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GRIPE AVIAR – ENFERMEDAD Y DIAGNÓSTICO Dennis J. Alexander Laboratorios de Referencia para la C.E., OIE, y FAO para la Gripe Aviar, Veterinary Laboratories Agency Weybridge, Addlestone, Surrey, R.U. INTRODUCCIÓN Los virus de la gripe son virus RNA de cepa negativa, segmentados, que se sitúan en la familia de Ortomixoviride en tres géneros: Influenzavirus A, B y C. Sólo los virus de la gripe A han sido descritos como causantes de infecciones naturales en aves. Los virus de la gripe tipo A se dividen además en subtipos en base a sus relaciones antigénicas en las glicoproteínas superficiales: hemoaglutinina (H) y neuraminidasa (N). En la actualidad se han reconocido 15 subtipos H (H1-H15) y nueve subtipos de la neuraminidasa (N1-N9). Cada virus tiene un antígeno H y un antígeno N, aparentemente en cualquier combinación. Todos los subtipos y la mayoría de las combinaciones posibles han sido aislados en especies de aves. Aunque los virus de la gripe han sido aislados en gran número de especies aviares (Stallknecht, 1998), el conjunto genético para todos los virus de la GA está primordialmente formado por las aves acuáticas, que son responsables de la perpetuación de estos virus en la naturaleza (Alexander, 2000). Estudios filogenéticos (Rohm et al., 1995; Banks et al., 2000a, b) de virus de la GA muestran que los linajes y las estirpes de los virus aislados están más relacionados con los parámetros geográficos y temporales que con el huésped en el que fueron aislados. Tampoco hay distinción en los virus aislados en aves silvestres o domésticas. La forma grave de la gripe aviar [GA] denominada altamente patógena [GAAP], conocida antiguamente como la “peste aviar”, es una de las dos enfermedades más temidas en las aves de corral y otras aves. No es sólo porque la mortalidad en las bandadas puede llegar al 100%, sino también por el 1 impacto económico de las restricciones comerciales y los embargos que se aplican a las zonas infectadas. Mucos países, incluyendo todos los de la Unión Europea, tiene en vigor medidas reglamentarias de control en caso de brotes de cualquiera de estas enfermedades (CEC, 1992) y está reconocida como enfermedad OIE de la lista A (OIE Manual, 2000). ENFERMEDAD Los virus de la gripe A que infectan a las aves de corral se pueden dividir en dos grupos distintos según la gravedad de la enfermedad que causan. Los virus muy virulentos causan GAAP, en la cual la mortalidad puede llegar al 100%. Estos virus han quedado restringidos a los subtipos H5 y H7, aunque no todos los virus de estos subtipos causen GAAP. Desde 1959, se ha informado sobre 20 aislados primarios de estos virus en aves de corral (Tabla 1). Los demás virus causan una enfermedad mucho más benigna, que consiste primariamente en una afección respiratoria leve, depresión y problemas en la puesta para aves ponedoras. En algunas ocasiones, otras infecciones o las condiciones ambientales pueden causar una exacerbación de las infecciones gripales, llevando a enfermedades más importantes. Por ejemplo, en brotes de GABP en Italia en 1999, se registró frecuentemente una elevada mortalidad en pavos jóvenes, llegando al 97% en una bandada (Capua et al., 2000). Base molecular de la virulencia La glicoproteina hemoaglutinina para el virus de la gripe tiene dos funciones importantes que son imperativas para la infectividad del virus. En primer lugar produce la unión a la célula huésped y después la fusión entre la membrana de la célula huésped y la membrana del virus, de forma que el material genético viral se introduce en la célula huésped. Esta glicoproteína se produce como un precursor, HA0, que necesita una segmentación post traslacional por las proteasas del huésped antes de poder inducir la fusión de las membranas y de que las partículas del virus se vuelvan infecciosas (Rott, 1992). Las proteínas precursoras del HA0 en los virus GABP tienen una sola arginina en el lugar de la segmentación y otra en la posición -3 ó -4. La segmentación de estos virus 2 está limitada a sólo ciertas proteasas del huésped, como las enzimas parecidas a la tripsina, y por ello su replicación sólo puede producirse en aquellos lugares del huésped donde existan dichas enzimas, tales como los tractos respiratorio e intestinal. Las proteínas HA0 de los virus GAAP poseen múltiples aminoácidos básicos [arginina y lisina] en sus lugares de segmentación HA0, como resultado de la inserción aparente o de la sustitución aparente (Vey et al, 1992, Wood et al, 1993, Senne et al, 1996) y parece que sólo son segmentables por una(s) proteasa(s) ubicua(s), probablemente una o más endoproteasas que procesan las pro proteínas y están relacionadas con la subtilisina. Entre ellas, la candidata líder es la furina (Stieneke-Grober et al., 1992). Estos virus pueden replicarse en cualquier parte del ave, dañando órganos y tejidos vitales, conduciendo a la enfermedad y la muerte (Rott, 1992). Por ejemplo, todos los virus GABP del subtipo H7 tienen la secuencia de aminoácidos, en el lugar de segmentación del HA0, -PEIPKGR*GLF- o PENPKGR*GLF-, mientras que los ejemplos de secuencias de aminoácidos para virus GAAP H7 son: -PEIPKKKKR*GLF-, PETPKRKRKR*GLF-, PEIPKKREKR*GLF-, -PETPKRRRR*GLF-, -PEIPKGSRVRR*GLF-. Aunque los primeros 18 virus GAAP en la Tabla 1 y el virus GAAP 2003 Netherlands tienen múltiples secuencias de aminoácidos básicos, igual que todos los virus GAAP secuenciados que se aislaron antes de 1959, esto no es cierto para los virus aislados en los brotes GAAP en Chile en el 2002. El virus H7N3 aislado en estos brotes tenía secuencias con inserción de 11 aminoácidos pero sin la exigencia mínima aparente de aminoácidos básicos, ya que sus secuencias eran PEKPKTCSPLSRCRETR*GLF (4372) o PEKPKTCSPLSRCRKTR*GLF (4957) (Suárez et al., 2003). Las teorías actuales sugieren que los virus de la GA, subtipos H5 y H7, de alta virulencia surgen por mutación de virus de baja virulencia (García et al, 1996, Perdure et al., 1998) aunque debe haber más de un mecanismo por el cual esto sucede. Esto está apoyado por estudios filogenéticos de virus del subtipo H7, que indican que los virus GAAP no constituyen un linaje o linajes separados filogenéticamente sino que parecen surgir de cepas no patógenas (Rohm et al., 1996; Banks et al., 2000a) y de la selección in vitro de los 3 mutantes virulentos para los pollos a partir de virus H7 no virulentos (Li et al., 1990). Parece que estas mutaciones ocurren solamente después de que el virus se haya trasladado de su huésped natural silvestre a las aves de corral. Sin embargo, la mutación a la virulencia es impredictible y puede ocurrir muy pronto, después de introducirse en las aves de corral, como en los brotes 1-4, 6, 8-12, 14, 15, 17, 19 y 20 de la Tabla 1, o después de que el virus GABP haya circulado durante varios meses, como en el caso de los brotes 7, 13, 16 y 18. Señales clínicas Gripe Aviar de Baja Patogenicidad. La gravedad de la enfermedad causada por el virus que induce poca o ninguna enfermedad en pollos infectados experimentalmente y sin múltiples aminoácidos básicos en el lugar de segmentación del HA0 (virus GABP) está muy influenciada por: la cepa del virus, la especie y edad del huésped, el estado inmunológico del huésped frente al virus y especialmente la presencia de otros agentes infecciosos, tales como: Pasteurella spp, virus de la enfermedad de Newcastle (incluyendo las cepas de vacuna), pneumovirus aviar, virus de la bronquitis infecciosa, E. coli y Mycoplasma spp, condiciones de inmunodeficiencia y factores ambientales (como exceso de amoníaco, polvo, temperaturas cálidas o frías). En un extremo, la enfermedad vista puede no ser aparente o serlo muy poco. Por ejemplo, Alexander y Spackman (1981) informó que una infección GABP en una bandada de pavas en puesta sólo produjo unos signos respiratorios leves y transitorios y un 2% de huevos con cáscara blanca. Otros brotes GABP que tuvieron lugar en pavos casi al mismo tiempo produjeron descensos del 20-40% en la puesta y enfermedades respiratorias con una mortalidad baja pero significativa. En el otro extremo, las infecciones por virus GABP pueden estar asociadas a enfermedades graves y de elevada mortalidad. En Alabama, 1975, los brotes en pollos producidos por un virus GABP del subtipo H4N8, registraron mortalidades hasta del 69% en las bandadas infectadas (Johnson et al., 1977). 4 Brotes importantes en 1995, causados por virus GABP del subtipo H7N3 afectaron a pavos en Utah (EE.UU.). El virus estuvo asociado con mortalidades elevadas, especialmente en aves jóvenes, con alrededor del 40% de mortalidad en aves entre 0 y 4 semanas de edad (Halvorson et al., 1998). En la mayoría de los casos la mortalidad estuvo asociada a infecciones dobles con Escherichia coli o Pasteurella multocida. Durante las infecciones con GABP H7N1 en Italia (1999) los pavos se vieron especialmente afectados. En pavos criados para carne, la gravedad de la enfermedad clínica y post mortem varió considerablemente. Los signos clínicos estuvieron dominados por padecimientos respiratorios con una mortalidad entre el 5% y el 97% dependiendo de la edad de las aves afectadas (Capua et al., 2000). En aves jóvenes para carne, los signos fueron en general lo bastante graves para causar un 40-97% de mortalidad en las bandadas infectadas. En las pavas de cría se observó una forma más benigna de la misma situación clínica, consistente en estertores, tos, hinchazón de los senos suborbitales y un estado febril asociado con pérdida de apetito. La producción de huevos cayó entre un 30 y un 80% durante la fase aguda, pero se recuperó parcialmente a niveles inferiores al normal a las tres semanas de declararse la enfermedad. Las tasas de mortalidad oscilaron entre el 5 y el 20% (Capua et al., 2000). En años recientes se ha informado sobre problemas igualmente serios asociados con brotes generalizados de virus del subtipo H9N2, especialmente en Pakistán e Irán, pero también en Oriente Medio y países asiáticos hasta China. Gripe Aviar Altamente Patógena. Con frecuencia, la primera señal de GAAP en bandadas de pollos o pavos, especialmente aves que no están en jaulas, es la aparición brusca de una mortalidad elevada, que puede acercarse al 100% en pocos días. Los signos clínicos que pueden asociarse con la elevada mortalidad son: cese de la puesta, signos respiratorios, estertores, lagrimeo excesivo, sinusitis, edema de la cabeza y la cara, hemorragias subcutáneas con cianosis de la piel, especialmente en la cabeza y las barbas y diarrea. Ocasionalmente pueden presentarse 5 signos neurológicos. Usualmente, estos signos son más marcados en los animales que les toma tiempo morirse. Lesiones Las lesiones generales que se observan suelen reflejar los signos clínicos y por ello son también muy variadas y de poca ayuda para el diagnóstico. En los casos más graves, las aves muestran diversas lesiones congestivas y hemorrágicas en la piel, hígado, bazo, corazón, riñones y pulmones. Sin embargo, estos signos están usualmente ausentes en las aves que mueren de repente. Las infecciones por virus de la gripe de baja virulencia están normalmente asociadas a lesiones del tracto respiratorio, en especial sinusitis, a veces con exudados desde mucopurulentos a caseosos. Las lesiones generalizadas de riñón también se han asociado a infecciones de pollos por virus de gripe de baja virulencia. Se ha informado sobre pancreatitis en aves infectadas por virus de gripe, tanto de alta como de baja virulencia. Estudios histológicos detallados en infecciones por virus GAAP no han podido mostrar lesiones patognomónicas y se han obtenido resultados distintos, peculiares de los órganos involucrados, con virus de diferente virulencia. En general, las infecciones altamente patógenas conducen a edema, hiperemia, hemorragias y focos necróticos degenerativos en las vísceras. La necrosis miocárdica y la miocarditis son con frecuencia rasgos apreciables en algunas infecciones virulentas por virus. Algunos virus involucran marcadamente el sistema nervioso central y en estas infecciones se puede ver frecuentemente amplios hematomas perivasculares y necrosis de las células neuronales; con menor frecuencia pueden ser visibles edemas y hemorragias en el tejido nervioso. Definición de la gripe aviar La marcada variación en la enfermedad causada por virus GABP y GAAP del mismo subtipo, y el hecho que hasta la fecha dos subtipos, H5 y H7, han mostrado ser responsables de la GAAP, significa que se requiere una definición cuidadosa y específica a los fines de control reglamentario y comercio. 6 La legislación en vigor en la UE para controles reglamentarios (CEC, 1992) define la GA como ‘una infección de las aves de corral causada por cualquier virus de la gripe A que tenga un índice de patogenicidad intravenosa mayor que 1,2 en pollos de 6 semanas o cualquier infección por virus de la gripe A de los subtipos H5 o H7 para los que la secuenciación de nucleótidos haya mostrado la presencia de múltiples aminoácidos básicos en el lugar de segmentación de la hemoaglutinina’. Sin embargo, sobre la base de la evidencia que los virus GAAP emergen en aves de corral domésticas a partir de progenitores GABP de los subtipos H5 y H7, el caso debe ser que no sólo deben controlarse los virus GAAP sino también sus progenitores GABP en las aves de corral domésticas (Capua y Marangon, 2000; Alexander, 2003). Como resultado, el Comité Científico sobre Salud Animal de la Unión Europea presentó una propuesta para una nueva definición (EU SCAHAW, 2000) que es: ‘una infección de las aves de corral causada por cualquier virus de la gripe A que tenga un índice de patogenicidad intravenosa mayor que 1,2 en pollos de 6 semanas o cualquier virus de la gripe A de los subtipos H5 o H7’. Una definición muy similar, con fines de comercio, se presentó también en un borrador del Capítulo de Códigos OIE (OIE, 2002), pero hasta ahora ninguna de las dos ha sido adoptada por las autoridades competentes. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Debido a que ninguno de los signos o lesiones producidos por la GABP o la GAAP son patognomónicos, el diagnóstico exige el uso de técnicas de laboratorio que incluyen la caracterización del virus infectante y una evaluación de su virulencia respetando las definiciones. En la UE y, hasta cierto punto, bajo los reglamentos de OIE, esto requiere actualmente el uso de técnicas virológicas convencionales, pero cada vez se están usando más técnicas de biología molecular que también comentaremos más adelante. 7 Diagnóstico Convencional de Laboratorio Las técnicas convencionales a utilizar para el diagnóstico de la GA se describen en detalle en la Directiva 92/40/EEC (CEC, 1992) para la UE y son básicamente idénticas a las descritas en el manual OIE (OIE, 2000). En resumen, estas técnicas consisten en el aislamiento y caracterización del virus infectante de la GA usando las técnicas siguientes: Aislamiento del Virus: Se inoculan, en la cavidad alantoidea de huevos embrionados de 9 a 11 días, suspensiones en soluciones antibióticas de frotis traqueales o cloacales (o heces) tomados de aves vivas, o de heces y muestras mezcladas de órganos de aves muertas. Los huevos se incuban a 35–37°C durante 4–7 días. Se comprueba la presencia de actividad hemaglutinadora en el fluido alantoideo de todos los huevos que en su eclosión contienen embriones muertos o moribundos y en todos los huevos al final del período de incubación. Los fluidos que den reacción negativa deberán pasar por un segundo lote de huevos como mínimo. Identificación del Virus: Si se aísla un agente hemaglutinante, se puede confirmar la presencia de virus de la gripe A con una prueba de inmunodifusión entre el virus concentrado y un antisuero contra el nucleocápside o los antígenos de la matriz, ambos comunes en todos los virus de la gripe A. La mayoría de los laboratorios tendrán antisueros específicos para el virus de la enfermedad de Newcastle (paramixovirus aviar tipo 1), y en vista de su amplia difusión y su uso casi universal como vacuna viva en las aves de corral, es mejor evaluar su presencia con pruebas de inhibición de la hemoaglutinación (IH). La identificación del subtipo del virus de la gripe A se hace normalmente usando antisueros policlonales de pollos, criados frente a una batería de virus intactos de la gripe. La identificación de la neuraminidasa se realiza con un enfoque similar. La identificación de subtipos con estas técnicas necesita mucho trabajo y requiere mantener grandes existencias de antisueros y otros reactivos. Por lo tanto, está fuera del alcance de muchos laboratorios de diagnóstico que no estén especializados en virus de la gripe. Hay ayuda 8 disponible sobre los Laboratorios de Referencia de la OIE. No obstante, los Laboratorios Nacionales y Regionales deben estar en posición de identificar los virus de la gripe de los subtipos H5 y H7, y de valorar la virulencia de dichos virus con pruebas in vivo o in vitro, en línea con las definiciones internacionales. Evaluación de la patogenicidad. Tal como se ha mencionado, la definición de GA para la que deben tomarse medidas reglamentarias comprende la evaluación de la virulencia del virus de la GA para los pollos. En la UE se utiliza para esta evaluación la prueba del índice de patogenicidad intravenosa, que se lleva a cabo como sigue. Fluido alantoideo infectivo fresco, con un título de HA >1/16 (>24 o >log2 i) 4 cuando se exprese como el recíproco) se diluye 1/10 en suero isotónico estéril. 0,1 ml del virus diluido se inyectan por vía intravenosa a cada uno de ii) diez pollos SPF de 6 semanas. Las aves se examinan a intervalos de 24 horas durante 10 días. Cada iii) ave se puntúa en cada observación: 0 si está normal, 1 si está enferma, 2 si está gravemente enferma, 3 si ha muerto. (El juicio entre aves enfermas y gravemente enfermas es una valoración clínica subjetiva. Normalmente, las aves ‘enfermas’ muestran uno de los signos siguientes y las ‘gravemente enfermas’ muestran más de uno. Los signos son: problemas respiratorios, depresión, diarrea, cianosis de la piel expuesta o de las barbas, edema de la cara y/o cabeza, signos de nerviosismo. Los individuos muertos deben puntuarse con un 3 cada uno de los días de observación posteriores a la muerte.) El índice de patogenicidad intravenosa (IPIV) es la puntuación media por iv) ave y por observación sobre el período de 10 días. Un índice de 3,00 significa que todas las aves murieron en 24 horas y un índice de 0,00 significa que ningún ave mostró signos clínicos durante el período de observación de 10 días. En las definiciones actuales, los virus de los subtipos H5 y H7 necesitan también secuenciarse en el lugar de la segmentación del HA0 para demostrar 9 la presencia o ausencia de aminoácidos básicos múltiples. Se han utilizado con éxito diversas técnicas y estrategias para secuenciar los nucleótidos en esta porción del código genético del HA para la región del lugar de segmentación de la hemoaglutinina de los subtipos H5 y H7 de la gripe aviar, permitiendo deducir qué aminoácidos hay. El método de uso más común ha sido la reacción en cadena de la polimerasa de trascripción inversa [RT-PCR], usando áreas complementarias de los iniciadores de oligonucleótidos en el gen, a ambos lados de la región de codificación del lugar de segmentación, seguida por la secuenciación cíclica del cDNA producido (Wood et al., 1993). Varios pasos de este procedimiento se pueden facilitar usando ‘kits’ y secuenciadores automáticos disponibles comercialmente. Si, eventualmente, se adoptan las nuevas definiciones propuestas, el diagnóstico de la GA obligatoria necesitará solamente la identificación de la infección con virus de los subtipos H5 o H7, aunque las pruebas del IPIV seguirán siendo necesarias para otros subtipos. Desarrollo de técnicas para el diagnóstico de la GA Actualmente, las técnicas convencionales de aislamiento y caracterización del virus para el diagnóstico de la GA siguen siendo el método de elección, por lo menos en el diagnóstico inicial de infecciones por GA. Sin embargo, los métodos convencionales tienden a ser caros, muy laboriosos y lentos. Los últimos 10 años han visto enormes desarrollos y perfeccionamientos en técnicas moleculares y de diagnóstico, muchos de los cuales se han aplicado al diagnóstico de las infecciones por GA. Detección de antígenos: El ‘kit’ Directigen® Flu A, disponible comercialmente [Becton Dickinson Microbiology Systems], que es un sistema de ensayo de inmunidad por enzimas de captura de antígenos, se ha utilizado para detectar la presencia de virus de gripe A en aves de corral (Slemons y Brugh, 1998), especialmente en los EE.UU. El ‘kit’ usa un anticuerpo monoclonal contra la nucleoproteína y por ello debe ser capaz de detectar cualquier virus de la gripe A. Aunque se desarrolló para detectar virus en infecciones de mamíferos, se ha aplicado con éxito para detectar virus en aves 10 de corral y otras aves, aunque puede haber variaciones de sensibilidad para distintos especímenes. La principal ventaja de la prueba es que puede demostrar la presencia de GA en 15 minutos. Las desventajas son que no se logra la identificación de los subtipos y que los ‘kits’ son caros. Detección directa del RNA: Aunque, según se demuestra por las definiciones de la GAAP por la UE y la OIE, las técnicas moleculares se han utilizado durante algún tiempo para el diagnóstico de la GA, hay recientes desarrollos en su aplicación para la detección y caracterización de los virus de la GA directamente a partir de muestras clínicas de aves infectadas. Las técnicas RT-PCR sobre muestras clínicas, podrían, con los iniciadores correctamente definidos, conducir a una detección rápida y a la identificación del subtipo [por lo menos el H5 y el H7], además de producir un cDNA que podría usarse para la secuenciación de los nucleótidos (Suárez, 1998; Starick et al., 2000; Munch et al., 2001). Los resultados obtenidos por Koch (2003) indican que debe tenerse cuidado con las muestras clínicas utilizadas, ya que mientras muestras traqueales de aves infectadas muestran una gran sensibilidad y especificidad respecto al aislamiento del virus, los ensayos RTPCR sobre muestras fecales carecían de sensibilidad. La aplicación real de ensayos directos RT-PCR pueden servir para identificar rápidamente brotes sucesivos, una vez el foco primario de infección ha sido detectado y el virus caracterizado. Esta técnica se utilizó con éxito durante los recientes brotes de GAAP en los Países Bajos. Se han aplicado modificaciones al uso de la RT-PCR para reducir el tiempo de identificación del virus y de su secuenciación. Por ejemplo, Spackman et al., (2002) usaron un sistema RT-PCR, en “tiempo real" y en un solo paso, con iniciador y sonda de hidrólisis fluorogénica para detectar los virus de la GA y determinar los subtipos H5 o H7. Los autores concluyeron que la prueba cumplía bien respecto al aislamiento del virus y ofrecía una alternativa más rápida y económica. Se han diseñado modificaciones del método RT-PCR directo para la detección del RNA viral con el fin de reducir el efecto de las substancias inhibidoras en la muestra, la posibilidad de contaminar los ácidos nucleicos y el 11 tiempo necesario para lograr el resultado. Por ejemplo, la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) con detección por luminiscencia electroquímica (NASBA/ECL) es una reacción isotérmica continua en la que no se necesitan equipos especializados para producir ciclos térmicos. Se han desarrollado ensayos NASBA para la detección de virus de la A, subtipos H7 y H5 en muestras clínicas con un tiempo de 6 horas (Collins et al., 2002; Ko et al., 2003). Parece muy probable que en un plazo breve de tiempo la tecnología de base molecular se habrá desarrollado lo suficiente para permitir ensayos “junto a la bandada” para detectar la presencia del virus de la GA, con los subtipos específicos y marcadores de la virulencia. El alcance del uso de estos ensayos en el diagnóstico de la GA dependerá en gran manera del acuerdo y la adopción de definiciones de las infecciones reglamentarias para fines de control y de comercio. REFERENCIAS Alexander, D.J. (2000) A review of avian influenza in different bird species. Proceedings of the ESVV Symposium on Animal Influenza Viruses, Gent 1999. Veterinary Microbiology 74, 3-13. Alexander, D.J. (2003). Should we change the definition of avian influenza for eradication purposes? Proceedings of the 5th International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, April 14-17 2002. Avian Diseases, in press Alexander, D.J. and Spackman, D. (1981). Characterization of influenza A viruses isolated from turkeys in England during March - May 1979. Avian Pathology 10, 281-293. Banks J, Speidel EC, McCauley JW, and Alexander DJ (2000a). Phylogenetic analysis of H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses. Archives of Virology 145, 1047-1058 Banks, J., Speidel, E.C., Harris P.A. and Alexander, D.J. (2000b). Phylogenetic analysis of influenza A viruses of H9 haemagglutinin subtype. Avian Pathology 29, 353-360. Capua, I. & Marangon, S. (2003). The use of vaccination as an option for the control of Avian Influenza. Avian Pathology, 32, 335-343. Capua, I., Mutinelli, F., Marangon, S. and Alexander, D.J. (2000). H7N1 Avian Influenza in Italy (1999-2000) in intensively reared chickens and turkeys. Avian Pathology 29, 537-543. CEC. (1992). Council Directive 92/40/EEC of 19th May 1992 introducing Community measures for the control of avian influenza. Official Journal of the European Communities, L167, 1-15. 12 Collins, R.A., Ko, L.S., So, K.L., Ellis, T., Lau, L.T. & Yu, A.C.H. (2002). Detection of highly pathogenic and low pathogenic avain influenza subtype H5 (Eurasian lineage) using NASBA. Journal of Virolgoical Methods, 103, 213-225. EU SCAHAW (2000). The definition of avian influenza. The use of vaccination against avian influenza. Report 17 of the European Union Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare adopted 27.06.00, Sanco/B3/AH/R17/2000. http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scah/out45_en.pdf pp38. Garcia, M., Crawford, J.M, Latimer, J.W., Rivera-Cruz, E., Perdue, M.L. (1996). Heterogeneity in the haemagglutinin gene and emergence of the highly pathogenic phenotype among recent H5N2 avian influenza viruses from Mexico. Journal of General. Virology 77, 1493-1504 Halvorson, D.A., Frame, D.D., Friendshuh, A.J., Shaw, D.P. (1998). Outbreaks of low pathogenicity avian influenza in USA. Proceedings of the 4th International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia. U.S. Animal Health Association pp 36-46. Johnson, D.C., Maxfield, B.C., Moulthrop, J.I. 1977 Epidemiologic studies of the 1975 avian influenza outbreak in chickens in Alabama. Avian Diseases 21, 167-177. Ko, L.S., Lau, L.T., Banks, J. Aherne, R., Brown, I.H.,. Collins, R.A, Chan, K.Y., Xing, J. & Yu, A.C.H (2003). Nucleic acid sequence-based amplification methods to detect avian influenza virus. Journal of Virolgoical Methods, in press Koch, G. (2003) Laboratory issues: Assessment of the sensitivity and specificity of PCR for NDV on cloacal and tracheal swabs compared to virus isolation. Proceedings of the Joint Seventh Annual Meetings of the National Newcastle Disease and Avian Influenza Laboratories of Countries of the European Union, Padova, 2002 pp 114-117 Li S, Orlich MA, Rott R. (1990). Generation of seal infuenza virus variants pathogenic for chickens, because of hemagglutinin cleavage site changes. Journal of Virology; 64: 3297-3303. Munch, M., Nielsen, L., Handberg, K. & Jorgensen, P. (2001). Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA. Archives of Virology 146, 87-97. OIE (2000). Highly pathogenic avian influenza (fowl plague). Chapter 2.1.14. OIE Manual of Standards for diagnostic tests and vaccines, 2000. OIE : Paris pp 212-220 OIE (2002). Report of the ad hoc group on Avian Influenza. In: Preliminary final report of the meeting of the OIE International Animal Health Code Commission Rio de Janeiro (Brazil), 25 November-5 December 2002 pp151177. Perdue, M., Crawford, J., Garcia, M., Latimer, J., and Swayne, D. (1998). Occurrence and possible mechanisms of cleavage site insertions in the avian influenza hemagglutinin gene. Proceedings of the 4th International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia. U.S. Animal Health Association pp.182-193. 13 Rohm C, Horimoto T, Kawaoka Y, Suss J, and Webster RG (1995) Do haemagglutinin genes of highly pathogenic avian influenza viruses constitute unique phylogenetic lineages? Virology 209: 664-670 Rott, R., (1992). The pathogenic determinant of influenza virus. Veterinary Microbiology 33, 303-310. Senne, D.A., Panigrahy, B., Kawaoka, Y., Pearson, J.E., Suss, J., Lipkind, M., Kida, H., and Webster, R.G. (1996). Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: Amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential. Avian Diseases 40, 425-437. Slemons, R. & Brugh, M. Rapid detection as an aid in early diagnosis and control of avian influenza. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens Georgia. U.S. Animal Health Association Kennett Sq. PA. pp. 313-317. Spackman, E., Senne, D.A., Myers, T.j., Bulaga, L.L., Garber, L.P., Perdue, M.L., Lohman, K., Daum, L.T. & Suarez, D.L. (2002). Development of a realtime reverse transcriptase PCR asssy for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. Journal of Clinical Microbiology 40, 3256-3260. Stallknecht, D.E. (1998). Ecology and epidemiology of avian influenza viruses in wild bird populations. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens Georgia. U.S. Animal Health Association Kennett Sq. PA. pp. 61-69. Starick, E., Romer-Oberdorfer, A. & Werner, O. (2000). Type- and subtypespecific RT-PCR assays for avian influenza viruses. Journal of Veterinary Medicine B 47, 295-301. Stieneke-Grober, A., Vey, M., Angliker, H., Shaw, E., Thomas, G., Roberts, C. Klenk, H-D., and Garten, W. (1992). Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin endoprotease. EMBO Journal 11, 2407-2414. Suarez, D. (1998). Molecular diagnostic techniques: can we identify influenza viruses differentiate subtypes and determine pathogenicity potential of viruses by RT-PCR? Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens Georgia. U.S. Animal Health Association Kennett Sq. PA pp 318-325. Suarez, D.L., Senne, D.A., Banks, J., Brown, I.H., Essen, S.C., Lee, C.W., Manvell, R.J., Mathieu-Benson, C., Pedersen, J., Panigrahy, B., Spackman, E. & Alexander, D.J. (2003). A shift in virulence from low pathogenic to highly pathogenic avian influenza for the H7N3 virus responsible for outbreaks of disease in poultry in Chile appears to be the result of intergenic recombination between the haemagglutinin and NP genes. Abstracts of the XII International Conference on Negative Strand RNA Viruses. Pisa Italy June 14-19th 2003 p164. Vey, M., Orlich, M., Adler, S., Klenk, H-D., Rott, R., and Garten, W. (1992). Haemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the recognition motif R-X-R/K-R. Virology 188, 408-413. Wood, G.W., McCauley, J.W., Bashiruddin, J.B., and Alexander, D.J. (1993). Deduced amino acid sequences at the haemagglutinin cleavage site of avian 14 influenza A viruses of H5 and H7 subtypes. Archives of Virology 130, 209217. Zanella, A., Poli, G. & Bignami, M. (1981). Avian Influenza: Approaches in the control of disease with inactivated vaccines in oil emulsion. Proceedings of the First International Symposium on Avian Influenza, 1981. Carter Composition Corporation, Richmond, USA, pp. 180-183. Tabla 1: Virus GAAP primarios aislados en aves de corral desde 1959 1.A/pollos/Escocia/59 (H5N1) 2.A/pavos/Inglaterra/63 (H7N3) 3.A/ pavos/Ontario/7732/66 (H5N9) 4.A/ pollos/Victoria/76 (H7N7) 5.A/ pollos/Alemania/79 (H7N7) 6.A/ pavos/Inglaterra/199/79 (H7N7) 7.A/ pollos/Pennsylvania/1370/83 (H5N2) 8.A/ pavos/Irlanda/1378/83 (H5N8) 9.A/ pollos/Victoria/85 (H7N7) 10.A/ pavos/Inglaterra/50-92/91 (H5N1) 11.A/ pollos/Victoria/1/92 (H7N3) 12.A/ pollos/Queensland/667-6/94 (H7N3) 13.A/ pollos/México/8623-607/94 (H5N2) 14.A/ pollos/Pakistán/447/94 (H7N3) 15.A/ pollos/NSW/97 (H7N4) 16.A/ pollos/Hong Kong/97 (H5N1) 17.A/ pollos/Italia/330/97 (H5N2) 18.A/ pavos/Italia/99 (H7N1) 19.A/ pollos/Chile/2002 (H7N3) 20.A/ pollos/Países Bajos/2003 (H7N7) *Donde los brotes fueron muy extendidos y afectaron a más de una especie, se incluye en la lista el aislado del primer brote. 15