEOTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS¡Error!
no definido.
Marcador
1.5. FUNCIONES Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ................ ¡Error!
Marcador no definido.
1.5.1.ÁCIDO
DESOXIRRIBONUCLEICO
…………………………………..¡Error! Marcador no definido.
O
ADN
1.5.2. ÁCIDO RIBONUCLEICO O ARN ....... ¡Error! Marcador no definido.
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1.6. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR¡Error!
definido.
Marcador
no
1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN ......................... ¡Error! Marcador no definido.
1.6.2. LA TRADUCCIÓN Y EL CÓDIGO GENÉTICO¡Error! Marcador no
definido.
1.7. ENZIMAS Y VECTORES USADOS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR........ ¡Error!
Marcador no definido.
1.7.1. CONCEPTO DE ENZIMA ................... ¡Error! Marcador no definido.
1.7.2. USOS DE LAS ENZIMAS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR ........ ¡Error!
Marcador no definido.
1.7.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE ENZIMAS ................. ¡Error!
Marcador no definido.
1.7.4. ACOMPAÑANTES NO PROTEICOS DE LAS ENZIMAS .............. ¡Error!
Marcador no definido.
CAPÍTULO II ........................................................... ¡Error! Marcador no definido.
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO . ¡Error!
Marcador no definido.
2.1. ETAPAS DE LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ...... ¡Error!
Marcador no definido.
2.1.1. PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS ..... ¡Error!
Marcador no definido.
2.1.2. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO¡Error! Marcador
no definido.
2.2. CLONADO DEL GEN. ...................................... ¡Error! Marcador no definido.
2.2.1. PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR¡Error! Marcador no
definido.
2.2.2. PASOS A SEGUIR PARA UNA CLONACIÓN MOLECULAR ....... ¡Error!
Marcador no definido.
2.3. ELECTROFORESIS.......................................... ¡Error! Marcador no definido.
2.3.1. FUNDAMENTO DE LA ELECTOFORESIS¡Error!
definido.
2.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL ADN¡Error!
definido.
Marcador
Marcador
no
no
2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN ..................... ¡Error! Marcador no definido.
2.4.2. ALMACENAMIENTO DEL ADN ...... ¡Error! Marcador no definido.
2.4.3. CONSERVACIÓN DEL ADN EN TEJIDO FRESCO¡Error!
no definido.
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Marcador
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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2.5. NORMAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ............ ¡Error!
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2.5.1.POSIBLES CONTAMINACIONES EN EL LABORATORIO DE ..................
BIOLOGIA MOLECULAR ................... ¡Error! Marcador no definido.
2.5.2.ORGANIZACIÓN ESPACIAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA .........
MOLECULAR ....................................... ¡Error! Marcador no definido.
2.5.3. OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS . ..... ¡Error!
Marcador no definido.
CAPÍTULO III ......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN........................ ¡Error! Marcador no definido.
3.1. PASOS PREVIOS A LA HIBRIDACIÓN ........... ¡Error! Marcador no definido.
3.2. MÉTODOS HIBRIDACIÓN DE LABORATORIO¡Error!
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Marcador
no
3.2.1. EL MÉTODO DE HIBRIDACIÓN SOUTHERN ¡Error! Marcador no
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3.2.2. NORTHERN O NORTHERN BLOT .. ¡Error! Marcador no definido.
3.2.3. WESTERN BLOT ............................... ¡Error! Marcador no definido.
3.2.4. DOT BLOT Y SLOT BLOT .................. ¡Error! Marcador no definido.
3.2.5. HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS) .......... ¡Error! Marcador no definido.
3.2.6. CHIP DE ADN .................................... ¡Error! Marcador no definido.
3.2.7. SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID)¡Error! Marcador no
definido.
3.2.8. HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS¡Error! Marcador no
definido.
3.2.9. MAPAS DE RESTRICCIÓN ............... ¡Error! Marcador no definido.
3.2.10. HIBRIDACIÓN DE ADN O RAMIFICADO (BRANCHED DNA) ¡Error!
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2.3.11. cDNA MICROARRAY ....................... ¡Error! Marcador no definido.
3.3. PASOS DE LA HIBRIDACIÓN ........................ ¡Error! Marcador no definido.
3.3.1. FUNDAMENTO DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS .. ¡Error!
Marcador no definido.
3.4. APLICACIONES DE LA HIBRIDACIÓN ......... ¡Error! Marcador no definido.
3.4.1. INGENIERÍA GENÉTICA .................. ¡Error! Marcador no definido.
3.4.2. MEDICINA FORENSE ....................... ¡Error! Marcador no definido.
3.4.3. BIOINFORMÁTICA ........................... ¡Error! Marcador no definido.
3.4.4. NANOTECNOLOGÍA DE ADN .......... ¡Error! Marcador no definido.
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3.4.5. HISTORIA Y ANTROPOLOGÍA......... ¡Error! Marcador no definido.
CAPÍTULO IV .......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN MEDIANTE LA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)¡Error! Marcador no
definido.
4.1. FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. ¡Error!
Marcador no definido.
4.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA REALIZAR LA PCR.¡Error! Marcador
no definido.
4.3. CICLOS DURANTE LA PCR. ........................... ¡Error! Marcador no definido.
4.4. APLICACIONES. .............................................. ¡Error! Marcador no definido.
4.4.1. INVESTIGACIÓN ............................... ¡Error! Marcador no definido.
4.4.2. MEDICINA ........................................ ¡Error! Marcador no definido.
CAPÍTULO V ........................................................... ¡Error! Marcador no definido.
TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN¡Error!
definido.
Marcador
no
5.1. FUNDAMENTO DE LA SECUENCIACIÓN. .... ¡Error! Marcador no definido.
5.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA LA SECUENCIACIÓN. ................. ¡Error!
Marcador no definido.
5.3. CONDICIONES UTILIZADAS DURANTE LA SECUENCIACIÓN. ............ ¡Error!
Marcador no definido.
5.4. SECUENCIADORES DE ADN. ........................ ¡Error! Marcador no definido.
5.5. APLICACIONES. .............................................. ¡Error! Marcador no definido.
CAPÍTULO VI .......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA .............. ¡Error! Marcador no definido.
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Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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INTRODUCCIÓN
El tema planteado pretende dar a conocer las técnicas básicas usadas en Biología
Molecular que se utilizan en la investigación biomédica.
Además, es sumamente importante que todos los profesionales de la salud conozcan
el porqué, para que y la importancia que tienen estas técnicas, herramienta
primordial para el área médica, por tanto, es indispensable y necesario, que en la
actualidad los químicos farmacéuticos, licenciados y tecnólogos, conozcan los
alcances tecnológicos para ayudar a la población con una alternativa de vida al
paciente.
La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de
todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se
transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos.
Este conocimiento ha permitido cruzar barreras naturales entre especies y colocar
genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante
el empleo de técnicas de ingeniería genética.
Una de las consecuencias importantes derivadas, fue la producción de fragmentos de
ácidos nucleicos a gran escala, abriendo las puertas a la secuenciación de los ácidos
nucleicos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia
génica o la obtención de organismos superiores recombinantes.
El surgimiento y consolidación de la ciencia experimental constituye, sin lugar a
dudas, uno de los grandes logros de la humanidad al convertirse en poderosas
herramientas para modificar la realidad natural.
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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Estos hechos son reflejados en las siguientes palabras del científico y divulgador de
las ciencias Bertrand Russell (1872-1970): “Ciento cincuenta años de ciencia han
resultado más explosivos que cinco mil años de cultura precientífica.”
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
El objetivo general es fortalecer los conocimientos obtenidos en el seminario de
graduación los cuales me permiten analizar y demostrar la importancia de las
¨Técnicas básicas de la Biología Molecular¨ y sus aplicaciones mediante la
recopilación bibliográfica y científica, con el fin de obtener el título de Químico
Farmaceuta otorgado por la Universidad Católica De Cuenca al culminar el cuarto
año de la carrera.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
 Conocer el origen de la biología molecular, y las Disciplinas científicas que
forman parte de la misma.
 Definir e identificar las Etapas en la obtención de un organismo transgénico.
 Diferenciar los Métodos de Hibridación en un laboratorio de biología
molecular.
 Aprender a diferenciar correctamente los Ciclos que se dan durante la PCR.
 Profundizar los conocimientos sobre la Técnica directa de la secuenciación y
la utilidad que nos brinda.
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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CAPÍTULO ‘I’
CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
-1-
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1.1. HISTORIA Y ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.
1.1.1. LOS PRIMEROS PASOS
Desde hace muchísimos años, tantos que no podría precisarse el momento exacto,
el hombre busca descubrir un orden para el Universo y ubicarse a sí mismo dentro
de ese orden. Es la búsqueda de un lugar en esa vastedad la que originó fábulas,
mitos y leyendas que asignaban a uno o varios dioses la creación y el mantenimiento
de todo lo existente. Es esa misma búsqueda, casi desesperada, la que animó a
muchos hombres a cuestionar estas explicaciones y encontrar otras, que no
delegaran el poder de la existencia, en definitiva, de la vida y la muerte, en fuerzas
sobrenaturales o seres mitológicos. La Biología aparece en Grecia antigua nos da
cuenta de ese esfuerzo por encontrar, desde el que hacer filosófico, las respuestas a
viejas y nuevas preguntas.1
La historia de la Biología tradicionalmente ha sido dividida en tres etapas de
desarrollo, cada una de estas se caracteriza por una serie de descubrimientos y
propuestas, un desarrollo tecnológico y una forma de organizar el pensamiento;
estas etapas son: antigua, moderna y molecular.2
1.1.1.1. BIOLOGÍA ANTIGUA
La Biología como un conjunto de conocimientos organizados se inicia hacia el año
500 A.C. en Grecia; muchos de los resultados obtenidos en esta época se
fundamentaban en la observación y en el pensamiento lógico, el método científico
como herramienta para la investigación aun no se conocía. Hacia el año 500 antes
de
nuestra
era,
surgen
los
Filósofos
naturalistas,
establecieron
que
el
comportamiento de la naturaleza no dependía del estado de ánimo de un o varios
dioses; consideraban que los fenómenos naturales podían ser comprendidos por el
hombre si los observaba cuidadosamente, esta observación sistemática permitiría,
además, predecir la ocurrencia de dichos fenómenos. El Filósofo naturalista más
destacados fue Aristóteles (384-322 A.C.) quien estableció el primer método de
investigación y aportó las primeras ideas sobre el origen de la vida o “teoría de la
generación espontánea”.
1
2
http://www.alipso.com/monografias/origenes_biologia_celymolec/
http://www.elergonomista.com/biologia/historia.htm
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-2-
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Algunos otros investigadores de la época se interesaron por la anatomía y la
fisiología, entre ellos podemos mencionar a:
Galeno (130 - 200 años D.C.). Considerado el primer anatomista griego y aún
cuando en su época no se permitían las disecciones humanas, describió nuestra
anatomía.
Andreas Vesalius (1514–1565). Médico originario de Bruselas, Bélgica, practicó
disecciones humanas y describió de una mejor manera la anatomía humana. Sus
resultados se encuentran en un libro llamado “Corpori Humani Fabrica”.
Hieronimus Fabricius (1537 – 1619). Contribuyó a explicar la circulación sanguínea,
al demostrar que las venas presentan una serie de “puertas” o “válvulas” que
impiden que la sangre se regrese por un mismo vaso.
William Harvey (1578 – 1657). Médico y científico inglés, descubrió que el corazón
era el encargado de bombear la sangre y además, descubrió el sentido de la
circulación sanguínea.
Para concluir con este período de poco más de 2000 años, podemos decir que
durante la etapa de Biología antigua surgieron las primeras ideas sobre el origen de
la vida, se empieza a describir la anatomía y fisiología humana, así mismo, surgen la
botánica, la zoología y la taxonomía.
1.1.1.2. BIOLOGÍA MODERNA
Esta etapa se inicia a mediados del siglo XVII y se extiende hasta poco antes del
año 1920. Uno de los inventos más importantes de esta época, es sin lugar a dudas
el microscopio, ya que con su ayuda se empezaron a observar estructuras biológicas
que a simple vista no era posible hacerlo. La historia no establece claramente quien
inventó el microscopio; algunos historiadores piensan que Giovanni Farber lo inventó
en 1550; otros opinan que le corresponde a Zaccharias Jannsen en 1590.
Entre los primeros microscopistas destacados podemos citar a los siguientes:
 Marcello Malpighi (1628 – 1694)
 Jan Swammerdam (1637 – 1680)
 Anton van Leeuwenhoek (1632 – 1723)
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Dentro de esta época, destacan algunos investigadores que establecieron la
importancia de la célula en la estructura de los organismos, entre ellos:
Robert Hooke (1635 – 1703), fue el primero en utilizar la palabra “célula”.
Marie Francois Bichat (1771 – 1802), establece que los órganos estaban formados
por subunidades a las que llamó tejidos; también estableció que dentro de los tejidos
existía un nivel más bajo de organización (células).
Robert Brown en 1831 estableció que todos los tipos de célula tienen núcleo.
Theodor Schwann y Mathias Schleiden en 1838, biólogos alemanes establecieron
que la célula era la unidad anatómica y estructural de los seres vivos. Estos son dos
de los postulados de la Teoría Celular.
Rudolf Virchow, en 1858 propone el tercer postulado de la teoría celular al
puntualizar que la célula es la unidad de origen.
Otros investigadores, destacan al explicar la historia evolutiva de las especies, el
origen de la vida y los mecanismos de la herencia; entre ellos:
Charles Darwin (1809 – 1882), autor del libro “El Origen de las Especies” en él
expuso sus ideas sobre la evolución de las especies por medio de la selección
natural. Esta teoría originó, junto con la teoría celular y la de la herencia biológica, la
integración de la base científica de la biología actual.
Luis Pasteur (1822–1895), demostró la falsedad de la hipótesis de la generación
espontánea al comprobar que un ser vivo procede de otro. Asentó las bases de la
bacteriología, investigó acerca del cólera de las gallinas y desarrolló la vacuna del
ántrax para el ganado y la vacuna antirrábica.
Gregor Johann Mendel (1822–1884), estudió la herencia biológica, de padres a
hijos, con lo que asentó las bases de la Genética.
Como conclusión a este período de unos 300 años: etapa caracterizada por un
método de trabajo experimental y por la tentativa de relacionar a las estructuras
celulares con su función, surgen nuevos campos de la biología como la
microbiología, citología, genética y evolución entre otras.
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1.1.1.3. BIOLOGÍA MOLECULAR
Se inicia aproximadamente en 1920 y se caracteriza por el estudio de la estructura
celular y sus funciones, tanto a nivel fisiológico como a nivel molecular. Otro hecho
importante dentro de esta época, es el establecer que tipo de sustancias químicas
intervienen en la estructura de la célula, también se explica cual es la función que
desempeña cada una de estas sustancias dentro de la misma.
A partir de la descripción de Watson y Crick se produjo una creciente acumulación
de descubrimientos, especialmente en la década de 1960, que nos permiten hoy
tener las herramientas necesarias para estudiar agentes infecciosos a nivel
molecular.
Friedrich Meischer 1869, realizó por primera vez el aislamiento de la molécula de
ADN, a partir de núcleos aislados de linfocitos humanos y se denominó "nucleina".
Albrecht Koseel en 1879, demostró que la nucleina estaba compuesta por 4 bases
orgánicas, adenina, guanina, timina y citosina.
En 1924, Fuegel desarrolló un marcador químico para demostrar por microscopia de
luz que el ADN estaba en el núcleo de todas las células de distintas especies.
En 1944 Oswald T Avery, Colin M. MacLeod y Maclyn McCarty demostraron que en
el ADN estaba la información responsable de la herencia.
En 1950 Erwin Chargaff demostró que la composición química del ADN variaba
entre un organismo y otro, pero siempre existía una concentración molar equivalente
entre A-T y C- G.
Watson y Crick en 1953, utilizando datos de difracción de rayos X, propusieron el
modelo de doble hebra para la estructura del ADN.
En 1957, Kronberg aisló y purificó la enzima responsable de la replicación del ADN,
la ADN polimerasa. Este descubrimiento es la base para todos los métodos de
síntesis de ADN in vitro como la PCR.
En 1961, Doty et al y Marmur descubrieron las propiedades de hibridación del ADN.
En 1962, Arber aisló y purificó enzimas que cortaban el ADN en secuencias
específicas. La función de estas enzimas es proteger a las bacterias de infecciones
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virales degradando el ADN viral. El descubrimiento de enzimas como la ADN ligasa
dio origen a moléculas de ADN recombinante. Se crearon las primeras moléculas de
ADN recombinante dando origen a la ingeniería genética.
En 1966 Nirenberg, Ochoa, Khorama, descubrimiento del código genético.
En 1967 Gellert, aislamiento y purificación de la enzima ADN ligasa.
En 1972 Boyer, Cohen y Berg, desarrollo de las técnicas de clonación de ADN.
En 1975, Southern desarrolló un método para fijar ADN digerido por enzimas de
restricción a un soporte sólido y realizar en él, la hibridación con sondas específicas.
La técnica desarrollada se llamó Southern-blot y la extensión de esta metodología a
ARN se denominó Northern-blot y a proteínas, Western-blot. Otras variaciones de
este método, que no utilizan la separación electroforética, se denominan dot-blot.
En 1977, Sanger et al y Maxam y Gilbert, desarrollaron métodos de secuenciación
del ADN. Ambos métodos difieren en que uno permite leer el código genético
rompiendo la molécula de ADN en nucleótidos específicos y el otro, incorporando
nucleótidos que bloquean la extensión de la síntesis de ADN (más utilizado).
En 1981 Palmiter y Brinster, primeros animales transgénicos.
En 1985, Mullis reunió algunas metodologías para realizar síntesis de ADN in vitro
en forma exponencial (PCR), considerada como una revolución dentro la biología
molecular ya que con la amplificación exponencial es posible el análisis de
moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras.
En 1997 Tomb, Cole y Parkill, secuenciación de genomas bacterianos completos.
En el 2001, Venter y Collins, secuenciación del genoma humano.
1.1.2. ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
El término de Biología Molecular fue acuñado por W. Weaver de la Rockefeller
Foundation en (1938). Pero el término Biología Molecular no se consolidó a la
terminación de la Segunda Guerra Mundial.
Desde el primer momento surgieron dos escuelas que se disputaron la hegemonía.
G. S. Stent en 1968 las ha descrito como:
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Escuela informacionista, americana, era hostil a la Bioquímica. La Biología podía
proporcionar contribuciones significativas al progreso de la Física.
Escuela estructuralista, plenamente integrada a la Bioquímica. La Física podía hacer
aportaciones muy valiosas a la Biología. 3
1.1.2.1. ESCUELA INFORMACIONISTA
Esta escuela tuvo su antecedente en las ideas primero de Niels Bohr y después de
Max Delbrück Bohr elaboró la noción de que algunos fenómenos biológicos no se
podrían explicar completamente en términos de la Física convencional.
En 1935 Max Delbrück afirmó que la genética era el dominio de la investigación
biológica en que las explicaciones físicas y químicas podían resultar insuficientes en
el sentido expresado por Bohr, de modo que concluyo que: “la genética es autónoma
y no se debe mezclar con concepciones fisicoquímicas”.
En 1945 Edwin Schrödinger con su libro “What is life?” se convirtió en una especie
de revolución biológica. Y además centró la atención sobre el tema del material
genético. El libro lo leyó también Watson (1966) quedó polarizado hacia el objetivo
de desentrañar el secreto del gen.
Avery, MacCarthy y MacLeod, probaron que el factor de transformación es DNA.
E. Chargaff en 1950 y su grupo realizaron una extensa determinación de la
composición de DNA de las fuentes biológicas más variadas y mostraron variación
en la composición dependiendo del origen de la muestra.
Watson y Crick en 1953 quienes convencidos de que el DNA es el material genético
llegaron a la estructura de la doble hélice.
1.1.2.2. ESCUELA ESTRUCTURALISTA
La escuela tiene sus orígenes en los estudios por difracción de rayos X de proteínas
que se presentan en forma de fibras en que hay suficiente regularidad. W. H. Bragg
y su hijo W. L. Bragg inventaron la cristalografía de rayos X en 1912 y luego
3
http://www.alipso.com/monografias/origenes_biologia_celymolec/
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Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
fundaron la escuela de cristalógrafos que convirtió al Reino Unido en la patria de la
estructura molecular.
John Desmond Bernal demostró en 1939 que el virus del mosaico del tabaco, TMV,
consiste en una asociación de centenares de subunidades proteínicas idénticas.
W. C. Astbury en 1945. En el DNA las bases forman una pila compacta, que es
perpendicular al eje de la molécula.
Pauling et al, propone la existencia de los elementos de estructura secundaria,
denominados hélice alfa y hoja beta.
En 1937 Max Perutz se
propuso establecer la estructura en el espacio de la
molécula de la proteína hemoglobina, por difracción de rayos X.
En 1959 junto con M. Rossman, A. F. Cullis, H. Muirhead y T.C.T. North lograban
resolver la estructura.
En 1953 Sanger y Thomson ya habían completado la secuencia de las cadenas A y
B de la hormona. Dos años después lograron establecer la posición de los puentes
disulfuro en la molécula de la insulina.
1.2. DISCIPLINAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA
MOLECULAR.
La Biología es una disciplina que pertenece a las Ciencias Naturales (abarcan todas
las disciplinas científicas como; biología, la física, la química, la geología y la
astronomía, que se dedican al estudio de la naturaleza, de los aspectos físicos de la
realidad, a diferencia de las ciencias sociales que estudian los factores humanos.)4
La palabra biología está formada por dos vocablos griegos: bios (“vida”) y logos
(“estudio o tratado”) y significa “estudio de la vida”. Se trata de una de las ciencias
naturales cuyo principal objetivo es el estudio del origen, de la evolución y de las
propiedades que poseen todos los seres vivientes de esta manera establecer las
leyes generales que rigen la vida orgánica.
4
http://www.encuentros-multidisciplinares.org/Revistan%C2%BA3/Miguel%20A%20Fuertes%2020Jos%C3%A9%20M%20P%C3%A9rez.pdf
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Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
La biología es una disciplina científica que abarca un amplio espectro de campos de
estudio que, a menudo, se tratan como disciplinas independientes. Todas ellas
juntas, estudian la vida en un amplio rango de escalas.
 La vida se estudia a escala atómica y molecular en biología molecular, en
bioquímica y en genética molecular.
 Desde el punto de vista celular, se estudia en biología celular o citología, y a
escala pluricelular se estudia en fisiología, anatomía e histología.
 Desde el punto de vista de la ontogenia o desarrollo de los organismos a nivel
individual, se estudia en biología del desarrollo.
 Las poblaciones interdependientes y sus hábitats se examinan en la ecología y
la biología evolutiva, y la que trata el comportamiento de los grupos, la etología. 5
1.2.1.
DISCIPLINAS
CIENTÍFICAS
QUE
FORMAN
PARTE
DE
LA
BIOLOGÍA MOLECULAR.
El estudio mediante métodos fisicoquímicos de la materia viva y los procesos
biológicos engloba una serie de disciplinas científicas que pueden considerarse
dentro del concepto general de Biología Molecular. La teoría biológica general
sugiere que cualquier sistema genético (genotipo) que pueda evolucionar por
selección natural requiere un almacenamiento de memoria bastante estable, y en
consecuencia será poco reactivo, aunque el fenotipo del organismo esté más
dispuesto a reaccionar con el medio ambiente.
1.2.1.1. BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL.
Trata del conocimiento de la naturaleza química de los constituyentes celulares que
en su mayor parte es idéntico al de la “química orgánica de los productos naturales”.
En las últimas décadas ha ido adquiriendo mayor importancia en el conocimiento de
las sustancias naturales de alto peso molecular, el estudio de la constitución y
estructura de las proteínas y de los ácidos nucleicos.
5
http://hnncbiol.blogspot.com/2008/01/biologia-ciencias-biologicas.html
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1.2.1.2. BIOQUÍMICA INORGÁNICA O“QUÍMICA INORGÁNICA BIOLÓGICA”
La tendencia inicial se refleja aún en la división de la química en orgánica e
inorgánica. Ahora esta distinción es artificial y no tiene base científica. Así, los 25
elementos químicos que libres en forma de iones, o combinados en macrocomplejos,
regulan espacial y temporalmente muchas de las interacciones entre biomoléculas.
1.2.1.3. BIOQUÍMICA METABÓLICA Y ENZIMOLOGÍA.
La “Bioquímica Metabólica” tiene como objetivo el estudio de las reacciones
químicas que suceden continuamente en los seres vivos. Estas reacciones químicas
se efectúan gracias a la regulación catalítica de los enzimas, cuyo estudio, ocupa un
amplio lugar dentro de la Bioquímica en la disciplina denominada “Enzimología”.
1.2.1.4. FISIOLOGÍA MOLECULAR.
El estudio de la regulación de los procesos químicos que tienen lugar en las
estructuras de la célula y que constituyen la verdadera función de dichos elementos
estructurales es el objetivo de la “Fisiología Molecular”.
1.2.1.5. BIOLOGÍA MOLECULAR Y QUÍMICA FÍSICA.
Muchos de los procesos biológicos fundamentales, han podido ser explicados
gracias a la aplicación de técnicas de investigación fisicoquímicas dando lugar a la
disciplina científica denominada Biología Molecular. La Química Física describe la
naturaleza en términos de átomos, moléculas y energía, el carácter interdisciplinario
de la Biología Molecular se hace aún más patente teniendo en cuenta que su ciencia
madre, la Química Física, utiliza como herramienta de trabajo las matemáticas.
1.3. INFORMACIÓN GENÉTICA Y EL GENOMA.
1.3.1. EL GENOMA
El genoma es la información genética con que cuentan los seres vivos contenido en
las células presente en un organismo en particular, la cual está almacenada en los
genes y estos a su vez en los cromosomas. Prácticamente todos los genomas (con
excepción de los de algunos virus) están formados por ADN, una doble hélice
compuesta por dos hebras de nucleótidos.
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La secuencia de nucleótidos del ADN es la que determina la información contenida
en los genes.
Fig. 1.1. El secreto de la vida del cromosoma a los genes6
En el caso de organismos eucariotas, la mayor parte del genoma está contenida en
el núcleo, pero algunos orgánulos celulares, como mitocondrias y cloroplastos,
también contienen material genético, constituido por moléculas de ADN. El genoma
nuclear de la célula eucariota puede ser diploide (2n, siendo n el número de
cromosomas), si está formado por dos series de cromosomas en cada núcleo; o
haploide (n), si solo existe una serie cromosómica por núcleo. Los biólogos tienen un
gran interés en el estudio e identificación de los genes y han completado la
secuenciación del genoma (conjunto de genes) humano en abril de 2003, que
actualmente permite identificar y hacer terapias para las enfermedades que se
trasmiten genéticamente como: enanismo, albinismo, hemofilia, sordera, etc.
El genoma humano contiene cerca de 3 billones de nucleótidos (pares de bases, pb)
presentes en 46 cromosomas (22 autosomas y 2 cromosomas sexuales). En los
seres humanos el sexo del recién nacido depende del tipo de espermatozoide que
realice la fecundación. Si el espermatozoide que fecunda el óvulo es portador del
cromosoma X el cigoto resultante dará lugar a una niña (XX) y si el espermatozoide
que fecunda al óvulo es portador del cromosoma Y el cigoto dará lugar a un niño
(XY). El espermatozoide y el óvulo humano son las células responsables de la
6 Biología celular, 4º ESO. i.e.s. "la rábida" departamento de biología y geología.
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/manuales/materiales_tic/Cell_anim_archivos/Cell_anim_arch
ivos/DELCROMOSAGENES.jpg
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transmisión de los caracteres hereditarios. Poseen una compleja estructura que les
permite llevar a cabo el transporte del material genético y la formación del cigoto que
dará origen al nuevo individuo con las características de los progenitores.
Fig. 1.2. Cromosomas Humanos y el Material Genético. 7
1.3.3. MATERIAL GENÉTICO
El material genético se emplea para guardar la información genética de una forma de
vida orgánica. Para todos los organismos conocidos actualmente, el material
genético es casi exclusivamente ácido desoxirribonucleico (ADN o DNA). Algunos
virus usan ácido ribonucleico (ARN o RNA) como su material genético. Las células
modernas usan el ARN principalmente para construir proteínas de las instrucciones
del ADN, en la forma de ARN mensajero, ARN ribosómico y ARN de transferencia.
1.3.4. CROMATINA Y LOS CROMOSOMAS
El DNA nunca está desnudo. En eucariotas interacciona con una gran variedad de
proteínas, se espiraliza y condensa para formar la cromatina y los cromosomas.
Los cromosomas constituyen el orden superior de empaquetamiento del DNA y se
pueden visualizar al microscopio óptico como un ovillo formado por una hebra de 1,7
a 8,5 cm de longitud y esta formada por una unidad estructural que es la cromatina
que se
visualiza al microscopio electrónico (fibras que contienen aprox. 60%
proteína y 35% DNA y 5% RNA). Está compuesta por 6-7 nucleosomas por vuelta.
Cada nucleosoma es un disco formado por un octámero de proteínas básicas
7
i.e.s. "la rábida", departamento de biología y geología, Biología celular, 4º ESO.
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/manuales/materiales_tic/Cell_anim_archivos/Cell_anim.htm
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denominadas histonas, donde exteriormente se enrolla el DNA. Todo el ovillo de
ADN de la célula forma una esfera de un radio inferior a 2 milésimas de milímetro.
Fig. 1.3. La Célula, el cromosoma y el ADN.8
Lo que hace el ADN capaz de producir copias es que al igual que el viviente
completo, tiene una estructura simétrica duplicada: es una molécula de doble
cadena en forma de escalera en espiral.
1.3.4.1. MORFOLOGÍA DEL CROMOSOMA METAFÁSICO
Los cromosomas se ven como estructuras delgadas y alargadas. Tienen un brazo
corto y otro largo, separados por un estrechamiento o constricción primaria, llamada
centró mero. El brazo corto se designa como p y el largo como q. El centrómero es el
punto de unión del huso mitótico y es parte integral del cromosoma. Es esencial para
el movimiento y segregación normales del cromosoma durante la división celular.
Con frecuencia tienen constricciones secundarias (NOR) en los brazos cortos,
conectando trozos muy pequeños de ADN llamados satélites, que contienen genes
que codifican el RNA ribosómico. Las cromátides son estructuras idénticas en
morfología e información ya que contienen cada una
molécula de ADN. Las
cromátidas están unidas por el centrómero. Morfológicamente se puede decir que el
cromosoma es el conjunto de dos cromátidas y genéticamente cada cromátida tiene
el valor de un cromosoma. Los telómeros se encuentran al extremo de cada brazo
del cromosoma. El ADN de los telómeros no se transcribe.
8
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Los cromosomas metafásicos tienen cuatro formas básicas y se pueden clasificar de
acuerdo con la longitud de los brazos corto y largo, así como por la posición del
centrómero.
 Los cromosomas metacéntricos tienen los brazos corto y largo de
aproximadamente la misma longitud, con el centrómero en el punto medio.
 Los cromosomas submetacéntricos tienen los brazos corto y largo de longitudes
desiguales, con el centrómero más próximo a uno de los extremos.
 Los cromosomas acrocéntricos tienen el centrómero my cerca de un extremo,
con un brazo corto muy pequeño.
 En los telocéntricos el centrómero está en un extremo del cromosoma y éste
tiene un solo brazo.
Fig. 1.4. ADN empaquetada hasta constituir un cromosoma9 y Morfología del
cromosoma (1nm = 0,001 mm = 1 x 10 mm = 1 x 10 mm). 10
1.3.5. LOS GENES
Gen es la unidad de herencia, partícula de material genético o hereditario que
determina la herencia de una característica determinada, o de un grupo de ellas. En
términos moleculares puede definirse como la secuencia lineal de nucleótidos
considerada como unidad de almacenamiento de información, y físicamente está
9
Ficha de trabajo de la Dra. Andrea Albarenga Julio del 2010 Niveles de compactación del ADN en
eucariotas. http://biologia-lacienciadelavida.blogspot.com/2010/07/ciclo-celular-ficha-de-trabajo-para4.html
10 Genética - Técnicos para Bioterio by Gabriel Robledo is licensed under a Creative Commons
Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada
3.0
Unported
License.http://geneticabioterio.wordpress.com/cromosomas/
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formado por un segmento del ADN del cromosoma localizado en el núcleo celular y
se disponen en línea a lo largo de cada uno de ellos. Cada gen ocupa en el
cromosoma una posición, o locus (plural: loci).
Atendiendo al aspecto que afecta a la herencia, esa unidad básica recibe también
otros nombres, como recón, cuando lo que se completa es la capacidad de
recombinación (el recón será el segmento de ADN más pequeño con capacidad de
recombinarse), y mutón, cuando se atiende a las mutaciones (y, así, el mutón será el
segmento de ADN más pequeño con capacidad de mutarse).
Los genes no están situados siempre de forma contigua en el ADN, sino que
separando los genes existe una gran cantidad de ADN (región intergénica). En
términos generales, un gen es un fragmento de ADN que codifica una proteína o un
péptido. El ADN contiene la información genética de todos los seres vivos. Es como
el código de barra de todos los organismos vivos que existen en la tierra, que está
formado por segmentos llamados genes. El conjunto de todos los caracteres
transmisibles, que vienen fijado en los genes, recibe el nombre de genotipo y su
manifestación exterior en el aspecto del individuo el de fenotipo. Se llama idiotipo al
conjunto de posibilidades de manifestar un carácter que presenta un individuo. La
combinación
de
genes
es
específica
para
cada
organismo
y
permite
individualizarnos. Estos genes provienen de la herencia de nuestros padres y por
ello se utiliza los tests de ADN para determinar el parentesco de alguna persona.
La genética (del término "Gen", que significa "descendencia") es el campo de las
ciencias biológicas que trata de comprender cómo la herencia biológica es
transmitida de una generación a la siguiente, y cómo se efectúa el desarrollo de las
características que controlan estos procesos.
1.4. TIPOS Y COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS.
1.4.1. ÁCIDO NUCLÉICO
Los ácidos nucleicos son macromoléculas, polímeros formados por la repetición de
monómeros llamados nucleótidos, es decir, unidos mediante enlaces fosfodiéster. Se
forman, así, largas cadenas o polinucleótidos, lo que hace que algunas de estas
moléculas lleguen a alcanzar tamaños gigantes (de millones de nucleótidos de
largo). La información contenida en los ácidos nucleicos es transcripta y luego
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traducida a las proteínas. Son las proteínas las moléculas que finalmente ejecutarán
las "instrucciones" codificadas en los ácidos nucleicos. A las unidades químicas que
se unen para formar los ácidos nucleicos se les denominan nucleótidos. 11
1.4.1.1. TIPOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Existen dos tipos de ácidos nucleicos:
 ADN (ácido desoxirribonucleico) y
 ARN (ácido ribonucleico).
En los eucariotas la estructura del ADN es de doble cadena helicoide, mientras que
la estructura del ARN es polinucleótido lineal monocatenaria, aunque puede
presentarse en forma extendida, como el ARNm, o en forma plegada, como el ARNt
y el ARNr. La masa y el peso molecular del ADN es generalmente mayor que la del
ARN. El ADN contiene la información genética de todos los seres vivos. Ambos
ácido nucleicos, se encuentran simultáneamente en organismos eucariotas y
procariotas (bacterias, etc.), y sólo uno de ellos en los virus.
1.4.1.2. COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos polímeros de alto peso molecular constituidos por unidades
elementales
denominadas
nucleótidos.Cada
nucleótido
es
una
molécula
compuesta por tres unidades:
a) Molécula de azúcar o glúcido de tipo pentosa (monosacárido de cinco átomos
carbonos), puede ser:
D-ribosa (R), en el caso del RNA
D-2- desoxirribosa (dR), en el caso del DNA
Ambas son aldopentosas y las encontraremos en los nucleótidos como
ßfuranosas. Conviene destacar que la única diferencia entre ambas está en que
en el carbono 2 de la desoxirribosa hay un hidrógeno (-H) en lugar del grupo
alcohol (-OH).
11
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b) Base orgánica nitrogenada, son compuestos orgánicos cíclicos, que incluyen dos
o más átomos de nitrógeno y son la parte fundamental de los ácidos nucleicos.
Biológicamente existen cinco bases nitrogenadas, que se clasifican en:
Las Bases Purínicas, derivadas de la estructura de las Purinas (con dos anillos):
la Guanina (G) y la Adenina (A). Ambas se encuentran tanto en el ADN como el
ARN.
Las Bases Pirimidínicas, derivadas de la estructura de las Pirimidinas (con un
anillo): la Timina (T), Citosina (C) y Uracilo (U). La timina sólo se encuentra en la
molécula de ADN, el uracilo sólo en la de ARN y la citosina, en ambos tipos de
macromoléculas.
Fig. 1.5. Composición Química de los Ácidos Nucleicos.12
Además de las bases nitrogenadas descritas, se han encontrado otras en
algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Entre las
bases púricas son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6-metil-aminopurina;
las bases pirimidínicas la 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil
citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares. En los ARN
transferentes (ARN-t) que intervienen en el proceso de traducción de proteínas
se encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I).
12
Biología COU- Anaya. Bloque 1. Tema 6: Composición química de los Ácidos Nucleicos.
http://www.iesbanaderos.org/html/departamentos/biogeo/Apuntes/Bio/T%206%20Ac%20Nucleicos/2%20Composicion.htm
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c) Grupos o radical fosfato, uno o varios derivados del ácido fosfórico (H 3PO4-). En
la cadena de ácido nucleico une dos pentosas a través de una unión
fosfodiester.
1.4.2. NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS
El azúcar y la base nitrogenada se unen entre si formando un nucleósido. El enlace
se forma entre el carbono anomérico (C1) del azúcar (pentosa) y uno de los
nitrógenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las bases nitrogenadas
mediante un enlace de tipo N-glucosídico. En la unión se forma una molécula de
agua.
La unión mediante un enlace éster o fosfoéster entre el nucleósido y el ácido
fosfórico da lugar al nucleótido. Es una unión entre un OH del ácido fosfórico y el OH
situado en el carbono 5 del azúcar, con formación de una molécula de agua.
Los nucleótidos son las unidades o monómeros utilizados para construir largas
cadenas de polinucleótidos. Tanto los nucleótidos como los nucleósidos pueden
contener como azúcar la D-ribosa (ribonucleótidos y ribonucleósidos) o la pentosa
2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucleótidos y desoxirribonucleósidos).
Además, los
nucleótidos pueden tener 1, 2 ó 3 grupos fosfato unidos al carbono 5’ de la pentosa,
existiendo por tanto, nucleótidos 5’ monofosfato, nucleótidos 5’ difosfato y
nucleótidos 5’ trifosfato según el número de grupos fosfato que posea.
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Se denomina nucleótido-monofosfato (como el AMP) cuando hay un solo grupo
fosfato, cuando lleva unido una unidad de fosfato al carbono 5' de la ribosa o
desoxirribosa y dicho fosfato sirve de enlace entre nucleótidos, uniéndose al carbono
3' del siguiente nucleótido; nucleótido-difosfato (como el ADP) si lleva dos y
nucleótido-trifosfato (como el ATP) si lleva tres.
La terminología empleada para referirse a los nucleósidos y nucleótidos es la
siguiente:
BASE NITROGENADA
NUCLEÓSIDO
NUCLEÓTIDO
Adenina
Adenosina
Ácido Adenílico
Guanina
Guanidina
Ácido Guanílico
Citosina
Citidina
Ácido Citidílico
Timina
Timidina
Ácido Timidílico
Uracilo
Uridina
Ácido Uridílico
1.4.3. LOS DINUCLEOTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS
Dos nucleótidos van a poder unirse entre sí mediante un enlace ésterfosfato
(fosfoéster). Un dinucleótido en el que se unieron un nucleótido con la base A con un
nucleótido con la base G y el enlace fosfodiester se formó entre el OH (hidroxilo) del
azúcar del carbono 3'del nucleótido con base A y entre un OH del ácido fosfórico del
carbono 5'del nucleótido con base G con formación de una molécula de agua, se
representa simplemente como AG. Si a este dinucleótido se le agrega otro
nucleótido en el carbono 3' y este nucleótido tiene una base T, el trinucleótido
resultante se representará por AGT. Ésta es la forma simplificada en que se
acostumbra representar los polinucleótidos.
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La unión de otros nucleótidos dará lugar a un polinucleótido. Es de destacar que en
toda cadena de polinucleótidos el nucleótido de uno de los extremos tendrá libre el
OH del azúcar en posición 3, éste será el extremo 3' de la cadena. El ácido fosfórico
del nucleótido que se encuentre en el extremo opuesto también estará libre, éste
será el extremo 5'. Esto marca un sentido en la cadena de polinucleótidos. Toda
cadena podrá considerarse bien en sentido 3'-5' o en sentido 5'-3' y así habrá que
indicarlo.
Estructura de un polirribonucleótido
1.5. FUNCIONES Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS.
Así como las proteínas están formadas por cadenas largas de aminoácidos, los
ácidos nucleicos están formados por cadenas largas de nucleótidos. Un nucleótido,
sin embargo, es una molécula más compleja que un aminoácido. El DNA y el RNA
desempeñan papeles biológicos muy diferentes. El DNA es el constituyente primario
de los cromosomas de las células y es el portador del mensaje genético. La función
del RNA es transcribir el mensaje genético presente en el DNA y traducirlo a
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proteínas. Los nucleótidos, además de su papel en la formación de los ácidos
nucleicos, tienen una función independiente y vital para la vida celular. Cuando un
nucleótido se modifica por la unión de dos grupos fosfato, se convierte en un
transportador de energía, necesario para que se produzcan numerosas reacciones
químicas celulares.13
1.5.1. ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO O ADN
El ácido desoxirribonucleico, es un tipo de ácido nucleico, una macromolécula , que
forma parte de todas las células. Contiene las instrucciones o información genéticas
usadas en el desarrollo y el funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos
y también de los virus, excepto algunos cuyo material genético es ARN (los
retrovirus), siendo el responsable de su transmisión hereditaria. Dentro de las
células, el ADN está organizado en estructuras llamadas cromosomas. Estos
cromosomas se duplican antes de que las células se dividan, en un proceso llamado
replicación de ADN. Las proteínas cromáticas, como las histonas, comprimen y
organizan el ADN dentro de los cromosomas. Estas estructuras compactas dirigen
las interacciones entre el ADN y otras proteínas, ayudando al control de las partes
del ADN que son transcritas.
1.5.1.1.
TIPOS DE ADN
Acorde a las evidencias, sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos
del 10 %).
Existen diferentes tipos que los podemos dividir en:
 ADN de copia única (el 57 % del total) formados por segmentos de
aproximadamente 1000 pares de nucleótidos longitud, una pequeña parte de
este ADN contiene los genes.
 ADN repetitivo (20 %) son unidades de aproximadamente 300 pares de
nucleótidos que se repiten en el genoma unas 105 veces (Unidades de
repetición). Se intercalan con el ADN de copia única.
 ADN satélite (altamente repetitivo: 28 %) son unidades cortas de pares de
nucleótidos que se repiten en el genómico. Son característicos en cada especie
13
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y pueden ser separados por centrifugación. Constituyen la heterocromatina y no
se le conoce función.
Según su estructura se distinguen los siguientes tipos de ADN:
 Monocatenarios o de una cadena; por ejemplo los de algunos virus.
 Bicatenarios, con dos hebras o cadenas (algunos virus, las bacterias y los
eucariotas). Esta doble cadena puede disponerse en forma lineal (ADN del
núcleo de las células eucarióticas) o en forma circular (ADN de las células
procarióticas, así como de las mitocondrias y cloroplastos eucarióticos).
1.5.1.2. PROPIEDADES DEL DNA
 Insolubles en soluciones diluidas de NaCl
 Soluble en soluciones concentradas de NaCl
 Insoluble en alcohol
 Puede ser disociado de la proteína por tratamiento con un detergente o un fenol
Químicamente, el ADN es un largo polímero de unidades simples llamadas
nucleótidos con un armazón hecho de azúcares y grupos de fosfato unidos
alternativamente entre sí mediante enlaces de tipo éster. Unido covalentemente a
cada azúcar se encuentra una base nitrogenada: adenina, timina, citosina o guanina.
La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que
codifica la información. Esta información es interpretada usando el código genético,
que especifica la secuencia de los aminoácidos de las proteínas, según una
correspondencia de un triplete de nucleótidos (codón) por cada aminoácido.
Entonces el ADN son polinucleótidos constituidos por d-AMP, d-GMP, d-CMP y
dTMP. También existen otras bases nitrogenadas (las llamadas bases nitrogenadas
minoritarias), derivadas de forma natural o sintética de alguna otra base mayoritaria.
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Lo son por ejemplo la hipoxantina, relativamente abundante en el tRNA, o la cafeína,
ambas derivadas de la adenina; otras, como el aciclovir, derivadas de la guanina,
son análogos sintéticos usados en terapia antiviral; otras, como una de las derivadas
del uracilo, son antitumorales.
1.5.1.3. CARACTERISTICAS DEL ADN
 Es una doble hélice enrollada helicoidalmente “a derechas” (sentido dextrorso).
Por lo común su estructura tridimensional posee giro hacia la derecha (ß-ADN,
dextrogiro) que es la forma más estable y ocasionalmente posee giro ha la
izquierda (z-ADN, levógiro)
Fig. 1.6. Enrollamiento del AND.14
 Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los
que un grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azúcares
sucesivos (posiciones 3’ de un azúcar y 5’ del siguiente).
 Las dos hélices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno
producidos entre las bases nitrogenadas de cada hélice. Siguiendo los datos de
Chargaff (1959), la Adenina de una hélice aparea con la Timina de la hélice
complementaria mediante dos puentes de hidrógeno. Igualmente, la Guanina de
una hélice aparea con la Citosina de la complementaria mediante tres puentes
de hidrógeno.
14
http://heliotropodeluz.wordpress.com/2008/06/14/la-clave-esta-en-el-adn/
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 El diámetro independientemente de la especie de la doble hélice es de 20Å. Las
bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble
hélice y están apiladas unas sobre otras a una distancia de 3,4 Å, el cual está
constituido por 10 residuos de nucleótidos. Cada 10 bases, cada 34 Å se
produce una vuelta completa de la doble hélice (360º). El tamaño de la molécula
de ADN de doble hélice se expresa en miles de bases o Kb. La longitud de 1kb
es entonces 0.34 micras. Una molécula de ADN de un milímetro de longitud
estará formado de 3 mil Kb o sea tres millones de bases.
 Las bases se encuentran en sus configuraciones cetónicas, cumpliendo así las
reglas de apareamiento A-T y G-C. La secuencia de bases nitrogenadas puede
ser cualquiera, no existe ninguna restricción.
1.5.1.4. ESTRUCTURA DEL ADN
El ADN es una molécula por lo general bicatenaria, formada por dos cadenas
dispuestas de forma antiparalela y con las bases nitrogenadas enfrentadas.
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El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos sólo
se han observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformación
que adopta el ADN depende de su secuencia, la cantidad y dirección de
superenrollamiento que presenta, la presencia de modificaciones químicas en las
bases y las condiciones de la solución, tales como la concentración de iones de
metales y poliaminas.
De las tres conformaciones, la forma "B" es la más común en las condiciones
existentes en las células. Las dos dobles hélices alternativas del ADN difieren en su
geometría y dimensiones.
La forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, más amplia que la "B", con
una hendidura menor superficial y más amplia, y una hendidura mayor más estrecha
y profunda. La forma "A" ocurre en condiciones no fisiológicas en formas
deshidratadas de ADN.
Los segmentos de ADN en los que las bases han sido modificadas por metilación
pueden sufrir cambios conformacionales mayores y adoptar la forma "Z". En este
caso, las hebras giran alrededor del eje de la hélice en una espiral que gira a mano
izquierda, lo opuesto a la forma "B".
Fig. 1.7. De izquierda a derecha, las estructuras de ADN A, B y Z.15
Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por proteínas específicas
que se unen a ADN-Z y posiblemente estén implicadas en la regulación de la
transcripción.
1.5.1.5. REPLICACIÓN DEL ADN
La replicación del ADN es el proceso por el cual se obtienen copias o réplicas
idénticas de una molécula de ADN. La replicación es fundamental para la
15
Wikipedia. Estructuras en doble hélice de ADN. http://es.wikipedia.org/wiki/ADN-A.
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transferencia de la información genética de una generación a la siguiente y, por
ende, es la base de la herencia. El mecanismo consiste esencialmente en la
separación de las dos hebras de la doble hélice, las cuales sirven de molde para la
posterior síntesis de cadenas complementarias a cada una de ellas. El resultado final
son dos moléculas idénticas a la original. Este tipo de replicación se denomina
semiconservativa debido a que cada una de las dos moléculas resultantes de la
duplicación presenta una cadena procedente de la molécula madre y otra recién
sintetizada. Todas las funciones del ADN dependen de sus interacciones con
proteínas. También pueden unirse enzimas, entre las cuales son particularmente
importantes las polimerasas, que copian la secuencia de bases del ADN durante la
transcripción y la replicación.
La replicación del DNA en la naturaleza donde obtienen dos moléculas hijas
exactamente iguales consiste en:
1. Separación de las dos cadenas que forman la doble hélice, de lo cual se encargan
enzimas y proteínas que se encuentran en la célula eucariótica.
2. Unión de los cebadores ('primers' o iniciadores) de DNA en una de las hebras
separadas.
3.Unión de la polimerasa a los lugares donde se encuentra el "primer" para
comenzar a copiar de manera progresiva la hebra de DNA, ya que la polimerasa
necesita un cebador que le indique dónde empezar, por ser incapaz de copiar DNA
monocatenario. El sentido de la síntesis es siempre 5'- 3'.
4. Constitución de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra
hija, por lo que al proceso se le denomina replicación semiconservativa del DNA.
Según la Horquilla replicativa del DNA con todas las enzimas implicadas se sigue el
siguiente proceso.
Es necesaria la existencia de un "primer" para que la DNA polimerasa de E. coli
inicie cadenas de novo. Este "primer" es proporcionado por una RNA polimerasa
llamada primasa, la cual en asociación con un complejo de proteínas llamado
primosoma sintetiza una cadena corta de RNA. La DNA polimerasa III puede utilizar
este "primer" para continuar la síntesis de DNA. Una proteína llamada helicasa
(originalmente llamada rep) es necesaria para desenlazar y abrir la hélice de DNA
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para permitir la replicación. Las proteínas de enlace a DNA se encargan de
estabilizar las regiones de simple cadena que se forman transitoriamente durante el
proceso de replicación.
Fig.1.8.Horquilla Replicativa16
La DNA polimerasa puede sintetizar DNA en la dirección 5' - 3', por lo que una de las
hebras debe ser sintetizada discontinuamente, esto lleva a la formación de cortas
cadenas de DNA con huecos entre ellas que deben ser completados por la acción
de la DNA polimerasa I y unidos por la acción de una DNA ligasa.
1.5.1.6. FUNCIONES BIOLÓGICAS DEL ADN
El ADN es el portador de la información genética y a través de ella puede controlar,
en forma indirecta, todas las funciones celulares. Debemos recordar aquí que las
enzimas son proteínas que catalizan todas las funciones biológicas y se sintetizan
en las células de acuerdo a la información genética. Los segmentos de ADN que
llevan la información genética se llaman genes. Podemos considerar el DNA como el
cerebro celular que regula el número y naturaleza de cada tipo de estructura y
composición celular, transmitiendo la información hereditaria y determinando la
estructura de las proteínas, que a través de enzimas determinará el resto de
funciones celulares.
1.5.2. ÁCIDO RIBONUCLEICO O ARN
Esta macromolécula representa alrededor del 7% del peso de una célula, constituida
por largas cadenas de ribonucleotidos, unidos por enlaces fosfodiester. Estos se
16
http://www.editoriallapaz.org/ateismo_ADN_acetatos_files/image010.gif
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forman por la unión de un grupo fosfato, ribosa (una aldopentosa cíclica) y una base
nitrogenada unida al carbono 1’ de la ribosa, que puede ser
C, G, A y U. En
general los ribonucleótidos se unen entre sí, formando una cadena simple, excepto
en algunos virus.
La cadena simple de ARN puede plegarse y presentar regiones con bases
apareadas, de este modo se forman estructuras secundarias del ARN, que tienen
muchas veces importancia funcional, como por ejemplo en los ARNt (ARN de
transferencia).
1.5.2.1. TIPOS DE ARN
Se conocen tres tipos principales de ARN y todos ellos participan de una u otra
manera en la síntesis de las proteínas. Ellos son:
ARN MENSAJERO (ARNm)
Consiste en una molécula lineal de nucleótidos (monocatenaria), cuya secuencia de
bases es complementaria a una porción de la secuencia de bases del ADN. El
ARNm dicta con exactitud la secuencia de aminoácidos en una cadena polipeptídica
en particular. Las instrucciones residen en tripletes de bases a las que llamamos
codones, los cuales determinan el aminoácido que debe incorporarse en la proteína
que se va a sintetizar. Son los ARN más largos y pueden tener entre 1000 y 10000
nucleótidos. En los eucariontes los ARNm derivan de moléculas precursoras de
mayor tamaño que se conocen en conjunto como ARN heterogéneo nuclear
(hnARN),
el
cual
presenta
secuencias
internas
no
presentes
en
ARN
citoplasmáticos. El nombre mensajero deriva de su papel el intermediario: actúa
como vehículo de transporte de información genética entre el ADN y las proteínas.
ARN RIBOSOMAL (ARNR)
Este tipo de ARN una vez transcripto, pasa al nucléolo donde se une a proteínas. De
esta manera se forman las subunidades de los ribosomas. Aproximadamente dos
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terceras partes de los ribosomas corresponde a sus ARNr. Los ribosomas, formados
por proteínas y ARN ribosomal y participan activamente en la lectura de la molécula
de ARN mensajero para sintetizar las proteínas contenidas en la secuencia de
codones del ARN mensajero.
Diagrama de un ribosoma
Procarionte
ARN DE TRANSFERENCIA (ARNt)
Este es el más pequeño de todos y el más abundante en las células, tiene
aproximadamente 75 nucleótidos en su cadena, además se pliega adquiriendo lo
que se conoce con forma de hoja de trébol plegada. El ARNt se encarga de
transportar los aminoácidos libres del citoplasma al lugar de síntesis proteica. En su
estructura presenta un triplete de bases complementario de un codón determinado,
lo que permitirá al ARNt reconocerlo con exactitud y dejar el aminoácido en el sitio
correcto. A este triplete lo llamamos anticodón.
Molécula de ARNt
Estos tres tipos de ARN están implicados en el pasaje de información del lenguaje
de los nucleótidos del ADN al de los aminoácidos de las proteínas, en un proceso
conocido como; “El dogma central de la biología”.
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ARN PEQUEÑO NUCLEAR (ARNpn O snRNA)
En eucariontes encontramos un grupo de seis ARN que están en el núcleo, el ARN
pequeño nuclear, estos desempeñan cierto papel en la maduración del ARNm.
Existen, aparte de los naturales, algunos ácidos nucleicos no presentes en la
naturaleza sintetizados en el laboratorio:
 Ácido nucleico peptídico
 Morfolino y ácido nucleico bloqueado (lna en inglés).
 Ácido nucleico glicólico.
 Ácido nucleico treósico.
1.5.2.2. PROPIEDADES DEL RNA
 Soluble en soluciones diluidas de NaCl
 Insoluble en alcohol
 Puede ser disociado de las proteínas por tratamiento con un detergente o fenol.
1.5.2.3. FUNCIÓN DEL ARN
Un gen está compuesto, como hemos visto, por una secuencia lineal de nucleótidos
en el ADN, dicha secuencia determina el orden de los aminoácidos en las proteínas.
Sin embargo el ADN no proporciona directamente de inmediato la información para
el ordenamiento de los aminoácidos y su polimerización, sino que lo hace a través
de otras moléculas, los ARN.
1.6. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN
Durante la transcripción la enzima ARN polimerasa, copia la secuencia de una hebra
del ADN y fabrica una molécula de ARN complementaria al fragmento de ADN
transcripto. El proceso es similar a la replicación del ADN, pero la molécula nueva
que se forma es de cadena simple ARN. La información del DNA es transferida al
RNAm, que es sintetizado utilizando como molde el DNA original y dirigido por la
holoenzima RNA polimerasa. Este RNAm será transportado desde el núcleo a los
ribosomas que se encuentran en el citoplasma.
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1.6.2. LA TRADUCCIÓN Y EL CÓDIGO GENÉTICO
La factoría celular responsable de la síntesis de proteínas es el ribosoma. La
molécula especifica que va a trasladar los aminoácidos (componentes elementales
de las proteínas) siguiendo las pautas dictadas por el RNAm es el RNAt. Cada RNAt
tiene un anticodón especifico (formado por tres bases denominados codones). La
molécula del ARN mensajero se traslada a los ribosomas donde ocurre la etapa de
traducción. A medida que el ribosoma lee la secuencia de codones va formando una
proteína, a partir de la unión de aminoácidos. Según cuál es el codón que el
ribosoma "lee" va colocando el aminoácido que corresponde. Si se considera la
combinación de cuatro bases tomadas de a tres, existe un total de 64 codones
posibles. Cada codón determina qué aminoácido se colocará en la proteína que se
está fabricando. De los 64 codones, 61 corresponden a aminoácidos y 3 son
codones de terminación (stop), responsables de la finalización de la síntesis
proteica.
La siguiente tabla es el código genético o "diccionario" que permite traducir la
información escrita en el lenguaje de los ácidos nucleicos (nucleótidos) al lenguaje
de las proteínas (aminoácidos), y es universal, válido para todos los seres vivos.
Así, la secuencia ATG (AUG en el ARNm) codifica para la metionina, y el codón TTT
(UUU en el ARNm) codifica para la fenilalanina en todos los organismos vivos.
Como sólo existen 20 aminoácidos en la naturaleza, varios codones pueden
codificar para el mismo aminoácido (por ejemplo, al aminoácido glicina le
corresponden los codones GGU, GGC, GGA y GGG).
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Una proteína cargada denominada aminoacil tRNA sintetasa es la encargada de
unir el aminoácido correcto correspondiente al anticodón a una posición de anclaje.
De esta manera a partir de una señal de iniciación en el RNAm (codón ATG)
comienza la síntesis, y el primer aminoácido transportado por el RNAt y
correspondiente a este codón es la metionina. Este primer paso se denomina
iniciación de la traducción y tiene lugar en una posición concreta del ribosoma
denominada aminoacil (A). Posteriormente este RNAt junto con su aminoácido
correspondiente salta a una posición contigua denominada peptidil (P) y llega un
nuevo RNAt con el correspondiente aminoácido para anclarse en su codón y se sitúa
en la posición A que ha quedado libre. Entre ambos aminoácidos se establece una
unión peptídica y el RNAt de la posición P es liberado, comenzando el proceso de
nuevo.
Este proceso de elongación continúa hasta llegar a un codón de parada. Una vez
sintetizada la proteína pueden haber modificaciones postranscripcionales (cortes por
enzimas proteolíticas, fosforilaciones, glicosilaciones etc.
Se deduce entonces que la Replicación, Transcripción y Traducción son los tres
fenómenos sobre los que versa el Dogma Central de la Biología Molecular.
 La replicación consiste en la copia del ADN de una célula, antes de la división
celular, para que la célula hija tenga el mismo ADN que la madre.
 La transcripción consiste en convertir la información contenida en el ADN en un
formato “legible” para la maquinaria celular de síntesis de proteínas, el ARN.
 La traducción es el mecanismo por el que el mensaje que lleva el ARN se utiliza
para sintetizar proteínas.
Con estos tres mecanismos conseguimos extraer de la información genética (ADN)
los materiales (proteínas) necesarios tanto funcional como estructuralmente para
que una célula funcione.
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1.7. ENZIMAS
MOLECULAR
Y
VECTORES
USADOS
EN
LA
BIOLOGIA
1.7.1. CONCEPTO DE ENZIMA
Los
enzimas
son
estructuras
de
carácter
proteico,
catalizadores biológicos muy potentes y eficaces, tienen
una extraordinaria capacidad, tanto así, que permiten
reacciones que sin ellas se tendrían que realizar en
temperaturas, pH o presiones incompatibles con la vida.
Existe un grupo particular de enzimas que tiene funciones a nivel de genético.
Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan
indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente
desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran
su consecución.
1.7.2. USOS DE LAS ENZIMAS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR
Algunas son utilizadas en técnicas como PCR (taq polimerasa), enzimas de
restricción para sondas de hibridación, plásmidos recombinantes, secuenciación de
ADN, clonación, etc. (BAM H1, EcoRI, etc.), entre otras técnicas.
1.7.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE ENZIMAS
El nombre de una enzima suele derivarse del sustrato o de la reacción química que
cataliza, con la palabra terminada en -asa. Por ejemplo, lactasa proviene de su
sustrato lactosa; alcohol deshidrogenasa proviene de la reacción que cataliza que
consiste en "deshidrogenar" el alcohol; ADN polimerasa proviene también de la
reacción que cataliza que consiste en polimerizar el ADN.
La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado una
nomenclatura para identificar a las enzimas basada en los denominados Números
EC. De este modo, cada enzima queda registrada por una secuencia de cuatro
números precedidos por las letras "EC". El primer número clasifica a la enzima en
base a su mecanismo de acción.
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A continuación se indican las seis grandes clases de enzimas existentes en la
actualidad:
1.7.3.1. EC1 ÓXIDO-REDUCTASAS
Reacciones de oxido-reducción: Si una molécula se reduce, tiene que haber otra que
se oxide, catalizan reacciones de oxido reducción o redox.
Precisan la colaboración de las coenzimas de oxido reducción (NAD+, NADP+, FAD)
que aceptan o ceden los electrones correspondientes. Tras la acción catalítica, estas
coenzimas quedan modificadas en su grado de oxidación, por lo que deben ser
recicladas antes de volver a efectuar una nueva reacción catalítica. Ejemplos:





Deshidrogenasas
Amino oxidasa
Deaminasas
Catalasas.
Peroxidasas.
1.7.3.2.
EC2 (KINASAS) TRANSFERASAS
Transferencia de grupos funcionales:




grupos aldehídos
grupos acilos
grupos glucosilos
grupos fosfatos
Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas moléculas) a otras
sustancias receptoras.
monosacáridos,
Suelen
aminoácidos,
actuar en
etc.
procesos de
Ejemplos:
interconversión
transaminasas,
de
quinasas,
Transaldolasas, Transcetolasas.
1.7.3.3.
EC3 HIDROLASAS
Reacciones de hidrólisis, transforman polímeros en monómeros. Actúan sobre:
 enlace éster
 enlace glucosídico
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Catalizan reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de monómeros a
partir de polímeros. Actúan en la digestión de los alimentos, previamente a otras
fases de su degradación. La palabra hidrólisis se deriva de hidro → 'agua' y lisis →
'disolución'. Ejemplos: glucosidasas, lipasas, esterasas, Peptidasas y Fosfatasas.
1.7.3.4.
EC4 ISOMERASAS
Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus isómeros funcionales
o de posición, es decir, catalizan la racemización y cambios de posición de un grupo
en determinada molécula obteniendo formas isoméricas. Suelen actuar en procesos
de interconversión.
Ejemplo:
 Epimerasas (mutasa).
 Aldolasas
 Decarboxilasas
1.7.3.5.
EC5 LIASAS
Adición a los dobles enlaces:
 Entre C y C
 Entre C y O
 Entre C y N
Catalizan reacciones en las que se eliminan grupos H2O, CO2 y NH3 para formar un
doble enlace o añadirse a un doble enlace. Ejemplos: descarboxilasas, liasas,
Isomerasas de azúcar, Epimerasas y Mutasas.
1.7.3.6.
EC6 LIGASAS O SINTETASAS
Formación de enlaces, con aporte de ATP




Entre C y O
Entre C y S
Entre C y N
Entre C y C
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Catalizan la degradación o síntesis de los enlaces denominados "fuertes" mediante
al acoplamiento a moléculas de alto valor energético como el ATP. Ejemplos:
sintetasas, carboxilasas, Peptidosintetasas.
1.7.4. ACOMPAÑANTES NO PROTEICOS DE LAS ENZIMAS
1.7.4.1.
COFACTORES
Son iones inorgánicos que se unen temporariamente a las enzimas Ejemplos:
 Hierro Fe 2+ o Fe 3+ Oxidación / reducción
 Cobre, Cu + o Cu 2+ Oxidación / reducción
 Cinc, Zn2+ Ayuda a unir el NAD
1.7.4.2. COENZIMAS
Moléculas pequeñas que tiene carbono, interaccionan débilmente durante la
catálisis. La mayor parte de las coenzimas son vitaminas, muchas de las cuales
deben ser incorporadas con la dieta.
 Biotina:
Transporta
 Coenzima A:
-COO-
Transporta -CH2-CH3
 NAD y FAD Transportan electrones
1.7.4.3. GRUPOS PROSTETICOS
Están permanentemente unidos a las enzimas
 Hemo: Une iones O2 y electrones, contiene el cofactor hierro
 Flavina: Une electrones
 Retinal: Cofactor en la absorción de la luz
 Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato,
uniéndose al sitio activo. Se mueven de una enzima a otra agregando o quitando
grupos químicos del sustrato
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CAPÍTULO II
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO
TRANSGÉNICO
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2.1. ETAPAS DE
TRANSGÉNICO
LA
OBTENCIÓN
DE
UN
ORGANISMO
2.1.1. PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS
Uno de los objetivos principales de la biotecnología moderna es lograr que una
célula realice una tarea específica y útil de manera predecible y controlable. Por
ejemplo, que las células de la planta de maíz produzcan una nueva proteína que sea
capaz de eliminar a insectos que se alimentan de ella. Esto sería útil ya que
permitiría reducir el uso de insecticidas químicos y aumentaría la productividad para
el agricultor. En la actualidad, la biotecnología moderna permite lograr este tipo de
maíz. La mayoría de estas técnicas permiten estudiar biomoléculas, en particular
ADN, ARN y proteínas, y se las denomina técnicas de biología molecular. Por otra
parte, se denomina ingeniería genética a las técnicas que se usan específicamente
para transferir genes de un organismo a otro y construir fragmentos de ADN
recombinante (combina ADN de diferentes organismos). Así, es posible obtener las
proteínas recombinantes de interés y también mejorar cultivos y animales.
Las técnicas de biología molecular y de ingeniería genética se basan en una
característica particular que tienen los ácidos nucleicos: las bases A (adenina), T
(timina), C (citosina) y G (guanina) que forman parte de las moléculas de ADN y de
ARN tienen la capacidad de hibridar con bases complementarias siguiendo siempre
la siguiente regla: A se une con T y C se une con G.
Fig. 2.1. Estructura de una molécula de ARN de transferencia (ARNt) con regiones de bases
complementarias (en círculos rojos). La molécula de ARN, si bien mayormente es una única
hebra, tiene la posibilidad de aparearse con otra, e incluso de plegarse y formar regiones
complementarias dentro de la misma molécula. 17
“Biología” de Helena Curtis y N. Sue Barnes, 6ta Edición (2000) Editorial Panamericana. Capítulo
16: “DNA recombinante: las herramientas del oficio”.
17
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Así, si un investigador busca estudiar un gen de interés, basta con conocer al menos
una parte de su secuencia, para poder construir una porción complementaria que
permita “pescar” de algún modo a ese gen de interés. Esa porción pequeña de ácido
nucleico se denomina “sonda” y al sintetizarla en el laboratorio se le suele poner
alguna marca que permita visualizarla luego fácilmente (por ejemplo, fluorescencia),
como se representa en la siguiente imagen.
Fig. 2.2. Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria 18.
Otro principio subyacente en las técnicas de biología molecular es que el ADN,
debido a su estructura química y molecular, es mucho más estable que el ARN, por
lo cual la mayoría de las técnicas más fácilmente manipulables son con ADN.
Por último, las enzimas que se usan para cortar y pegar fragmentos de ADN, o para
sintetizar fragmentos de ADN, provienen de organismos. Estas enzimas se mejoran
para que trabajen eficientemente en las condiciones de laboratorio.
2.1.2.
ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO
La obtención de un transgénico implica la participación de un organismo que dona el
gen de interés y un organismo receptor del gen que expresará la nueva
característica deseada. Para el caso particular de la producción de una variedad de
maíz que resista el ataque de insectos, el organismo dador es la bacteria del suelo
denominada Bacillus thuringiensis (Bt corn) de la cual se extrae el gen que
determina la síntesis de la proteína insecticida, y el organismo receptor del gen es la
planta de maíz.
Las etapas del trabajo son básicamente cinco que a continuación se detalla cada
una de estas y las técnicas que involucran.
18 Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria. Fuente: “Las
sondas de ácidos nucleicos” por Rodolfo Wettstein en Ciencia Hoy, Volumen 4 -Nº 20- Setiembre
/octubre 1992
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia.
Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
2.1.2.1.
CORROBORAR QUE EXISTE UN GEN QUE CODIFICA PARA LA
CARACTERÍSTICA DE INTERÉS
Cuando se encuentra una característica en un organismo que resulta interesante
para transferir a otro organismo debe verificarse que es producto de un gen. Para
verificar que la característica de interés está codificada en el ADN y que no es
resultado de la interacción con el medioambiente, se aplican técnicas de genética.
Si la característica se atribuye a una proteína, que es producto directo de un gen,
será más sencillo transferir esa característica a un organismo que no la tiene.
2.1.2.2.
CLONADO DEL GEN
Una vez que se determinó que el organismo donante posee un gen que codifica para
la característica de interés, los biólogos moleculares se lanzan a la tarea de
conseguir ese gen, es decir: “clonar” el gen. Clonar un gen significa tenerlo puro en
el tubo de ensayos, o mejor aún, dentro de un vector (una molécula mayor de ADN
que permite guardar fragmentos de ADN en forma estable y práctica por más
tiempo). La tarea de clonar involucra varias técnicas que se describen a
continuación:
a) Extracción de ADN. Las extracciones de ADN de todos los organismos guardan
cierta similitud y consisten en romper las células para liberar su contenido y
separar el ADN liberado del resto de los componentes celulares.
b) Búsqueda de un gen entre la mezcla de genes del ADN. Si se conoce una
pequeña porción de la secuencia del gen que se está buscando, es posible
construir una sonda que permita “pescar” el fragmento de ADN que contiene esa
misma secuencia. Una vez aislado ese fragmento se lo estudia más
detalladamente. La técnica de PCR (siglas en inglés de Reacción en Cadena de
la Polimerasa) permite amplificar la cantidad de ADN y esto facilita el clonado del
gen de interés. La técnica de PCR se le estudia en el capítulo IV.
c) Una vez terminada la PCR, se realiza una técnica conocida como “electroforesis
en gel de agarosa” para visualizar los millones de fragmentos de ADN de interés.
Esta técnica consiste en armar un gel de agarosa, con pequeños huecos en un
extremo donde se deposita (“siembra”) el contenido del tubo de PCR. El gel es
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sometido a corriente eléctrica de modo que el ADN, que es una molécula
cargada negativamente, se desplaza por el gel hacia el polo positivo. Cuanto
más pequeño es el fragmento de ADN más rápido se desplaza y llega hasta el
extremo opuesto. Al preparar el gel se agrega la sustancia bromuro de etidio que
se intercala entre las bases del ADN y permite visualizarlo al ser iluminado con
luz UV. Las bandas luminosas corresponden a los fragmentos de ADN
amplificados.
d) Una vez que se visualizó el resultado del PCR en el gel de agarosa, la “bandita”
del gel que contiene el ADN de interés se recorta y se purifica el ADN. Luego se
realiza la secuenciación que consiste en conocer la cantidad y el orden en que
se ubican los nucleótidos en el fragmento de ADN analizado. Actualmente se
realiza en un secuenciador automático utilizando nucleótidos marcados
fluorescentemente, que son leídos por un láser acoplado a una computadora.
e) Construcción del vector recombinante: Esta etapa consiste en “recortar y pegar”
ADN para insertar el gen de interés dentro de un vector. Para recortar el ADN se
utilizan enzimas de restricción y para pegar fragmentos de ADN se utilizan
enzimas ligasas. Como muestra la imagen el vector abierto y el fragmento de
interés se agregan al tubo de ensayos en presencia de la enzima ligasa. Al
fragmento de ADN dentro del vector se denomina “inserto” y el nuevo vector se
conoce como “vector recombinante”.19
Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria. Fuente: “Las
sondas de ácidos nucleicos” por Rodolfo Wettstein en Ciencia Hoy, Volumen 4 -Nº 20- Setiembre
/octubre 1992
19
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2.1.2.3.
MODIFICAR EL GEN
La ventaja de tener el gen clonado en un vector, es que se puede transferir a una
bacteria que, al multiplicarse en el laboratorio, también multiplica al vector que porta.
De esta forma se logra tener millones de copias del vector recombinante para poder
modificar el inserto que lleva dentro. Modificar el inserto significa agregarle pequeñas
secuencias de ADN, mediante el uso de ligasas, necesarias para que el gen
funcione correctamente en el organismo receptor. Por ejemplo: si se clona un gen Bt
de una bacteria para luego ponerlo en maíz, se debe agregar un promotor que
funcione bien en plantas, es decir, que permita que las células vegetales expresen la
proteína Bt. El promotor es una región fundamental del gen ya que determina
cuándo y dónde se expresará el gen.
2.1.2.4. TRANSFERIR EL GEN AL ORGANISMO RECEPTOR
El gen de interés se puede introducir en células vegetales o animales y dar lugar a la
formación de un organismo genéticamente modificado (OGM) o transgénico.
La introducción de nuevos genes por ingeniería genética en plantas origina los
llamados cultivos transgénicos o genéticamente modificados (OGM). En la
producción de estos cultivos hay una primera etapa en la que se introduce el gen de
interés en las células vegetales. Este proceso también se denomina transformación.
En muchas especies vegetales (especialmente en las dicotiledóneas) es posible
introducir genes a través de una bacteria del suelo, llamada Agrobacterium
tumefaciens. Para las monocotiledóneas se ha desarrollado un método alternativo,
denominado “bombardeo con micropartículas”. La segunda etapa consiste en
regenerar una planta completa a partir de la única célula transformada. El resultado
es una planta completa que lleva el gen de interés en cada una de sus células. Por
último se realiza el mejoramiento por cruzamiento para transferir el gen incorporado
a variedades de alto rendimiento.
Existen varias técnicas para transferir genes a células de mamíferos con el objetivo
de que se integre al genoma. Una de ellas es la microinyección del ADN de interés
directamente en un óvulo fecundado. Los cigotos así obtenidos son luego
implantados en el útero de una madre adoptiva, o receptora, que ha sido preparada
hormonalmente para poder llevar adelante la gestación. Otra técnica consiste en
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transferir el gen de interés a las células de un embrión de mamífero que proliferan in
vitro. Cuando el embrión sigue su desarrollo en el útero de una madre receptora, se
forma un animal con células transgénicas.
2.1.2.5. CARACTERIZAR EL ORGANISMO RECEPTOR TRANSFORMADO.
Una vez obtenido el OGM, se debe demostrar, entre otras cosas, si tiene una (o
más) copias del transgén, y cómo y en qué tejidos se expresa el gen. Para lograrlo
se extrae el ADN del organismo y se lo analiza. La técnica de PCR, ya explicada,
permite amplificar el transgén, si es que está en el genoma del organismo, y es una
técnica rápida para verificar si el organismo ha sido transformado o no. Para estimar
cuántas copias del gen se insertaron en el genoma del organismo se utiliza la
técnica denominada Southern Blotting que se representa en la siguiente ilustración:
Representación esquemática de la técnica de Southern Blot. En este ejemplo se
analiza la presencia de un cierto gen en ADN de tres individuos. Esta técnica
consiste en extraer ADN del organismo en estudio, fragmentar el ADN en forma
aleatoria con enzimas de restricción, someter los fragmentos de ADN a electroforesis
en gel de agarosa, y transferir los fragmentos de ADN desde el gel a una membrana
(de nitrocelulosa o nylon). Luego, para detectar cuántas copias del transgén
quedaron integradas al genoma del organismo, se utilizan sondas marcadas
(radioactivamente, con fluorescencia, u otros métodos). La membrana se baña en
una solución que contiene la sonda y se “revela” (como una radiografía) para ver si
quedó marca en algún fragmento de ADN. En la ilustración las tres muestras de ADN
poseen al menos una copia del gen transferido.
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Para analizar en qué tejido, momento y cantidad se expresa el gen se analiza la
presencia del ARN mensajero y de la proteína codificados por el transgén (proteína
recombinante), mediante técnicas específicas denominadas Northern blot (para el
ARNm), y Western blot y ELISA (para las proteínas).
2.2. CLONADO DEL GEN.
2.2.1. PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR
La denominación "ADN recombinante" se refiere a combinaciones muevas de ADN
creadas entre secuencias o fragmentos de esta molécula y moléculas de ADN
bacteriano (o de otra clase) capaces de duplicarse indefinidamente en el laboratorio
(Freifelder, 1983). En este proceso, primero se obtiene un fragmento del ADN de
interés denominado inserto, el cual se une a otra molécula de ADN (generalmente de
mayor tamaño) llamado vector. Posteriormente se lleva a cabo el proceso de
clonación molecular en sí, en el cual se introduce el ADN recombinante en una
célula receptora y esta finalmente al multiplicarse da lugar a nuevas células con
similares características a ella; obteniéndose de esta manera lo que se denomina un
clon. Por consiguiente un clon no es más que un grupo grande de células, moléculas
de ADN o bacterias que surge de una célula o molécula ancestral y son idénticas a
esta; y clonación es el proceso que le da origen.
Las células receptoras del ADN híbrido pueden ser tanto procariotas como
eucariotas y el proceso de introducción del mismo se denomina transformación para
las primeras y transfección para las segundas.
2.2.2. PASOS A SEGUIR PARA UNA CLONACIÓN MOLECULAR
2.2.2.1. UNA FUENTE ADECUADA DE ADN
Las fuentes más importantes de ADN para clonación son el ADN genómico
(cromosómico) que contiene los genes completos y lo que se conoce como ADN
complementario (ADNc) que se obtiene a partir del ARN mensajero (ARNm) bajo la
acción de la enzima transcriptasa reversa o transcriptasa inversa. Esta enzima es
capaz de sintetizar ADN a partir del ARN el cual le sirve como molde. El empleo de
una u otra fuente depende de los objetivos que se persigan con el estudio a realizar.
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2.2.2.2. VECTORES DE CLONACIÓN (ADN RECOMBINANTE)
Un vector de clonación es una molécula pequeña de ADN que puede replicarse de
manera autónoma en un huésped (células bacterianas o de levaduras), a partir de
las cuales es posible aislarlo en forma pura para el análisis. Los vectores se utilizan
para clonación porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que
secuencias adicionales de ADN sean incorporadas en su material genético; se
autorreplican utilizando la maquinaria enzimática de la célula huésped, y en este
proceso, no se mezclan con el ADN genómico de la célula. Debido a que los
vectores de clonación pueden generar un gran número de copias por célula, ya que
los huéspedes bacterianos o de levaduras pueden crecer indefinidamente en el
laboratorio, es posible obtener grandes cantidades de secuencias del ADN de
interés. Cierto número de vectores se utiliza de modo común para este propósito,
cada uno con ventajas y limitaciones y dentro de ellos tenemos:
PLÁSMIDOS: Son moléculas circulares de ADN de doble cadena que se replican de
modo extracromosómico en bacterias, o menos comúnmente en levaduras. En ellos
se encuentran genes que le confieren al organismo que los posee resistencia a
algunos antibióticos, así como genes involucrados en la producción de toxinas y la
degradación de productos naturales.
BACTERIÓFAGOS: Son virus que infectan a las bacterias y están constituidos, según
su clase, por un núcleo de ADN o ARN y una cubierta proteica; algunos presentan
una cola, y son incapaces de replicarse autónomamente por lo que necesitan
infectar a la célula para poder hacerlo. Dentro de los fagos más utilizados como
vehículos moleculares de clonación, se encuentran la lambda y sus derivados.
CÓSMIDOS: Son básicamente plásmidos que emplean la habilidad de las partículas
infecciosas del bacteriófago para "empaquetar" de manera eficiente grandes piezas
lineales de ADN e introducirlas en las células bacterianas. Estos vectores se
reproducen de igual manera que los plásmidos en las bacterias.
"CROMOSOMAS
ARTIFICIALES"
DE
LEVADURA:
Además
de
los
vectores
anteriormente mencionados, existe otro tipo que permite clonar hebras de ADN de
gran tamaño y que se conocen como cromosomas artificiales de levadura. Este tipo
de vector es capaz de replicarse en el huésped Saccharomyces cerevisiae (levadura
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común usada en panadería) y tiene la estructura semejante a los cromosomas de
levadura normales.
ENZIMA: Permitan la escisión o corte en sitios específicos del fragmento de ADN a
clonar y su posterior fusión con el vector: Existe un grupo de enzimas con funciones
diferentes que tienen gran aplicación en ingeniería genética; de ellas ya se ha
mencionado a la transcriptasa inversa. Nos referiremos con más detalle ahora a las
endonucleasas de restricción o enzimas de restricción y a la ADN ligasa como útiles
herramientas en el proceso de clonación de genes.
2.2.2.3. MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN O TRANSFECCIÓN CELULAR:
Una vez obtenido el ADN recombinante, el próximo paso es introducirlo dentro de
una célula huésped que le ofrezca la maquinaria necesaria para su autorreplicación
los más empleados son: electroporación, transfección mediada por calcio-fósforo o
DEAE-dextrán, empleo de polibreno, fusión de protoplastos, empleo de liposomas,
microinyección directa al núcleo, uso de virus, entre otros.
2.2.2.4.
MÉTODOS PARA ANALIZAR LOS CLONES RESULTANTES HASTA LA
IDENTIFICACIÓN DEL QUE CONTIENE EL GEN DE INTERÉS .
Un importante paso en el proceso de clonación es la identificación de aquel clon o
clones que contienen el ADN recombinante. Aún en las mejores condiciones los
plásmidos se mantienen de forma estable sólo en una minoría de la población
bacteriana. Para identificar estos transformantes se emplean varios métodos, los
cuales también solamente serán mencionados. Así tenemos los ensayos de
hibridación,
los
métodos
inmunológicos
(anticuerpos
radiactivos,
inmunoprecipitación), el empleo de marcadores de selección, etc.
Entonces la Clonación consiste en la obtención de un gran número de fragmentos
idénticos a partir de uno original.
Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un
transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc.) que tras introducirlo dentro
de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado
considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente
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se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del
fragmento de interés.
2.3. ELECTROFORESIS
2.3.1. FUNDAMENTO DE LA ELECTOFORESIS
Esta técnica permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño al aplicar
una corriente eléctrica a un gel en el interior del cual se ha introducido una mezcla
de fragmentos. Éstos comienzan a moverse desde el polo negativo al polo positivo
de tal modo que los fragmentos más pequeños se mueven más rápido que los más
grandes. Cuando la corriente cesa, los fragmentos de ADN se han distribuido a lo
largo del gel, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando
una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de
ADN de un tamaño determinado. Adicionalmente puede utilizarse una secuencia
complementaria de un ADN como sonda para buscar un fragmento específico en el
patrón de bandas.
Por ejemplo, los científicos pueden usar el ADN encontrado en la sangre presente
en la escena de un crimen como sonda para buscar fragmentos complementarios en
electroforesis conteniendo ADN obtenido de diversas personas sospechosas.
Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas
poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es
conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos
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pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases. La poliacrilamida es
preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos.
El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos
nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que
se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de
este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula
pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula
grande. Las velocidades de migración de las moléculas de ácidos nucleicos, son
inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares. La
detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante
intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el
propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz
ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la migración de los ácidos
nucleicos en un gel además de su tamaño es la configuración espacial que adopte la
molécula.
El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:

DNA: en pares de bases o bp.

RNA: en nucleótidos o nt.

Proteínas: en Daltons o Da.
2.3.1.1.
ELECTROFORESIS DEL ADN EN GEL DE AGAROSA.
Electroforesis a través de geles de agarosa es el método estándar para separar e
identificar fragmentos de ADN. La técnica es simple, rápida y capaz de resolver
fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otro
procedimiento. La localización del ADN dentro del gel puede ser determinada
directamente por tinción con el agente intercalador fluorescente Bromuro de
Ethidium; bandas que contienen cantidades tan pequeñas como 10 ng de ADN,
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pueden ser detectadas a simple vista examinando el gel bajo luz ultravioleta. La
corrida electroforética se realiza colocando el gel que contiene el ADN en un campo
eléctrico, y las moléculas migran a una velocidad que es inversamente proporcional
al log10 de su talla en pares de bases.
Esta velocidad de migración está también afectada por la concentración de la
agarosa en el gel, la conformación del ADN, el voltaje, la composición de bases, la
presencia de agentes intercalantes, la temperatura y la composición del tampón de
corrida. Los plásmidos con exacto número de bases pero con diferente
conformación, tienen velocidades de migración diferentes.
2.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL ADN
2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN
Para la extracción del ADN humano se pueden tomar diferentes fuentes:










Sangre,
Saliva,
Semen,
Hisopado vaginal,
Restos de fluidos en ropa,
Orina,
Piel,
Bulbo piloso,
Muestras de biopsias de órganos/tejidos,
Material cadavérico (ej. huesos), etc.
2.4.2. ALMACENAMIENTO DEL ADN
Se separa el ADN de otras fases orgánicas celulares y se almacena de la siguiente
manera:
 El ADN purificado refrigerado a 4 ° C se conserva hasta 3 años.
 Aquellas muestras que necesitan mantenerse más de 3 años deberán
congelarse a -70 ° C.
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2.4.3. CONSERVACIÓN DEL ADN EN TEJIDO FRESCO
Si se trata de tejido fresco (semen, biopsias, sangre, sedimento urinario, líquidos,
heces, etc.), un máximo de:
 3 meses un refrigeración,
 5 años a -20ºC, o
 10 años a -80ºC.
Si se trata de material en parafina, no necesita refrigeración porque se encuentra ya
fijado con formol.
Si se trata ya de ADN o ARN deben almacenarse a
-20ºC, si se mantiene en
condiciones óptimas sin pasar por cambios de temperatura, congelamientos y
descongelamientos numerosos, la muestra estará vigente por más de 10 años.
NOTA: el tiempo de validez de la muestra dependerá de su finalidad, en caso de
muestras para diagnóstico lo óptimo es su utilización inmediata pero si se trata de
investigación, el tiempo puede ser más amplio.
Para evitar una degradación tanto de las muestras como de los reactivos, se debe
trabajar siempre sobre hielo así como de alicuotar todo el material para evitar los
sucesivos descongelamientos.
2.5. NORMAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR.
2.5.1.
POSIBLES
CONTAMINACIONES
EN
EL
LABORATORIO
DE
BIOLOGIA MOLECULAR
Las reacciones moleculares al ser sumamente sensibles, necesitan un tratamiento
especial para evitar cualquier tipo de contaminación.La manipulación con guantes
limpios es primordial para garantizar que el material genético de las diferentes
muestras no se degrade por la acción de nucleasas (DNAsas y RNAsas) presentes
en la piel y mucosas del operario.
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Cada muestra debe ser procesada de manera individual y con material desechable y
no hablar o pasar las manos y el material sobre las muestras con los tubos abiertos.
Las muestras deben ser debidamente rotuladas el momento mismo en el que lleguen
al laboratorio y mmantener la cadena de frío para evitar degradación de muestras.
2.5.2.
ORGANIZACIÓN ESPACIAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
Instrumentos totalmente necesarios para que cada una de las áreas funcione de
forma autónoma e independiente. Entre dichos instrumentos estarán aquellos
dedicados a:
1.
la correcta preparación de tampones, sales, soluciones de lisis o soluciones de
purificación del ADN /ARN,
2.
la obtención y cuantificación del ADN/ARN a partir de distintas muestra
biológicas,
3.
la amplificación en solución e “in situ” de ADN/ARN,
4.
hibridación de ADN/ARN,
5.
separación de las moléculas de ADN/ARN en geles de agarosa o de
poliacrilamida y,
6.
visualización de las moléculas de ADN/ARN una vez separadas en gel.
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2.5.3. OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN.
A un laboratorio de Biología Molecular de tipo clínico llegan
distintos tipos de
muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN
“A priori” se plantean dos situaciones diferentes. Si lo que se pretende es conocer la
ubicación física del ADN/ARN de interés en un corte histológico se deberá proceder
a estudios “in situ”, mientras que si no es necesario conocer dicha ubicación será
suficiente con obtener el ADN celular en solución. El ADN en solución
es una
mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran
presentes en la muestra virus/bacterias.
Centrándose en la obtención de ADN en solución existen diferentes métodos de lisis:
lisis diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solución de ADN obtenida
no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificación,
restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente por un lado separar
el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan, preferentemente proteínas,
proceso que suele realizarse con ayuda de solventes orgánicos (fenol y cloroformo)
y, por otro separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad
inhibidora presentes en la solución de ADN. El ADN una vez limpio de proteínas y/o
pequeñas moléculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayoría de las
situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltración o precipitación con
alcohol.
El sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han
sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido. Pueden
emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometría
y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como la comparación del grado
de fluorescencia respecto a un control de concentración conocida.
Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el
propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.
En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor
diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:
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1.
separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o
poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV
oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación
de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de
características conocidas (Ej. movilidad de un exón mutado del gen supresor p53
en relación al mismo exón normal...), o bien,
2.
detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico
o quimioluminiscente.
Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el
fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:
1.
Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción
se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación
HPV, genotipado ApoE...).
2.
Hibridación.
Los fragmentos generados en el PCR se separan en
gel de
agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y
finalmente se hibridan con un ADN sonda marcada (Ej. Tipificación de los
genes HLA Clase II...).
3.
Secuenciación.
Los
fragmentos
generados
durante
la
reacción
de
secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej.
Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas
enfermedades...).
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CAPÍTULO III
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
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3.1. PASOS PREVIOS A LA HIBRIDACIÓN
Podemos clasificar las metodologías de análisis del ADN en aquellas que buscan su
multiplicación, ya in vivo, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya in
vitro, como la clonación, y aquellas que explotan las propiedades específicas de
elementos concretos, o de genomas adecuadamente clonados. Es el caso de la
secuenciación de ADN y de la hibridación con sondas específicas ("southern blot" y
chips de ADN).La hibridación molecular es uno de los pilares de la mayor parte de
las metodologías que se utilizan en el laboratorio de biología molecular. Un grupo de
estas técnicas se ha diseñado para identificar determinadas secuencias en los
ácidos nucleicos. La hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre
entre cadenas de ácidos nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es
análogo a la reacción antígeno-anticuerpo, pero con la diferencia de que en la
hibridación en lugar de anticuerpos se emplean las llamadas sondas. Las sondas no
son más que fragmentos cortos de ADN o ARN sintetizados in vitro y que se marcan
con sustancias radiactivas fluorescentes o de otro tipo a fin de hacer posible su
posterior detección y de esta manera la identificación de la secuencia de ADN o ARN
de interés.
Para poder realizar Hibridación en una muestra de ADN se necesitan realizar los
siguientes pasos Previos a la Hibridación:
1. Separación de fragmentos
 Extracción de ADN
 Fragmentar el ADN en porciones más pequeñas (Enzimas de restricción)
 Separar los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como
sustrato de migración un gel (separación por tamaño)
2. Inmovilización de los fragmentos en soporte sólido
 Desnaturalización con solución alcalina (simple cadena)
 Transferencia a soporte sólido (membrana de nylon / nitrocelulosa): Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Se agrega solución (NaCl) para evitar rehibridación previa a colocar la sonda.
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3.2. MÉTODOS HIBRIDACIÓN DE LABORATORIO
Existen
hibridaciones
que
son
muy
empleadas
en
Biología
Molecular:
experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridaciones de ácidos
nucleicos que se usan frecuentemente en las técnicas de laboratorios:
 Tipo Southern o Southern blot, para uniones ADN-ADN (DNA cortado con
enzimas de restricción e hibridado con una sonda de DNA) y
 Tipo northern o Northern Blot, para uniones ADN-ARN (RNA separado e
hibridado con sondas de DNA o RNA).
Estas técnicas consisten en una separación inicial de las moléculas en base a su
peso molecular mediante electroforesis, trasferencia capilar de estas moléculas a un
filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y detección.
Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físicoquímico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene
una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras
moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.
A continuación se señalan diferentes procedimientos de laboratorio que utilizan el
principio de hibridación y en los que la variación está dada por el tipo de ácido
nucleico utilizado, el soporte en que se lleva a cabo la hibridación y la forma de
colocar los ácidos en la membrana.
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3.2.1. EL MÉTODO DE HIBRIDACIÓN SOUTHERN O SOUTHERN BLOT:
El método recibe su nombre en honor a su inventor, el biólogo inglés Edwin M.
Southern en 1975. Sirve para la detección de genes específicos en el ADN celular
o secuencias específicas de ADN. Debido a que la transferencia del ADN del gel a
la membrana se produce por capilaridad, con el mismo principio utilizado por años
para limpiar manchas con papel secante, el proceso se conoce en inglés como
blotting; Southern propuso utilizar el término blot (secado) o blotting para referirse
a esta técnica y actualmente se conoce como Southern blot.
Para llevar a cabo hibridaciones de este tipo, se aísla el ADN de un tejido o línea
celular, luego se purifica, y se digiere con enzimas de restricción específicas. Los
fragmentos generados se separan mediante electroforesis y después son
transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se
lleva a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en
una solución llamada de transferencia (solución salina concentrada). A continuación
se sitúa la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y
por capilaridad la solución de transferencia es atraída a la pila de papel filtro,
arrastrando consigo al ADN hacia la membrana, donde queda inmovilizado
conservando la misma posición relativa que ocupaba en el gel. Luego, el ADN puede
ser hibridado en la membrana con una sonda marcada (radiactivamente o con un
fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de
ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda
unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una
forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de
sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con
fluorocromo. La sonda está situada en el filtro en la posición del fragmento de
secuencia complementaria, que es una posición fija fácilmente localizable en el gel.
Esta técnica se ha empleado para el diagnóstico y caracterización de diversas
inmunodeficiencias, la distrofia muscular de Duchenne, la hipoplasia adrenal
congénita, la deficiencia de glicerol-quinasa, la distrofia miotónica severa y en
análisis de mutaciones de genes en células B de leucemia linfoblástica crónica, entre
otras enfermedades.
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3.2.2. NORTHERN O NORTHERN BLOT
Es una variante del método anterior, el procedimiento que se sigue es similar al
Southern en el lugar de utilizar ADN como sustrato de estudio, se emplea ARN.
Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que
se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar
ADN, el método Northern sirve para identificar ARN.
El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis
en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en
estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de
tipo Southern.
El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de
expresión génica. Esta técnica se ha aplicado en estudios de la modulación de la
síntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide, en el análisis de
expresión de receptores que participan en la síntesis de moléculas en cultivos
celulares, en análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de enzimas, y en la
regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de células leucémicas
humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico.
3.2.3. WESTERN BLOT
También se han desarrollado técnicas semejantes que permiten la detección de
secuencias dadas de ARN o de proteínas específicas (técnica Western, basada en el
uso de anticuerpos). No es un método de análisis directo de los ácidos nucleicos,
sino del producto de la expresión de los genes, o sea las proteínas. Aunque difiere
de los anteriores en cuanto a que no existe hibridación, sino que la identificación de
las proteínas se realiza con anticuerpos marcados, sí se mantiene el principio de la
transferencia a la membrana que sirve de soporte posterior a la electroforesis y
previo a la identificación, y por lo cual siguiendo el juego de palabras ha sido
denominado de esta manera. Esta técnica permite el desarrollo de pruebas para
diferenciar tipos de virus que infectan a células, se ha aplicado en estudios de la
variabilidad individual de los niveles de determinadas enzimas, en la caracterización
molecular de genes, etc.
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3.2.4. DOT BLOT Y SLOT BLOT
Son procederes similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es
sometido a electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la membrana. Este
tipo de análisis requiere de un molde asociado a succión con vacío para colocar el
ARN que puede producir círculos o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot). Este
tipo de prueba es muy útil cuando se quieren estudiar gran número de muestras,
pero tienen la limitante de no ofrecer información sobre el tamaño de las bandas del
ARN hibridado.
3.2.5. HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS)
Es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de la misma manera
que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. La especificidad de
la hibridación in situ (HIS) se basa en la unión recíproca de una secuencia de
oligonucleótidos (la sonda), con una secuencia complementaria de nucleótidos
presente en las moléculas de ARN o ADN dentro del tejido. Entre las ventajas de
esta técnica están su alto grado de resolución espacial que permite la localización de
secuencias génicas a escala cromosómica, con lo que se pueden detectar
translocaciones y otras alteraciones, así como también el estudio de expresión
génica a escala celular y subcelular. Otra de sus ventajas es que se puede realizar
en material fijado e incluido en parafina lo que permite realizar estudios
retrospectivos en material de archivo. Por otra parte la cantidad de tejido requerido
para realizar un estudio de HIS es mínima en comparación con otras técnicas de
biología molecular.
Permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico
de la célula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado
de su entorno celular para tener acceso la sonda, pero preservando la morfología
para la consiguiente interpretación y análisis. Para ello se emplean fijadores
especialmente
de
entrecruzamiento,
como
la
formalina,
paraformaldehido,
glutaraldehido.
Entre las principales aplicaciones de la HIS tenemos la detección de ARN o ADN de
origen viral, el análisis de la expresión génica (detección de ARNm) y los análisis
cromosómicos.
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Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para
su observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo
northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre
tejidos de material orgánico utilizando técnicas imunohistoquímicas se puede
conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los
genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. También en esta
categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son
secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro
del cromosoma, con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos
observar con un microscopio electrónico.
La HIS con fluorescencia (FISH) es una importante herramienta de uso rutinario en
investigación y con grandes posibilidades de aplicación en el diagnóstico de
enfermedades neoplásicas, genéticas, estudios a nivel cromosómico, etc. Es una
técnica desarrollada recientemente en la que un segmento de DNA marcado (una
sonda), específico para una zona determinada de un cromosoma, se hibrida con
preparaciones de cromosomas en metafase, profase o interface y luego se visualiza
bajo un microscopio de fluorescencia
Fig. 3.1. Hibridación in situ con fluorescencia. 20
20
Clinical Cytogenetics, Part 1, Mary Beth Dinulos, M.D. HuBio 554 Medical Genetics, Fall 1997, Dr.
Marshall Horwitz, Univ. Washington. http://biomodel.uah.es/citogene/horwitz/cytogen1.htm
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3.2.6. CHIP DE ADN
El siguiente paso en el desarrollo de técnicas de hibridación ha llevado a la
miniaturización de los filtros de nitrocelulosa y a la utilización de matrices
microscópicas en forma de chip de ADN. De esta manera se pueden colocar en una
matriz una inmensa cantidad de copias génicas diferentes y mediante un proceso de
hibridación detectar todas aquéllas que tienen una secuencia parecida. Modificando
las características de las moléculas presentes en la matriz así como cambiando las
sondas utilizadas, las posibilidades de análisis de expresión que proporcionan los
chip de ADN son enormes.
3.2.7. SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID)
Fueron inventadas en 1990 por un grupo de científicos daneses (Buchardt, Berg,
Nielsen, Egholm). Son una nueva clase de sondas híbridas entre ácido nucleico y
proteínas, diseñadas para la detección de secuencias específicas de ácidos
nucleicos. Su estructura esta formada por una cadena de aminoácidos que forman el
esqueleto principal, y a los cuales se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los
parámetros conformacionales descritos por Watson y Crick. Las bases (A, T, C, G)
están colocadas a la misma distancia que en el DNA
Esta estructura hibrida le confiere una serie de características especiales:
 Son moléculas de simple cadena
 No están cargadas siendo el esqueleto principal flexible.
 Sus hibridaciones son rápidas, específicas y sensibles.
 Presentan una especificidad y sensibilidad mas elevada que los oligomeros
DNA/RNA
 Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede.
 Enlaces más fuertes
 Moléculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas.
3.2.8. HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS
Es un método empleado para identificar colonias bacterianas que contengan
determinada secuencia de ácidos nucleicos de interés. La metodología consiste en
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sembrar los clones sobre placas de Petri con agar para después de crecidos
transferirlos a membranas de nylon o nitrocelulosa y luego realizar la hibridación.
3.2.9. MAPAS DE RESTRICCIÓN
Esta técnica se basa en el principio de la enzimología de restricción donde de una
molécula de ADN dada se obtendrán siempre los mismos fragmentos cada vez que
sea expuesta a una enzima de restricción particular. La complejidad del mapa
depende del tamaño de la molécula (a mayor número de bases será mayor el
número de sitios de restricción) y del número de enzimas utilizadas. De esta forma,
dos moléculas de ADN del mismo tamaño pueden ser fácilmente diferenciadas por
los mapas de restricción que producen al tratarlas con las mismas enzimas.
Este mismo principio lo utiliza el procedimiento denominado análisis de
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), pero aprovechando
el hecho de la existencia de variaciones en la constitución genética de la población
(polimorfismo genético), que hace que se observen diferencias entre los individuos
en cuanto al número y longitud de los fragmentos producidos. La existencia de los
RFLPs es la base de la técnica que se ha denominado huellas digitales del ADN y
que permite establecer inequívocamente la relación padres e hijos, entre otras
aplicaciones.
3.2.10. HIBRIDACIÓN DE ADN O RAMIFICADO (BRANCHED DNA)
La metodología de hibridación con ADN ramificado o branched DNA (bDNA) se basa
en hibridaciones consecutivas de sondas que reconocen por una parte la secuencia
de ADN o ARN en estudio y por otra, secuencias introducidas a la reacción para
amplificar la señal de hibridación. En este método la visualización del ADN blanco no
depende de un proceso enzimático, como en la reacción de polimerasa en cadena,
sino de la amplificación de la señal de hibridación. Esta metodología es altamente
reproducible y se utiliza clínicamente en la cuantificación de carga génica en
pacientes portadores del VIH, VHB y VHC.
2.3.11. cDNA MICROARRAY
La tecnología de cDNA microarray se basa en la incorporación en un chip, similar al
utilizado en computación, de 5.000 a 8.000 sondas que representan la totalidad de
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los genes expresados por un microorganismo. De este modo se puede identificar los
patrones de expresión bacteriana de acuerdo a distintas condiciones fisiológicas o
patológicas. El principio de cDNA microarray es la hibridación, pero a diferencia de
los métodos tradicionales, se utilizan múltiples sondas, las que unidas a un sistema
cuantitativo de análisis, permiten identificar patrones de expresión génica. Esta
metodología, aunque aún se encuentra a nivel experimental, tiene una proyección
tan importante en clínica como la PCR.
Figura Método de ADN ramificado (branched DNA) para cuantificación de ácidos nucleicos.
El proceso comienza con la hibridación de las sondas de captura a una fase sólida. A
continuación se produce la reacción de hibridación entre las sondas de captura y el ADN o
ARN en estudio, lo cual es seguido de la introducción de la sonda de amplificación que
contiene múltiples sitios para las sondas de revelado. Estas últimas están conjugadas con
moléculas quimioluminiscentes de modo que la cantidad de luz emitida es proporcional a la
cantidad de ADN o ARN hibridado.
3.3. PASOS DE LA HIBRIDACIÓN
 Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba
 Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecíficas
 Se revela por autoradiografía
3.3.1. FUNDAMENTO DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
La hibridación o renaturalización de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso
por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con
secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que
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toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en
el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que
absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la
cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los
dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están
totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.
Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T;
A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A
Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra
rápidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos,
una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las
cadenas y dificultará la unión.
El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que
contiene a la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la
temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante
tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno;
por tanto, y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para
romper dos, dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es
igual para todas las especies, es más, el %GC es distinto incluso entre el ADN
nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de
extracción de ADN, según que tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre
otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el
ADN mit.
¿Qué es una sonda?
Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una
molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una
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molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de
hibridación.
Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos:
 Fragmentos de DNA
 Fragmentos de RNA
 Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.
¿Qué son las moléculas reporter?
Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta
tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos:
radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa,
Peroxidasa...) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina).
¿Qué factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reacción de
hibridación?
 Concentración del ácido nucleico diana
 Complementariedad sonda-ácido nucleico diana
 Concentración de la sonda.
 Longitud de la sonda
 Actividad específica de la molécula reporter.
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 Condiciones de hibridación(pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, Tm)
 Acceso al ácido nucleico diana.
 Formato de hibridación
¿Cuales son los formatos de hibridación?
 Hibridación en solución: La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran en
una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La
velocidad de formación del dúplex en estas condiciones es alta. El problema
de este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha
reaccionado, empleándose entre otros métodos la nuclease S1-precipitación
con tricloroacético o la hibridación protección assay.
 Hibridación en fase sólida: El ácido nucleico diana o bien la sonda se
encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación
por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación
se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el
ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona,
híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminados mediante lavados.
Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución.
Actualmente también se ha conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las
placas de microtitulación.
3.4. APLICACIONES DE LA HIBRIDACIÓN
Fig. 8. Potenciales
microorganismos
aplicaciones
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clínicas
de
la
secuenciación
de
genomas
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de
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3.4.1. INGENIERÍA GENÉTICA
La investigación sobre el ADN tiene un impacto significativo, especialmente en el
ámbito de la medicina, pero también en agricultura y ganadería (donde los objetivos
son los mismos que con las técnicas tradicionales que el hombre lleva utilizando
desde hace milenios - la domesticación, la selección y los cruces dirigidos - para
obtener variedades de animales y plantas más productivos). La moderna biología y
bioquímica hacen uso intensivo de la tecnología del ADN recombinante,
introduciendo genes de interés en organismos, con el objetivo de expresar una
proteína recombinante concreta, que puede ser:
 aislada para su uso posterior: por ejemplo, se pueden transformar
microorganismos para convertirlos en auténticas fábricas que producen grandes
cantidades de sustancias útiles, como insulina o vacunas, que posteriormente se
aíslan y se utilizan terapéuticamente.
 necesaria para reemplazar la expresión de un gen endógeno dañado que ha
dado lugar a una patología, lo que permitiría el restablecimiento de la actividad
de la proteína perdida y eventualmente la recuperación del estado fisiológico
normal, no patológico. Este es el objetivo de la terapia génica, uno de los
campos en los que se está trabajando activamente en medicina, analizando
ventajas e inconvenientes de diferentes sistemas de administración del gen
(virales y no virales) y los mecanismos de selección del punto de integración de
los elementos genéticos (distintos para los virus y los transposones) en el
genoma diana. En este caso, antes de plantearse la posibilidad de realizar una
terapia génica en una determinada patología, es fundamental comprender el
impacto del gen de interés en el desarrollo de dicha patología, para lo cual es
necesario el desarrollo de un modelo animal, eliminando o modificando dicho
gen en un animal de laboratorio, mediante la técnica ‘’knockout’’. Sólo en el caso
de que los resultados en el modelo animal sean satisfactorios se procedería a
analizar la posibilidad de restablecer el gen dañado mediante terapia génica.
 utilizada para enriquecer un alimento: por ejemplo, la composición de la leche
(una importante fuente de proteínas para el consumo humano y animal) puede
modificarse mediante transgénesis, añadiendo genes exógenos y desactivando
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genes endógenos para mejorar su valor nutricional, reducir infecciones en las
glándulas mamarias, proporcionar a los consumidores proteínas anti patógenas
y preparar proteínas recombinantes para su uso farmacéutico.
 útil para mejorar la resistencia del organismo transformado: por ejemplo en
plantas se pueden introducir genes que confieren resistencia a patógenos (virus,
insectos, hongos…), así como a agentes estresantes abióticos (salinidad,
sequedad, metales pesados…).
3.4.2. MEDICINA FORENSE
Los médicos forenses pueden utilizar el ADN presente en la sangre, el semen, la
piel, la saliva o el pelo en la escena de un crimen para identificar al responsable.
Esta técnica se denomina huella genética, o también "perfil de ADN". Al realizar la
huella genética, se compara la longitud de secciones altamente variables de ADN
repetitivo, como los microsatélites, entre personas diferentes. Este método es
frecuentemente muy fiable para identificar a un criminal. Sin embargo, la
identificación puede complicarse si la escena está contaminada con ADN de
personas diferentes. La técnica de la huella genética fue desarrollada en 1984 por el
genetista británico Sir Alec Jeffreys, y fue utilizada por primera vez en medicina
forense para condenar a Colin Pitchfork en los asesinatos de Narborough (UK) en
1983 y 1986. Se puede requerir a las personas acusadas de ciertos tipos de
crímenes que proporcionen una muestra de ADN para introducirlos en una base de
datos. Esto ha facilitado la labor de los investigadores en la resolución de casos
antiguos, donde sólo se obtuvo una muestra de ADN de la escena del crimen, en
algunos casos permitiendo exonerar a un convicto. La huella genética también
puede utilizarse para identificar víctimas de accidentes en masa, o para realizar
pruebas de consanguinidad.
3.4.3. BIOINFORMÁTICA
La bioinformática implica la manipulación, búsqueda y extracción de información de
los datos de la secuencia del ADN. El desarrollo de las técnicas para almacenar y
buscar secuencias de ADN ha generado avances en el desarrollo de software de los
ordenadores, para muchas aplicaciones, especialmente algoritmos de búsqueda de
frases, aprendizaje automático y teorías de bases de datos. La búsqueda de frases o
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algoritmos de coincidencias, que buscan la ocurrencia de una secuencia de letras
dentro de una secuencia de letras mayores, se desarrolló para buscar secuencias
específicas de nucleótidos. En otras aplicaciones como editores de textos, incluso
algoritmos simples pueden funcionar, pero las secuencias de ADN pueden generar
que estos algoritmos presenten un comportamiento de casi-el-peor-caso, debido al
bajo número de caracteres. El problema relacionado del alineamiento de secuencias
persigue identificar secuencias homólogas y localizar mutaciones específicas que las
diferencian. Estas técnicas, fundamentalmente el
alineamiento múltiple de
secuencias, se utilizan al estudiar las relaciones filogenéticas y la función de las
proteínas. Las colecciones de datos que representan secuencias de ADN del
tamaño de un genoma, tales como las producidas por el Proyecto Genoma Humano,
son difíciles de usar sin anotaciones, que marcan la localización de los genes y los
elementos reguladores en cada cromosoma. Las regiones de ADN que tienen
patrones asociados con genes que codifican proteínas – o ARN – pueden
identificarse por algoritmos de localización de genes, lo que permite a los
investigadores predecir la presencia de productos génicos específicos en un
organismo incluso antes de que haya sido aislado experimentalmente.
3.4.4. NANOTECNOLOGÍA DE ADN
La estructura de ADN de la izquierda (mostrada de forma esquemática) se autoensambla en la estructura visualizada por microscopía de fuerza atómica a la
derecha. La nanotecnología de ADN es el campo que busca diseñar estructuras a
nanoescala utilizando las propiedades de reconocimiento molecular de las moléculas
de ADN.
La nanotecnología de ADN utiliza las propiedades únicas de reconocimiento
molecular del ADN y otros ácidos nucleicos para crear complejos ramificados autoensamblados con propiedades útiles. En este caso, el ADN se utiliza como un
material estructural, más que como un portador de información biológica. Esto ha
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conducido a la creación de láminas periódicas de dos dimensiones (ambas basadas
en azulejos, así como usando el método de ADN origami), además de estructuras en
tres dimensiones con forma de poliedros.
3.4.5. HISTORIA Y ANTROPOLOGÍA
A lo largo del tiempo, el ADN almacena mutaciones que se heredan y, por tanto,
contiene información histórica, de manera que comparando secuencias de ADN, los
genetistas pueden inferir la historia evolutiva de los organismos, su filogenia. La
investigación filogenética es una herramienta fundamental en biología evolutiva. Si
se comparan las secuencias de ADN dentro de una especie, los genetistas de
poblaciones pueden conocer la historia de poblaciones particulares. Esto se puede
utilizar en una amplia variedad de estudios, desde ecología hasta antropología,
como ilustra el análisis de ADN llevado a cabo para identificar las Diez Tribus
Perdidas de Israel. Por otro lado, el ADN también se utiliza para estudiar relaciones
familiares recientes.
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CAPÍTULO IV
TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN
MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
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Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
4.1. FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que
permite la copia in vitro de secuencias específicas de DNA y que ha revolucionado el
campo de la Biología Molecular. Conceptualmente, la PCR es una técnica sencilla,
consiste en la separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere
amplificar, y su copia simultánea a partir de un punto, determinado por un fragmento
de DNA artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima denominada
DNA polimerasa. El resultado es la duplicación del número de moléculas de una
secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un número determinado de
veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificación
exponencial del número de copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si
partimos de una molécula única de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se
duplica el número de moléculas, teóricamente, al final de los 30 ciclos, se obtendrán
230 moléculas idénticas, es decir 1073741824 moléculas.
La gran ventaja de la PCR es que amplifica únicamente el fragmento de DNA que
queremos aunque esté en cantidades mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de
grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La reacción es
eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia
de otros componentes.
La PCR se aplicó inicialmente como una técnica de laboratorio de investigación,
pero su gran especificidad y sensibilidad ha permitido el desarrollo de técnicas
específicas basadas en la PCR en muchos campos de la investigación y el análisis.
Así, la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan
diversos como la investigación (clonado de genes, detección de clones
recombinantes, estudio de DNA de fósiles), medicina forense y criminalística
(determinación de la paternidad, identificación de individuos, identificación
sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violación, etc.), sanidad animal y
mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza de
razas, etc.) y medicina (diagnóstico de enfermedades).
La PCR fue desarrollada por Kary Mullis en 1985, utilizando como DNA polimerasa
el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando
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los tubos de reacción en cada ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC
(desnaturalización) y 37 ºC (hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta
enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla
en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a la
PCR en una técnica tediosa y costosa. La PCR mejoró vertiginosamente como
herramienta de laboratorio a partir de 1988, gracias a dos hechos que hicieron que la
técnica se pudiera automatizar: el primero de ellos fue la comercialización de la
enzima denominada Taq polimerasa que es un enzima termoestable, por lo que
permanece activa después de incubaciones prolongadas a 94 ºC, y no hay que
añadirla en cada ciclo de amplificación. El segundo hecho fue la aparición en el
mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura
automáticamente, sin necesidad de distintos baños. La gran revolución que ha
producido en la Biología Molecular la aparición de la PCR ha supuesto para su
descubridor la concesión del Premio Nobel en el año 1993.
La técnica de PCR se representa en la siguiente ilustración:
Explicación de la imagen: la técnica de PCR permite obtener, a partir de una sola
molécula de ADN, millones de copias de un fragmento de ADN particular. La base
de esta técnica consiste en que la enzima polimerasa de ADN cumpla su función:
sintetizar ADN a partir de un pequeño fragmento llamado cebador, y de los
nucleótidos (A, C, G y T). Las nuevas moléculas de ADN sintetizadas en cada
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ciclo sirven de molde para ciclos siguientes. Por lo tanto, la PCR es una reacción
de amplificación de fragmentos de ADN en forma exponencial y al final del ciclo
35-40 en el tubo de ensayos existen millones de copias del fragmento de interés.
4.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA REALIZAR LA PCR.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR: del inglés Polymerase Chain
Reaction).El propósito de este método es la obtención de gran número de copias
de un fragmento de ADN de interés. El PCR es un método in vitro para sintetizar
de manera enzimática secuencias específicas de ADN. La reacción utiliza dos
oligonucleótidos (entre 15 y 40 pb) como cebadores que hibridizan en extremos
opuestos de la secuencia que se quiere amplificar. La elongación de estos
cebadores es catalizado por una ADN Polimerasa termoestable (Ej. Taq
polimerasa). Una serie repetida de ciclos que involucra, la desnaturalización del
molde, la hibridización de los cebadores y la elongación de los cebadores por la
polimerasa, resulta en la acumulación exponencial del fragmento de ADN a
amplificar (figura B). La especificidad de la reacción está dada por la secuencia
de los oligonucleótidos cebadores y en esto radica el éxito y la gran utilidad de
esta técnica.
Los componentes de la reacción de PCR son los que siguen, los cuales deben
mezclarse adecuadamente en el tubo de reacción. La cantidad y calidad de estos
componentes
influyen
significativamente
en
la
especificidad,
calidad
y
rendimiento de esta reacción; igualmente influye el diseño de los ciclos de
temperatura, como se describen más abajo.
1. El ADN molde del cual se quiere amplificar un fragmento
2. Los oligonucleótidos cebadores
3. ADN polimerasa
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4. MgCl2
5. Desoxiribonucleótidos libres (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)
6. Tampón (pH, fuerza iónica y aditivos adecuados para la enzima empleada)
4.3. CICLOS DURANTE LA PCR.
Hay tres etapas fundamentales en un PCR, las cuales son repetidas entre 30 y 40
veces. Esto es realizado en un termociclador automático que realiza estos cambios
de temperatura en muy corto tiempo.
1. Desnaturalización (940C): La doble hebra del ADN se separa en dos cadenas
independientes.
En esta etapa todos los procesos enzimáticos están detenidos.
2. Hibridización o anneling (450C – 600C): Los oligonucleótidos se unen a sus
secuencias específicas por complementación de bases, la polimerasa se une al
ADN y usando el oligonucleótido como cebador comienza a polimerizar.
3. Extensión (720C): Es la temperatura ideal para que polimerase la enzima. La
polimerasa adiciona los desoxiribonucleótidos (dNTPs) complementarios a la
cadena molde de 5´ a 3´ (la cadena molde se lee de 3´ a 5´).
4.4. APLICACIONES.
La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como
herramienta de detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de
interés; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo
en diagnóstico clínico.
4.4.1. INVESTIGACIÓN
La PCR convencional se emplea como base para multitud de técnicas en el
laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final
permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de interés.
Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con cebadores que
contienen una secuencia apta para la recombinación dirigida con un plásmido.
Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de secuencias de
ADN en vectores, como pueden ser los plásmidos. Para ello, se emplean cebadores
que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interacción
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posterior con otra complementaria situada en el vector de clonación a emplear. Por
ejemplo, se puede incluir una diana de restricción en dichos cebadores, de modo
que, y si ésta no existía previamente en el fragmento y es única en el vector, pueda
efectuarse una ligación mediante la ligasa de T4 tras la digestión con la enzima de
restricción apropiada de ambos elementos. Otro método asimilable a esta vía es el
empleo de la recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una
secuencia que faculta a una recombinasa la recombinación dirigida con un vector
dado.
4.4.2. MEDICINA
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis:
Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro
infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de
PCR posea unas características de tamaño o temperatura de fusión que permitan
identificarlo de forma inequívoca. En el caso de infecciones virales que implican la
integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador, como es el de la
infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral
existente y por tanto, del estadio de la enfermedad.
La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los
servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta técnica se
pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B)
mientras aún están en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test de
PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas
individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de
ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante.
El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso
largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada
uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes
cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.
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4.4.3. PALEONTOLOGÍA, ANTROPOLOGÍA BIOLÓGICA, Y CIENCIAS
FORENSES
Los campos de la paleontología, antropología biológica y la medicina y antropología
forense se han visto enormemente beneficiados por esta técnica, puesto que todas
ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas
gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biológicos que más
información
puede
proporcionar
es
el
ADN.
La relativa estabilidad de éste permite que, aunque fragmentado, se conserve
durante largos períodos si las condiciones son propicias. En ocasiones las muestras
intactas con las que se puede contar son extraordinariamente pequeñas o están
deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades útiles
para posteriores pasos de análisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material
recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente,
en teoría basta una sola molécula para que el proceso pueda tener lugar. También
debido a la naturaleza de la técnica y su propósito de amplificación de fragmentos
pequeños, esta fragmentación no impide que este ADN pueda ser empleado como
molde para una reacción de PCR.
En paleontología y Antropología la PCR permite recuperar las escasas cantidades
de ADN que aún no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podría
preservarse son la brea las cenizas volcánicas, el ámbar, hielos históricos polares o
glaciares y ambientes áridos, sedimentos, así como en los cristales de apatita de
restos de esqueleto, siendo posible de ese modo caracterizar cadáveres, fósiles u
otros restos mediante genotipado por análisis de micro satélites o incluso genomas
de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados
mediante el ADN genómico del hombre de Neanderthal. El propósito sería utilizar
este ADN amplificado para posteriormente realizar estudios filogenéticos o
etnográficos o de poblaciones mediante la comparación de secuencias de ADN, o el
estudio de las causas de la separación evolutiva de dos especies.
En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o
para obtener pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un
crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos.
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4.4.4. AGRONOMÍA Y DIVERSIDAD
Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genéticas de individuos
concretos, dentro del marco de la genética forense, existen métodos basados en la
PCR que permiten discernir entre grupos infraespecíficos de cultivos de interés
agronómico; por ejemplo, de cultivares. Para ello, se emplean oligonucleótidos de un
tamaño lo suficientemente pequeño como para que ceben de forma relativamente
inespecífica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrón de bandas
discreto e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los
fragmentos tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un
comportamiento similar, de los que divergen...
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CAPÍTULO V
TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN
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5.1. FUNDAMENTO DE LA SECUENCIACIÓN.
La secuenciación del ADN consiste en dilucidar el orden de los nucleótidos de un
polímero de ADN de cualquier longitud, si bien suele dirigirse hacia la determinación
de genomas completos, debido a que las técnicas actuales permiten realizar esta
secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos
de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos
relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial,
han establecido la secuencia completa del ADN de muchos genomas de animales,
plantas y microorganismos.
El método de secuenciación de Sanger ha sido el más empleado durante el siglo XX.
Se basa en la síntesis de ADN en presencia de didesoxinucleósidos, compuestos
que, a diferencia de los desoxinucleósidos normales (dNTPs), carecen de un grupo
hidroxilo en su extremo 3'. Aunque los didesoxinucleótidos trifosfatados (ddNTPs)
pueden incorporarse a la cadena en síntesis, la carencia de un extremo 3'-OH
imposibilita la generación de un nuevo enlace fosfodiéster con el nucleósido
siguiente; por tanto, provocan la terminación de la síntesis. Por esta razón, el método
de secuenciación también se denomina «de terminación de cadena». La reacción se
realiza usualmente preparando un tubo con el ADN molde, la polimerasa, un
cebador, dNTPs convencionales y una pequeña cantidad de ddNTPs marcados
fluorescentemente en su base nitrogenada. De este modo, el ddTTP puede ir
marcado en azul, el ddATP en rojo, etc. Durante la polimerización, se van truncando
las cadenas crecientes, al azar, en distintas posiciones. Por tanto, se produce una
serie de productos de distinto tamaño, coincidiendo la posición de la terminación
debido a la incorporación del ddNTP correspondiente. Una vez terminada la
reacción, es posible correr la mezcla en una electroforesis capilar (que resuelve
todos los fragmentos según su longitud) en la cual se lee la fluorescencia para cada
posición del polímero.
EL DIAGNOSTICO DEL FUTURO
Muestra  Extracción de A.N.  Amplificación de zona interés  Secuenciación
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5.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA LA SECUENCIACIÓN.
Una vez que ha sido clonado un fragmento de ADN es necesario determinar su
secuencia para conocer los genes que contiene y la secuencia
exacta de las
proteínas que codifica, así como los elementos reguladores que funciona en cis.
La secuenciación del ADN es una técnica que no estuvo disponible hasta 1977
cuando Sanger, por un lado, Maxam y Gilbert, por otro, idearon dos estratégicas
diferentes con esta finalidad. Aunque ambas técnicas son utilizadas en la actualidad
para ciertos propósitos, es la idea de Sanger la que se utiliza de forma rutinaria al a
hora de secuenciar moléculas de ADN.
Mientras que la técnica de Maxam y Gilbert esta basada en la degradación química
del ADN, la de Sanger tiene como base la terminación de la síntesis de una cadena
de ADN por una polimerasa mediante la utilización de nucleótidos que no solamente
carecen del grupo oh en posición 2, característica de todos desoxirribonucleotidos,
sino que también les falta el grupo OH en posición 3.
En la siguiente figura se muestra el esquema de cómo funciona la técnica de
secuenciación.
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5.3. CONDICIONES UTILIZADAS DURANTE LA SECUENCIACIÓN.
Ya que en los secuenciadores actuales permiten secuenciar hasta 96 muestras
simultáneamente, la reacción se lleva a cabo en placas microtiter de 96 pocillos. Una
vez mesclados en cada pocillo todos los componentes de la reacción (ADN, cebador
y una mezcla de tampón, dNTPs, ddNTPs fluorescente y polimerasa) en un volumen
final de 10 micro litros, se lleva acabo la reacción en un termiciclador especial, que
permite utilizar este tipo de placas microtiter.
El termociclador realiza un total de entre 25 y 50 veces, en el caso de que se quiera
secuenciar ADN plasmídico, una desnaturalización a 96C durante 10 seg, para
obtener ADN de cadena sencilla, un anillamiento a 52C durante 10 seg, y una
elongación de la cadena durante 4 min. Estas condiciones varían dependiendo del
tipo de ADN molde que se quiere secuenciar.
Al final del proceso tendremos que, a partir del cebador, se habrá originado una
mezcla de cadenas de ADN de cadena sencilla y longitud variable, las cuales, todas
poseen en el extremo 5 el oligonucleótido utilizado como cebador, y en el extremo 3
de un ddNTP fluorcente correspondiente a la base complementaria del ADN molde.
Ya que cada ddNTP emite una luz de longitud de onda diferente, cada una de esas
cadenas de ADN podrá ser interpretada como una base en la secuencia del ADN.
5.4. SECUENCIADORES DE ADN.
Una vez realizada la reacción, es necesario realizar las mesclas de cadenas de ADN
de cadena sencilla y reconocer la base correspondiente a cada posición. Para se
emplean los secuenciadores de ADN.
Los secuenciadores de ADN actuales, altamente sofisticados, permiten secuenciar
96 muestras simultáneamente, y admiten de 6 a 8 cargas al día. Si tenemos en
cuenta que en cada reacción se puede obtener una secuencia superior a las 700
bases, nos encontramos con que es posible leer en un solo día más de 400.000
bases.
Los secuenciadores de uso más común en los laboratorios utilizan para separar las
cadenas de ADN de cadena doble un sistema de electroforesis capilar, que posee
grandes ventajas respecto a los geles convencionales que se utilizan en el pasado.
Una de ellas es que se evita la preparación del gel. Otra ventajas es que se pueden
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aplicar voltajes superiores, ya que el calor generado puede ser disipado rápidamente
gracias al pequeño diámetro de los capilares (entre 50 y 100 micras solamente), lo
que acorta el tiempo necesario para separar la muestra. Además, ya que la muestra
es leída al ir pasando las cadenas de ADN por el detector, no es necesario obtener
ninguna imagen del gel, ni interpretar el resultado.
El secuenciador esta también equipado con el dispositivo para emitir rayo laser y con
la cámara necesaria para medir la longitud de onda que emiten las cadenas de
oligonucleótidos al ser excitadas. A medida que va pasando la muestra, van
apareciendo picos de emisión de luz de una determinada longitud de onda, que son
recogidos por la cámara en forma de cromatogramas. Dichos cromatogramas son a
su vez interpretados en un ordenador, el cual suministra directamente la secuencia.
Los cromatogramas obtenidos en el secuenciador pueden ser observados utilizando
programas informáticos diseñados para este fin. Uno de ellos es el denominado
Chromas.
5.5. APLICACIONES.
El conocimiento exacto de la secuencia
abre la puerta a llevar a cabo
manipulaciones en el ADN que permitan conocer funciones especificas, tales como
muta génesis dirigidas, delecciones, expresión en sistemas heterógenas, etc.…
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CAPÍTULO VI
CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA
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6.1. CONCLUCIONES
CONCLUCION GENERAL
Luego de haber obtenido las conclusiones relacionadas con los objetivos específicos,
queda demostrado el objetivo general de esta monografía que fue fortalecer los
conocimientos obtenidos en el seminario de graduación los cuales me permiten
analizar y demostrar la importancia de las
¨Técnicas básicas de la Biología
Molecular¨ y sus aplicaciones mediante la recopilación bibliográfica y científica, con
el fin de obtener el título de Químico Farmaceuta otorgado por la Universidad
Católica De Cuenca al culminar el cuarto año de la carrera, por lo tanto, este
documento es una guía para que el estudiante de biofarmacia se desenvuelva de
buena manera frente a la práctica cotidiana que exige su profesión.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. El origen de la biología molecular se puede rastrear hasta fines del siglo XIX; sin
embargo, el descubrimiento de la estructura del ADN se considera como el inicio
de esta disciplina. Los avances producidos por la biología molecular en la década
´60 nos permiten contar hoy con herramientas para el estudio de
microorganismos a nivel molecular. Las Disciplinas científicas que forman parte
de la Biología Molecular son; Bioquímica Estructural, Bioquímica Inorgánica,
Bioquímica Metabólica y Enzimología, Fisiología Molecular, Química Física.
2. La obtención de un transgénico implica la participación de un organismo
que dona el gen de interés y un organismo receptor del gen que expresará la
nueva característica deseada. Las etapas en la obtención de un organismo
transgénico son básicamente cinco:
1. Corroborar que existe un gen que codifica para la característica de interés.
2. Clonar el gen de interés.
3. Modificar el gen para que funcione mejor en el organismo receptor.
4. Transferir el gen al organismo receptor.
5. Caracterizar el organismo receptor transformado.
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3. Los diferentes procedimientos de laboratorio que utilizan el principio de
hibridación la variación está dada por el tipo de ácido nucleico utilizado, el
soporte en que se lleva a cabo la hibridación y la forma de colocar los ácidos
en la membrana.
a) Desnaturalización (94ºC): La doble hebra del ADN se separa en dos cadenas
independientes. En esta etapa todos los procesos enzimáticos están detenidos.
b) Hibridización o anneling (45ºC – 60ºC): Los oligonucleótidos se unen a sus
secuencias específicas por complementación de bases, la polimerasa se une al
ADN y usando el oligonucleótido como cebador comienza a polimerizar.
c) Extensión (72ºC): Es la temperatura ideal para que polimerase la enzima. La
polimerasa adiciona los desoxiribonucleótidos (dNTPs) complementarios a la
cadena molde de 5´ a 3´ (la cadena molde se lee de 3´ a 5´).
4. La secuenciación del ADN consiste en dilucidar el orden de los nucleótidos
de un polímero de ADN de cualquier longitud, las técnicas actuales
permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de
gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el
Proyecto Genoma Humano.
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6.2. BIBLIOGRAFÍA:
1. KLUG William, CUMMINGS Michael, SPENCER Charlotte; CONCEPTOS DE
GENÉTICA, Editorial Pearson Educación S.A, Edición 8ª, Madrid España
2006
2. KLUG William, CUMMINGS Michael, SPENCER Charlotte, “et al”, conceptos
de genética, Editorial Pearson Educación S.A, Edición 8ª, Madrid España
2006.
3. BRUCE Alberts, (1938- ), JOHNSON, ALEXANDER, LEWIS, JULIAN; COLL
Durfort, “et al”, Biología molecular de la célula, Ediciones Omega, S.A, 5ª ed.,
1ª imp (07/2010)
4. LEÓN SERRANO, Javier, manual de genética molecular, Editorial Síntesis,
S.A, 1. ed.(12/1990)
5. GONZÁLEZ HERNÁNDEZ A, Principios de bioquímica clínica y patología
molecular, Ediciones Elsevier España, S.A, 1ª ed.(2010)
6. Nelson, David L.; Cox, Michael M.; Lehninger, Albert L., Lehninger: principios
de bioquímica, Ediciones Omega, S.A, 1ª ed., 1ª imp.(07/2009).
7. Tymoczko, John L.; Berg, Jeremy M.; Stryer, Lubert, Editorial Reverte,
6(08/11/2007).
8. Williams, Bryan L.; Wilson, Keith, principios y técnicas de bioquímica
experimental, Ediciones Omega, S.A, 1. ed.(02/1981).
9. Ramos Ruiz, Ricardo, Técnicas de investigación en biología molecular,
Universidad Autónoma de Madrid, Servicio de Publicaciones,1ª ed., 1ª
imp.(10/2000)
10. Tagu, Denis; Moussard, Christian, Fundamentos de las técnicas de biología
molecular, Editorial Acribia, S.A, 1ª ed., 1ª imp.(04/2006).
11. Freifelder, D., Técnicas de bioquímica y biología molecular, Editorial Reverté,
S.A, 1ª. ed. , 4ª. imp.(06/1981)
Direcciones en internet:
http://www.argenbio.org/xaga/h/biotecnologia/02_a4.php
http://www.elergonomista.com/biologia/historia.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa
http://definicion.de/ciencias-naturales/
Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
PRELIMINARES__________________________________PÁGINAS
CARÁTULA……………………….………………………………………………………….……………………I
DEDICATORIA………..…..………………………………………………………..………….................II
AGRADECIMIENTO……………………………………..……………………………………………….III
ÍNDICE…………………………………………………………………………………………………………...IV
INTRODUCCIÓN…………..………………………………………………………………………………VIII
OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………….…..X
CAPÍTULO ‘I’............................................................................................................. .- 1 CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ..................................... - 1 1.1. HISTORIA Y ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ................................. - 2 1.1.1. LOS PRIMEROS PASOS......................................................................... - 2 1.1.2. ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR .......................................... - 6 1.2. DISCIPLINAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ....... - 8 1.3. INFORMACIÓN GENÉTICA Y EL GENOMA. ................................................. - 10 1.3.1. EL GENOMA ........................................................................................ - 10 1.3.2. MATERIAL GENÉTICO ...................................................................... - 12 1.3.3. CROMATINA Y LOS CROMOSOMAS ................................................ - 12 1.3.4. LOS GENES ......................................................................................... - 14 1.4. TIPOS Y COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ...............................- 15 1.4.1. ÁCIDO NUCLÉICO ...............................................................................- 15 1.4.2. NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS .................................................... - 18 1.4.3. LOS DINUCLEOTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS ............................. - 19 1.5. FUNCIONES Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ..................... - 20 1.5.1.ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO O ADN …………………………………..- 21 1.5.2. ÁCIDO RIBONUCLEICO O ARN ........................................................ - 27 1.6. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR .................................... - 30 1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN .......................................................................... - 30 1.6.2. LA TRADUCCIÓN Y EL CÓDIGO GENÉTICO ................................... - 31 1.7. ENZIMAS Y VECTORES USADOS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR............. - 33 1.7.1. CONCEPTO DE ENZIMA .................................................................... - 33 1.7.2. USOS DE LAS ENZIMAS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR ............. - 33 Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular
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Universidad Católica de Cuenca
Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia.
Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
1.7.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE ENZIMAS ...................... - 33 1.7.4. ACOMPAÑANTES NO PROTEICOS DE LAS ENZIMAS ................... - 36 CAPÍTULO II ............................................................................................................ - 37 OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ...... - 37 2.1. ETAPAS DE LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ........... - 38 2.1.1. PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS .......... - 38 2.1.2. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO ........................ - 39 2.2. CLONADO DEL GEN. ....................................................................................... - 44 2.2.1. PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR ................................... - 44 2.2.2. PASOS A SEGUIR PARA UNA CLONACIÓN MOLECULAR ............ - 44 2.3. ELECTROFORESIS........................................................................................... - 47 2.3.1. FUNDAMENTO DE LA ELECTOFORESIS ........................................ - 47 2.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL ADN .................................... - 49 2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN ...................................................................... - 49 2.4.2. ALMACENAMIENTO DEL ADN ....................................................... - 49 2.4.3. CONSERVACIÓN DEL ADN EN TEJIDO FRESCO .......................... - 50 2.5. NORMAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ................. - 50 2.5.1.POSIBLES CONTAMINACIONES EN EL LABORATORIO DE ..................
BIOLOGIA MOLECULAR .................................................................... - 50 2.5.2.ORGANIZACIÓN ESPACIAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA .........
MOLECULAR .........................................................................................- 51 2.5.3. OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS . .......... - 52 CAPÍTULO III .......................................................................................................... - 54 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN......................................................................... - 54 3.1. PASOS PREVIOS A LA HIBRIDACIÓN ............................................................ - 55 3.2. MÉTODOS HIBRIDACIÓN DE LABORATORIO ............................................ - 56 3.2.1. EL MÉTODO DE HIBRIDACIÓN SOUTHERN ................................. - 57 3.2.2. NORTHERN O NORTHERN BLOT ................................................... - 58 3.2.3. WESTERN BLOT ................................................................................ - 58 3.2.4. DOT BLOT Y SLOT BLOT ................................................................... - 59 3.2.5. HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS) ........................................................... - 59 3.2.6. CHIP DE ADN ..................................................................................... - 61 3.2.7. SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID) ................................. - 61 3.2.8. HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS ............................... - 61 Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta
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Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia.
Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico.
3.2.9. MAPAS DE RESTRICCIÓN ................................................................ - 62 3.2.10. HIBRIDACIÓN DE ADN O RAMIFICADO (BRANCHED DNA) ..... - 62 2.3.11. cDNA MICROARRAY ........................................................................ - 62 3.3. PASOS DE LA HIBRIDACIÓN ......................................................................... - 63 3.3.1. FUNDAMENTO DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS ....... - 63 3.4. APLICACIONES DE LA HIBRIDACIÓN .......................................................... - 66 3.4.1. INGENIERÍA GENÉTICA ................................................................... - 67 3.4.2. MEDICINA FORENSE ........................................................................ - 68 3.4.3. BIOINFORMÁTICA ............................................................................ - 68 3.4.4. NANOTECNOLOGÍA DE ADN ........................................................... - 69 3.4.5. HISTORIA Y ANTROPOLOGÍA.......................................................... - 70 CAPÍTULO IV ............................................................................................................- 71 TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN MEDIANTE LA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ...................................- 71 4.1. FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. ..... - 72 4.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA REALIZAR LA PCR........................... - 74 4.3. CICLOS DURANTE LA PCR. ............................................................................ - 75 4.4. APLICACIONES. ............................................................................................... - 75 4.4.1. INVESTIGACIÓN ................................................................................ - 75 4.4.2. MEDICINA ......................................................................................... - 76 CAPÍTULO V ............................................................................................................ - 79 TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN ............................................... - 79 5.1. FUNDAMENTO DE LA SECUENCIACIÓN. .....................................................- 80 5.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA LA SECUENCIACIÓN. ...................... - 81 5.3. CONDICIONES UTILIZADAS DURANTE LA SECUENCIACIÓN. ................. - 82 5.4. SECUENCIADORES DE ADN. ......................................................................... - 82 5.5. APLICACIONES. ............................................................................................... - 83 CAPÍTULO VI ........................................................................................................... - 84 CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA ............................................................... - 84 -
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