Download Detección del genoma del VPPA mediante PCR en tiempo real

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PPA MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL EMPLEANDO UNIVERSAL PROBE LIBRARY (UPL)
PNT/CISA/PPA/PCR/3
2014
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CONTENIDO
CENTRO DE INVESTIGACION EN
SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA)
Laboratorio de Referencia de la UE de PPA (EURL-ASF)
Centro de Investigación en Sanidad Animal
CISA-INIA, Valdeolmos 28130, Madrid, Spain.
1. OBJETO.
2. ALCANCE.
3. REFERENCIAS.
3.1.
DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
3.2.
DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
Contacto
Dr. Carmina Gallardo
Virginia Pelayo
E-mail: [email protected]
4. GENERALIDADES.
5. REALIZACIÓN.
PNT/CISA/PPA/PCR/3/
PROCEDIMENTO NORMALIZADO DE TRABAJO (PNT): DETECCIÓN
DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA
MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN
TIEMPO REAL EMPLEANDO UNIVERSAL PROBE LIBRARY (UPL)
5.1.
MATERIALES Y REACTIVOS.
5.2.
MÉTODOS.
5.3.
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
5.4.
PUNTOS CRÍTICOS
5.5.
MEDIDAS DE SEGURIDAD.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PPA MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL EMPLEANDO UNIVERSAL PROBE LIBRARY (UPL)
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1. OBJETO.
El objeto del presente procedimiento es describir el método a seguir para la detección
específica de ADN del virus de la peste porcina africana (VPPA) en material clínico
mediante una nueva técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real
que emplea una sonda de la Universal Probe Library (UPL, Roche Applied Science) (UPLPCR).
Este método ha sido validado por el Laboratorio Europeo de Referencia (EURL) y está descrito en
Fernández-Pinero, J.; Gallardo, C.; Elizalde, M.; Robles, A.; Gómez, C.; Bishop, R.; Heath, L.; CouacyHymann, E.; Fasina, F.O.; Pelayo, V.; Soler, A.; Arias, M. (2013). Molecular diagnosis of African swine
fever (ASF) by a new real-time PCR using Universal Probe Library (UPL). Transbound Emerg. Dis., 60:
48-58.
PPA REVISIONES:
1.
2.
3.
Arias, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J., Karriker,
L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevenson, G.W. (Eds), Diseases of swine, 10th Edition. John
Wiley and Sons, United States of America, pp. 396-404.
Arias, M.; Sánchez, C.; González, M.A.; Carrasco, L. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2002). “Peste
porcina Africana” In “Curso digital de enfermedades infecciosas porcinas”. On line, July,
2002. [http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/7/7-ppa.htm]
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). RECOGNIZING AFRICAN
SWINE FEVER. A FIELD MANUAL. 2000 Edition.
[ http://www.fao.org/docrep/004/X8060E/X8060E00.HTM]
4.
Oura CA, Edwards L, Batten CA. “Virological diagnosis of African swine feverComparative study of available tests”. Virus Res. 2012 Nov 3. doi:pii: S01681702(12)00411-X. 10.1016/j.viruses.2012.10.022. [Epub ahead of print]
3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
2. ALCANCE.

Este procedimiento es de aplicación al ácido nucleico extraído siguiendo el procedimiento
descrito en el PNT/CISA/PPA/EXTRACCIÓN ADN/1 -“Extracción del ADN del virus de la
peste porcina africana para su detección mediante reacción en cadena de la polimerasa PCR-“- en los siguientes tipos de muestra de origen porcino: suero, sangre (con EDTA),
homogeneizados de tejidos, en sobrenadantes de cultivo celular y en homogeneizados de
garrapatas del género Ornithodoros.

4. GENERALIDADES.
3. REFERENCIAS.
4.1. ABREVIATURAS.
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
1.
Fernández-Pinero, J.; Gallardo, C.; Elizalde, M.; Robles, A.; Gómez, C.; Bishop, R.; Heath, L.;
Couacy-Hymann, E.; Fasina, F.O.; Pelayo, V.; Soler, A.; Arias, M. (2013). Molecular diagnosis
of African swine fever (ASF) by a new real-time PCR using Universal Probe Library (UPL).
Transbound Emerg. Dis., 60: 48-58.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA PESTE PORCINA AFRICANA
(PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1).
EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA PARA SU
DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
(PNT/CISA/PPA/DNA EXTRACCIÓN/1)
ADN: ácido desoxirribonucleico.
E+: Control positivo de extracción.
E-: Control negativo de extracción.
R+: Control positivo de reacción.
R-: Control negativo de reacción.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.
PPA: Peste porcina africana.
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UPL: Universal probe library
UPL-PCR: PCR en tiempo real que emplea una sonda UPL
VPPA: Virus de la peste porcina africana.
4.2. PRINCIPIO.
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la detección
específica del ADN del VPPA mediante la amplificación enzimática de un pequeño
fragmento del genoma viral delimitado por una pareja de primers o cebadores
específicos. Requiere de la extracción previa del ADN del VPPA desde el material de
origen a analizar, que será el molde de la reacción enzimática. En la técnica de PCR en
tiempo real, la aparición de producto amplificado es continuamente monitorizada en
equipos especiales gracias a la incorporación en la mezcla de reacción de fluoróforos
que emitirán fluorescencia de manera proporcional a la acumulación del amplicón.
Determinando la intensidad de la fluorescencia en cada ciclo de amplificación, se
obtendrá una curva sigmoidal que representa la aparición de producto amplificado a lo
largo de la PCR.
Mediante la técnica de PCR se pueden analizar distintos tipos de muestras, como
sobrenadantes de cultivo celular, sangre recogida en EDTA, suero y homogeneizados de
garrapatas y tejidos porcinos. Es particularmente útil para la detección del ADN del
VPPA en muestras de tejido porcino en mal estado de conservación que no son
adecuadas para técnicas de aislamiento viral o detección de antígeno, o cuando el virus
ha podido ser inactivado antes de la llegada de las muestras al laboratorio.
La Universal Probe Library (UPL, Roche Applied Science) es una colección de 165
sondas fluorogénicas de hidrólisis pre-sintetizadas y pre-validadas para su empleo en
ensayos de PCR en tiempo real. Están formadas por una secuencia de entre 8-9
nucleótidos modificados tipo locked nucleic acid (LNA), y están marcadas con el
fluoróforo emisor FAM en su extremo 5’ y una molécula quencher especial en el
extremo 3’. Originalmente se diseñaron para análisis de expresión génica y se ofrecen
como un sistema de detección universal. En este caso, la especificidad de la PCR se
mantiene gracias a la estricta selección de una pareja de primers específicos de la
región diana a amplificar que son combinados con la sonda UPL apropiada.
El método descrito de UPL-PCR para VPPA emplea una pareja de primers específica
diseñada en una región altamente conservada del genoma viral, VP72, junto con una
sonda UPL apropiada (UPL#162, Roche Applied Science). Esta combinación asegura la
detección de un amplio rango de aislados de VPPA pertenecientes a los distintos
genotipos descritos para VPPA (19 de 22 genotipos probados hasta ahora). Los primers
amplifican un fragmento de ADN de 68 pb, entre las posiciones de nucleótidos 893 y
960 de la secuencia del gen completo VP72 de la cepa española de referencia España70
(nº de acceso a GenBank S89966). La sonda utilizada para la detección del producto
amplificado es la sonda UPL#162, situada entre las posiciones de ambos primers y
disponible comercialmente en Roche Applied Science. La sonda está marcada en su
extremo 5’ con una molécula emisora de fluorescencia (6-carboxifluoresceína, FAM) y
en el 3’ con una molécula apantalladora de fluorescencia especial (dark quencher dye).
La PCR es una técnica rápida, que puede completarse en pocas horas, y de elevada
sensibilidad, permitiendo detectar la presencia de virus incluso antes de la aparición de
los primeros signos clínicos en los animales infectados. La técnica UPL-PCR descrita a
continuación es altamente sensible, siendo su límite de detección inferior a 20 copias de
ADN. Es la técnica de elección en casos hiperagudos, agudos y subagudos de la PPA.
Los cerdos recuperados de infecciones agudas o crónicas, generalmente exhiben una
viremia durante varias semanas, haciendo de la PCR también una herramienta muy útil
para la detección del VPPA en cerdos infectados con cepas de virulencia baja o
moderada.
5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
MATERIALES




Congelador de <-10ºC.
Congelador ≤ -70ºC.
Gradillas (racks) refrigerantes para tubos de mini centrífuga de 1,5 y tubos de
reacciones de PCR 0,2 ml de 96 pocillos.
Guantes de látex o de nitrilo.
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











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Micropipetas automáticas monocanal de 1-10 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 2-20 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 20-200 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 100-1000 µl.
Minicentrífuga de tubos de PCR.
Nevera de 4±3ºC.
Sistema de detección PCR a tiempo real con un bloque termociclador para 96
reacciones (96 well format thermocycler reaction block), incluyendo software
MxPro-Mx3005P v.4.10 o de características similares.
Puntas de micropipeta de rangos 1-200 y 200-1000 µl, estériles.
Puntas de micropipeta con filtros resistentes a aerosoles de rangos 1-10, 2-20,
20-200 y 100-1000 µl, estériles.
Tubos tipo eppendorf estériles, aptos para micro centrífuga, de volúmenes 0,2
ml, 0,5 ml, 1,5 ml y 2 ml.
Tubos tipo eppendorf ámbar estériles de 0,5 ml
Vórtex.
REACTIVOS.


LightCycler 480 Probes Master kit, disponible comercialmente en Roche
Applied Science (Ref. 04 707 494 001, 500 reacciones). Conservar a <-10ºC.
Sonda UPL#162, disponible comercialmente en Roche Applied Science (Ref.
04694490001) a una concentración de 10 pmol/µl: 5’-6FAM-GGCCAGGA-dark
quencher-3’. Conservar <-10ºC en alícuotas, en oscuridad. Fecha de caducidad: 1
año



Primers concentración 20 pmol/µl Conservar <-10ºC en alícuotas. Fecha de
caducidad: 1 año
- primer ASF-VP72-F 5’-CCCAGGRGATAAAATGACTG-3’ (sentido);
- primer ASF-VP72-R 5’-CACTRGTTCCCTCCACCGATA-3’ (antisentido).
H2O estéril libre de nucleasas, grado PCR.
Controles de referencia: los siguientes controles deben incluirse en cada
proceso de amplificación.
o
E+: Control positivo de extracción obtenido durante el proceso de
extracción del ADN del VPPA. Conservar a <-10ºC. Fecha de
caducidad: 6 meses.
E-: Control negativo de extracción obtenido durante el proceso de
extracción del ADN del VPPA.
R+: Control positivo de reacción. ADN obtenido de muestra positiva
de PPA. Se recomienda preparar un control positivo en el límite de
detección de la técnica Conservar a <-10ºC. Conservar a <-10ºC.
Fecha de caducidad: 6 meses.
R-: Control negativo de reacción: agua destilada incluida en el paso de
la amplificación para descartar contaminaciones.
o
o
o
5.2. MÉTODOS.
Aspectos generales:




El ensayo amplifica un fragmento de ADN de 68 pb dentro de la región VP72
del genoma de VPPA.
La PCR se realiza en un volumen final de 20 µl.
La sonda UPL debe mantenerse siempre protegida de la luz.
Tras la preparación de la mezcla de reacción, se añadirán 2 µl de ADN extraído
a cada tubo de reacción.
Preparación de la mezcla de reacción:
En un tubo de micro-centrífuga de 1,5 ml estéril, se preparará la mezcla de PCR, según
se describe a continuación, para el número total de muestras a analizar (incluyendo los
controles positivos y negativos de extracción y reacción) más, al menos, una muestra
adicional (para compensar posibles errores de pipeteo).
1
2
3
4
5
REACTIVOS DE LA MEZCLA
DE REACCIÓN
H2O
Master mix 2X
Primer ASF-VP72-F 20 M
Primer ASF-VP72-R 20 M
Sonda UPL#162 10 M
Volumen master mix
1x VOLUMEN
(reacción 20l)
7 l
10 l
0,4l
0,4l
0,2l
18 l
CONCENTRACIÓN
FINAL
1X
0,4 M
0,4 M
0,1 M
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Añadir 18 µl de la mezcla de la reacción de PCR a cada tubo de PCR de calidad
óptica de 0,2 ml.
Añadir 2µl del ADN extraído a cada tubo de PCR de 0,2 ml.
Incluir los controles de reacción R+ y R-.
Después de añadir la muestra, cerrar bien los tubos y dar un golpe de centrífuga para
bajar la mezcla de PCR. Colocar los tubos en un termociclador automatizado de tiempo
real y correr el programa de incubación detallado a continuación.
Las muestras que reporten un valor de Ct>38 pueden considerarse negativas si la curva
de amplificación presenta forma lineal. En este caso, la señal de fluorescencia que se
observa puede deberse a una lectura de fluorescencia inespecífica o a la posible
degradación espontánea de la sonda al final de la reacción.
El procedimiento se considerará válido si los controles positivos de extracción y
reacción muestran unos valores de Ct de 32±4, y los controles negativos de extracción
y reacción no dan valor de Ct (≥40).
CICLO DE PCR.
DESCRIPCIÓN
Activación de la polimerasa
Desnaturalización ADN
Anillamiento/elongación
Temperatura Tiempo
95ºC
95ºC
60ºC
5 min
10 sec
30 sec
Nº ciclos
1x
45 x
Programar la lectura de fluorescencia en el canal FAM al final de cada ciclo.
5.3. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
El punto en el cual la fluorescencia pasa de niveles no significativos (indistinguibles del
fondo) a niveles claramente detectables, se denomina ciclo umbral (Ct: cycle
threshold), y éste será el valor umbral de intensidad de fluorescencia a partir del cual
una muestra será considerada positiva. El ciclo umbral es inversamente proporcional a
la cantidad de ADN molde presente en la mezcla de reacción al inicio de la misma, es
decir, en la muestra analizada. El valor de Ct es determinado automáticamente por el
software del termociclador empleado.
En una muestra positiva se obtendrá una curva sigmoidal representando el nº de ciclos
frente al valor de fluorescencia emitido, donde el valor de Ct será menor de 40. Una
muestra negativa mantendrá su perfil de fluorescencia por debajo del valor umbral y el
equipo no reportará ningún valor de Ct (ver figura).
Las muestras que reporten un valor de Ct>38 deben considerarse dudosas si se
observa una curva sigmoidal, debiendo repetirse el análisis para confirmar el resultado.
5.4. PUNTOS CRÍTICOS
Siendo una de las ventajas de la técnica de PCR su elevada sensibilidad, el punto crítico
durante todo el proceso de análisis es el riesgo de contaminación de las muestras y, por
tanto, los posibles falsos positivos que en este caso se obtendrían. La contaminación
puede deberse al propio VPPA presente en las muestras que puedan ser positivas o en los
controles positivos empleados en el proceso de extracción, o al ADN del VPPA resultante
de la amplificación y manipulado durante el análisis de los amplicones de una PCR anterior
mediante la electroforesis en gel de agarosa. Por ello, es imprescindible seguir y cumplir
unas estrictas normas de trabajo para minimizar el riesgo de contaminación intrínseco a la
técnica de PCR:
 Todos los pasos que implican el análisis de muestras por PCR se realizarán en
espacios diferenciados, con equipamiento y material específicos para cada uno:
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preparación de muestras, extracción de ADN, montaje de mezcla de PCR, análisis
por electroforesis de los productos de PCR.
Trabajar siempre con guantes de látex o nitrilo limpios en el laboratorio de PCR.
Cada vez que el técnico que esté realizando el análisis acceda a una zona de PCR
diferente, deberá cambiarse los guantes desechando los que tenía puestos.
El material será de uso exclusivo para el paso del procedimiento para el que esté
destinado por su situación/identificación.
Utilizar una punta de pipeta diferente cada vez que se pipetee en un tubo
conteniendo alguna muestra o ADN.
5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD.









Leer y seguir cuidadosamente el protocolo.
Conservar los reactivos a la temperatura indicada antes de su utilización.
No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes kits.
Evitar cualquier contaminación de los reactivos.
No utilizar los reactivos una vez superada la fecha de caducidad.
No comer, beber ni fumar en el laboratorio.
No pipetear los reactivos con la boca.
Utilizar siempre guantes de látex o nitrilo.
Las sondas utilizadas para la detección del producto amplificado son altamente
sensibles a la luz, por lo que deben manipularse únicamente en el momento de uso y
mantenerse siempre protegidas de la luz (utilizar tubos color ámbar para conservar el
stock de sondas y preparar la mezcla de reacción).
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Plantilla de resultados CISA/PPA/PCR/3
REGISTRO DE ENTRADA CISA:
FECHA DE ANÁLISIS:
TIPO DE MUESTRAS:
TÉCNICO(S) EXTRACCIÓN:
LOTE KIT EXTRACCIÓN:
LOTE + E:
TÉCNICO(S) PCR:
LOTE R+:
PROGRAMA REALIZADO:
ORDEN
PIPETEO
1
2
3
4
5
6
REACTIVOS PCR MIX
1x
VOLUMEN
(reacción 20 µl)
Nx
CONCENTRACIÓN
FINAL
H2O
7 µl
Master mix 2x
10 µl
1x
Primer ASF-VP72-F 20 µM
0,4 µl
0,4 µM
Primer ASF-VP72-R 20 µM
0,4 µl
0,4 µM
Sonda UPL#162 10 µM
0,2 µl
0,1 µM
Volumen PCR mix
18 µl
Adición de 2 µl de ADN molde (muestras y controles de reacción)
IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS EN TUBOS/PLACA
OBSERVACIONES: