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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PESTE PORCINA AFRICANA
PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1/
REV. 2013
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CENTRO DE INVESTIGACION EN
SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA)
Laboratorio de Referencia de la UE de PPA (EURL-ASF)
Centro de Investigación en Sanidad Animal
CISA-INIA, Valdeolmos 28130, Madrid, Spain.
Contacto
Dr. Carmina Gallardo
Virginia Pelayo
E-mail: [email protected]
CONTENIDO
1. OBJETO.
2. ALCANCE.
3. REFERENCIAS.
3.1.
DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
3.2.
DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
4. GENERALIDADES.
5. REALIZACIÓN.
PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1
PROCEDIMENTO NORMALIZADO DE TRABAJO (PNT):
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE
LA PESTE PORCINA AFRICANA.
5.1.
MATERIALES Y REACTIVOS.
5.2.
MÉTODOS
5.3.
MEDIDAS DE SEGURIDAD.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PESTE PORCINA AFRICANA
PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1/
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1.OBJETO
El objeto del presente procedimiento es describir el método a seguir para preparar
las muestras sobre las que se van a realizar ensayos para el diagnóstico de la peste
porcina africana, tanto serológico como virológico.
NOTA: Cada muestra debe haber sido previamente registrada, por lo que estará
identificada con un número de registro de entrada y un número de identificación
de la muestra (ID muestra) en caso de que haya ingresado más de una muestra del
mismo remitente.
PPA REVISIONES:
1.
2.
3.
[http://www.fao.org/docrep/004/X8060E/X8060E00.HTM]
3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE
2. ALCANCE
•
Este procedimiento es de aplicación a los siguientes tipos de muestra de origen
porcino:
•
•
•
Muestras para diagnóstico serológico: sangre sin anticoagulante o suero.
Muestras para diagnóstico virológico: sangre recogida con EDTA, suero,
homogeneizados de tejidos y garrapatas.
•
•
•
3. REFERENCIAS
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
1.
2.
AFRICAN SWINE FEVER. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals (mammals, birds and bees). CHAPTER 2.8.1. OIE, 2012
[http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.08.01_ASF.pdf]
COLLECTION AND SHIPMENT OF DIAGNOSTIC SPECIMENS. Manual of Diagnostic
Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). CHAPTER 1.1.1.
OIE, 2008 http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.01_COLLECTION.pdf
Arias, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J.,
Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevenson, G.W. (Eds), Diseases of swine,
10th Edition. John Wiley and Sons, United States of America, pp. 396-404.
Arias, M.; Sánchez, C.; González, M.A.; Carrasco, L. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2002).
“Peste porcina Africana” In “Curso digital de enfermedades infecciosas porcinas”.
[http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/7/7-ppa.htm] on line, July, 2002.
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). RECOGNIZING
AFRICAN SWINE FEVER. A FIELD MANUAL. 2000 Edition.
•
•
•
EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA PARA SU
DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
(PNT/CISA/PPA/DNA EXTRACCIÓN/1)
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) CONVENCIONAL
(PNT/CISA/PPA/PCR/1)
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
(PNT/CISA/PPA/PCR/2)
AISLAMIENTO VIRAL DEL VPPA EN CULTIVOS PRIMARIOS DE LEUCOCITOS
PORCINOS E IDENTIFICACIÓN MEDIANTE LA HAD (PNT/CISA/PPA/VI/1)
AISLAMIENTO VIRAL DEL VPPA EN MACRÓFAGOS ALVEOLARES PORCINOS E
IDENTIFICACIÓN MEDIANTE LA HAD (PNT/CISA/PPA/VI/2)
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS FRENTE AL VIRUS DE LA PESTE
PORCINA AFRICANA MEDIANTE ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA) INDIRECTO
(PNT/CISA/PPA/ELISA/1)
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS FRENTE AL VIRUS DE LA PESTE
PORCINA AFRICANA MEDIANTE INMUNOTRANSFERENCIA (IMMUNOBLOTTING)
(PNT/CISA/PPA/IB/1)
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS FRENTE AL VIRUS DE LA PESTE
PORCINA AFRICANA MEDIANTE INMUNOPEROXIDASA INDIRECTA (IPT)
(PNT/CISA/PPA/IPT/1)
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4. GENERALIDADES.
4.1. ABREVIATURAS.
PPA: Peste porcina africana.
r.p.m.: Revoluciones por minuto.
VPPA: Virus de la peste porcina africana.
4.2. PRINCIPIO.
El punto de partida para la investigación de una enfermedad animal en el
laboratorio es la toma de muestras teniendo en cuenta si van a ser utilizadas para
el diagnóstico, la vigilancia o el certificado sanitario.
Los laboratorios de diagnóstico de PPA requieren la entrega de muestras
adecuadas que lleguen al laboratorio en buenas condiciones. No es posible hacer
un buen diagnóstico si la muestra no está en las condiciones adecuadas.
Las muestras diana para el diagnóstico de la PPA son:
1.
Muestras porcinas (salvaje y doméstico):
⇒ Para la detección de anticuerpos de PPA:
•
Suero: Sangre completa obtenida de la vena yugular, la vena cava
inferior, venas auriculares o durante la necropsia del animal sin
anticoagulante. Cantidad mínima recomendada: 500 µl
⇒ Para la detección del virus de la PPA:
•
•
Suero: Sangre completa obtenida de la vena yugular, la vena cava
inferior, venas auriculares o durante la necropsia del animal sin
anticoagulante. Cantidad mínima recomendada: 1 ml.
Sangre: Sangre completa obtenida de la vena yugular, la vena cava
inferior, venas auriculares o durante la necropsia del animal con
anticoagulante (EDTA). Cantidad mínima recomendada: 1 ml.
•
Órganos obtenidos durante la necropsia del animal: Bazo, pulmón,
riñón, corazón, tonsilas, linfo-nodos (mesénterico, retro-faríngeo,
renal, gastro-hepático, etc). Cantidad minima recomendada: 5gr.
2. Muestras de vectores: Las garrapatas blandas del género Ornithodoros
actúan cómo vectores de la PPA. Pueden encontrarse en las hendiduras
de las pocilgas, en madrigueras de roedores y en las madrigueras de los
jabalíes africanos. Existen diferentes técnicas para su captura cómo la
captura manual, trampas de dióxido de carbono o por aspiración.
Después de la captura las garrapatas pueden mantenerse vivas hasta su
procesamiento o conservadas en nitrógeno líquido lo que permite una
mayor supervivencia del virus evitando su inactivación. Se puede detectar
tanto el virus cómo el genoma viral.
Cómo norma general las muestras deben tomarse cuidadosamente con el fin
de evitar cualquier lesión o estrés excesivo para el animal o cualquier peligro
para el operador. Las muestras deben tomarse de forma aséptica y se debe
tener cuidado para evitar la contaminación cruzada. Deben embalarse,
etiquetarse y enviarse al laboratorio por el procedimiento más rápido posible,
controlando convenientemente la temperatura. Se deben seguir los requisitos
específicos para el embalaje y expedición de sustancias infecciosas, incluidos
los especímenes para el diagnóstico. Todas las muestras deberán
acompañarse de una carta o formulario de envío en el que se indique el
nombre y la dirección del remitente, el origen del material, el historial
pertinente, la identificación del animal y espécimen correspondiente y las
pruebas solicitadas.
Para más información acerca del procedimiento de envío de muestras al CISAINIA [http://asf-referencelab.info/asf/files/envio-muestras/ASF_URL_PRODUCT_PRICE_LIST_CISA_INIA.pdf].
5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
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MATERIALES.
• Balanza analítica.
• Centrífuga de mesa Megafuge 1.0R [rotor Heraeus #7570 o de similares características].
• Congelador <-10ºC.
• Congelador <-70ºC.
• Eppendorff tubos de 1,5 ml.
• Filtros MINISART [Ref.: 16555K (Sartorius) o de similares características] de 0,45 microns.
• Guantes de látex o de nitrilo.
• Homogeneizador de tejidos (mecánico o manual).
• Incubador 37±2ºC.
• Microcentrífuga [eppendorf o de similares características].
• Micropipetas automáticas monocanal de 1-10 µl.
• Micropipetas automáticas monocanal de 10-100 µl.
• Micropipetas automáticas monocanal de 10-200 µl.
• Micropipetas automáticas monocanal de 200-1000 µl.
• Nevera de 4±3ºC.
• Papel absorbente.
• Papel de aluminio.
• pHmetro (0,01 UpH).
• Pipeteador automático Pipetboy acu o equivalente.
• Pipetas de vidrio o plástico, estériles, para descargar 1-25 ml.
• Puntas de pipeta desechables.
• Reloj cronómetro.
• Tubos eppendorf (o equivalentes) de 0,5 ml, 1,5 ml y 2 ml.
• Tubos de plástico estériles de 10 ml y 50 ml.
REACTIVOS.
• Sulfato de gentamicina (50mg/ml) 1%
características]. Conservar
4±3ºC.
•
Tampón fosfato salino (PBS 1x) pH 7,2 (±0,2 UpH)→ El PBS puede adquirirse
en tabletas [Ref.: 524650-1 (CALBIOCHEM) o de similares características] o puede prepararse
de la siguiente manera:
ClNa [Ref. 1.06404.1000 (MERCK) o de similares características]
ClK [Ref. 1.04936.0500 (MERCK) o de similares características]
P04H2K [Ref. 1.04873.1000 (MERCK) o de similares características]
P04HNa2 [Ref. 1.06586.0500 (MERCK) o de similares características]
Agua destilada
Conservar a Tª ambiente. Fecha de caducidad 1 año.
8,0 gr (±0,1)
0,2 gr (±0,01)
0,2 gr (±0,01)
1,15 gr (±0,05)
1.000 ml
5.2. MÉTODOS.
5.2.1
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LAS TÉCNICAS DE
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS.
Antes de proceder a realizar los ensayos descritos en los procedimientos
PNT/CISA/PPA/ELISA/1, PNT/CISA/PPA/ELISA/2, PNT/CISA/PPA/IB/1, PNT/CISA/PPA/IPT/1 y cualquier otro ensayo
para la detección de anticuerpos contra el VPPA, las muestras se prepararán de
acuerdo a los siguientes pasos:
a.
b.
c.
Si la muestra está sin procesar (sangre sin anticoagulante), incubarla primero
1 hora a 37±2ºC y después dejarla toda la noche a 4±3ºC para permitir la
separación del coágulo sanguíneo.
Retirar el coágulo y centrifugar en centrífuga de mesa a 780g (≈1.500 r.p.m.)
durante 10 minutos.
Pasar el sobrenadante (suero) a un tubo cónico de 1.5 ml tipo eppendorf y
rotular el tubo con el número de registro de entrada y el código ID de la
muestra correspondiente. Si no se utiliza inmediatamente conservar a <-70ºC.
[Ref.: 17-518Z (BioWhittaker) o de similares
5.2.2
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LAS TÉCNICAS DE
DETECCIÓN DE VIRUS.
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PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PESTE PORCINA AFRICANA
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Antes de proceder a realizar los ensayos descritos en los procedimientos,
[PNT/CISA/PPA/DNA EXTRACCIÓN/1, PNT/CISA/PPA /VI/1, PNT/CISA/PPA /VI/2] y cualquier otro ensayo para la
detección del virus o del genoma del VPPA, las muestras se prepararán de acuerdo a
los siguientes pasos:
Muestras de suero (sangre completa sin anticoagulante):
a. Si la muestra está sin procesar (sangre sin anticoagulante), incubarla primero
1 hora a 37±2ºC y después dejarla toda la noche a 4±3ºC para permitir la
separación del coágulo sanguíneo.
b. Retirar el coágulo y centrifugar en centrífuga de mesa a 780g (≈1.500 r.p.m.)
durante 10 minutos.
c. Pasar el sobrenadante (suero) a un tubo cónico de 1,5 ml tipo eppendorf y
rotular el tubo con el número de registro de entrada y el código ID de la
muestra correspondiente. Si no se utiliza inmediatamente conservar a <70ºC.
Muestras de tejidos:
a. Preparar una suspensión al 10% de macerado de órgano problema en PBS 1x
estéril pH 7,2 (aproximadamente 1 g de órgano en 10 ml de PBS 1x estéril).
b. Centrifugar la suspensión en centrífuga de mesa a 1.050g (≈2.000 r.p.m.)
durante 10 minutos.
c. Recoger el sobrenadante y filtrar en filtros MINISART de 0,45 micras.
d. Tratar el sobrenadante filtrado con antibióticos (sulfato de gentamicina al
1%). Dejar durante 1 hora a 4±3ºC para que actúen los antibióticos.
e. Alicuotar la muestra filtrada y tratada con antibióticos en tubos cónicos de
1,5 ml tipo eppendorf y rotular el tubo con el número de registro de entrada
y el código ID de la muestra correspondiente. Si no se utiliza inmediatamente
conservar a <-70ºC.
Muestras de garrapatas:
a. Preparar una suspensión de la garrapata en 1,5 ml de PBS 1x estéril pH 7,2
suplementado con 0,1 % de antibióticos.
b. Centrifugar la suspensión en microcentrífuga a 5.000g (≈14.000 r.p.m.)
durante 5 minutos.
c.
Alicuotar la muestra filtrada y tratada con antibióticos en tubos cónicos de 1,5
ml tipo eppendorf y rotular el tubo con el número de registro de entrada y el
código ID de la muestra correspondiente. Si no se utiliza inmediatamente
conservar a <-70ºC.
5.3. MEDIDAS DE SEGURIDAD.
•
•
•
•
•
•
•
•
Leer atentamente el protocolo.
Conservar los reactivos a la temperatura indicada antes de su utilización.
Evitar cualquier contaminación de los reactivos.
No utilizar los reactivos una vez superada la fecha de caducidad.
No comer beber ni fumar mientras se manipulen los reactivos y/o las
muestras.
No pipetear los reactivos con la boca.
Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra a testar.
Etiquetar todas las muestras procesadas con el registro de entrada y el
código de identificación para su correcta trazabilidad.