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Genética reversa II. Construcciones
antisentido+miRNA+siRNA/RNAi.
Mutagenesis por inserción, únicamente factible en organismos
con elementos de inserción funcionales y sistemas de
transformación altamente eficaces. La producción de colecciones
es costosa. Recolección de alelos de éxito variable
Downregulation mediada por RNA, “únicamente” requiere que el
sistema sea transformable (transitoria- o establemente)
Genética reversa II
En los 80s ya se había observado en E.coli que RNAs de 100 b
complementarios a mRNAs daban lugar a una disminución apreciable
en la síntesis de las correspondientes proteínas
A principios de los 90s ya se conocía en detalle el proceso de
regulación de la traducción mediado por RNA-AS en determinados
genes de C. elegans (genes reguladores lin-4 y let-7)
A lo largo de los 90s se utilizó una estrategia consistente en la
eliminación de la actividad génica mediante la expresión, vía
transgénesis, de un RNA antisentido
Genética reversa II
Ventajas:
Flexibilidad, inactivación de miembros específicos o de toda
una familia de genes (redundancia)
Distintos alelos en distintos eventos de transformación
Dominante?
Genética reversa II
Métodos de análisis:
Presencia de la construcción
Nivel de transcripción
Acumulación de proteína!!!!!!!!!!!
Problemas:
Resultado impredecible
Análisis Genético difícil si se da inestabilidad
Las perspectivas de utilización de esta tecnología han mejorado
cuando se han comprendido las bases moleculares de los
distintos mecanismos de silenciamiento post-transcripcional
Genética reversa II. Construcciones
antisentido+miRNA+siRNA/RNAi.
Plant gene silencing regularized G. Bruening (1998) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95,13349–13351
Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by
simultaneous expression of sense and antisense RNA (1998) P. M.
WATERHOUSE, M. W. GRAHAM, AND M-B. WANG. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95,13959–13964
Virus resistance and gene silencing: killing the messenger (1999) P. M.
Waterhouse, N. A. Smith and M-B. Wang. Trends in Plant Sciences 4, 452-457
Genética reversa II. Construcciones
antisentido+miRNA+siRNA/RNAi.
Lee, RC and Ambros, V (2001). An extensive class of small RNAs in
Caenorhabditis elegans. Science 294, 862-864.
Lau, NC, Lim, LP, Weinstein, EG, and Bartel, DP (2001). An abundant class of
tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science
294, 858-862.
Lagos-Quintana, M, Rauhut, R, Lendeckel, W and Tuschl, T (2001).
Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science 294,
853-858.
MicroRNAs in plants. (2002). Brenda J. Reinhart, Earl G. Weinstein, Matthew
W. Rhoades, Bonnie Bartel and David P. Bartel1. Genes Dev. 16: 1616-1626
Genética reversa II. Construcciones
antisentido+miRNA+siRNA/RNAi.
Potent and specific genetic interference by double-stranded
RNA in Caenorhabditis elegans. (1998). Fire, A, Xu, S,
Montgomery, MK, Kostas, SA, Driver, SE, and Mello, CC Nature
391, 806-811.
RNA as target of double-stranded RNA-mediated genetic
interference in Caenorhabditis elegans. (1998). Montgomery, MK,
Xu S, and Fire A. Proc. Natl Acad. Sci. 95, 15502-15507.
RNA interference: It’s a small RNA world (2001) E. G. Moss.
Current Biology 11
Genome-wide RNAi (2001) R. Barstead Current Opinion in
Chemical Biology 5, 63–66
Genética reversa II
En C. Elegans, la inyección de un RNA duplex provoca pérdida de
función del gen correspondiente.
Genética reversa II
El efecto está mediado por la degradación del correspondiente
mRNA.
Genética reversa II
Conclusiones de los trabajos con RNAi en C. elegans:
1. Silenciamiento inducido por dúplex, apenas por S o AS
2. Específico del RNA homólogo del dsRNA
3. El dsRNA debe corresponder a secuencia de exón, probaron
intrones y promotores sin éxito (mecanismo citoplásmico,
PTGS)
4. El mRNA diana desaparece
5. Unas pocas moléculas de dsRNA/célula son suficientes. El
dsRNA debe amplificarse o actuar catalíticamente
6. El efecto del dsRNA se extendía a otros tejidos e incluso a la
progenie
7. Sugirieron que esto podría explicar el efecto PTGS observado en
plantas
8. Especularon que dsRNA podría explotar un mecanismo
fisiológico de “gene silencing”
Un modelo para el silenciamiento
El mecanismo de RNAi se ha detectado en todos los eucariotas
testados (excepto S. cerevisiae). En células de mamífero no se
pueden usar dsRNA>21 b (sin desencadenar apoptosis).
El problema está siendo diseccionado genéticamente en organismos
modelo como C. Elegans, Drosophila, Arabidopsis o Neurospora
Silencing genes silencing genes (2000) S. N. Covey. Trends in Plant Science 5, 405406
RNA silencing in plants (2004) David Baulcombe. Nature, 431, 356-363.
Dicers at RISC: The Mechanism of RNAi. Cell, Vol. 117, 1–4, April 2, 2004.
RNAi: RISC Gets Loaded. Cell, Vol. 123, 543–553, November 18, 2005
Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642–655, 2009
Inducción de los RNA induced Silencing
complexes (RISC) por siRNA
Excepto insectos y
mamíferos
Inducción de los RNA induced Silencing
complexes (RISC) por siRNA
Genética reversa II
Aplicaciones del modelo
Consruir vectores para generar organismos transgénicos RNAi es fácil
Actualmente existen aplicaciones en red (fundamentalmente en
páginas de casas comerciales) que facilitan el diseño de
construcciones para producir in vivo o in vitro tanto siRNAs como
miRNA
También es posible adquirir librerías de RNAi pre-testados para
experimentos “genome wide”
Discutir validez de experimentos de silenciamiento “transitorio”
Genética reversa II. Un ejemplo
RNA Interference-Based Gene Silencing as an
Efficient Tool for Functional Genomics in Hexaploid
Bread Wheat
Silvia Travella, Theres E. Klimm, and Beat Keller
Plant Physiol.
Volume 142(1):6-20
September 6, 2006
Copyright © 2006. American Society of Plant Biologists. All rights reserved.
Location of the wheat ESTs used to construct the RNAi vectors in their corresponding wheat
consensus sequence and in the corresponding full-length cDNAs identified in rice
Travella S. et.al. Plant Physiol. 2006:142:6-20
Copyright © 2006. American Society of Plant Biologists. All rights reserved.
RNAi-mediated specific silencing of the wEIN2 genes in hexaploid wheat
Travella S. et.al. Plant Physiol. 2006:142:6-20
Copyright © 2006. American Society of Plant Biologists. All rights reserved.
T2 generation analysis of the homozygous T1 EIN2-RNAi transgenic plant 1 generated from
the T0 line 10
Travella S. et.al. Plant Physiol. 2006:142:6-20
Copyright © 2006. American Society of Plant Biologists. All rights reserved.
Genética reversa II. Otro ejemplo
A Global In Vivo Drosophila RNAi Screen Identifies NOT3 as a
Conserved Regulator of Heart Function
Cell 141, 142–153, April 2, 2010
El objetivo de este trabajo es identificar, y caracterizar
funcionalmente, genes implicados en la función cardiaca, en
humanos
La herramienta experimental utilizada inicialmente es el RNAi
condicional en Drosophila. Líneas GAL4/UAS-RNAi del “Vienna
Drosophila RNAi Center” (VDRC)
Genética reversa II. Otro ejemplo
El material transgénico del VDRC permite el análisis del efecto del
RNAi sobre un gen determinado en diferentes condiciones, tejidos..
Gen de interés
Genética reversa II. Otro ejemplo
La efectividad del sistema se ha
comprobado mediante reproducción,
por RNAi, de los fenotipos causados
por mutaciones clásicas
Genética reversa II. Otro ejemplo
El VDCR dispone de stocks de moscas UAS-RNAi que cubren en
conjunto >90% de los genes de Drosophila
Genome-wide RNAi libraries (GD and KK)
P-element library
(GD)
ΦC31 library
(KK)
Available since
2007
2009
Insertion of the UAS-IR
Targeted into VIE-260b landing site,
Random. Insertions mapped to chromosome X,
chromosome 2, at position 22019296 (5' to
2 or 3. Precise locations unknown.
CR33987)
Target selection / PCR template design
Dietzl et al (2007) Nature v448 p151
Horn and Boutros (DKFZ, Heidelberg)
Hairpin length range/average (bp)
109-400 (321)
81-799 (357)
Transformation vector
pMF3 (10x UAS)
pKC26 (10x UAS)
Verification of transformant lines
Restriction digest
Sanger sequencing
Coverage
16,763 lines
11,292 genes (81%)
Average of 1.2 lines/gene
9,822 lines
9,646 genes (69%)
Average of 0.7 lines/gene
Activity
Soma and germline. Enhanced by coexpression of Dicer2
Soma and germline. Enhanced by coexpression of Dicer2
Genética reversa II. Otro ejemplo
A Global In Vivo Drosophila RNAi Screen Identifies NOT3 as a
Conserved Regulator of Heart Function
Cell 141, 142–153, April 2, 2010
En este trabajo se utiliza la colección del VDRC en un screening
“genome wide” en el que los RNAi se expresan en corazón,
buscando eventos de down-regulation que afecten a la función
cardiaca. Se trata de una aproximación de genética directa.
¿Es importante el nivel de expresión final de cada gen diana?
Lo que si es importante es tener en cuenta la posibilidad de efectos
en otros genes
Genética reversa II. Otro ejemplo
El efecto parcial del
RNAi es aquí una
ventaja
De genes conservados
en mamíferos
Genética reversa II. Otro ejemplo
Un screening preliminar con 80 líneas sirve para determinar el tipo de
tratamiento óptimo para descubrir efectos causados por estrés cardiaco
En un experimento control, con factores
transcripcionales de función probada en
corazón (círculos), la mayoría, pero no
todos, los knockdown mostraron un
efecto.
Genética reversa II. Otro ejemplo
En el screening masivo se analizan
7971 líneas, que representan 6751
genes conservados y con potencial
función cardiaca.
Los candidatos fueron re-testados y
en algunos casos se generaron nuevas
líneas RNAi para verificar los
resultados
Finalmente, 490 candidatos mostraron susceptibilidad a estrés cardiaco
con Z>3 (>3 desviaciones estándar de la media). Estos genes fueron
anotados con GO
Junto a genes previamente identificados, el screening identificó un gran
número de genes y rutas no asociadas previamente a la función cardiaca
Genética reversa II. Otro ejemplo
5 de los 8 miembros del
complejo CCR4-Not aparecen
en la colección de líneas con
problemas cardiacos
Genética reversa II. Otro ejemplo
Genética reversa: el complejo
CCR4-Not no ha sido implicado
previamente
en
función
cardiovascular pero 5 de los 8
miembros muestran un claro
fenotipo y otros dos uno más débil.
En una nueva ronda de líneas RNAi,
incluyendo construcciones efectoras
con otro promotor cardiaco, los
datos se confirman
Genética reversa II. Otro ejemplo
Las líneas RNAi para not-3 y UBC4
muestran defectos en diversos parámetros de
la función cardiaca
Y defectos severos en la organización de miofibrillas en el tubo cardiaco
Genética reversa II. Otro ejemplo
Estudios de not-3 en ratón y humanos en el siguiente seminario