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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
AISLAMIENTO VIRAL DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA EN MACRÓFAGOS
ALVEOLARES PORCINOS E IDENTIFICACIÓN MEDIANTE HEMOADSORCIÓN
REV. 2013
PNT/CISA/PPA/VI/2
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CONTENIDO
1. OBJETO.
CENTRO DE INVESTIGACION EN
SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA)
Laboratorio de Referencia de la UE de PPA (EURL-ASF)
Centro de Investigación en Sanidad Animal
CISA-INIA, Valdeolmos 28130, Madrid, Spain.
Contacto
Dr. Carmina Gallardo
Virginia Pelayo
E-mail: [email protected]
2. ALCANCE.
3. REFERENCIAS.
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
4. GENERALIDADES.
5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
PNT/CISA/PPA/VI/2
PROCEDIMENTO NORMALIZADO DE TRABAJO (PNT):
AISLAMIENTO VIRAL DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA EN
MACRÓFAGOS ALVEOLARES PORCINOS E IDENTIFICACIÓN
MEDIANTE HEMOADSORCIÓN
5.2. PREPARACIÓN.
5.3. MÉTODOS.
5.4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
5.5.
PUNTOS CRÍTICOS
5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
AISLAMIENTO VIRAL DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA EN MACRÓFAGOS
ALVEOLARES PORCINOS E IDENTIFICACIÓN MEDIANTE HEMOADSORCIÓN
REV. 2013
1. OBJETO.
El presente procedimiento tiene por objeto describir el método para la detección
de virus de la peste porcina africana (VPPA) mediante la técnica de aislamiento
viral en macrófagos alveolares obtenidos de pulmones de cerdo.
6.
PNT/CISA/PPA/VI/2
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Malmquist, W. y Hay, D. (1960). “Hemadsorption and cytopathic effect produced by African
swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures”. Am. J. Vet. Res. 21,
104-108.
PPA REVISIONES:
1.
2. ALCANCE.
2.
Este procedimiento es de aplicación a muestras de suero, sangre con
anticoagulante y tejidos porcinos, así como homogeneizados de garrapatas del
género Ornithodoros.
3.
Arias, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J.,
Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevenson, G.W. (Eds), Diseases of swine,
10th Edition. John Wiley and Sons, United States of America, pp. 396-404.
Arias, M.; Sánchez, C.; González, M.A.; Carrasco, L. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2002).
“Peste porcina Africana” In “Curso digital de enfermedades infecciosas porcinas”.
On line, July, 2002. [http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/7/7-ppa.htm]
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). RECOGNIZING
AFRICAN SWINE FEVER. A FIELD MANUAL. 2000 Edition.
[ http://www.fao.org/docrep/004/X8060E/X8060E00.HTM]
3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
3. REFERENCIAS.
1.
2.
3.
4.
5.
•
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
•
AFRICAN SWINE FEVER. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals
(mammals,
birds
and
bees).
CHAPTER
2.8.1.
OIE,
2012
•
[http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.08.01_ASF.pdf]
Carnero R., Larenaudie, B., Ruiz-Gonzalvo, F. y Haag, J. (1967). “Peste porcine africaine.
Etudes sur la reaction d'hemadsorption et son inhibition par des anticorps specifiques “. Rec.
Vet. Med. 143, 49-59.
Carrasco L., de Lara FC, Martin de las Mulas J, Gomez-Villamandos JC, Hervas J, Wilkinson PJ,
Sierra MA . (1996a). “Virus association with lymphocytes in acute African swine fever”.Vet
Res;27(3):305-12
Carrascosa AL, Bustos MJ, de Leon P. “Methods for growing and titrating African swine fever
virus: field and laboratory samples“. Curr Protoc Cell Biol. 2011 Dec;Chapter 26: Unit 26.14.
Galindo I, Almazan F, Bustos MJ, Viñuela E, Carrascosa AL. (2000). “African swine fever virus
EP153R open reading frame encodes a glycoprotein involved in the hemadsorption of
infected cells”. Virology Jan 20;266(2):340-51.
•
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA PESTE PORCINA
AFRICANA (PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1).
EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA PARA SU
DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
(PNT/CISA/PPA/DNA EXTRACCIÓN/1)
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA
MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) CONVENCIONAL
(PNT/CISA/PPA/PCR/1)
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA
MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
(PNT/CISA/PPA/PCR/2)
4. GENERALIDADES.
4.1. ABREVIATURAS.
ECP: efecto citopático
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HAD: hemoadsorción
IFD: inmunofluorescencia directa
MAP: macrófagos alveolares porcinos
NC: control negativo
PC: control positive VPPA
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
r.p.m: revoluciones por minuto
PPA: Peste porcina africana.
VPPA: Virus de la peste porcina africana.
4.2. PRINCIPIO.
El aislamiento del VPPA se realiza en cultivos primarios porcinos. El VPPA es
capaz de infectar y replicarse de forma natural en cultivos de leucocitos de
sangre periférica de cerdo, donde además de producir un efecto citopático (ECP)
en los macrófagos infectados, previamente a la lisis celular origina un efecto
característico de Hemoadsorción (HAD), que consiste en la adsorción de los
hematíes del cerdo alrededor de los leucocitos que han sido infectados por PPA.
La imagen al microscopio se presenta en forma de morula o corona (roseta) de
eritrocitos alrededor de los leucocitos.
El efecto de la hemoadsorción está unido a la presencia de dos genes en el
genoma del VPPA. El ORF EP402R que codifica para una proteína homóloga al
marcador de superficie molecular CD2, y el gen EP153R que codifica para una
proteína homóloga al marcador de superficie molecular CD44. El primero es el
responsable del fenómeno de la hemoadsorción debido a que cuando el virus
replica en las células diana, expresa el CD2 cómo marcador de superficie
produciéndose la unión entre el CD58 presente en la superficie de los eritrocitos
y el CD2 de las células infectadas. Esta unión que origina una estructura en
forma de mórula o roseta, se encuentra estabilizada por la acción de la proteína
codificada por el gen EP153R.
El aislamiento viral y la identificación mediante la HAD es la técnica de
referencia para la confirmación de un resultado positivo o dudoso obtenido
previamente mediante la técnica de ELISA de antígeno, la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) o la Inmunofluorescencia Directa (IFD), sobre todo en
caso de que se trate de un brote primario de la PPA.
5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
MATERIALES.
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•
Agitador/incubador 37±2ºC.
Balanza electrónica.
Baño de agua
Botellas estériles de 250ml y 500 ml.
Bisturí estéril
Cabina de flujo laminar clase II
Cámara de contaje celular [THOMA or NEUBAHUER o características similares].
Centrífuga [SORVALL RC6 rotor SLA 1500 o características similares].
Centrífuga de mesa [rotor Heraeus #7570 o características similares].
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Congelador de <-10ºC.
Congelador ≤-70ºC.
Criotubos
Contenedor de nitrógeno líquido
Cubetas desechables.
Desfibrinador mecánico
Embudo estéril
Fórceps estériles
Frascos de cultivo, T25, T75 y T150 [Falcon].
Guantes de látex o de nitrilo.
Incubador CO2 (±0.5%) / 37±3ºC.
Micropipetas automáticas monocanal de 1-10 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 10-200 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 200-1000 µl.
Micropipetas automáticas multicanal de 5-50 µl.
Micropipetas automáticas multicanal de 50-200 µl.
Microscopio invertido de contraste de fases.
Nevera de 4±3ºC.
Papel adsorbente.
pHmetro (0,01 UpH).
Pipeteador automático Pipetboy acu o equivalente.
Pipetas de vidrio o plástico, estériles, para descargar 1-25 ml.
Placas de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano [NUCLONTM “Surface,
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•
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•
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Puntas de pipetas desechables de 1-20, 20-200 and 200-1000 µl..
Reloj cronómetro.
Tijeras estériles
Tubos eppendorf (o equivalentes) de 0,5 ml, 1,5 ml y 2 ml.
Tubos de centrífuga SORVAL
Tubos de plástico estériles de fondo cónico 12 ml y 50 ml.
Vórtex.
NUNC o características similares].
REACTIVOS.
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Ácido cítrico [Ref.: 1.00244.1000 (Merck) o características similares] Conservar a Tª
ambiente.
Aminoácidos no esenciales 100x [Ref.: BE13-114E (BioWhittaker) o características
similares]. Conservar a 4±3ºC.
Citrato tri-sódico di-hidratado [Ref.: 1.06448.1000 (Merck) o características similares]
Conservar a Tª ambiente.
Cloruro amónico NH4Cl [Ref.: 1.01145.1000 (Merck) o características similares]. Conservar
a Tª ambiente.
Cloruro potásico (ClK) [Ref. 1.04936.0500 (MERCK) o características similares]. Conservar a
Tª ambiente.
Cloruro sódico (ClNa) [Ref. 1.06404.1000 (MERCK) o características similares]. Conservar a
Tª ambiente.
Colorante de Türk [Ref.: 1.09277.0500 (Merck) o características similares]. Conservar a Tª
ambiente.
Dimetil sulfóxido (DMSO) [Ref.: 10002430 (Bio-Rad) o características similares].
Conservar a Tª ambiente..
Fosfato monopotásico (P04H2K) [Ref. 1.04873.1000 (MERCK) o características similares].
Conservar a Tª ambiente.
Fosfato sódico (P04HNa2) [Ref. 1.06586.0500 (MERCK) o características similares].
Conservar a Tª ambiente.
Glucosa [Ref.: 1.08342.1000 (Merck) o características similares]. Conservar a Tª ambiente..
Glutamina [4mM] [Ref.: BE17-605E (BioWhittaker)] o características similares]. Conservar a
<-10 ºC.
Nistatina [10.000 U/ml] [Ref.: 15340029 (Gibco) o características similares]. Conservar a
<-10 ºC
PC: Aislado de la PPA hemoadsorbente. Conservar a ≤ -70º C.
Piruvato sódico [Ref.: BE13-115E (BioWhittaker) o características similares]. Conservar a
4±3ºC.
RPMI 1640 medio de cultivo celular [Ref.: BE12-167F (BioWhittaker) o características
similares]. Conservar a 4±3ºC
Sulfato de gentamicina 50mg/ml [Ref.: 17-518Z (BioWhittaker) o características similares].
Conservar a 4±3ºC.
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Suero fetal bovino (SFB) [Ref.: 10106-169 (Gibco) o características similares]. Conservar a
<-10 ºC.
Tampón fosfato salino (PBS 1x) en tabletas [Ref.: 524650-1 (CALBIOCHEM) o
características similares]. Conservar a Tª ambiente.
•
5.2. PREPARACIÓN
5.2.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.
La preparación de las muestras a analizar se realizará según se describe en el
PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1 “Preparación de muestras para el diagnóstico de
la peste porcina africana”.
5.2.2. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS.
•
Ácido citrato-dextrosa (ACD)
Citrato tri-sódico di-hidratado
Ácido cítrico
Glucosa
Agua destilada
-----11 gr(±0,1)
-----4,34 gr (±0,05)
-----13,35 gr (±0,1)
-----a 500 ml
Esterilizar por filtración y conserver a 4±3ºC. Fecha de caducidad: 1 año.
•
Medio de cultivo de los MAP: RPMI 1640 suplementado con 20% de
SFB, 1% aminoácidos no esenciales 100x, 1% Piruvato sódico, 1% de
glutamina [4mM], nistatina [10.000 U/ml] y sulfato de gentamicina
50mg/ml. Conservar a 4±3ºC.
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Tampón fosfato salino (PBS 1x) pH 7,2 (±0,2 UpH)→ El PBS puede adquirirse
en tabletas [Ref.: 524650-1 (CALBIOCHEM) o de similares características] o puede prepararse
de la siguiente manera:
ClNa
----------8,0 gr (±0,1)
ClK
----------0,2 gr (±0,01)
----------0,2 gr (±0,01)
P04H2K
----------1,15 gr (±0,05)
P04HNa2
Agua destilada ----------1.000 ml
Conservar a Tª ambiente. Fecha de caducidad 1 año.
5.3. MÉTODOS
A) OBTENCIÓN DE LOS MAP.
Los MAP se obtienen de pulmones de lechones (2-3 semanas) por perfusión de
la cavidad pulmonar mediante lavado bronco-alveolar con una solución de
lavado pulmonar según el siguiente protocolo;
1.
Cerrar la tráquea con un fórceps antes de seccionarla
2.
Lavar bien los pulmones con agua destilada separando el corazón.
3.
Se envuelven los pulmones en papel adsorbente y se introduce en su
interior mediante un embudo estéril 500-600 ml de la solución de
lavado
•
Solución de congelación: SFB + 10 % DMSO. Se debe preparer en el
•
Solución de lavado bronco-pulmonar: PBS1 x + sulfato de gentamicina
50mg/ml + 3% ACD. Conservar a 4±3ºC
4.
Masajear los pulmones durante 1-2 minutos e introducir el lavado
alveolar en una botella (este proceso se repite 2-3 veces).
•
Solución de lisis de eritrocitos: 0,83% Cloruro amónico estéril → 8,3gr
(±0,1) de NH4Cl en 1.000 ml de agua destilada. Conservar a 4±3ºC. Fecha
de caducidad: 6 meses.
5.
Distribuir en tubos de centrífuga de 250 ml
6.
Centrifugar en centrífuga SORVALL RC6 (rotor SLA 1500) a 2.500g
(4.000 r.p.m) durante 15 minutos a temperatura ambiente.
momento de uso.
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B)
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7.
Resuspender el precipitado en 50 ml de medio de lavado y pasarlo a un
tubo FALCON estéril de 50 ml
8.
Centrifugar en centrífuga de mesa [Megafuge 1.0R rotor Heraeus
#7570mesa] 2.080 g (4.000 r.p.m) durante 2 minutos a temperatura
ambiente.
9.
Repetir el lavado dos veces
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células viables por pocillo). Las placas se incubaron a 37±2ºC en
incubador de CO2 (±0.5%) entre 1-4 horas mientras se preparan las
muestras.
C)
INOCULACIÓN DE LAS MUESTRAS.
1.
10. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado celular en un
volumen conocido (p.ej. 5ml) de SFB. Se realiza un recuento de MAP
en cámara de contaje celular, calculando el volumen total de de
solución de congelación necesario para tener una concentración final
7
de 5 x 10 células (MAP)/ml.
Inocular el cultivo celular de MAP con una dilución 1/10 (20 µl/pocillo)
de la muestra problema estéril tratada según se especifica en el
PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1. Se recomienda inocular como mínimo
cuatro pocillos de la placa por muestra.
2.
11. Distribuir las células resuspendidas en la solución de congelación en la
7
concentración de 5 x 10 células (MAP)/ml en criotubos (1ml/criotubo)
y congelar en nitrógeno líquido.
Dejar otros 4 pocillos sin inocular como controles de la evolución del
cultivo (CN) y cuatro pocillos inoculados con CP para comprobar que
realmente ha funcionado la técnica y poder comparar las muestras
problemas.
3.
Añadir 20 µl/pocillo de una dilución final 1/100 de eritrocitos porcinos
en PBS 1x estéril.
4.
Las placas se incuban a 37±2ºC en atmósfera de CO2 (±0.5%) hasta un
máximo de 1 semana leyéndolas diariamente para comprobar la
aparición del ECP y/o de la HAD.
CULTIVO DE LOS MAP
7
1.
Descongelar un criotubo de MAP (10 cells/ml) de los MAP a 37±2ºC en
baño de agua.
2.
Se pasan a un tubo cónico estéril de 12ml y se centrifugan en
centrífuga de mesa [Megafuge 1.0R rotor Heraeus #7570mesa] 1.050g (2.000 r.p.m)
durante 10 minutos.
3.
Lavar el precipitado celular con 5 ml de PBS 1x estéril centrifugando en
centrífuga de mesa [Megafuge 1.0R rotor Heraeus #7570mesa] 1.050g (2.000 r.p.m)
durante 10 minutos.
4.
Resuspender el precipitado celular en 10 ml de medio de cultivo de
6
macrófagos teniendo una concentración final de 5x10 células/ml que
se distribuyen a una placa de 96 pocillos, 100 µl por pocillo (400.000
5.4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
NOTE: Al momento de la lectura de resultados, cada pocillo es analizado de
forma individual comparando los resultados con los controles. Siempre se debe
incluir en cada ensayo CN y CP.
Los pocillos inoculados serán observados diariamente para comprobar la
aparición de la HAD o del ECP. Paralelamente son observados los pocillos
controles para comprobar el desarrollo y vitalidad de los cultivos
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comparativamente con las muestras. La primera lectura se puede realizar a las
14-16 horas post-inoculación. Las siguientes cada 24 horas.
Para la observación al microscopio de
la reacción de HAD en los pocillos es
necesario remover los eritrocitos
sedimentados mediante agitación
suave de la placa. Con la agitación los
eritrocitos no adsorbidos se separan y
deslizan sobre los leucocitos y
solamente los adsorbidos quedan
fijados a los leucocitos infectados, en
caso positivo, formando una corona
de una o varias capas de hematíes
alrededor de la célula.
Para saber si el posible ECP sin HAD es producido por el VPPA y poder
diferenciarlo de los demás se recurre al examen del sedimento celular por la
técnica de PCR o de la IFD. Cuando el resultado es negativo a partir del líquido
sobrenadante de los pocillos inoculados que muestran ECP de los cultivos se
subinoculan nuevos cultivos de MAP (2º pase). El enriquecimiento del virus
permite ver la HAD. Cuando en este segundo pase los cultivos experimentan
también ECP sin HAD se repite el tercer pase por leucocitos. Entonces puede
aparecer la HAD o continuar el efecto citopático sin HAD en pases sucesivos, en
el caso de cepas no hemoadsorbentes.
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Para mayor seguridad, en todas las muestras negativas en el primer pase, se
realiza de forma sistemática la sub-inoculación en cultivos de MAP, antes de
formular el dictamen negativo.
5.4. PUNTOS CRÍTICOS
La técnica del aislamiento viral del VPPA presenta unos resultados de especificidad
y sensibilidad totalmente adecuados para el diagnóstico virológico de la PPA. Sin
embargo hay que tener en cuenta a la hora de la realización de la técnica una serie
de puntos críticos que afectan o pueden afectar al resultado obtenido. Estos puntos
críticos son;
1.
El periodo de lectura se extenderá hasta la aparición de la HAD o del efecto ECP
sin HAD. Si no se observan cambios en los cultivos, el período de observación
será de 7 días. La imagen de la HAD se presenta en forma de una mórula o
corona (roseta) de eritrocitos alrededor de los leucocitos infectados.
Cuando está presente la HAD, el diagnóstico es positivo de PPA. La observación
del ECP sin HAD puede ser debido a un virus de PPA no hemoadsorbente, a
otros virus diferentes de PPA o a la toxicidad del inóculo (efecto citotóxico).
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2.
3.
La realización de la técnica es muy laboriosa y lenta y requiere entre 5 y
10 días para dar un diagnóstico de la enfermedad siempre que se observe
HAD en un primer pase. En caso contrario el diagnóstico puede tardar en
darse entre 15-30 días desde que se reciben las muestras. Por este motivo
no se utiliza cómo técnica de elección para un diagnóstico virológico
rutinario sino cómo técnica de confirmación de aquellos resultados que
han dado positivos mediante la técnica de PCR.
La observación del ECP sin HAD puede ser debido a otros virus diferentes
de PPA o a la toxicidad del inóculo (efecto citotóxico). Esto dificulta el
diagnóstico especialmente cuando se trata de cepas no hemoadsorbentes
del VPPA y requiere una posterior confirmación mediante la técnica de
PCR.
Estudios previos han demostrado que muestras en estado de
putrefacción son inadecuadas para aislar el virus. Las muestras deben
mantenerse tan frías como sea posible sin congelarlas pero manteniendo
la cadena de frío. En países donde es difícil mantener la cadena de frío y se
procede al envío de las mismas en solución salina con glicerol se ha
detectado una menor probabilidad de aislar el virus. Asimismo, se ha visto
que el análisis de muestras liofilizadas influye de forma negativa en el
aislamiento viral.
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4.
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La realización de la técnica requiere de un animalario para la obtención de
sangre periférica de cerdo donante y de laboratorios equipados para
análisis virológicos y cultivos celulares con unos requisitos mínimos de
bioseguridad.
5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD.
•
•
•
•
•
•
•
Leer atentamente el protocolo.
Resulta esencial realizar los procedimientos de forma que se evite la
contaminación de los cultivos celulares.
Conservar los reactivos a la temperatura indicada antes de su utilización y
en condiciones de esterilidad.
No comer beber ni fumar mientras se manipulen los reactivos y/o las
muestras.
No pipetear los reactivos con la boca.
Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra a testar.
Incluir sistemáticamente un CP y CN.
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Plantilla de Resultados CISA/PPA/AISLAMIENTO/2
REGISTRO ENTRADA CISA:
CÉLULAS:
FECHA CULTIVO CELULAR:
FECHA INOCULACIÓN MUESTRAS:
TÉCNICO:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
PC
B
PC
C
PC
D
PC
E
NC
F
NC
G
NC
H
NC
OBSERVACIONES: