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Química Orgánica II
Aminoácidos y Proteínas
Trabajo Práctico de Laboratorio 4
Tema: Aminoácidos y Proteínas
Introducción Teórica
AMINOÁCIDOS
 Propiedades químicas
Los aminoácidos poseen en su estructura un grupo ácido y un grupo básico, por lo
cual presentan propiedades anfotéricas. Un anfolito es aquella especie que puede aceptar y
donar protones (H+). En una solución de bajo pH, los aminoácidos están totalmente
protonados y tienen una carga positiva. Si la solución es casi neutra, los aminoácidos existen
como iones dipolares, o sea iones con una carga positiva y una carga negativa. Los iones
dipolares también se conocen como zwitteriones. Un aminoácido que existe como un ion
dipolar es neutro ya que las cargas, positiva y negativa, se cancelan. Para valores de pH altos,
los aminoácidos se cargan negativamente. En solución se establece un equilibrio entre las
tres formas.
Por ejemplo, para el aminoácido glicina:
•
A pH 2 todos los grupos aparecen protonados: -COO- como -COOH y -NH2 como NH3+. El aminoácido tiene una carga positiva neta.
•
A partir de pH 2,34 (pK1) el carboxilo se disocia (-COO-) y el amino sigue protonado (NH3+). El aminoácido tendrá simultáneamente carga positiva y negativa (zwitterion).
•
A partir de pH 9,60 (pK2) el carboxilo sigue disociado (-COO-) y el amino pierde el
protón (-NH2). El aminoácido queda con una carga negativa neta.
Si analizamos el movimiento electroforético de los aminoácidos a distintos valores de
pH, encontraremos un valor al cual su movilidad es nula. Este valor de pH corresponde a la
condición en la cual la especie dominante es aquella que no posee carga eléctrica neta. Este
valor de pH recibe el nombre de punto isoeléctrico (pI). Podemos definir entonces al pI
como el valor de pH al cual un aminoácido, un péptido o una proteína poseen carga neta
“0”. Este valor se puede calcular a partir de la curva de titulación o empleando la siguiente
ecuación: pI= (pK1+ pK2)/2.
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 Titulación en presencia de formaldehido
Este procedimiento de titulación de aminoácidos con un hidróxido en presencia de
formaldehido fue diseñado por Sørensen en 1907 y se basa en el consumo de la especie con el
grupo amino libre, lo cual produce un desplazamiento a la derecha del equilibrio indicado como
pK2, con la consiguiente liberación de protones y acidificación del medio. El descenso en los
valores de pH se registra a partir de la generación de la especie nucleófila, es decir a partir del
punto de inflexión correspondiente al valor de pK del grupo amino.
En el caso de un aminoácido dicarboxílico, como ácido aspártico como por ejemplo:
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En este caso, para calcular el pI deben considerarse los valores de pK que rodean a la
especie de carga neta 0.
Por último, para el caso de un aminoácido dibásico, como arginina, se observa que:
Al igual que en caso anterior para calcular el pI deben considerarse los valores de pK
que rodean a la especie de carga neta 0, encontrándose el zwitterion a pH básico.
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Una reacción característica de aminoácidos es la conjugación de su grupo amino con
ninhidrina. Esta reacción es de gran utilidad porque genera un aducto coloreado que sirve
como revelador en cromatografía en placa delgada (CCD).
 Reacción general de un aminoácido con ninhidrina
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Mecanismo de reacción
Reacción de ninhidrina con el aminoácido prolina
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ENLACE PEPTÍDICO
Una unión peptídica es un enlace amida entre el grupo α-amino de un aminoácido y
el α-carboxilo de otro. Como cualquier amida su estructura presenta más de una forma
contribuyente con buen peso en su híbrido de resonancia:
Esta es una característica central de péptidos y proteínas, que determina no solo la
arquitectura proteica, sino también cuestiones importantes en relación a su química. Una de
ellas es la interpretación de su mecanismo de hidrólisis en medio ácido, dónde el análisis de
las estructuras contribuyentes al híbrido de resonancia justifica la posición más básica del
enlace.
CH C
CH3
CH3
CH3
CH CH3
CH CH3
CH CH3
CH2
OH
H3N
CH3
H
N
CH C
OH
H3N
H
N
CH C
CH C
H3N
OH
CH C
H
N
CH C
O
CH3
O
CH3
O
CH2
OH
CH2
OH
O
lenta
H
CH3
CH33
CH CH3
CH
CH CH
CH33
CH
CH C
C
CH22
H22
N
N CH
CH C
C
CH
CH33 O
O
O
OH
OH
H
H33N
N
OH
OH
CH CH3
CH C
CH3
O
CH2
H3N
H3N
CH C
CH3 OH2
CH3
H3N
CH2
OH
H
H
OH
H
CH C
O
6
OH
H
N
CH C
O
OH
OH
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INSULINA
La insulina es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y
secretada por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. La insulina es una
hormona anabólica por excelencia, ya que permite disponer a las células del aporte
necesario de glucosa para los procesos de síntesis con gasto de energía. Esta hormona
reduce el nivel de glucosa en la sangre y promueve el almacenamiento de glucosa como
glucógeno y grasa.
La insulina está constituida por dos secuencias de aminoácidos. La cadena A tiene 21
aminoácidos, y la cadena B tiene 30 aminoácidos. Las cadenas están unidas entre sí a través
tres puentes disulfuro. Las hormonas peptídicas por lo general son diferentes para cada
especie, aunque conservan similitudes importantes. La insulina humana es idéntica a la
insulina de cerdo, excepto que el último aminoácido de la cadena B del cerdo es alanina (Ala)
en vez de treonina (Thr).
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ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
La electroforesis es una técnica basada en los movimientos de moléculas cargadas en
un campo eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (cátodo y
ánodo), este movimiento denominado “electroforesis” da nombre a la técnica. En el
transporte electroforético, a la fuerza del campo eléctrico se opone la resistencia viscosa del
medio, produciéndose, cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las
partículas.
En resumen, puede asumirse que cuando una molécula cargada se coloca en un
campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo tanto de su densidad de
carga y de la intensidad del campo eléctrico.
La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de
compuestos que poseen grupos ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas y ácidos
nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias dependerá del pH del
medio en que se encuentren. Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo y si
tiene carga negativa migrará hacia el ánodo. La fuerza iónica de la solución buffer tiene una
importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite
velocidades de migración de los solutos más rápidas y con menor desprendimiento de calor.
Como se describió previamente, las proteínas pueden encontrarse cargadas positiva
o negativamente o permanecer eléctricamente neutras, según la proporción de los diversos
grupos ionizados a un determinado pH. En su pI una proteína tiene carga neta cero. Por
debajo de los valores de pI las proteínas estarán cargadas positivamente y por encima,
negativamente.
Las proteínas de suero humano se pueden separar mediante esta técnica. Sus puntos
isoeléctricos están entre 4,9 (albúmina) y 7,4 (γ -globulinas). Al realizar la electroforesis con
un buffer de pH= 8,6, todas las proteínas del suero tendrán carga negativa. La albúmina, al
tener el punto isoeléctrico más alejado del pH, tiene más carga negativa y avanza más
rápido, quedando más cerca del polo positivo que las γ -globulinas, que migran muy poco
por ser el pH del buffer de corrida próximo a su pI. Las restantes proteínas séricas quedan
situadas entre estas dos.
En suero humano la composición normal es:
Albúmina
54 - 62%
α-globulinas
9 - 15%
β-globulinas
8 - 13%
γ-globulinas 14% - 19%
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El perfil de un electroforetograma de un suero humano adulto normal es similar al
representado en el siguiente esquema.
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Parte práctica
Parte 1: Propiedades anfotéricas de los aminoácidos. Curva de Titulación de Glicina
Objetivo: Obtener la curva de titulación en función del pH, de glicina, en ausencia y presencia
de formaldehido. Comparar las curvas obtenidas, calcular los pKa correspondientes y el punto
isoeléctrico del aminoácido.
Conocimientos necesarios para la realización e interpretación del trabajo
•
Equilibrio ácido-base. Nomenclatura y formulación de Bronsted-Lowry y Lewis. pH.
Curva de titulación de ácidos débiles.
•
Aminoácidos como iones dipolares. Curvas de titulación, en medio acuoso y con el
agregado de formol, etanol o acetona. pH observados. Formas iónicas.
•
Punto isoeléctrico de un aminoácido. Cálculo del mismo.
Realizar las siguientes curvas de titulación:
1) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, titulado con NaOH 1 M.
2) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, con formol (glicina 0,05 M; formol 1 M) titulado con
NaOH 1 M.
Para realizar la curva 1 prepare la siguiente solución:
Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto)
HCl 1 M................... 10,00 ml (exacto)
Agua destilada......... 180,00 ml (exactos)
Para realizar la curva 2 prepare la siguiente solución:
Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto)
HCl 1 M................... 10,00 ml (exacto)
Formaldehído.......... 01,00 ml (exacto)
Agua destilada......... 170,00 ml (exactos)
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 Colocar en un erlenmeyer de 500 ml la mezcla inicial a titular, preparar la bureta con
la solución titulante de NaOH 1M. (Asegure el buen funcionamiento de los robinetes.
El pHmetro deberá estar calibrado con buffer pH 4,0 a temperatura ambiente).
Precauciones: La medición de los volúmenes de glicina, ácido clorhídrico y formaldehído deberá
realizarse con exactitud, para ello se utilizará pipetas de doble aforo (usar una pipeta distinta en
cada caso).
 Titulación
Colocar en el vaso de precipitación la solución a titular, a temperatura ambiente, con
el agitador. Introducir con mucho cuidado el electrodo de vidrio hasta que el líquido cubra el
bulbo y el orificio de unión líquida del electrodo. Acercar la bureta de modo que el pico de la
misma esté dentro del vaso de precipitación.
Agitar por un momento; dejar reposar el líquido y medir el pH inicial de la solución.
Dejar caer un volumen de la solución de titulación y agitar suavemente (los volumenes a
agregar se encuentran en la tabla de valores). Dejar de agitar y proceder a la lectura del pH.
Continuar agregando la solución de titulación según lo indicado en la tabla de valores,
agitando después de cada agregado y dejando de agitar, para luego realizar la lectura de pH.
Proseguir la titulación hasta pH extremo (alrededor de pH 10-12) con NaOH.
Tabla de valores
Glicina
Glicina + Formaldehído
pH
pH
NaOH 1M (ml)
0
0.3
0.6
1
2
3
4
5
6
11
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7
8
9
10
10.3
10.6
11
11.3
11.6
12
13
14
15
16
17
18
19
20.0
Precauciones: Al llegar al pH extremo no dejar el electrodo de vidrio sumergido en la solución
por más de 2 ó 3 minutos (especialmente en medio alcalino), dado que el vidrio con el que está
fabricado el electrodo es atacado y pierde sensibilidad. Inmediatamente, sacar el electrodo y
lavarlo con abundante agua bidestilada. Esta precaución es esencial y se considerará falta grave
no tratar el electrodo con estos cuidados.
Al finalizar el trabajo práctico, lavar la microbureta con HCl al 10% y con agua destilada, para
evitar de esta forma que se pegue el robinete y quede inutilizado.
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 Trazar una curva de titulación con pH en las ordenadas y miliequivalentes de reactivo
agregado en las abscisas.
 Comparar las curvas de glicina con formaldehído y sin formaldehído; para ello
grafique las dos curvas de glicina en una misma hoja de papel milimetrado. Indique
los respectivos pK y calcule el punto isoeléctrico del aminoácido glicina.
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Parte 2: Aminoácidos y proteínas
Objetivo: Realizar la hidrólisis química de un péptido natural y observar sus aminoácidos
constituyentes, por análisis cromatográfico en CCD.
1.
Hidrólisis de Insulina
Técnica:
Colocar 1 ml de insulina (80-100 U) en un tubo ampolla y con cuidado, adicionar 1ml
de HCl concentrado. Observe la coagulación de la proteína por adición del ácido. Cerrar el
extremo del tubo sobre la llama de mechero (esta paso será llevado a cabo previamente por
el ayudante de laboratorio). Colocar el tubo en un baño de agua a ebullición durante 45
minutos. La temperatura del baño no debe ser inferior a 100 °C, en caso contrario, utilizar
un baño de glicerina.
Transcurrido el tiempo de calentamiento, cortar el extremo del tubo ampolla y volcar
su contenido con precaución, en un vidrio de reloj. Llevar a seco sobre un manto de
evaporación. Una vez seco, retomar el extracto con 2-3 gotas de ácido acético diluido y
realizar los cromatogramas correspondientes.
2. Cromatografía en placa del hidrolizado de insulina
Condiciones de la cromatografía
Material:
Fase estacionaria: Sílica gel.
Solvente de corrida: Butanol: ácido acético: agua (60:20:20)
Revelador: Ninhidrina (solución alcohólica 1.5 %)
Con el extracto obtenido, realizar la cromatografía empleando los patrones de
aminoácidos disponibles disueltos en ácido acético. Una vez desarrollada la cromatografía,
secar la placa, revelarla y colocarla en la estufa a 120 °C durante unos minutos.
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Parte 3: Fraccionamiento de proteínas séricas por electroforesis
Objetivo: Separar mediante la técnica electroforética las proteínas presentes en el suero,
utilizando como soporte acetato de celulosa.
1. Obtención de suero
A partir de 10 ml de sangre extraída sin anticoagulante, separar el suero por
centrifugación a 3000 rpm durante 5-10 minutos (esta paso será llevado a cabo previamente
por el ayudante de laboratorio).
2. Puesta a punto de soporte
Sumergir las tiras de 8,5 cm por 2,5 cm de acetato de celulosa en solución buffer de
veronal-veronal sódico, pH 8,6 y fuerza iónica 0,036, durante como mínimo 10 minutos o
hasta saturación. Eliminar mediante suave presión entre papeles de filtro el exceso de
buffer.
3. Ubicación del soporte en la cámara de electroforesis
Colocar las tiras (con pinzas) en el puente correspondiente. El contacto soportebuffer, se efectúa mediante papel de filtro Whatman N°1 del mismo ancho de la tira. Se
debe evitar el contacto directo de las tiras de soporte con la solución buffer, para prevenir
distorsiones del frente.
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4. Sembrado de la muestra y desarrollo del electroforetograma
Sembrar (con capilar) el suero en una banda estrecha que no alcance los bordes de la
tira de acetato de celulosa y a 2 cm del extremo catódico. Desarrollar la corrida
electroforética durante 60 minutos aplicando un potencial de 200 V, resultando un amperaje
de 1 a 1,5 Amp por tira.
5. Coloración
Una vez finalizada la operación anterior, retirar las tiras y sin secar, sumergir en la
solución colorante (Negro de Amido 10 B (Amidoschwarz 10 B) al 0,5% en agua) durante 30 a
60 segundos.
6. Decoloración
Se procede a remover el exceso de colorante usando una mezcla de metanol-ácido
acético (95:5), renovando la solución de lavado hasta que no extraiga más colorante.
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Algunas consideraciones a tener en cuenta:
a. Conservación de las tiras de acetato de celulosa:
El paquete abierto debe conservarse en posición vertical hasta que se utilicen todas
las tiras. Si las 25 tiras se usan en el lapso de una semana, agregar agua dentro del paquete;
pero si se usan en un período superior a los 15 días, conservarlas en un recipiente
conteniendo metanol. No dejarlas secar al aire porque las tiras pierden las dimensiones y las
características del gel.
b. Reconocimiento de la superficie permeable por las proteínas:
Sólo una superficie es permeable por las proteínas y se reconoce fácilmente porque
es más opaca, después de secarse entre dos hojas de papel de filtro.
c. Composición del buffer pH 8.6
-
Veronal sódico 0.04 (recomendado)
-
Veronal sódico 5.15 + EDTA
-
Veronal sódico + Veronal ácido
d. Solución de negro amido
-
Metanol 450 ml
-
Ácido acético 100 ml
-
Negro amido 6,0 g
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Agua destilada 450 ml
Precauciones: Utilizar guantes para manipular el suero. No abrir ni sacar las tiras de la cuba
electroforética mientras el equipo se encuentre enchufado.
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