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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA – INIA) OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO SOLUBLE CITOPLASMÁTICO DEL VIRUS PESTE PORCINA AFRICANA PNT/CISA/PPA/Ag-VPPA/1 REV. 2013 Página 1 of 6 CONTENIDO 1. OBJETO. CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA) European Union Reference Laboratory for ASF, (EURL-ASF) Centro de Investigación en Sanidad Animal CISA-INIA, Valdeolmos 28130, Madrid, Spain. Contact people Dr. Carmina Gallardo Virginia Pelayo E-mail: [email protected] 2. ALCANCE. 3. REFERENCIAS. 3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN. 3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE. 4. GENERALIDADES. 5. REALIZACIÓN. 5.1. MATERIALES Y REACTIVOS. PNT/CISA/PPA/Ag-VPPA/1 PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO (PNT) PARA LA OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO SOLUBLE CITOPLASMÁTICO DEL VIRUS PESTE PORCINA AFRICANA 5.2. PREPARACIÓN. 5.3. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA. 5.4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. 5.5. PUNTOS CRÍTICOS. 5.6. MEDIDAS DE SEGURIDAD. CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA – INIA) OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO SOLUBLE CITOPLASMÁTICO DEL VIRUS PESTE PORCINA AFRICANA PNT/CISA/PPA/Ag-VPPA/1 REV. 2013 Página 2 of 6 1. OBJETO. El presente procedimiento tiene por objeto describir el método para la semipurificación del antígeno del virus de Peste Porcina Africana utilizado posteriormente cómo antígeno en las técnicas de diagnóstico serológico ELISA e IB. Esta técnica está incluida en el Manual de la OIE (capítulo 2.8.1 del “Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres” de la edición del 2012) 6. 7. 8. Tabarés, E., Martinez, J., Ruiz-Gonzalvo, F. y Sánchez-Botija, C. (1980b). “Proteins specified by African swine fever virus. II. Analysis of proteins in infected cells and antigenic properties”. Arch. Virol. 66, 119-132. Tabarés, E., Martinez, J., Martin, E. y Escribano J. (1983). “Proteins specified by African swine fever virus. IV. Glycoproteins and phosphoproteins”. Arch. Virol. 77, 167-180. Tabarés, E. (1987). “Characterization of African swine fever virus proteins”. In: Becker Y (Ed.) African swine fever. Martinus Nijhoff, Boston, pp 51-61. PPA REVISIONES: 1. 2. ALCANCE. 2. Este procedimiento es de aplicación a células MS (riñón de mono) infectadas con el virus de la Peste Porcina Africana E70 adaptado a MS. 3. Arias, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J., Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevenson, G.W. (Eds), Diseases of swine, 10th Edition. John Wiley and Sons, United States of America, pp. 396-404. Arias, M.; Sánchez, C.; González, M.A.; Carrasco, L. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2002). “Peste porcina Africana” In “Curso digital de enfermedades infecciosas porcinas”. On line, July, 2002. [http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/7/7-ppa.htm] Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). RECOGNIZING AFRICAN SWINE FEVER. A FIELD MANUAL. 2000 Edition. [ http://www.fao.org/docrep/004/X8060E/X8060E00.HTM] 3. REFERENCIAS. 3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN. 1. AFRICAN SWINE FEVER. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). CHAPTER 2.8.1. OIE, 2012 2. Enjuanes L, Carrascosa AL, Vinuela E. (1977) “Isolation and properties of the DNA of African swine fever (ASF) virus”. J Gen Virol Sep; 32(3):479-92. Escribano J., Tabares E. (1987). “Proteins specified by African swine fever virus: V. Identification of immediate early, early and late proteins”. Arch Virol; 92(3-4):221-32. Sánchez-Vizcaíno J.M. (1986). “African swine fever diagnosis”. In African Swine Fever ed. J. Becker, pp. 63-71. Boston: Martinus Nijhoff. Tabarés, E., Marcotegui, M., Fernández, M. y Sánchez-Botija, C. (1980a). “Proteins specified by African swine fever virus. I. Analysis of viral structural proteins and antigenic properties”. Arch. Virol. 66, 107-117. [http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.08.01_ASF.pdf ] 3. 4. 5. 3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE. PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE LAS TIRAS DE INMUNOBLOTTING (PNT/CISA/PPA/IB-TIRAS/1). DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS FRENTE AL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA) INDIRECTO (PNT/CISA/PPA/ELISA/1) DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS FRENTE AL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE INMUNOTRANSFERENCIA (IMMUNOBLOTTING) (PNT/CISA/PPA/IB/1) 4. GENERALIDADES. 4.1. ABREVIATURAS. CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA – INIA) OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO SOLUBLE CITOPLASMÁTICO DEL VIRUS PESTE PORCINA AFRICANA PNT/CISA/PPA/Ag-VPPA/1 REV. 2013 Página 3 of 6 Ag-: Antígeno soluble citoplasmático del VPPA. CL: Control límite de referencia. CN: Control negativo de referencia. CP: Control positivo de referencia. CO: Cut off (punto de corte). DO: Densidad óptica. IB: Immunoblotting. MS: células de riñón de mono. m.o.i: multiplicidad de infección. r.p.m.: revoluciones por minuto. PPA: Peste porcina africana. Vf: Volumen final. VP: proteína viral. VPPA: Virus de la peste porcina africana. 4.2. PRINCIPIO. El virus de la peste porcina africana (VPPA) es capaz de replicar en el citoplasma de células de riñón de mono (células MS). La fracción soluble citoplasmática se obtiene tras la infección de dicho cultivo celular con VPPA en presencia de suero porcino. Una vez semipurificado es empleado como antígeno en las distintas técnicas de detección de anticuerpos. El aislado español E70 adaptado a MS es el virus utilizado en el proceso de producción del antígeno. En la semipurificación del VPPA se obtienen diferentes proteínas virales donde la VP73 es la proteína estructural mayoritaria de la cápsida. Esta proteína induce anticuerpos en una infección natural, de ahí su importancia como reactivo para diferentes técnicas de diagnóstico. Otras proteínas importantes por su capacidad antigénica obtenidas tras el proceso de semipurificación son la proteína p32 y la proteína p54. Estas proteínas son parcialmente purificadas (junto con otras proteínas del VPPA) por simple extracción a partir de las partículas virales presentes en la fracción citoplasmática de células infectadas. El extracto de virus semipurificado es usado como antígeno efectivo para el diagnóstico de PPA mediante la técnica de ELISA e IB. 5. REALIZACIÓN. 5.1. MATERIALES Y REACTIVOS. MATERIALES Agitador orbital 37±2ºC Balanza precisión. Botellas de vidrio 100, 250 y 500 ml. Cabina de flujo laminar de bioseguridad tipo II. Centrífuga de mesa [Megafuge1.0R (rotor Heraeus #7570) o características similares]. Centrífuga [SORVALL RC6/ rotor SLA-1500 SUPER-LITE o características similares]. Congelador de <-10 ºC. Congelador<-70 ºC. 2 Frascos de cultivo T25, T75 y T150 cm [Falcon]. Filtros SARTORIUS MINISART 0,45 micras [Sartorius 16555 o características similares]. Guantes de látex o de nitrilo. Hielo. Incubador 37±3ºC /CO2 (±0.5%). Micropipeta automática monocanal de 10-200l. Micropipeta automática monocanal de 1-10 l. Micropipeta automática monocanal de 10-100 l. Micropipeta automática monocanal de 200-1000 l. Micropipeta automática monocanal de 0,5-10l. Nevera de 4±3ºC. Papel absorbente. Papel de aluminio. pHmetro (0,01 UpH). Pipetas de vidrio o plástico, estériles, para descargar 1-25ml. Pipeteador automático Pipetboy acu o equivalente. Probetas de 50 a 250 ml. Puntas desechables (1-10 µl, 1-200 µl, 200-1000 µl). Reloj cronómetro. CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA – INIA) OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO SOLUBLE CITOPLASMÁTICO DEL VIRUS PESTE PORCINA AFRICANA PNT/CISA/PPA/Ag-VPPA/1 REV. 2013 Página 4 of 6 Tubos Eppendorff (o equivalentes) de 0,5, 1,5 y 2 ml Tubos de plástico estériles de 10 ml y 50 ml (COSTAR Ref. 4870). . Tubos de centrífuga Ultracentrífuga [SORVALL WX ULTRA / 100 rotor SW-41-1 o características similares] Vórtex. REACTIVOS Agua destilada o desionizada. Ácido Clorídrico fumante 37% para análisis 5.2. PREPARACIÓN 5.2.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS EDTA 0,2M → 0,90gr (±0,01) de EDTA en 10 ml de agua destilada (Vf10 ml). Conservar a 4±3ºC. Fecha de caducidad: 1 mes. NaCl 5M → 7,30gr (±0,05) de NaCl en 25 ml de agua destilada (Vf25 ml). Conservar a temperatura ambiente. Fecha de caducidad: 1 mes. NP40 10% →20 ml de NP40 en 180 ml de agua destilada (Vf200 ml). Conservar a temperatura ambiente. Fecha de caducidad: 3 meses. Sacarosa 0,34 M en Tris HCl 5mM pH8 (±0,2UpH) →34,9gr (±0,5) sacarosa para fines bioquímicos en 1,5ml de Tris HCl 1M. Completar hasta 300 ml con agua destilada (Vf300 ml). Conservar a <-10 ºC. Fecha de caducidad: 1 mes. Sacarosa 0,067 M en Tris HCl 5mM pH8 (±0,2UpH) →6,88gr (±0,05) sacarosa para fines bioquímicos en 1,5ml de Tris HCl 1M. Completar hasta 300 ml con agua destilada (Vf300 ml). Conservar a <-10 ºC. Fecha de caducidad: 1 mes. Sacarosa 64% (v/v) en Tris HCl 0,4M pH8 (±0,2UpH) → Añadir 128gr(±1) de sacarosa para gradientes de densidad en 80 ml de Tris HCl 1M y completar con agua destilada hasta 200 ml (Vf200 ml). Conservar a <-10 ºC. Fecha de caducidad: 1 mes. Sacarosa 20% (v/v)) en Tris HCl 50mM pH8 (±0,2UpH) → Añadir 60gr (±0,5) de sacarosa para gradientes de densidad en 20 ml de Tris HCl 1M y completar con agua destilada hasta que la masa total sea de 300gr (v/v). Conservar a <-10 ºC. Fecha de caducidad: 1 mes. Tampón TEN → 175 µl Tris HCl 1M + 700 µl EDTA 0,2M + 250 µl βmercaptoetanol + 2,37 ml de agua destilada. Esta solución debe ser preparada en el momento de uso. [Ref. Merck 1.00317 o características similares]. Aminoácidos no esenciales (NEAA) 100x [Ref. Lonza BE-13-114E o características similares]. -mercaptoetanol [Ref.Merck Ref. 805740 o características similares]. Células de riñón de mono (MS) [ATCC/ECACC 91070510]. Cloruro Sódico (NaCl) [Ref.Merck 1.06404 o características similares]. Ácido etilen-diamino-tetra acético (EDTA) [Ref. Sigma E-5391 o características similares o características similares]. Medio de cultivo EMEM [Ref. BioWhittaker BE12136K o características similares], Medio Eagle suplementado con 10% de suero de cerdo filtrado con filtros MiniSart (0,45 micras) y estéril [Ref. Sigma P-9783 o características similares], 1% de solución 100X de aminoácidos no esenciales [ Ref. BioWhittaker BE13-114E o características similares], 1% glutamina [4mM] [Ref. BioWhittaker BE17-605E o características similares], y sulfato de gentamicina 50mg/ml [Ref. BioWhittaker 17-518Z o características similares]. Nonidet P40 (NP) [Ref.Merck 492016 o características similares]. Piruvato sódico [Ref.Lonza BE-13-115E o características similares]. Sacarosa para fines bioquímicos [Ref Merck 1.07687 o características similares]. Sacarosa para gradientes de densidad [Ref .Merck 1.07654 o características similares]. Suero de cerdo filtrado-estéril [Ref Sigma P-9783 o características similares]. Timerosal [Ref.Sigma T 4687 o características similares]. Tris (hydroxymethyl)-aminometano [Ref Merck 1.08387 o características similares]. CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA – INIA) OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO SOLUBLE CITOPLASMÁTICO DEL VIRUS PESTE PORCINA AFRICANA PNT/CISA/PPA/Ag-VPPA/1 REV. 2013 Página 5 of 6 Tris HCl 1M pH8 (±0,2UpH) (Vf500 ml) → 60,57gr (±0,5) Tris en 300 ml de agua destilada Ajustar el pH a 8(±0,2UpH) con HCl y completar con agua destilada hasta un volumen de 500ml (Vf500 ml). Conservar a temperature ambiente. Fecha de caducidad: 3 meses. 10. Distribuir la totalidad del volumen en los tubos de ultracentrífuga sobre un colchón de sacarosa al 20% (v/v) 11. Centrifugar a 100.000 g durante 1 hora a 4 ±1ºC [25.000r.p.m./1h 5 minutos SORVALL WX ULTRA / 100 rotor SW-41-1]. 12. Recoger la fracción situada encima del colchón de sacarosa (Ag-PPA) y añadir Timerosal hasta una concentración final de 0,1% (conservante). 5.3. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA 1. 2 Infectar células MS (confluentes al 80%) crecidas en falcon T175 cm con virus del VPPA E70MS48 (adaptado a células MS) a una m.o.i de 10 en medio sin suero. 13. Congelar a <-20ºC durante 24horas y posteriormente a <-70ºC. Conservar a <-70 ºC en alícuotas de 100l. Fecha de caducidad: 18 meses 2. Incubar durante 2 horas a 37±3 ºC en agitación continua (adsorción del virus). 2 Pasadas las dos horas completar el volumen correspondiente al T175 cm con medio EMEM con un 2% de suero cerdo. 5.4. ANÁLISIS E INTREPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. 3. Incubar durante 36-48 horas a 37±3 ºC. 4. Recoger las células y centrifugar 5 minutos a 650 g SORVAL rotor SLA1500). La banda situada encima del colchón de sacarosa corresponde al antígeno semipurificado (Ag-VPPA). 5. Descartar el sobrenadante y lavar el precipitado con Sacarosa 0,34 M (~ 20ml), y centrifugar a 1000 g 5 minutos para recoger las células (1.500 r.p.m./10 minutos centrífuga de mesa Megafuge1.0R (rotor Heraeus #7570). 6. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón hipotónico 2 Sacarosa 0,067 M (1,8 ml por Falcon 175 cm ), dejándolo en hielo durante 10 minutos, agitando a los 5 minutos. 7. Añadir NP40 10%, hasta una concentración final del 1% (v/v), [1/9 del volumen total] agitando y colocándolo en hielo durante 10 minutos. Agitar a los 5 minutos, consiguiendo así la lisis celular. 8. Añadir 1/7 del volumen total de Sacarosa 64% (v/v). Centrifugar a 1.200g durante 10 minutos [2.500 r.p.m./ 10 minutos centrífuga de mesa Megafuge1.0R (rotor Heraeus #7570]. 9. Recoger el sobrenadante y añadir 1/19 del volumen total de tampón TEN. Añadir 1/10 del volumen total de NaCl 5 M e incubar 15’ en hielo. En este paso, se disgregan las partículas virales, manteniendo el NaCl la isotonicidad. (1.500 r.p.m./ 20 minutos centrífuga La validez de cada lote de Ag-VPPA para el ELISA indirecto de la OIE (PNT/CISA/PPA/ELISA/1) debe ser comprobado mediante una titulación, enfrentándolo a los sueros de referencia positivo, límite y negativo (CP, CL Y CN), para determinar la dilución óptima del antígeno con la que se han de antigenar las placas de ELISA. Un lote de Ag-PPA es considerado válido cuando, a una dilución de 1:1600 (0,5-0,9g/por pocillo) y utilizando una dilución de los sueros de referencia de 1/30, la absorbancia del CP es 4 veces superior a la absorbancia obtenida en el CN y el CL presenta un valor de absorbancia dentro del rango del Cut Off (CO) [PNT/CISA/PPA/ELISA/1]. CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA – INIA) Dilución 1/30 OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO SOLUBLE CITOPLASMÁTICO DEL VIRUS PESTE PORCINA AFRICANA PNT/CISA/PPA/Ag-VPPA/1 REV. 2013 Página 6 of 6 DENSIDAD OPTICA (D.O. 620nm) PC LC NC 1 2 3 4 5 6 A 1/200 1/200 1/200 0.149 0.086 0.061 B 1/400 1/400 1/400 0.163 0.093 0.076 C 1/800 1/800 1/800 0.572 0.195 0.100 D 1/1600 1/1600 1/1600 1.460 0.429 0.157 E 1/3200 1/3200 1/3200 0.991 0.279 0.145 F 1/6400 1/6400 1/6400 0.771 0.238 0.135 G 1/12800 1/12800 1/12800 0.431 0.167 0.114 H 1/25600 1/25600 Blanco 0.226 0.127 0.078 Titulación Ag DOCP = 1,460 ≥ 1,0 CP/CN = 9,29 > 4 DOCN = 0,157 ≤ 0,250 ODCL = 0,457 ≥ CO (0,449) – 0,1 La validez de cada lote de Ag-VPPA para los ensayos de Immunoblotting también debe ser comprobada tal y como está descrito en el procedimiento para la producción de tiras de Inmunoblotting (IB) para la detección de anticuerpos PNT/CISA/PPA/TIRAS-IB/1). Cada nuevo lote de Ag-PPA es considerado válido para su uso en la producción de tiras de IB cuando el CP-PPA reacciona frente a las proteínas virales con pesos moleculares (x10-3) comprendidos entre IP 12.5, IP 23.5, IP 25, IP 25.5, IP 30, IP 31, IP 34 y IP 35, mostrando el patrón específico de reacción que se muestra en la figura. 5.5. PUNTOS CRÍTICOS Durante todo el proceso, es importante mantener los reactivos y realizar los diferentes pasos en hielo. Se debe tener especial cuidado en el momento de recoger el antígeno semipurificado, evitando recoger el colchón de sacarosa. 5.6. MEDIDAS DE SEGURIDAD Leer atentamente el protocolo. Conservar los reactivos a la temperatura indicada antes de su utilización. No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes kits. Evitar cualquier contaminación de los reactivos. No utilizar los reactivos una vez superada la fecha de caducidad. No comer beber ni fumar mientras se manipulen los reactivos y/o las muestras. No pipetear los reactivos con la boca.
