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La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular. La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan: la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro. La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen. la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio. las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética. Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta. La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo. 1 Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas: 1. Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios: o Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. o Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción. En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas. En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras. 2 En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción. Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente. Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar. En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente. 2 Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. 3 Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación. En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido. En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa) Figura a En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos. Figura b Figura c La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia. Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo (figura f). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN. 4 figura e figura f figura d Cósmidos. Son plásmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos) y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el cósmido uniendo los tres elementos génicos, y el resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN. Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador. Genes de luminiscencia. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota. 5 3 Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto. Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente. En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos: Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus. En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar cómo lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana. 4 Clonado del ADN. Una vez que se ha conseguido la población de bacterias transformadas, (recuerda que llevan además del gen de interés un gen por ejemplo de resistencia a un antibiótico por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina), por lo que las bacterias que se consideran transformadas, serán aquellas que sobrevivan. El siguiente paso es poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el gen que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células que llevan todas ese gen de interés. Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés para el hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca genómica. 6 Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es la determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN, conocida como secuenciación de dicho ácido nucléico. Se ha conseguido gracias a las enzimas de restricción y a la posibilidad de obtener numerosas copias de un ácido nucléico por clonación. El método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como la técnica del didesoxi. Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos (figura 1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos un nucleótido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'. Figura 1 Figura 2 Como los nucleótidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucleótido será imposible que se una otro nucleótido y la cadena terminará aquí. Figura 3 (Es necesario tener esto presente para comprender la técnica del didesoxi) Figura 3 7 Abreviadamente, éste sería el método a seguir: Como la técnica se basa en la síntesis de ADN, para hacer la reacción de secuenciación se necesita: Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar. Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena. desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación. Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido (Figura 4). Figura 4 8 Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situación del didesoxinucleótido incorporado. En el caso expuesto en el dibujo, esta reacción de secuenciación se hace con un didesoxi de ADENINA, lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podrá continuarse la polimerización de nuevos nucleótidos, nos queda por tanto un pequeño fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN original, en ese lugar estará el nucleótido complementario que lleva TIMINA. En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucleótidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN original, en esas situtaciones tendremos TIMINA. Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto. Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí, dan la secuencia del ADN. (Figura 5) 9 Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas. La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores. La reacción es un proceso cíclico: 1. La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. 2. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). 3. Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado. APLICACIONES DE LA PCR 1. Secuenciación: Una de las razones más comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su 10 secuenciación. Es mucho más sencillo y rápido que la clonación en células. 2. Estudios evolutivos: Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3. Huellas dactilares del ADN: La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones más interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad. 1. OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc., tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteínas se realizaba mediante su extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales. En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana. 2. OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la mayoría de los factores 11 antigénicos son proteinas lo que se hace es clonar el gen de la proteina correspondiente. 3. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN GENÉTICO: Conociendo la secuencia de nucleótidos de un gen responsable de una cierta anomalía, se puede diagnosticar si este gen anómalo está presente en un determinado individuo. En el siguiente dibujo se explica brevemente la base del diagnóstico. 12 4. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES. Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cáncer y diagnosticarlo incluso antes de que aparezcan los primeros síntomas. Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las características de gran cantidad de plantas para hacerlas más útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas. Las primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas después de haber sido cosechados. Entre los principales caracteres que se han transferido a vegetales o se han ensayado en su transfección, merecen destacarse: o Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas. Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt) dañina para las larvas de muchos insectos, de modo que no pueden desarrollarse sobre las plantas transgénicas con este gen. Respecto a los virus se ha demostrado que las plantas transgénicas con el gen de la proteina de la cápsida de un virus, son resistentes a la invasión de dicho virus. o Incremento del rendimiento fotosintético: Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente. o Mejora en la calidad de los productos agrícolas: Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes. o Síntesis de productos de interés comercial: Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables o Asimilación de nitrógeno atmosférico: Aunque no hay resultados, se ensaya la transfección del gen nif responsable de la 13 nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno, y que permitiría a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos nitrogenados, aumentando la síntesis de proteinas de modo espectacular. La transgénesis se puede definir como la introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares. Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la linea germinal (gametos). Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar: La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación. Manipular de forma específica la expresión génica in vivo. Estudiar la función de genes específicos. Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteinas humanas. La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica. La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas: 1. Transgénesis por microinyección de zigotos 2. Transgénesis por manipulación de células embrionarias. 14 Oveja Dolly La oveja Dolly (5 de julio de 1996 - 14 de febrero de 2003) fue el primer mamífero clonado a partir de una célula adulta. Sus creadores fueron los científicos del Instituto Roslin de Edimburgo (Escocia), Ian Wilmut y Keith Campbell. Su nacimiento no fue anunciado hasta siete meses después, el 23 de febrero de 19971 . Vida de Dolly Dolly fue en realidad una oveja resultado de una transferencia nuclear desde una célula donante diferenciada a un óvulo no fecundado y enucleado (sin núcleo), implantado después en una hembra portadora. La célula de la que venía Dolly era una célula ya diferenciada o especializada, procedente de un tejido concreto —la glándula mamaria— de un animal adulto (una oveja Fin Dorset de seis años), lo cual suponía una novedad, hasta ese momento se creía que sólo se podían obtener clones de una célula embrionaria, es decir no especializada. Cinco meses después nacía Dolly, que fue el único cordero resultante de 277 fusiones de óvulos enucleados con núcleos de células mamarias. Dolly vivió siempre en el Roslin Institute. Allí fue cruzada con un macho Welsh Mountain para producir seis crias en total. De su primera parición nace "Bonnie", en abril de 1998.1 Al año siguiente, Dolly produce mellizos: "Sally" & "Rosie", y en el siguiente parto trillizos: "Lucy", "Darcy" & "Cotton".2 En el otoño de 2001, a los cinco años, Dolly desarrolla artritis comenzando a caminar dolorosamente, siendo tratada exitosamente con drogas antinflamatorias.3 Deceso El 14 de febrero de 2003 (7 años), Dolly fue sacrificada debido a una enfermedad progresiva pulmonar.4 Piénsese que un animal de la raza Finn Dorset como era Dolly tiene una expectativa de vida de cerca de 11 a 12 años, pero Dolly vivió solo seis años. La necropsia mostró que tenía una forma de cáncer de pulmón llamada Jaagsiekte, que es una enfermedad común de ovejas, y es causada por el retrovirus JSRV.5 Los técnicos de Roslin no han podido certificar que haya conexión entre esa muerte prematura y el ser clon, pues otras ovejas de la misma manada sufrieron y murieron de la misma enfermedad.4 Tales enfermedades pulmonares son un particular peligro en las estabulaciones internas, como fue la de Dolly por razones de seguridad. Sin embargo, algunos han especulado que había un factor agravante al deceso de Dolly y era que tenía una edad genética de seis años, la misma edad de la oveja de la cual fue clonada.6 Una base para esta idea fue el hallazgo de sus telómeros cortos, que típicamente es resultado del proceso de envejecimiento.7 8 Sin embargo, el Roslin Institute ha establecido que los controles intensivos de su salud no revelaron ninguna anormalidad en Dolly que pudieran pensar en envejecimiento prematuro.6 15 PROYECTO GENOMA HUMANO El 26 de junio de 2000 es ya una fecha para la historia de la humanidad. Tras 10 años de intensa investigación, el genoma humano, considerado el auténtico libro de la vida, ha sido descifrado en sus partes esenciales. Este logro, que abre una nueva era en la lucha contra las enfermedades, fue anunciado consecutivamente en China, Japón, Francia, Alemania, el Reino Unido y Estados Unidos. Para conseguir este hito, que corona un siglo de investigación biológica, el proyecto público internacional y el privado de la empresa estadounidense PE Celera Genomics abandonaron la pugna que mantenían y decidieron anunciarlo conjuntamente en la Casa Blanca, en una ceremonia presidida por el presidente Bill Clinton El Proyecto Genoma Humano comenzó en 1990 en los Estados Unidos con un presupuesto de 375.000 millones de pesetas y un plazo de 15 años, con el objetivo de analizar molecularmente la herencia genética humana. Se trata de realizar mapas de cada uno de los cromosomas humanos. Implica dividir los cromosomas en pequeños fragmentos que puedan ser caracterizados y posteriormente ordenados en el cromosoma. Este proyecto supone la realización de dos tipos de mapas: Mapas genéticos: Estos mapas simplemente indican la posición relativa de los diferentes genes. Para esta confección se están estudiando la transmisión de caracteres hereditarios, capaces de ser objetivados de una generación a otra en grandes familias. Por ejemplo, en Estados Unidos se han localizado muchos genes gracias a estudios realizados en comunidades mormonas, cuya endogamia es notoria. En 1994 se terminó el primer mapa genético de todo el genoma humano. Mapas físicos: De mayor resolución, pues muestra la secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN que constituye el cromosoma. Se obtiene la secuencia de nucleótidos de un gen. Se realiza fundamentalmente mediante la electroforesis en geles de distintos fragmentos de ADN y la ayuda de ordenadores. El completar este mapa se ha conseguido cinco años antes de lo que se esperaba. 16