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LA ACETILACIÓN DE CROMATINA Y LA EXPRESIÓN DE GENES DEPENDIENTES DE CREB EN LA PATOLOGÍA DE LA ENFERMEDAD DE HUNTINGTON Investigador principal: Dr. Angel Luis Barco Guerrero Institut de Neurociències UMH Duración: 3 años 1 1. Resumen La enfermedad de Huntington (EH) es un desorden neurodegenerativo heredable originado por una extensión del trinucleótido CAG en la secuencia codificante del gen de la huntingtina (Htt). Estudios recientes indican que una característica importante de esta enfermedad es la desregulación transcripcional, que podría estar originada por el secuestro de la proteína CBP (CREB-binding protein) en los agregados intracelulares de Htt mutante (mHtt). CBP desempeña un papel doble en transcripción, como coactivador transcripcional de distintos factores de transcripción, incluyendo CREB, y como acetil-transferasa de histonas (HAT). La relevancia de esta segunda actividad en la patología de la EH se ha puesto de manifiesto en diversos estudios que demuestran que la acetilación de histonas está reducida en modelos de la enfermedad y que el tratamiento con inhibidores de deacetilasas de histonas (HDACi) reduce la patología. El objetivo de este proyecto era investigar la contribución de la desregulación de la expresión génica dependiente de CREB, y de la reducción de CBP y de la acetilación de la cromatina en la patología de la EH, así como evaluar el potencial terapéutico de distintos mecanismos compensatorios de la reducción de actividad HAT. 2. Resultados a. La expresión génica dependiente de CREB, neurodegeneración y EH El análisis interdisciplinar de ratones modificados genéticamente con niveles alterados de actividad CREB (bien con un exceso o una reducción de la misma) llevado a cabo por nuestro grupo, ha demostrado que el control temporal preciso de la expresión génica dependiente de CREB es un requerimiento esencial para la viabilidad neuronal y que cualquier desequilibrio en esta cascada de transducción de señales puede dar lugar a un proceso neurodegenerativo (Jancic et al., 2009; Lopez de Armentia et al., 2007). Para avanzar más en esta línea de investigación y explorar las 2 conexiones entre la neurodegeneración causada por cambios en CREB y la EH, una enfermedad previamente vinculada a la desregulación de CREB, comparamos los perfiles de expresión génica observados en mutantes CREB con los obtenidos en modelos murinos de EH. Nuestro análisis reveló una coincidencia relativamente pequeña entre ambas condiciones (Valor et al., 2010). Los cambios comunes a ambos tipos de mutantes incluían dianas directas de CREB, tales como c-fos y prodinorfina. Nuestros resultados en mutantes de CREB tienen otra implicación importante para la EH, ya que demuestran los peligros asociados a una manipulación prolongada de esta cascada de transducción de señales, lo que había sido propuesto con anterioridad como posible estrategia terapéutica para la EH. b. CBP y acetilación de histonas en modelos celulares y murinos de la EH Nuestro análisis exhaustivo del estado de acetilación de histonas en distintos modelos de la EH ha demostrado, tanto in vitro como in vivo, que la expresión de mHtt en neuronas no conlleva necesariamente un cambio en el estado global de acetilación de las histonas nucleosomales. Por otra parte, hemos generado y caracterizado ratones en los cuales hemos eliminado la actividad acetil-transferasa de histonas de CBP específicamente en neuronas posmitóticas del cerebro anterior y hemos observado que la pérdida de CBP causa una reducción dramática de la acetilación de histonas, particularmente de las histonas H2A y H2B. Sorprendentemente, estos animales no muestran ninguna pérdida aparente de neuronas incluso 8 meses después de la eliminación de CBP (Valor et al., 2011). Estos resultados indican que la relación entre acetilación de histonas y neurodegeración es más compleja de lo que pensábamos y abre la posibilidad de que los efectos beneficiosos de los HDACi no se deban a su acción sobre las histonas, sino sobre sustratos no histónicos, como factores de transcripción y proteínas del citoesqueleto. 3 c. Reducción de la patología de la EH mediante el incremento de la acetilación de histonas Hemos utilizado 3 estrategias distintas para examinar el efecto de un aumento de la acetilación de histonas en el modelo murino de la EH N171HD82Q: 1. Tratamiento farmacológico con el HDACi butirato sódico: distintas concentraciones de este compuesto fueron administradas a grupos de ratones N171-HD82Q y controles hermanos de camada, mediante su adición al agua, en comida líquida o inyectados intraperitonealmente. Posteriormente, evaluamos el nivel de acetilación global de las histonas nucleosomales en muestras procedentes de distintas regiones del cerebro relevantes en la EH a distintos tiempos después de iniciarse el tratamiento, en los que no observamos cambios globales. Esta línea de investigación sigue en desarrollo. Para complementar estos estudios, también examinamos el efecto de este compuesto en la fisiología de neuronas hipocampales en cortes de cerebro de ratón. Observamos que el butirato sódico potencia la fase tardía de la LTP, pero no tiene ningún efecto en la transmisión sináptica, la excitabilidad neuronal y las propiedades intrínsecas de las neuronas. 2. Exposición a largo plazo al enriquecimiento ambiental (EA): en el paradigma de EA, los animales se mantienen en jaulas de gran tamaño con juguetes y estímulos varios en lugar de permanecer en las convencionales jaulas de laboratorio. Un estudio reciente por un colaborador del grupo ha demostrado que el EA aumenta el nivel de acetilación de las histonas en el hipocampo de manera global, lo cual podría dar lugar a una reducción de la patología en un modelo murino de la enfermedad de Alzheimer (Fischer et al., 2007, Nature 447, 178-182). Para comprobar si un fenómeno similar podría también tener lugar en el caso de la patología de la EH, examinamos el impacto del EA en ratones N171-HD82Q. Seguimos la evolución de la patología mediante distintos ensayos durante las 12 semanas de tratamiento y observamos que el EA causó un retraso en la evolución de los síntomas, como los temblores, y la muerte del animal, aunque otros síntomas como la pérdida de peso y la aparición de agregados no fueron alterados por este tratamiento. La interacción entre EA y EH bien podría tener lugar a nivel transcripcional, ya que hemos observado en un estudio 4 paralelo que el EA induce una fuerte y bien definida respuesta transcripcional que incluye la sobreexpresión de varios genes importantes para la supervivencia neuronal (Lopez-Atalaya et al., remitido para su publicación). 3. Aumento mediante técnicas genéticas de la actividad HAT: esta tercera y ambiciosa estrategia está aún desarrollándose. Hemos diseñado en el contexto de este proyecto dos estrategias para sobreexpresar la actividad HAT y consiguientemente aumentar el nivel de acetilación de las histonas neuronales, tanto in vitro como in vivo: transgénesis y transducción con lentivirus de una construcción que codifica una proteína de fusión entre el dominio HAT de CBP, la proteína fluorescente GFP y una señal de localización nuclear. La evaluación de la eficacia de estas estrategias está en marcha. d. Patología cerebelar en la EH La caracterización de alteraciones neuropatológicas en el cerebro de ratones N171-HD82Q ha proporcionado un hallazgo interesante que no estaba previsto en el plan original. En estos ratones hay una expresión muy fuerte de mHtt en el cerebelo, primero en la capa de células de Purkinje y después en la capa granular, que correlaciona con la progresión de los síntomas. Aunque en general se considera que la patología cerebelar tiene un papel menor en la EH, la atrofia del cerebelo es una característica clave de las formas de EH de inicio muy temprano. Por lo tanto, la investigación en ratones N171-HD82Q puede ser especialmente importante para entender esta variante, relativamente rara, de la enfermedad. Es más, dado que algunas ataxias cerebelo-espinales afectan principalmente al cerebelo y están también originadas en una extensión de poliglutaminas (en genes distintos de la Htt), los hallazgos en esta línea de investigación pueden resultar también relevantes para esas enfermedades. Por todo ello, hemos decidido explorar en más detalle los cambios en el cerebelo de ratones realizando experimentos con micromatrices de DNA cuyo análisis sigue en marcha. 5 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos La ejecución de este proyecto ha proporcionado nuevos datos que resultan de gran importancia para entender la etiología de la EH y los fundamentos de nuevas terapias experimentales. Pueden ser, por tanto, de gran relevancia para los miles de familias que sufren esta devastadora enfermedad neurodegenerativa. Hemos abordado la reciente hipótesis que propone que cambios epigenéticos en la cromatina desempeñan un papel en neurodegeneración y que drogas que afectan el balance entre la acetilación y la deacetilación de histonas tiene un gran potencial neuroprotector y neurorrestaurador. Nuestros resultados indican que la relación entre acetilación de histonas y neurodegeneración es más complejo de lo esbozado en estudios recientes, ya que no existe una relación directa entre la deficiencia en CBP y la hipoacetilación de histonas neuronales y la neurodegeneración. Nuestros experimentos han revelado que la acetilación global de histonas no está afectada en algunos modelos de la EH y demostrado que la reducción severa del estado de acetilación no conlleva la muerte neuronal. Estas observaciones exigen una revisión de la hipótesis epigenética de la EH y abren la posibilidad de que las dianas terapéuticas de los HDACi no sean histonas, sino otro tipo de proteínas, como factores de transcripción o proteínas del citoesqueleto. Además, las herramientas genéticas generadas en el contexto de este proyecto serán esenciales en estudios futuros para examinar la eficacia de manipular el estado de acetilación de proteínas en el tratamiento de la EH. 4. Publicaciones Barco A, Lopez de Armentia M and Alarcon JM. Synapse-specific stabilization of plasticity processes: The synaptic tagging hypothesis revisited ten years later. Neurosci Biobehav Rev. 32(4):831-51. Factor d’impacte 2009 (IF): 7,8. 6 Viosca J, Lopez de Armentia M, Jancic D and Barco A (2009). Enhanced CREB-dependent gene expression increases the excitability of neurons in the basal amygdala and primes the consolidation of contextual and cued fear memory. Learn Mem 16(3): 193-197. IF: 4,1. Viosca J, Malleret G, Bourtchouladze R, Benito E, Vronskava S, Kandel ER and Barco A (2009). Chronic enhancement of CREB activity in the hippocampus interferes with the retrieval of spatial information. Learn Mem 16(3): 198-209. IF: 4,1. Jancic D, Lopez de Armentia M, Valor LM, Olivares R and Barco A (2009). Inhibition of cAMP-response element binding protein reduces neuronal excitability and plasticity, and triggers neurodegeneration. Cerebral Cortex 19(11): 2535-47. IF: 7,0. Viosca J, Schuhmacher A, Guerra and Barco A (2009). Germ line expression of H-RasG12V causes neurological deficits associated to Costello syndrome. Genes Brain Behav 8(1): 60-71. IF: 3,8. Sanchis-Segura C, Lopez-Atalaya JP and Barco A (2009). Selective boosting of transcriptional and behavioral responses to drugs of abuse by histone deacetylase inhibition. Neuropsychopharmacology 34(13):2642-54. IF: 7,0. Benito E and Barco A (2010). CREB's control of intrinsic and synaptic plasticity: Implications for CREBdependent memory models. Trends Neurosci 33(5): 230-40. IF: 12,8. 7 Valor LM, Jancic D, Lujan R and Barco A (2010). Ultrastructural and transcriptional profiling of neuropathological misregulation of cAMP-response element binding protein function. Cell Death Differ 17(10):1636-44. IF: 8,2. Valor LM and Barco A (2010). Hippocampal gene profiling: Toward a systems biology of the hippocampus. Hippocampus. Nov 15, disponible on-line. IF: 3,9. Valor LM, Pulopulos MM, Jimenez-Minchan M, Olivares R, Lutz B and Barco A (2011). Ablation of CBP in forebrain principal neurons causes modest memory and transcriptional defects and a dramatic reduction of histone acetylation, but does not affect cell viability. J Neurosci 31(5): 1652-63. IF: 7,2. Lopez-Atalaya JP, Ciccarelli A, Viosca J, Jimenez-Minchan M, Canals S., Giustteto M and Barco A. CBP is required for environmental enrichment-induced neurogenesis and cognitive enhancement. (Remitido.) 8