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CAPÍTULO 2.1.13.
PESTE PORCINA CLÁSICA (CÓLERA DEL CERDO)
RESUMEN
La peste porcina clásica (PPC), también denominada cólera del cerdo, es una enfermedad vírica
contagiosa de los cerdos. El agente causal es un miembro del género Pestivirus de la familia
Flaviviridae, estrechamente relacionado con los virus de la diarrea bovina fetal y de la enfermedad
de la frontera. Solo existe un serotipo de virus de la PPC (CSFV).
La enfermedad puede tener un desarrollo agudo, subagudo, crónico, de aparición tardía o
inaparente, dependiendo de varios factores víricos y del hospedador, siendo los más importantes
la edad de los animales, la virulencia del virus y el tiempo de infección (pre- o post-natal). Los
cerdos adultos suelen mostrar menos síntomas graves de la enfermedad que los jóvenes y tienen
mayor probabilidad de supervivencia. En cerdas gestantes, el virus puede atravesar la barrera
placentaria e infectar los fetos. La infección intrauterina con cepas del virus de baja o moderada
virulencia origina lo que se conoce como el síndrome de la "cerda portadora", que se caracteriza
por la muerte prenatal o perinatal, el nacimiento de lechones enfermos o una camada
aparentemente "sana" pero infectada. Un brote de PPC tiene graves consecuencias económicas
para el mercado de los cerdos y de productos derivados.
La elevada variabilidad clínica de la PPC dificulta a menudo el diagnóstico realizado sobre bases
clínicas y patológicas. Los métodos de laboratorio son por tanto esenciales para un diagnóstico
inequívoco. La detección del virus en la sangre y de anticuerpos en el suero son los mejores
métodos para diagnosticar PPC en cerdos vivos, mientras la detección del virus o de antígeno en
muestras de órganos resulta más adecuada en cerdos muertos.
Identificación del agente: Para la detección del antígeno de la PPC se utiliza la
inmunofluorescencia directa (FAT) en cortes de órganos de cerdos afectados. Para determinar si la
fluorescencia se debe a antígenos de PPC o de Pestivirus que no producen PPC se emplean
varios anticuerpos monoclonales. El aislamiento del CSFV se debe intentar en la línea celular de
riñón de cerdo (PK-15) o en otra línea celular adecuada. Los cultivos se examinan en cuanto a
crecimiento vírico por inmunofluorescencia o tinción con inmunoperoxidasa; los aislamientos
positivos se caracterizan posteriormente por medio de MAbs y por secuenciación génica parcial.
En varios laboratorios, para la identificación del ácido nucleico del CSFV se utilizan protocolos
basados en la reacción en cadena de la polimerasa. El aislamiento y la caracterización de cepas
patógenas sospechosas deben realizarse en un laboratorio con medidas de seguridad adecuadas
para trabajar con virus.
Pruebas serológicas: La detección de anticuerpos específicos contra el virus es particularmente
útil en piaras donde se sospecha una infección por CSFV iniciada al menos 30 días antes. Los
métodos serológicos son también adecuados para el control y para estudios de prevalencia, y
resultan esenciales en el caso de que un país desee el reconocimiento internacional de estar
exento de la enfermedad en ausencia de vacunación.
Como en los cerdos de cría se observan ocasionalmente anticuerpos contra CSFV que muestran
reacción cruzada con Pestivirus de rumiantes, las pruebas de análisis deben acompañarse de
pruebas confirmativas que sean específicas para CSFV Algunas pruebas ELISA son relativamente
específicas para CSFV pero la prueba de neutralización comparativa es el método definitivo de
diferenciación, y compara el nivel de anticuerpo frente a diferentes especies de Pestivirus.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas contra la PPC
contienen un virus vivo que se ha atenuado mediante pases en cultivos celulares o a través de
hospedadores adecuados que no pertenezcan a la familia Suidae. La producción de estas vacunas
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con virus vivos modificados (MLV) se basa en un sistema de lotes de inóculos que se ha validado
respecto a identidad vírica, esterilidad, pureza, seguridad, falta de transmisión, estabilidad e
inmunogenicidad. Si se utiliza CSFV para la producción de vacunas o en estudios de infección
experimental, las instalaciones deben cumplir los requisitos de la OIE para patógenos del Grupo 4
de Contención.
No se dispone de vacunas convencionales eficaces con virus completo inactivado. Recientemente,
se han desarrollado "vacunas marcadoras" que, en contraste con las vacunas con MLV, inducen
anticuerpos que pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural utilizando una prueba
diagnóstica de acompañamiento. Las "vacunas marcadoras" registradas en la actualidad se basan
en la principal glicoproteína de la envoltura vírica del CSFV (subunidad E2), y se producen en
insectos mediante la tecnología de ADN recombinante.
A. INTRODUCCIÓN
Los virus que causan la peste porcina clásica (PPC), la diarrea vírica bovina (DVB) y la enfermedad de la frontera
(EF) son miembros de la familia Flaviviridae, del género Pestivirus, y están estrechamente relacionados entre sí
tanto antigénica como estructuralmente. Los síntomas clínicos y las lesiones observadas post-mortem en los
cerdos afectados por PPC son muy variables debido a factores del virus y de los hospedadores. Además, las
infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden dar lugar en cerdos a una enfermedad clínica que es
indistinguible de la PPC (22, 24, 25).
Los síntomas más destacados de la enfermedad son su aparición en todos los grupos de edad, acompañada por
pirexia, agrupamiento de animales, inapetencia, torpeza, debilidad, conjuntivitis, estreñimiento seguido de diarrea
y una forma de andar vacilante. Varios días después de la aparición de los síntomas clínicos, las orejas, el
abdomen y la parte interna de los muslos pueden mostrar una decoloración morada. Los animales con
enfermedad aguda mueren en 1-2 semanas. La muerte súbita en ausencia de enfermedad clínica no es
sintomática de la PPC.
En algunas circunstancias relacionadas con la edad del animal y su condición, así como con la cepa de virus
implicado, puede aparecer la enfermedad en forma subaguda o crónica y durar 2-4 semanas o incluso meses. La
enfermedad crónica acarrea una disminución del crecimiento, anorexia, pirexia intermitente y diarrea. Las
infecciones congénitas persistentes pueden pasar indetectables durante meses y limitarse solo a unos cuantos
lechones de la piara. Los síntomas clínicos son inespecíficos: debilidad en ausencia de pirexia. Las infecciones
crónicas y persistentes siempre conducen a la muerte del animal. Las tasas de mortalidad en la piara pueden
superar ligeramente el nivel esperado. La PPC afecta al sistema inmune, y una característica es una leucopenia
generalizada, que a menudo puede detectarse antes de la aparición de la fiebre. La inmunosupresión puede
acarrear infecciones concurrentes.
En casos agudos, las lesiones patológicas grandes son a menudo poco llamativas o están ausentes. En los
casos típicos, los nódulos linfáticos se inflaman y enrojecen, y se presentan hemorragias en el epicardio, en los
riñones, la vejiga urinaria, la piel y la subepidermis. En los casos subagudos y crónicos, además de las lesiones
anteriores, pueden observarse úlceras necróticas o en "botón" en la mucosa del tracto gastrointestinal, la
epiglotis y la laringe.
Los hallazgos histopatológicos no son patognomónicos. Las lesiones pueden incluir una degeneración
parenquimatosa del tejido linfático, proliferación celular del tejido vascular intersticial y una meningoencefalitis no
supurativa, con o sin desgarro vascular.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
La variabilidad de los síntomas clínicos y de las lesiones post-mortem no suministran una evidencia firme para
establecer un diagnóstico inequívoco. Otras enfermedades víricas, como la peste porcina africana, el síndrome
de debilidad multisistémica post-destete, la dermatitis porcina y el síndrome de nefropatía, así como situaciones
septicémicas de tipo salmonelosis, pasteurelosis, actinobacilosis e infecciones con Haemophilus suis, pueden
confundirse con la PPC. De hecho, estas bacterias causan frecuentes infecciones concurrentes y el aislamiento
de estos patógenos puede enmascarar al virus de la PPC (CSFV) como la causa real de la enfermedad,
Por tanto, un diagnóstico presuntivo basado en síntomas clínicos y en lesiones post-mortem debe confirmarse
con investigaciones en el laboratorio. Así las pruebas laboratoriales de diagnóstico van a ser fundamentales
considerando las graves consecuencias que puede tener un brote de PPC en el mercado porcino y de productos
derivados.
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Los métodos de laboratorio para el diagnóstico de PPC se dirigen a detectar el virus, el ácido nucleico vírico o los
antígenos víricos, o bien a la detección de anticuerpos específicos. Para una interpretación correcta de los
resultados de estas pruebas, el inspector veterinario debe prestar una atención particular a la presentación
simultánea y agrupada de dos o más de los síntomas predominantes de la enfermedad citados anteriormente.
Para el diagnóstico de la PPC no se debe realizar el muestreo al azar. Sino que como uno de los primeros
síntomas de la PPC es la pirexia y se acompaña por viremia (6), el método pertinente para detectar piaras
infectadas en una fase temprana es la toma de muestras en animales febriles para la detección de virus en
sangre con etilén-diamino tetra-acético (EDTA), o en tejidos. Adicionalmente, se pueden tomar muestras de
sangre de un grupo mayor de cerdos para detección de los virus.
La PPC está bajo control oficial y el virus tiene un elevado riesgo de dispersión desde el laboratorio: en
consecuencia, debe realizarse un análisis de riesgos para determinar el nivel necesario de seguridad para el
diagnóstico y la caracterización del virus. La instalación debe cumplir los requisitos del Grupo de Contención
apropiado según determina la estimación de riesgos resumida en el Apéndice I.1.6.1. del Capítulo I.1.6. de este
Manual. Los países sin acceso a un laboratorio regional o nacional especializado de ese tipo, deberían enviar las
muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.
Los anticuerpos aparecen en la tercera semana de la enfermedad y persisten durante toda la vida del animal
superviviente. Las muestras para detección de anticuerpo se recogen en tubos ordinarios (no heparinizados)
cuando hayan transcurrido > 30 días desde que ocurrió el contacto sospechado con un brote confirmado,
utilizando cerdos convalecientes y piaras en contacto.
1.
Identificación del agente
a)
Métodos inmunológicos
•
Prueba de inmunofluorescencia
La prueba de inmunofluorescencia (FAT) es una prueba rápida que puede utilizarse para detectar el CSFV
en cortes finos de amígdalas, bazo, riñón, nódulos linfáticos o porciones distales del íleon. Los tejidos
deben recogerse de varios animales (3) y transportarse sin conservantes en frío, pero no congelados. Los
cortes se tiñen directamente con inmunoglobulina anti-PPC conjugada con isotiocianato de fluoresceína
(FITC) o indirectamente utilizando un conjugado secundario con FITC, y se examinan en un microscopio de
fluorescencia. El tejido de las amígdalas es el más adecuado durante la primera fase de la infección, ya que
es el primero en ser afectado independientemente de la ruta de infección (18). En casos subagudos y
crónicos, el íleon es con frecuencia positivo y a veces puede ser el único tejido que muestre fluorescencia.
Un resultado negativo por FAT no elimina por completo la presencia de infección de PPC. Cuando se
mantiene la sospecha de PPC, se deben obtener más muestras o intentar el aislamiento del virus en cultivo
celular (por ejemplo, en riñón porcino [PK-15] u otra línea celular de origen porcino que sea sensible y que
se conozca que está libre de contaminación con Pestivirus).
•
Procedimiento de la prueba
En cada serie de muestras de órganos para examen deben incluirse cortes de control positivo y negativo.
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i)
Se corta un trozo de las amígdalas, bazo, riñón o íleon, de aproximadamente 1 x 1 x 0,5 cm, y se
monta con un compuesto criostático o con agua destilada en un criostato.
ii)
Se congela el trozo de órgano en el criostato.
iii)
Se cortan secciones de un grosor menor de 4 µm y se montan en cubres libres de grasa de 10 x 32
mm con una esquina cortada. Todos los cortes se montan con esta esquina en la misma posición (por
ejemplo, arriba a la derecha).
iv)
Después de secar, los cortes montados se fijan con acetona (de grado analítico) durante 10 minutos a
temperatura ambiente, o al aire durante 20 minutos a 37°C.
v)
Los cortes se sumergen brevemente en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se elimina el
exceso de líquido con papel absorbente y se colocan (con la esquina cortada arriba a la derecha) en
una cámara de incubación húmeda con un pequeño volumen de agua colocada en el fondo de la
cámara.
vi)
Se deposita la solución de trabajo de inmunoglobulina anti-PPC en los cortes y se incuban en la
cámara cerrada durante 30 minutos a 37°C. Si se requiere un segundo conjugado con FITC, se lava el
corte cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente, y luego se añade la
dilución de trabajo del conjugado con FITC, incubándose como se ha descrito antes.
vii)
Los cortes se lavan cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente.
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viii) Se elimina el exceso de PBS con papel absorbente y se monta el cubre con el tampón de montaje en
un porta para microscopio (con el corte entre el cubre y el porta).
ix)
Se elimina el exceso del líquido de montaje con papel absorbente y se examinan los cortes para
fluorescencia en un microscopio de luz UV. Un corte positivo para PPC muestra células con
fluorescencia verde brillante. En las amígadalas, la fluorescencia es particularmente evidente en la
línea epitelial de las criptas. En cortes de riñón, la fluorescencia es más abundante en los túbulos
proximales y distales del córtex renal y en los conductos colectores de la médula. En el íleon, la
fluorescencia es más destacable en las células epiteliales de las glándulas de Lieberkünhn, mientras
que en el bazo la reactividad es más difusa, con concentraciones de células linfoides en la lámina
linfoide periarterial (PALS).
La FAT requiere utilizar una inmunoglobulina anti-PPC preparada de un anticuerpo policlonal contra el
CSFV que no distingue entre los antígenos de diferentes pestivirus. Los conjugados utilizados para FAT en
cortes o en cultivos celulares inoculados deben prepararse de gama-globulinas anti-CSFV de cerdos libres
del patógeno específico. La dilución de trabajo de los conjugados (al menos 1/30) debe combinar un
máximo de brillo con un mínimo de fondo.
Las cepas de virus vacunales vivos modificados (MLV) se multiplican principalmente en los nódulos
linfoides regionales y en el epitelio de las criptas de las amígdalas. Los cerdos vacunados con cepas MLV
pueden dar la prueba FAT positiva 2 semanas después de la vacunación (15, 19). La inoculación en conejo
se utiliza para diferenciar entre cepas de CSFV adaptadas a conejo y cepas de campo. A diferencia de las
cepas de campo, las cepas adaptadas a conejo causan una reacción febril e inducen una respuesta inmune
en conejos cuando se suministran intravenosamente.CSFV adaptadas a conejo.
En la prueba FAT, los cerdos infectados con pestivirus de rumiantes pueden dar reacciones positivas falsas.
Las infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden ocasionar síntomas clínicos y lesiones
patológicas indistinguibles de las presentes en la PPC crónica (22, 24, 25). Las infecciones por CSFV o
pestivirus de rumiantes se pueden diferenciar probando sueros de la cerda y de la camada, o de otros
animales en contacto con un lechón FAT-positivo, para anticuerpos neutralizantes frente a cada virus. Otro
método de distinguir estos virus es por inoculación de lechones seronegativos con una suspensión de
material sospechoso y realizar 5 semanas después pruebas de neutralización vírica (NV) en sus sueros
para los anticuerpos respectivos. Sin embargo, las pruebas NV pueden durar varios días y los métodos de
inoculación en animales duran varias semanas.
•
Diferenciación de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la
inmunoperoxidasa
La utilización de un conjunto de tres anticuerpos monoclonales (MAbs), conjugados con peroxidasa de
rábano (HRPO) o con FITC, o usados en conjunción con un conjugado anti-ratón, que sean capaces de
detectar de modo específico todas las cepas naturales de CSFV, las cepas vacunales de CSFV y los
pestivirus de rumiantes, respectivamente, permitirían, por una parte, una diferenciación inequívoca entre las
cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV y, por otra, distinguir entre el CSFV y otros pestivirus (10,
26, 28). Un prerequisito es que el MAb contra el VPPC reconozca todas las cepas de campo y que el MAb
anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione
selectivamente con todos los pestivirus de rumiantes (10). En áreas no vacunadas, se puede omitir el MAb
para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal antiPPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como única
confirmación de que un aislamiento corresponde a PPC. Un prerrequisito es que el MAb contra el CSFV
reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales
empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de
rumiantes (10). En áreas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como
control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener
cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como única confirmación de que un aislamiento corresponde a
PPC.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Cortar ocho o más secciones (4 µm) de las amígdalas que son positivas por FAT, o de otro órgano
positivo si no se dispone de amígdalas.
ii)
Fijar los cortes con acetona (grado análitico) durante 10 minutos en cubres libres y dejar secar al aire.
iii)
Preparar diluciones de trabajo de los respectivos MAbs conjugados con peroxidasa en PBS + 0,01%
de Tween 80 + suero de caballo al 5%, pH 7,6. (también puede utilizarse MAb conjugado con FITC,
así como MAb sin conjugar siempre que se emplee un conjugado secundario).
iv)
Después de lavar con PBS, se depositan en la dilución de trabajo del conjugado monoclonal
respectivo dos cortes, y otros dos en la dilución de trabajo del conjugado policlonal (controles).
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v)
Incubar durante 1 hora a 37°C en una cámara húmeda.
vi)
Lavar seis veces los cortes en PBS, durante 10 segundos cada vez.
vii)
Teñir los cortes con solución recién preparada de cromógeno del substrato * durante 5-15 minutos a
temperatura ambiente.
viii) Lavar los cortes con acetato sódico 0,05 M, pH 5,0, en agua destilada y montarlos en portas para
microscopía.
ix)
Examinar las secciones en un microscopio de fondo claro. La tinción del citoplasma de las células del
epitelio de las criptas de las amígdalas de un color rojo oscuro indica el reconocimiento del virus
aislado por el conjugado respectivo, y se considera positivo.
x)
Interpretación de la prueba:
Anticuerpo
policlonal
Anticuerpo monoclonal específico para
Interpretación
Cepa PPC
Cepa PPC vacunal
Cepa DVB/EF
+
+
–
–
PPC cepa de campo
+
+
+
–
PPC cepa vacunal
+
–
–
+
Cepa DVB/EF
+
–
–
–
Otros Pestivirus*, no PPC
* Se debe considerar siempre la existencia de cepas nuevas de PPC y cualquier aislamiento de casos en que se
sospeche PPC debería enviarse al laboratorio de referencia de la OIE.
•
Prueba de captura de antígeno
Para un diagnóstico rápido de PPC en cerdos vivos, se han desarrollado enzimoinmunoensayos de captura
de antígeno (ELISAs) para analizar piaras que se sospechan infectadas recientemente. Las pruebas ELISA
son del tipo de doble anticuerpo en sandwich, que emplean anticuerpos monoclonales y/o policlonales
contra varias proteínas víricas en el suero, en la fracción leucocitaria de la sangre o en sangre completa
anticoagulada (puede añadirse aquí un homogenado tisular clarificado ya que es un material adecuado para
ELISA) (7). La técnica es de realización relativamente simple, no requiere servicios de cultivo de tejidos, se
puede automatizar y puede dar resultados en medio día. La desventaja de que es menos sensible que el
aislamiento del virus, sobre todo en cerdos adultos y en casos suaves o subclínicos, puede compensarse
probando todos los cerdos de la piara sospechosa con pirexia. No obstante, debe tenerse también en
cuenta la baja especificidad de estas pruebas.
b)
Aislamiento de virus
El aislamiento de virus en cultivos celulares es un método de diagnóstico de PPC más sensible, pero más
lento, que la inmunofluorescencia con cortes congelados. El aislamiento de realiza mejor en células PK-15,
que se dividen rápidamente, y que se siembran sobre cubres simultáneamente con una suspensión de las
amígadalas al 2% en medio de cultivo. Para el aislamiento del CSFV se pueden utilizar otras líneas
celulares, pero deberían ser por lo menos tan sensibles como las células PK-15. Los cultivos se examinan
para focos fluorescentes por FAT después de 24-72 horas.
Para fines diagnósticos, el órgano más adecuado para aislar el virus de cerdos muertos o sacrificados son
las amígdalas. Alternativamente, se puede utilizar el bazo, el riñón o nódulos linfáticos.
*
A.
B.
C.
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Solución de cromógeno del substrato
Solución base de cromógeno: 0,4% de 3-amino-9-etil carbazol; N, N-dimetil-formamida (1 ml). Cuidado, compuesto
TÓXICO.
Acetato sódico 0,05 M, pH 5,0; 19 ml (esterilizados por filtración con membrana).
Solución base de substrato (peróxido de hidrógeno al 30%).
Mantener las soluciones base A y C a 4°C en oscuridad y la solución B a temperatura ambiente. La solución base A
puede mantenerse a 4°C durante al menos 6 meses y la solución C por 1 año. Inmediatamente antes de uso, diluir 1 ml
de la solución A en 19 ml de la solución B. Añadir después 10 µl de la solución base C. Mezclar bien y teñir los cortes.
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Un procedimiento detallado del aislamiento de virus es el siguiente:
i)
Preparar una solución base concentrada 100 veces de glutamina-antibiótico: disolver glutamina (2,92
g) en 50 ml de agua destilada (solución A) y esterilizar por filtración. Disolver cada uno de los
siguientes antibióticos en 5-10 ml de agua destilada estéril: penicilina (106 Unidades Internacionales
[UI]; estreptomicina (1 g); mycostatín (5 x 105 U); polimixina B (15 x 104 U); y kanamicina (1 g). Juntar
estas soluciones (solución B). Mezclar asépticamente las soluciones A y B, completar hasta 100 ml
con agua destilada estéril y guardar a -20°C en alícuotas de 5 ml.
ii)
Cortar en trozos pequeños 1-2 g de tejido y moler en un mortero con arena estéril y un pequeño
volumen de medio de cultivo hasta formar una pasta homogénea. Alternativamente, se puede utilizar
una trituradora a 4°C.
iii)
Hacer una suspensión al 20% (p/v) añadiendo solución salina equilibrada de Hanks (BBS) o medio
mínimo esencial de Hanks (MEM); por cada 10 ml de suspensión, se añade 1 ml del base de
glutamina-antibiótico. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 1 hora.
iv)
Centrifugar a 1.000 g durante 15 minutos
v)
Se tripsiniza una monocapa de células PK-15, se centrifuga la suspensión celular a 160 g durante 10
minutos y se resuspende para que contenga 2 x 106 células/ml en medio de cultivo (MEM de Eagle
con sales de Earle; 5% de suero bovino fetal libre de pestivirus de rumiantes y de anticuerpos contra
pestivirus; y 0,2 ml de la solución stock de glutamina-antibiótico por cada 10 ml de la suspensión
celular).
vi)
Mezclar nueve partes de la suspensión celular (del paso (v)) y una parte del sobrenadante (del paso
(iv)) e inocular 1,0-1,5 ml en 6-8 tubos Leighton con cubres, o en otros recipientes apropiados de
cultivo celular. Tres tubos se inoculan como controles con sólo 1,0-1,5 ml de suspensión celular.
Después de completar las inoculaciones de la muestra, se inoculan tres tubos como controles
positivos con CSFV. Hay que tener cuidado en evitar la contaminación con esta suspensión vírica
positiva. También deben prepararse cultivos negativos.
vii)
En los días 1, 2 y 3 post-inoculación, se lavan dos cultivos, junto con un cultivo control positivo y otro
negativo, dos veces durante 5 minutos cada vez con BBS de Hanks, MEM de Hanks o PBS, se fijan
con acetona fría (de grado analítico) durante 10 minutos, y se tiñen con un conjugado directo antiCSFV a la dilución de trabajo apropiada, o bien se tiñen indirectamente, como se describe en la
Sacción B.1.a.
Si la suspensión de amígdalas al 2% resulta tóxica para las células, la prueba debe repetirse utilizando
una dilución mayor u otro órgano.
viii) Después de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, los cubres se montan en 90% de
glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH>8,0, y se examinan para focos de fluorescencia.
En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden
usarse también para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulación de fondo plano o placas
M24. En tal caso, las placas se fijan y se tiñen como se describe más adelante para la prueba de
neutralización ligada con peroxidasa (NPLA).
La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clínicamente enfermos es una muestra
adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fracción de leucocitos u otros componentes, pero por
razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (9). El procedimiento es el siguiente:
i)
Congelar una muestra de sangre completa a -20°C y descongelar en un baño a 37°C.
ii)
Inocular 300 µl de sangre hemolizada en una monocapa de células PK-15 crecidas hasta un 75% de
confluencia * en una placa M24, y permitir la adsorción durante 1 hora a 37°C.
iii)
Eliminar el inóculo, lavar la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y añadir medio
de cultivo.
iv)
Después de una incubación de 3-4 días, las placas se lavan, se fijan y se tiñen, como se describe más
adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 µl para compensar la mayor
superficie celular.
Nota: este método es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la detección de
PPC aguda.
*
La inoculación simultánea, aunque ligeramente más sensible, es menos adecuada pues el anticoagulante puede interferir
con la adhesión de las células a la superficie.
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•
Reacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa
Se han descrito muchos métodos de transcripción inversa en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y otros se
están aún desarrollando. Una alternativa internacionalmente aceptada al ELISA de captura de antígeno y al
método de aislamiento del virus es una reacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa
anidada en un solo tubo (RT-nPCR) (14). Este método es rápido y más sensible que los ELISA de captura
de antígeno, el aislamiento vírico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado al diagnóstico
preclínico. Tiene la ventaja adicional de reducir el riesgo de contaminación porque los tubos no se abren
entre las transcripciones inversas sucesivas, la primera PCR y la PCR anidada (17). Están en desarrollo
métodos de PCR en tiempo real. Aún no hay un método disponible de RT-PCR estandarizado
internacionalmente. Se pueden obtener ejemplos de un protocolo adecuado en la literatura o de los
laboratorios de referencia de la OIE para la PPC (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Debido a su
velocidad y sensibilidad, la RT-PCR es un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de
enfermedad y está aceptada por la Unión Europea (1), aunque se recomienda que, debido a la facilidad con
la que pueden ocurrir positivos falsos, los resultados positivos de brotes deberían confirmarse siempre con
otras pruebas. La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva así como a órganos
sólidos y se ha utilizado con éxito para controlar brotes.
La epidemiología molecular de la PPC se basa en la comparación de diferencias genéticas entre los virus
aislados. La amplificación del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciación nucleotídica es el método más
simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias
regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiológicos moleculares (16). Se han
estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar
nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la región 5´ no codificante (5´NCR) del genoma
(150 nucleótidos) y la otra en el gen de la glicoproteína mayor E2 (190 nucleótidos). En resumen, el método
usado consiste en extraer el ARN vírico de cultivos de células PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar
una o ambas zonas dentro de 5´NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotídica de los
productos y comparar con la información acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia
de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. Los
CSFV aislados de brotes primarios deben enviarse a un laboratorio de referencia de la OIE para
investigación epidemiológica molecular. Se debe obtener un permiso de importación antes de su envío.
2.
Pruebas serológicas
La detección de anticuerpos específicos contra el virus es útil cuando se sospechan infecciones con cepas de
PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta 21
días post-infección. Las investigaciones serológicas dirigidas a detectar focos residuales de infección,
especialmente en piaras de producción, pueden ser también útiles para la erradicación de PPC en una fase
terminal.
Como la incidencia de la infección con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cría, solo
resultan útiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y
ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberían
confirmarse por pruebas NV comparativas.
Las pruebas de neutralización se realizan en cultivos celulares utilizando un método virus constante/suero
variable. Como el CSFV no es citopático, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras multiplicación, por
un sistema indicador. La prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (13) y la NPLA (20)
son las técnicas más ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El sistema
con peroxidasa tiene la ventaja de que puede estimarse a simple vista.
a)
272
Prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (prueba prescrita para el
comercio internacional)
i)
Sembrar una suspensión de células PK-15 a una concentración de 2 x 105 células/ml en placas Petri
de 5 cm con cubres extendidos en el fondo, o en tubos Leighton con un cubre, o en microplacas de
fondo plano.
ii)
Incubar los cultivos 1-2 días a 37°C en una cabina de CO2 hasta que alcancen el 70-80% de
confluencia. Se puede utilizar un incubador ordinario para tubos Leighton cerrados.
iii)
Inactivar los sueros durante 30 minutos a 56°C. A efectos del mercado internacional, es mejor probar
con una dilución inicial del suero de 1/5 (dilución final 1/10).
iv)
Incubar durante 1-2 horas a 37°C volúmenes iguales de suero diluido y de suspensión vírica que
contenga 200 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml. Por tanto se utiliza una
cantidad constante de CSFV de 100 DICT50 por cada pocillo de reacción.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
v)
Extraer los cubres de las placas Petri o de los tubos Leighton, lavar brevemente en medio sin suero,
cubrir la capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37°C en
atmósfera húmeda.
vi)
Colocar los cubres en un tubo Leighton limpio e incubar los cultivos en medio de mantenimiento
durante dos días más.
vii)
Sacar los cubres de los tubos Leighton, lavar las monocapas dos veces con PBS, pH 7,2, durante 5
minutos cada vez, fijar con acetona pura durante 10 minutos y teñir con la solución de trabajo del
conjugado durante 30 minutos a 37°C antes de lavar.
viii) Montar para microscopía los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con
carbonato/bicarbonato, pH > 8,0, y examinar por flluorescencia.
Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulación, se puede seguir el procedimiento para la
NPLA (ver más adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tiñen a continuación con la dilución de trabajo
del conjugado durante 30 minutos a 37°C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecta
fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de gran
longitud focal.
b)
Prueba de neutralización ligada a peroxidasa (NPLA) (prueba obligada para el comercio
internacional).
La NPLA se realiza en placas de microtitulación de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56°C
durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilución inicial de suero de
1/5 (dilución final 1/10). Para programas de seguimiento en un país, puede ser suficiente una dilución de
1/10. En cada prueba deben incorporarse controles apropiados para asegurar la especificidad y la
sensibilidad de las reacciones.
•
Procedimiento de la prueba
i)
En dos pocillos de una placa de microtitulación se depositan 50 µl de diluciones de suero en medio de
crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibióticos). El suero fetal bovino debe estar
libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un
tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tinción
inespecífica).
ii)
Añadir a los pocillos 50 µl de suspensión vírica, diluida en medio de crecimiento hasta contener
aproximademente 100 DICT50/50 µl, y mezclar el contenido en un agitador de microplacas durante
20 segundos.
iii)
Incubar las placas en un incubador de CO2 durante 1 hora a 37°C.
iv)
Añadir a todos los pocillos 50 µl de medio de crecimiento con 2 x 105 células/ml.
v)
Dejar crecer las células en 5% de CO2 hasta confluencia, normalmente en 3-4 días.
vi)
Eliminar el medio de crecimiento y lavar las placas una vez con NaCl 0,15 M.
vii)
Las placas se secan por absorción en papel absorbente.
viii) Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes métodos:
ix)
•
Las placas se incuban 45 minutos a 37°C, y luego a -20°C durante al menos 45 minutos. Se
sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 µl de paraformaldehido al 4% en
PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Se elimina el
paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0.15M; o
•
Las placas se incuban a 70-80°C durante 1-2 horas; o
•
Las placas se fijan en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total
a 25-30°C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo se obtiene un secado completo después de 3-5 minutos-, según se observa por el color
blanquecino de la monocapa celular).
Añadir a cada pocillo 50 µl de un suero porcino hiperinmune contra la PPC, diluido en NaCl 0,5 M que
contiene 1% de Tween 80 + 0,1 ml de azida sódica, pH 7,6. Incubar a 37°C durante 15 minutos. La
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
273
Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
dilución de trabajo del antisuero debe determinarse por titulación previa: es decir, un suero con un
título por NPLA de 1/30.000 puede utilizarse a 1/100.
x)
Lavar cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.
xi)
Añadir a cada pocillo 50 µl de un conjugado de Ig-HRPO antiporcina, diluida a su dilución de trabajo
con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6, y luego incubar durante 10 minutos a 37°C.
xii)
Lavar las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.
xiii) Añadir 50 µl de solución de cromógeno del substrato a cada pocillo y teñir durante 15-30 minutos a
temperatura ambiente. Esta solución se describe en la Sección B.1.a. "Diferenciación de pestivirus
mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa".
xiv) La prueba se lee visualmente. Las capas celulares infectadas se tiñen total o parcialmente de color
marrón rojizo. En casos dudosos, la monocapa debe examinarse por microscopía a baja resolución. El
citoplasma de las células infectadas se tiñe de rojo oscuro.
xv)
En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de células, de suero positivo y de titulación
del virus problema. La titulación del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una
concentración entre 30 y 300 DICT50/ 50 µl.
En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con BVDV reaccionan a baja dilución en las pruebas FAVN o
NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La amplitud de la reacción cruzada depende de la cepa
de BVDV implicada y del intervalo entre la infección y el tiempo de muestreo (27). Los altos niveles de
anticuerpo que se alcanzan normalmente después de exposición a la infección por PPC, incluso con cepas
de baja virulencia, permiten el uso de diluciones relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos
contra PPC, lo que evita muchas, aunque no todas, las reacciones cruzadas (20, 21). En caso de duda
continuada, son útiles las pruebas comparativas que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una
cepa de BDV que sean representativas del país o de la región. Las pruebas comparativas de neutralización
son titulaciones a punto final en las que la misma serie de diluciones dobles de la muestra de suero
sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT50 de cada cepa vírica seleccionada. Las pruebas
comparativas se realizan según los protocolos descritos para FAVN o NPLA; las líneas celulares deben ser
adecuadas para el BVDV y el DVB. Los títulos de neutralización se expresan como el inverso de la dilución
más alta de suero que evita el crecimiento celular en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de
cuatro veces o más entre los puntos finales de dos titulaciones debe considerarse decisiva para una
infección por la especie de virus que da el título más alto.
c)
Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional)
Las técnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado. Las
pruebas utilizadas deben minimizar las reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el
sistema de prueba debe asegurar la identificación de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de
la respuesta inmune a la infección.
Antígeno: El antígeno debe derivar de, o corresponder a, proteínas víricas de una de las cepas
recomendadas de CSFV. Las células utilizadas para preparar antígeno deben estar libres de cualquier otra
infección con Pestivirus.
Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de
cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a
conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una proteína vírica inmunodominante del CSFV. Los
ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM.
La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier
suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralización al menos 21 días
post-inoculación. La prueba ELISA sólo puede utilizarse con muestras de suero o plasma derivadas de
cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es específico para la PPC, las muestras
positivas deben analizarse además por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e infecciones por
otros pestivirus.
El ELISA bloqueante de captación de complejos (4) es un método de un solo paso muy adecuado para
utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rápida y fácil de
274
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
realizar, y detecta anticuerpos contra cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la
infección. Como los MAbs son específicos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captación de complejos
detectará anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser
más problemáticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmación.
Se puede obtener más información sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No existen vacunas eficaces con virus completo inactivado contra la PPC.
C1. Vacunas con virus vivos modificados
Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenúan por pases en cultivo celular o en una
especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae. La producción de lleva a cabo basándose
en un sistema de lotes de siembra. Éste debe ser validado respecto a identidad, esterilidad, pureza, seguridad,
ausencia de transmisión, estabilidad e inmunogenicidad.
Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. son de naturaleza general y
puede suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
El servicio de producción de vacunas debe funcionar bajo adecuadas medidas y prácticas de bioseguridad. Si se
utiliza el CSFV para producción de vacunas o para estudios de desafío de las vacunas, la parte del servicio
donde se realiza este trabajo debe cumplir los requisitos de Contención del Grupo 4 de patógenos como se
señala en el Apéndice I.1.6.1. del Capítulo I.1.6. de este Manual.
Para producir un lote de siembra y una vacuna final de alta calidad, se deben determinar las condiciones óptimas
para la obtención del virus. Para las vacunas producidas en cultivos celulares, se deben hacer experimentos con
curvas de crecimiento para estudiar el efecto de la composición del medio, de la regulación del pH y del
contenido atmosférico del CO2, la concentración inicial de células sembradas, la relación entre la superficie de la
capa celular y el volumen de medio, la fase de crecimiento de las células al tiempo de la infección vírica,
condición estacionaria o rotatoria del cultivo durante la replicación vírica, etc. Para las vacunas producidas en
animales, los factores que deben ser investigados para determinar el máximo de crecimiento vírico y los tejidos a
recoger son, entre otros, la edad, raza, peso, tamaño del inóculo (número de ID50 animal [dosis infecciosa del
50%]), patogénesis de la infección, y síntomas clínicos.
Cualquiera que sea el método de producción, el substrato debe recogerse en condiciones asépticas y someterse
a un ciclo de congelación y descongelación para liberar los virus asociados a las células. Los elementos
celulares grandes o los restos de tejidos se eliminan por filtración o centrifugación a baja velocidad. Se añade un
estabilizador, como lactosa, a una concentración final de 5%. La vacuna se homogeniza antes de su liofilización
para asegurar un lote uniforme.
En el producto final, el virus vacunal no debe diferir del material utilizado para validar el lote de siembra en más
de cinco pases. La vacuna comercial debe producirse en lotes en forma liofilizada como un producto homogéneo.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para validar un lote de siembra de una vacuna MLV contra la PPC, las muestras del inóculo de siembra
deben superar primero varios experimentos piloto. Excepto para pruebas de confirmación de identidad,
esterilidad, pureza y estabilidad de la atenuación, los experimentos piloto también deben realizarse con
muestras representativas del producto comercial final. Estas muestras se deben originar del mismo lote de
siembra probado antes.
A menos que se especifique de otro modo, todos los cerdos utilizados en pruebas piloto son cerdos sanos
de 6-8 semanas de edad, sin anticuerpos contra CSFV y BVDV, de la misma raza y origen, agrupados al
azar si es necesario, y mantenidos en las mismas condiciones. Las cerdas gestantes deben ser de igual
paridad.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
275
Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
El virus de siembra debe ser estéril e inducir anticuerpos neutralizantes que sean específicos contra una
cepa virulenta de CSFV en cerdos.
b)
Método de cultivo
La producción se realiza en cultivos celulares o en un hospedador adecuado de una especie que no
pertenezca a la familia Suidae.
c)
Validación como vacuna
i)
Pureza
La vacuna debe ser virológicamente pura.
Cada uno de tres cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus del
lote de siembra equivalente a diez veces la cantidad de virus contenido en una dosis de vacuna. Esto
se repite 3 semanas después utilizando la misma dosis y ruta de administración. Se toman muestras
de suero 2 semanas después de la última inoculación y se analizan por el método más sensible para
ausencia de anticuerpos contra los virus de la peste porcina africana, enfermedad de Aujeszky, DVB,
fiebre aftosa (todos los tipos), gastroenteritis transmisible, enfermedad vesicular porcina, síndrome
porcino reproductivo y respiratorio, gripe porcina (tipos H1N1 y H3N2), y contra adenovirus porcinos,
enterovirus porcinos (tipos 1 y 2), parvovirus porcino y circovirus.
ii)
Seguridad
En las pruebas de seguridad, cada uno de diez cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente
con diez dosis de vacuna. Otros diez cerdos sirven de control. Todos los cerdos se observan durante
las 3 semanas siguientes. Diariamente se anotan las temperaturas corporales y se toman muestras de
sangre con un anticoagulante durante la primera semana. Se anotan los pesos al tiempo de la
inoculación y 2 semanas más tarde. Ningún animal debe morir o mostrar síntomas de enfermedad
causada por el virus de la vacuna (lote de siembra). La temperatura diaria media del cuerpo no debe
alcanzar o superar los 40,5°C durante el período de la prueba. El aumento diario de peso medio no
debe descender significativamente (p< 0,05) respecto al del grupo control. Se puede despreciar la
leucopenia (número de leucocitos < 7 x 106 células/ml) si sólo ocurre en un cerdo durante 1 día.
Cada uno de diez cerdos se inmunosuprime por inyecciones diarias con 2 mg de prednisolona/kg de
peso corporal durante 5 días consecutivos. Al día 3 cada animal se inocula con el equivalente de una
dosis de vacuna, y se observa durante las tres semanas siguientes. Ningún animal debe morir o
enfermar debido al virus vacunal.
Cada una de diez cerdas gestantes de 25-35 días, se inoculan intramuscularmente con el equivalente
de una dosis de vacunas. Otros diez animales de la misma paridad y gestación sirven de control. La
vacunación no debe de interferir con la gestación a término, y el número de lechones vivos nacidos del
grupo de prueba no debe ser significativamente menor (p<0,05) que el del grupo control.
Para ensayos de campo se utiliza un mínimo de 200 cerdos paridos y criados por al menos 20 cerdas,
y que sean seronegativos para CSF y BDV. Las camadas se distribuyen del mismo modo en dos
granjas por lo menos. La mitad de los lechones de cada camada se inoculan intramuscularmente a los
7-14 días de edad con el equivalente de una dosis de vacuna. Los lechones no inoculados son los
controles. Todos los lechones se pesan al tiempo de la inoculación y 2 semanas más tarde, y se
observan durante 3 semanas. Una tasa de mortalidad que supera el 5% debido a causas ajenas a la
vacunación invalida la prueba. Ningún animal debe morir o mostrar signos de la enfermedad debido al
virus vacunal. El peso medio ganado por los lechones inoculados no debe ser un 20% menor que el
de los controles durante las 2 semanas post-inoculación.
iii)
Ausencia de transmisión
Para confirmar la ausencia de transmisión, se dividen 24 cerdos seronegativos en cuatro grupos
iguales. En cada grupo se inoculan cinco cerdos intramuscularmente con el equivalente de una dosis
de vacuna. El resto de los cerdos representa los controles. Todos los cerdos se inoculan 6 semanas
después como desafío con al menos 105 PID50 (dosis infecciosa del 50% de los cerdos) de una cepa
virulenta de CSFV. Todos los animales control deben ser serológicamente negativos al tiempo del
desafío, y morir después durante las 3 semanas siguientes. Todos los cerdos vacunados deben
permanecer sanos y sobrevivir.
iv)
Estabilidad de la atenuación
Para confirmar la estabilidad de la atenuación vírica, cada uno de dos cerdos se inocula
intramuscularmente con una cantidad de virus de lote de siembra equivalente a 100 dosis de vacuna y
276
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
se sacrifican 6-7 días después. Se juntan las amígdalas de ambos cerdos y se prepara una
suspensión al 10% en PBS, pH 7,2. Esto se usa para inocular intramuscularmente otros dos cerdos
con 2 ml y luego se sacrifican 6-7 después. Este protocolo se repite 5 veces. Durante estos pases, el
tejido de amígdalas se puede guardar a 4°C, si el almacenamiento es menor de 24 horas, o a -70°C
por períodos más largos. Al mismo tiempo, la presencia del antígeno de PPC se confirma en cada
pase por una prueba directa de FAT en cortes finos de las amígdalas o por aislamiento del virus en un
substrato adecuado. Si después de un cierto pase no se puede demostrar CSFV o antígeno, se realiza
una segunda serie de pases para mostrar infección, comenzando con los últimos dos cerdos de la
serie previa.
Se inoculan intramuscularmente cinco cerdos con el sexto pase del virus del lote de siembra,
equivalente a una dosis de vacuna o, si no se ha alcanzado este pase, con el pase más alto de las dos
series en que se detectó virus o antígeno vírico. Se inoculan de modo similar cinco cerdos adicionales
con una dosis de virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de la vacuna. Todos los cerdos se
pesan al tiempo de la inoculación y de nuevo 2 semanas más tarde. Se recoge sangre diariamente
con anticoagulante durante la primera semana, y todos los cerdos se mantienen bajo observación
durante 3 semanas. Ningún animal debe morir o enfermar por el virus de la vacuna. El peso medio
adquirido en los dos grupos durante las primeras dos semanas no debe diferir significativamente
(p<0,05). Cuando mucho, se permite leucopenia (número de leucocitos < 7 x 106 células/ml) en un
cerdo de cada grupo durante 1 día.
v)
Inmunogenicidad
Para demostrar una inmunogenicidad adecuada, se inoculan diez cerdos con una cantidad de virus
equivalente a una dosis de vacuna cada uno, y otros dos cerdos se mantienen por separado no
inoculados como controles. Todos los cerdos se someten una inoculación de desafío 7 días después
con 105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV. Solo deben morir los controles.
En una prueba para establecer la duración de la inmunidad, se inoculan diez cerdos con unas dosis de
vacuna cada uno y otros dos se mantienen por separado como control. Seis meses después, los
sueros de los cerdos inoculados se prueban para anticuerpos contra PPC; al menos ocho cerdos
deben resultar positivos. Todos los cerdos se inoculan después en desafío con al menos 105 PID50 de
una cepa virulenta de VPCC y se observan durante 3 semanas. Solo deben morir los controles.
Para determinar la protección al desarrollo del síndrome de la cerda portadora, se dividen al azar 20
cerdas grávidas en la misma fase de gestación en dos grupos. Un grupo se vacuna una o dos veces
con una cantidad equivalente a una dosis de vacuna, y cuatro semanas después de la última
inoculación se inoculan intranasalmente con una cepa de campo de baja virulencia, junto con las
cerdas control no vacunadas. Todas las cerdas se sacrifican 4 semanas después y los fetos se
examinan para presencia de CSFV o antígeno vírico. La vacunación debería reducir de modo
significativo la transmisión transplacentaria del virus.
En las condiciones de conservación prescritas por el fabricante para el producto final, un volumen de
virus equivalente a una dosis de vacuna debe mantener su inmunogenicidad por lo menos hasta el
final de la caducidad que se indique.
2.
Método de producción
Cada lote de vacuna de tipo MLV contra la PPC debe derivar del mismo lote de inóculo utilizado para las pruebas
piloto. Además, cada lote debe prepararse de acuerdo con el protocolo de producción y bajo las condiciones
expresadas para registrar el producto final. Las propiedades de cada lote y las del lote de siembra deben ser
uniformes.
3.
Control del proceso
El protocolo de producción dependerá de la cepa vacunal, del sistema de producción (animales o cultivos
celulares) y de los servicios disponibles. Las normas para vacunas obtenidas de cultivos celulares pueden variar
en función del sistema de producción, es decir, si proceden de cultivos primarios, líneas celulares, monocapas o
cultivos en suspensión.
4.
Control de lotes
Todos los cerdos utilizados en las pruebas de control deben tener 6-8 semanas y estar libres de anticuerpos
contra el CSFV o el BVDV. Deben tener un origen, raza, y crianza uniforme y, cuando sea necesario, estar
distribuidos en grupos aleatorios.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
277
Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
a)
Identidad
La vacuna debe inducir anticuerpos neutralizantes específicos contra una cepa viruenta de CSFV.
b)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de materiales biológicos se presentan en el
Capítulo I.1.5.
c)
Inocuidad
Se inoculan intramuscularmente tres cerdos con diez dosis cada uno de la vacuna reconstitiuida, en una
única inyección. Los cerdos se observan durante 3 semanas y se toma diariamente la temperatura corporal
durante la primera semana. Ningún cerdo debe morir o mostrar síntomas de la enfermedad atribuidos a la
vacuna, su temperatura corporal diaria no debe alcanzar nunca los 40,5°C o más, y deben crecer
normalmente.
d)
Pureza
El lote debe ser virológicamente puro. Para probar esto, se inoculan intramuscularmente tres cerdos con
diez dosis de vacuna cada uno. Se recogen muestras de suero al tiempo de la inoculación y 5 semanas
después. Los sueros se prueban para anticuerpos contra el DVB (neutralización durante 1 hora a 37°C) y
contra parvovirus porcinos (inhibición de la hemaglutinación utilizando cuatro unidades hemaglutinantes).
Los tres cerdos deben permanecer sin enfermedad. No es necesario realizar pruebas para pureza biológica
con vacunas producidas en conejos.
e)
Potencia
La potencia se expresa como el número de dosis protectoras del 50% (PD50) contenidas en una dosis de
vacuna. Una dosis de vacuna tiene al menos 100 PD50.
Se inoculan intramuscularmente dos grupos de cinco lechones de 6-8 semanas con una dilución 1/40 y
1/160 de la vacuna reconstituida, respectivamente, utilizando solución salina tamponada, pH 7,2. Dos
semanas después, los cerdos vacunados y dos cerdos control se inoculan intramuscularmente con
105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV como desafío. Los cerdos se observan durante las dos semanas
siguientes, período en el que los controles deben morir. Usando métodos estadísticos normales, a partir de
los cerdos sobrevivientes que no muestran síntomas de PPC, se calcula el número de PD50 contenido en la
vacuna.
La prueba de potencia se puede reemplazar por una prueba de infectividad, siempre que el fabricante
pueda demostrar que existe una relación clara y reproducible entre el contenido del virus de la vacuna y la
protección que confiere a cerdos en una inoculación de desafío.
f)
Estabilidad
El período de validez de un lote de vacuna liofilizada contra la PPC no debe ser menor de 1 año.
C2. Vacunas marcadoras
Pese a la existencia de vacunas MLV seguras y eficaces contra la PPC, su uso no ha sido favorecido en la
Unión Europea y algunos otros países libres de PPC o casi libres, debido a que los anticuerpos que inducen
tales vacunas no pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural. Esta desventaja no se presenta
en una "vacuna marcadora" capaz de provocar una respuesta inmune protectora que puede distinguirse de
la respuesta inmune inducida por el virus natural. Un prerrequisito para distinguir entre animales vacunados
y animales infectados naturalmente es la disponibilidad de una prueba serológica acompañante que es muy
discriminatoria para revelar infecciones residuales.
Las exigencias mínimas para las vacunas marcadoras contra la PPC y las pruebas discriminatorias
acompañantes se resumen del siguiente modo (5):
a)
Vacuna
La vacuna debe suministrar protección frente a cualquier contacto con el virus natural. La eficacia de la
vacunación debe demostrarse experimentalmente mediante estudios que analicen la transmisión del virus
natural en grupos de cerdos vacunados. El efecto protector de la vacunación debe alcanzarse en el menor
tiempo posible. Con preferencia, la protección rápida y fiable debe obtenerse después de una única
aplicación. Además, debe asegurarse que la infección de cerdas gestantes vacunadas no ocasiona
278
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.13. — Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
infección transplacentaria ni el nacimiento de crías con infección congénita por CSFV. La duración de la
inmunidad debe ser superior a 6 meses.
Hay muchas vacunas marcadoras contra la PPC en fase de desarrollo, pero en la Unión Europea se han
registrado hasta ahora dos. Ambas son vacunas con subunidades, que emplean como inmunógeno la
glicoproteína E2 del CSFV y que se han sometido a valoración independiente (8, 23). La subunidad E2 se
produce en células de insectos infectados por baculovirus modificados genéticamente, que contienen el gen
E2 del CSFV. Las vacunas, por tanto, no contienen ningún CSFV, y el baculovirus vector se inactiva
químicamente. La preparación final contiene aceites minerales como adyuvantes para formar una emulsión
doble (agua/aceite/agua) o simple (agua en aceite).
b)
Prueba discriminatoria acompañante
La prueba serológica discriminatoria acompañante debe ser muy sensible puesto que la vacunación
reducirá la prevalencia de la enfermedad. Debe ser utilizada como una prueba a nivel poblacional. Una
sensibilidad elevada reduce la especificidad de la prueba, ya comprometida por la presencia de anticuerpos
contra otros pestivirus, por lo que se debe disponer de pruebas confirmativas adecuadas y rápidas para
diferenciar los resultados positivos de los positivos falsos.
Las pruebas acompañantes que existen para las vacunas con subunidad E2 son pruebas ELISA basadas
en la detección de anticuerpos contra la proteína Erns (11, 12). Tal prueba se ha aprobado recientemente
por la Comisión Europea (2) para la determinar si las piaras vacunadas con una vacuna con subunidad E2
también pueden haber estado expuestas al virus natural.
REFERENCIAS
1.
ANON (2002). Commission decision of 1 February 2002 approving a Diagnostic Manual establishing
diagnostic procedures, sampling methods and criteria for evaluation of the laboratory tests for the
confirmation of classical swine fever (2002/106/EC). Official Journal of the European Union. L39/71.
2.
ANON (2003). Commission decision of 5 December 2003 amending Decision 2002/106/EC as regards the
establishment of a classical swine fever discriminatory test. (2003/859/EC). Official Journal of the European
Union. L324/55.
3
BOUMA A., STEGEMAN J.A., ENGEL B., DE KLUIJVER E.P., ELBERS A.R. & DE JONG M.C. (2001). Evaluation of
diagnostic tests for the detection of classical swine fever in the field without a gold standard. J. Vet. Diagn.
Invest., 13, 383–388.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste porcina clásica (ver Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la página Web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004