Download iridovirosis del esturión blanco

NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista
del capítulo 1.2.3 del Código de animales acuáticos.
Este capítulo no ha sido actualizado desde 2003.
CAPÍTULO 2.1.16.
IRIDOVIROSIS DEL ESTURIÓN BLANCO
RESUMEN
La enfermedad por el iridovirus del esturión blanco (IEB) es causa importante de mortalidad en las
formas juveniles cultivadas de esta especie (Acipenser transmontanus) en Norteamérica y entre el
esturión del Danubio (A. guldenstadi) en Europa (1, 2, 4). El esturión blanco es el hospedador del que
se aisló por primera vez el agente causal, el iridovirus del esturión blanco (WSIV). El esturión lacustre
(A. fulvescens) se ha podido infectar experimentalmente con el WSIV, pero no se conoce la
susceptibilidad de otras especies (3).
La descripción original del iridovirus del esturión blanco procede de los primeros criaderos de esturión
blanco en Norteamérica. La fuente del virus se supuso derivada de los esturiones silvestres adultos recogidos
del río Sacramento en California, Estados Unidos de América (EE.UU.), mantenidos en cautividad
para ser usados como reproductores (2). El WSIV se ha detectado también en el esturión blanco cultivado
del río Columbia en los estados de Oregón y de Washington en EE.UU., en el río Snake del sur del
estado de Idaho y en el río Kootenai del norte de Idaho, EE.UU. (4, 5). Todos estos esturiones blancos
descienden de esturiones blancos silvestres capturados en estado adulto. Se ha detectado el virus entre las
formas juveniles silvestres del esturión blanco de la parte inferior del río Columbia, y el virus es
potencialmente enzoótico en poblaciones silvestres del esturión blanco del noroeste del Pacífico de
Norteamérica (4). En el esturión del Danubio del norte de Europa se ha identificado un iridovirus similar
al WSIV, que puede ser enzoótico en poblaciones cultivadas de varias especies de esturión (1).
El WSIV es un virus con tropismo epitelial que infecta la piel, las branquias y el tracto alimentario
superior. Las infecciones de la mucosa oral y del epitelio del órgano olfativo originan el cese de la
alimentación que conduce al progresivo deterioro o delgadez del pez, que es el principal síntoma externo de
la enfermedad (6). Se ha descrito una mortalidad acumulada de hasta el 95% en grupos de peces infectados
en criaderos y a menudo las infecciones secundarias con protozoos o bacterias externas contribuyen a la
mortalidad global (2). Los peces infectados empiezan a morir con una debilidad moderada o grave a las 2–
3 semanas de la exposición al virus a una temperatura del agua de 17–19°C (7). Pueden presentarse
hemorragias en el abdomen y en las escamas ventrales, pero no son específicas de la IEB. No hay síntomas
internos específicos de la infección ya que el virus no realiza una infección sistémica. La infección viral es
evidente por observación microscópica de cortes de tejidos teñidos de peces infectados. Las áreas del
integumento, y en particular la piel, pueden mostrar una hiperplasia focal o difusa con células
características de Malpighi anfófilas o basófilas agrandadas (6). Estas células están llenas de partículas
víricas como se demuestra por microscopía electrónica. El virus puede aislarse de los peces infectados usando
líneas celulares de esturión, pero con alguna dificultad.
Los modos de transmisión del WSIV no se conocen bien pero la transmisión horizontal a través del agua
se ha demostrado en los criaderos y experimentalmente en el laboratorio (3). Investigaciones epidemiológicas
realizadas en criaderos aportan evidencia circunstancial de que el virus se transmite verticalmente por los
reproductores adultos, pero el virus nunca se ha aislado u observado en peces adultos.
Parece haber poca relación antigénica entre el WSIV y los iridovirus que actúan como agentes sistémicos,
representados por el virus de la necrosis hematopoyética epizoótica o el iridovirus de la dorada japonesa.
Tanto el mayor tamaño y la estructura membranosa interna del virión del WSIV, como la especificidad de
líneas celulares hospedadoras, el tipo de efecto citopático, y la localización de las células diana
(epiteliotrópica y no sistémica), distinguen a este agente de otros grupos de iridovirus de peces. Aunque el
virión del linfocistivirus (LCDV) tiene una morfología similar, el LCDV infecta los fibroblastos y no
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.16. — Iridovirosis del esturión blanco
células de Malpighi como en las infecciones por el WSIV, y la especificidad de las líneas celulares y los
tipos de efecto citopático son claramente diferentes en los dos agentes.
Los principales métodos de diagnóstico del WSIV incluyen la observación microscópica de las células
típicas que infecta en cortes teñidos de tejido de la mucosa oral, las branquias y la piel, o el aislamiento del
virus en líneas celulares de esturión (3). Existen anticuerpos policlonales neutralizantes y monoclonales de
unión que reconocen al WSIV, pero no a los iridovirus sistémicos. Estos anticuerpos también pueden
usarse en pruebas de inmunofluorescencia indirecta con tinciones inmunoquímicas de células infectadas en
cultivo celular y en cortes de tejidos infectados.
Los métodos actuales de control se basan en evitar al agente cuando sea posible. Como no hay métodos
actuales para detectar el virus en los progenitores adultos, los principales medios de control son la
cuarentena y la investigación de formas juveniles que sufren mortalidad, para detectar el WSIV en peces
jóvenes. Se están desarrollando los métodos para detector el virus en criaderos.
PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO
El diagnóstico del iridovirus del esturión blanco (WSIV) se basa en la observación de las células
patognomónicas infectadas en los cortes teñidos de tejidos infectados del pez y en el aislamiento del virus
usando líneas celulares de esturión. La confirmación de una infección por el WSIV consiste en la
neutralización del virus aislado mediante anticuerpos policlonales. La unión específica de anticuerpos
monoclonales (MAbs) a los antígenos víricos en cultivos celulares infectados o en frotis de tejidos de
peces infectados se está investigando como método alternativo al aislamiento en cultivo celular y a la
neutralización del virus para la identificación del WSIV.
El material infectado del pez adecuado para el examen virológico es el siguiente:
•
Pez afectado clínicamente: pez inferior a 6 cm: 1) para aislamiento del virus – arcos branquiales, piel
de la parte carnosa de la boca (pliegue oral) y aletas; 2) para histología – sección sagital que incluya las
branquias y epidermis de la región cefálica y también las aletas mayores. Pez superior a 6 cm: –
porciones de las branquias, parte carnosa del pliegue oral y porciones de la parte carnosa de las aletas
mayores. Estos tejidos pueden usarse tanto para aislamiento del virus como para examen histológico.
•
Pez asintomático (pez aparentemente sano): como el anterior.
1. PRUEBA DE REFERENCIA PARA ANÁLISIS DEL WSIV
1.1. Aislamiento del WSIV en cultivo celular
Líneas celulares empleadas: células WSS-2 (de bazo de esturión blanco) o WSSK-1 (de
piel de esturión blanco)
Las células crecen a 20°C en estufa con temperatura controlada usando medio mínimo esencial
estándar (MEM) suplementado con 10% se suero fetal bovino (FCS), que puede reducirse al 5%
después de la inoculación del virus.
a) Inoculación de las monocapas celulares
i)
Se toma una porción de las branquias, del pliegue oral y del abdomen y una vez
homogeneizado, se prepara el sobrenadante para obtener una dilución final del tejido de
1/50. Se prepara una segunda dilución que represente 1/100 (p/v). Se transfiere un
volumen apropiado de cada una de las dos diluciones a monocapas celulares de 24 horas.
Se inoculan al menos 2 cm2 de monocapa celular decantada con 100 µl de cada dilución.
ii)
Se deja absorber durante 0,5–1 hora a 20°C y, sin eliminar el inóculo, se añade el medio
de cultivo celular tamponado a pH 7,6 y suplementado con 5% FCS (2 ml/pocillo para
placas de cultivo celular con 12 pocillos). Se incuba a 20°C en una estufa con temperatura
controlada y refrigeración para asegurar un adecuado aislamiento.
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Capítulo 2.1.16. — Iridovirosis del esturión blanco
b) Control de la incubación
i)
Se sigue diariamente durante 30 días el curso de la infección en los cultivos inoculados y
en los cultivos control mediante examen microscópico a 40-100 aumentos.
ii)
Si en los cultivos celulares inoculados con las diluciones de los sobrenadantes del
homogeneizado de prueba aparece efecto citopático (ECP), se inician de inmediato los
procedimientos de identificación (véase la sección 1.2 más adelante).
Si se está aplicando un programa de vigilancia de control sanitario de los peces, se debe asegurar que
se suspende el estado sanitario aprobado para la unidad de producción y/o la zona (si fue aprobada
previamente) de la que se originó la muestra positiva para el virus. La suspensión del estado
aprobado se mantendrá hasta que se demuestre que el virus en cuestión no es el WSIV.
iii) Si en los cultivos inoculados no se desarrolla ECP (pese al desarrollo normal de ECP en
los controles con virus), los cultivos inoculados se deben volver a cultivar otros 15 días. Si
el control con virus no desarrolla ECP, se debe repetir el proceso con células susceptibles
frescas y nuevos lotes de muestras.
c) Procedimientos de subcultivos
i)
Se toman alícuotas de los medios de los cultivos celulares de todos las monocapas
inoculadas con diluciones de cada sobrenadante de los tejidos homogeneizados.
ii)
Las monocapas celulares se inoculan como se describe en la sección 1.1.a.
iii) Se incuban y controlan como se describe antes en la sección 1.1.b.
iv) Si no ocurre ECP, se puede considerar que la prueba es negativa.
1.2. Identificación del WSIV
a) Prueba de la neutralización
i)
Se recoge el medio de cultivo de las monocapas celulares que muestran ECP y se
centrífuga a 2.000 g durante 15 minutos a 4°C para eliminar restos celulares.
ii)
El medio que contiene el virus se diluye de 10–1 a 10–3.
iii) Se mezclan alícuotas (por ejemplo 200 µl) de cada dilución de virus con un volumen igual
de suero de conejo contra el WSIV diluido 1/100, y se tratan de modo similar las
alícuotas de cada dilución de virus con medio de cultivo celular.
iv) Se incuban todas las mezclas a 20°C durante 1 hora.
v)
Se transfieren las alícuotas de cada mezcla anterior a monocapas celulares (inocular dos
cultivos celulares por dilución) y se deja que ocurra la adsorción durante 0,5–1 horas a
20°C; con tal finalidad, son adecuadas las placas de cultivo con 24- o 12-pocillos, usando
como inóculo 50 µl.
vi) Cuando se completa la adsorción, se añade a cada pocillo medio de cultivo celular
suplementado con 5% FCS y tamponado a pH 7,4–7,6, y se incuba a 20°C.
b) Prueba de la inmunofluorescencia indirecta
Esta prueba (IFI) se realiza después del aislamiento del virus en cultivo celular.
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i)
Se preparan monocapas de células WSS-2 en pocillos de 2 cm2 de placas de cultivo celular
de plástico o en cubres hasta alcanzar alrededor del 80% de confluencia. El contenido del
medio de cultivo celular en FCS se puede reducir al 5%.
ii)
Cuando las monocapas celulares están listas para la infección, se inoculan las
suspensiones víricas que se han de identificar haciendo diluciones decimales seriadas
directamente en los pocillos de cultivo celular o en los frascos de cultivo.
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iii) Las suspensiones control del WSIV se diluyen de un modo similar, para obtener un título
vírico aproximado de 1.000 TCID50 (dosis infectiva del 50% en cultivo celular) por ml en
el medio de cultivo celular.
iv) Se incuba a 20°C durante 7 días.
v)
Se elimina el medio de cultivo celular, se lava una vez con solución salina tamponada con
0,01 M de fosfato (PBS), pH 7,2, y luego brevemente con fijador frío tres veces. Este
fijador es acetona (mantenida a –20°C) para el caso de los cubres, o una mezcla de
acetona 30%/etanol 70% (v/v) para contenedores de plástico, también mantenida a
–20°C.
vi) Se deja actuar el fijador durante 15 minutos. Para 2 cm2 de monocapa celular es adecuado
un volumen de 0,5 ml.
vii) Las monocapas se dejan secar al aire al menos durante 30 minutos y se procesan
inmediatamente o se congelan a –20ºC.
viii) Se prepara una solución de MAbs contra el WSIV en 0,01 M PBS, pH 7,2, que contenga
2% de leche desnatada, a la dilución apropiada.
ix) Las monocapas celulares desecadas se rehidratan mediante cuatro pasos de lavado con
PBS y, tras el último lavado, se elimina completamente este tampón.
x)
Las monocapas celulares se tratan con la solución de anticuerpo durante 1 hora a 37°C en
una cámara húmeda. El volumen de solución empleada es 0,25 ml/pocillo de 2 cm2.
xi) Se lava cuatro veces con PBS como antes.
xii) Se incuban las monocapas celulares a 37°C durante 1 hora con una dilución apropiada de
anticuerpo anti-ratón biotinado (con 2% de leche desnatada en PBS).
xiii) Se lava cuatro veces con PBS como antes.
xiv) Las monocapas celulares se tratan durante 1 hora a 37°C con una solución de conjugado
FITC (FITC = isotiocianato de fluoresceína).
xv) Se lava cuatro veces con PBS como antes.
xvi) Se examinan inmediatamente las monocapas celulares tratadas en las placas de plástico, o
se hacen preparaciones con cubres utilizando glicerol salino a pH 8,5 antes de la
observación microscópica.
xvii) Se examina con luz UV incidente usando un microscopio con lente ocular ×10 y lentes
objetivos ×20–40, con aberturas numéricas >0,65 y >1,3, respectivamente. Antes de
cualquier otra observación se comprueba que los controles positivos y negativos dan los
resultados esperados. Los resultados positivos corresponden a una fluorescencia difusa
por el citoplasma.
2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DEL WSIV
La confirmación de brotes debidos al WSIV depende de la observación de síntomas clínicos de la
enfermedad entre los esturiones afectados, la presencia de células patognomónicas infectadas en cortes
de tejidos infectados o del aislamiento del virus en cultivo celular seguido de su identificación en una
prueba de neutralización. La inmunotinción de células en tejidos diana con anticuerpos contra el WSIV
puede reemplazar la necesidad de aplicar la microscopía electrónica para comprobar los viriones del
WSIV.
2.1. Aislamiento del virus y subsiguiente identificación
Como en las secciones 1.1. y 1.2.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.16. — Iridovirosis del esturión blanco
2.2. Observación de células infectadas en cortes de tejidos teñidos
a) Para peces de longitud <6 cm, se conserva el pez completo en fijador histológico
i)
Se preparan cortes transversales (entre los que se han de incluir las branquias) del pez
completo para teñir con hematoxilina y eosina.
ii)
Se observa el epitelio de las branquias, aletas (pectoral y caudal) y del cuerpo incluyendo la
boca y el esófago, para evidenciar células agrandadas con tinción citoplásmica anfofílica o
basófila y un núcleo hipertrófico irregular.
b) Para peces de longitud >6 cm, extraer un arco branquial, una porción de 1 cm2 de la sección carnosa de
la boca (pliegue oral), y una muestra de la aleta y un trozo de piel del abdomen de tamaño similar.
Los tejidos se fijan y se preparan cortes de tejido teñidos para observar células infectadas
características como se describe anteriormente.
2.3. Prueba inmunohistoquímica
Se comienza con tejidos fijados en 10% de formalina neutra tamponada usada para examen
histológico.
i)
Los cortes se desparafinan y se rehidratan
a.
b.
c.
d.
e.
f.
ii)
Xileno-1 durante 5 minutos
Xileno-2 durante 5 minutos1
100% EtOH durante 3 minutos2. Rodee el área del tejido con un lápiz PAP3
95% EtOH durante 3 minutos
70% EtOH durante 3 minutos
Se lava con agua desionizada durante 3 minutos
Se inactiva la peroxidasa endógena mojando los portas en 0,3% de H2O2 en metanol
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
iii) Se lava el porta con agua y luego suavemente con PBS.
iv) Se bloquea 30 minutos en PBS con 10% de suero de cabra.
v)
Se elimina la solución bloqueadora y se añade al corte 20 µl de MAb biotinado IIIA11 o
IIC7 de ratón contra el WSIV en PBS (3 µg/ml) y se incuba 60 minutos a temperatura
ambiente.
vi) Se lava tres veces.
vii) Se añade peroxidasa-estreptavidina (1/1.000) en PBS durante 10 minutos.
viii) Se lava tres veces.
ix) Se tiñe con AEC4 (aminoetil carbazol) durante 5–15 minutos a 25°C. Se comprueba el
nivel de desarrollo viendo el porta en un microscopio. El desarrollo se detiene por
inmersión en PBS.
x)
Se lava tres veces.
xi) Se tiñe con hematoxilina de Mayer5 durante 5 minutos a temperatura ambiente.
xii) Se lava tres veces.
1
2
3
4
5
Al final de la sesión de tinción, eliminar el primer xileno para desparafinar. En la siguiente sesión usar el xileno 2 como xileno
inicial y usar xileno fresco en el segundo paso.
El protocolo de DAKO sugiere 3 minutes × 2 cambios de cada baño de alcohol. El servicio técnico indica que esto es
excesivo. Otros protocolos indican 1–3 cambios de 1–3 minutos cada uno.
PAP Pen obtenido de The Binding Site Inc., San Diego, CA. 1-800-633-4484.
AEC Substrate. Zymed AEC Substrate Kit.
Solución de hematoxilina de Mayer. Soln. al 0.1%. Sigma diagnostics, Cat#MHS-1.
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xiii) Se realiza un montaje en húmedo con medio de montaje Crystal/MountTM
húmedo/seco6. (AEC es soluble en tolueno o en medios de montaje orgánicos) Después
de secar durante toda la noche, se puede montar un cubre sobre el corte usando un medio
de montaje con disolvente orgánico como el medio Krystalon Mounting7.
PBS – 2 litros de × 10
1.
2.
3.
4.
5.
160 g. NaCl (0,137 M)
4,0 g. KCl (0,003 M)
28,8 g. Na2HPO4 (0,01 M)
4,8 g. KH2PO4 (0,002 M)
pH hasta 7,2–7,4 y llevar a 2 litros con H2O destilada.
Extraído del texto ·Antibodies – A Laboratory Manual. Harlow & Lane, 1988.
Solución salina tamponada con Tris (TBS)
50 mM Tris base
1 mM EDTA
150 mM NaCl
pH a 8,0 con HCl
1 litro × 1
6,07 g
0,409 g
8,7 g
~2,5 ml conc.
2 litros × 10
121,1 g.
8,18 g
174 g.
~50 ml conc.
TTBS
Para preparar TTBS se añade Tween-20 al 0,1% (1,0 ml/litro).
REFERENCIAS
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ADKISON M.A., CAMBRE M. & HEDRICK R.P. (1998). Identification of an iridovirus in Russian
sturgeon Acipenser guldenstadi from Northern Europe. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 18, 29–32.
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HEDRICK R.P., GROFF J.M., MCDOWELL T.S. & WINGFIELD W.H. (1990). An iridovirus infection of
the integument of the white sturgeon Acipenser transmontanus. Dis. Aquat. Org., 8, 39–44.
3.
HEDRICK R.P, MCDOWELL T.S., GROFF J.M., YUN S. & WINGFIELD W.H. (1992). Isolation and
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LAPATRA S.E., GROFF J.M., JONES, G.R., MUNN B., PATTERSON T.L., HOLT R.A., HAUCK A.K. &
HEDRICK R.P. (1994). Occurrence of white sturgeon iridovirus infections among cultured white
sturgeon in the Pacific Northwest. Aquaculture, 126, 201–210.
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LAPATRA S.E., IRELAND S., GROFF J.M., CLEMENS K. & SIPLE J. (1999). Adaptive disease
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WATSON L.R., GROFF J.M. & HEDRICK R.P. (1998). Replication and pathogenesis of white sturgeon
iridovirus (WSIV) in experimentally infected white sturgeon Acipenser transmontanus juveniles and
sturgeon cell lines. Dis. Aquat. Org., 32, 173–184.
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iridovirus (WSIV). Aquaculture, 166, 213–228.
*
* *
6
7
Crystal/Mount – medio de montaje en seco y en húmedo. Biomeda Corp. Cat # MO3.
Krystalon Mounting Media, EM Science, 64969/95.
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