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Enzimas
Las enzimas son
biocatalizadores de
naturaleza proteica
(catalizan reacciones bioquímicas que de
otro modo se llevarían a cabo a
velocidades extremadamente lentas)
¡¡aumentan la velocidad 103 a 1020 veces!!
- Como catalizadores, las enzimas
actúan en pequeña cantidad y se
recuperan indefinidamente.
- No llevan a cabo reacciones que
sean energéticamente desfavorables.
- No modifican el sentido de los
equilibrios químicos, sino que aceleran
su consecución.
NOMENCLATURA
Antiguamente las enzimas fueron nombradas
atendiendo al compuesto sobre el que actuaban,
añadiéndole el sufijo -asa o haciendo referencia a
la reacción catalizada.
Así tenemos:
-ureasa, cataliza la hidrólisis de la urea
-amilasa, la hidrólisis del almidón
-lipasa, la hidrólisis de lípidos
-ADNasa, la hidrólisis del ADN
-ATPasa, la hidrólisis del ATP, etc.
Clasificación
Tipo
En la actualidad, se ha adoptado una clasificación
y nomenclatura sistemática, en la que cada
enzima tiene un número de clasificación.
Reacción que cataliza
1. Oxidorreductasas
Transferencia de electrones
(oxido reducción)
2. Transferasas
Transferencia de grupos
funcionales
3. Hidrolasas
Reacciones de hidrólisis
4. Liasas
Adición a dobles enlaces
5. Isomerasas
Reacciones de isomerización
6. Ligasas o sintetasas
Formación de enlaces con
Hidrólisis de ATP
Esquema
Enzimas: Características
•
Son proteínas globulares. Están plegadas formando un surco o
bolsillo en el que encajan la molécula o las moléculas reactivas (el
sustrato) y donde tienen lugar las reacciones. Esta región del
enzima se conoce como sitio activo. El sustrato se une al sitio
activo mediante interacciones débiles como son: puentes de
hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas.
•
Tienen pesos moleculares que oscilan entre 12.000 y un millón.
•
Muchas son estereoespecificas (solo actúan sobre un isómero)
•
Algunas son proteinas conjugadas (necesitan una porción no
proteica)
Enzimas: estereoespecificidad
La acción de la enzima
es
extremadamente
selectiva
sobre
un
substrato
específico.
(tripsina solo corta el
enlace peptidico en Lys
o Arg)
COOC-H
H-C
Fumarato
(= ,trans)
COO-
COOC-H
C-H
COO-
+ N H3+
Aspartasa
COOH3+N-C-H
C-H2
COOL-Aspartato
COOH-C- NH3+
C-H2
COOD-Aspartato
Maleato
(= ,cis)
Enzimas que dependen de un cofactor
Una enzima conjugada completa se denomina
holoenzima, y está formada por una parte proteica
(apoenzima) y un cofactor no proteico (coenzima)
HOLOENZIMA =
APOENZIMA + COENZIMA
Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de
sustancias no proteicas
Existen dos categorías de cofactores:
•Inorgánicos: incluyen iones simples como Zn2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, K+, Na+
•Orgánicos: denominados generalmente coenzimas. Tienen un
significado especial en la nutrición de los mamíferos ya que la mayoría
son derivados de vitaminas o las mismas vitaminas
El papel del cofactor es:
1- Alterar la estructura tridimensional de la proteína o la unión con el substrato
o ambas
2- Participar en la reacción como otro sustrato (gralmente para coenzimas)
Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de
sustancias no proteicas
Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de
sustancias no proteicas
Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de
sustancias no proteicas
La coenzima compensa las transformaciones sufridas por el sustrato
Enzimas que dependen de un cofactor
La actividad optima de algunas enzimas depende de la cooperación de
sustancias no proteicas
La coenzima compensa las transformaciones sufridas por el sustrato
Coenzimas
Adenosine Triphosphate (ATP)
Coenzyme A (CoA)
Nicotinamide Adenine
Dinucleotide (NAD+)
Nicotinamide Adenine Dinucleotide
Phosphate (NADP+)
Flavin Adenine Dinucleotide (FAD)
Coenzimas
Formas oxidada y reducida de NAD (y NADP). El anillo en rojo se reduce por la adicion de
un ion hidruro al C-4
Modo de acción de las enzimas
Modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo
del enzima:
•Modelo llave cerradura
Supone que la estructura del sustrato y la del
centro activo son complementarias, de la misma
forma que una llave encaja en una cerradura. Este
modelo es válido en muchos casos, pero no es
siempre correcto.
Modo de acción de las enzimas
Modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo
del enzima:
•Modelo del ajuste inducido
el sitio activo adopta la conformación
idónea sólo en presencia del sustrato. La
unión del sustrato al centro activo del
enzima
desencadena
un
cambio
conformacional que da lugar a la
formación del producto. Sería algo así
como un cascanueces, que se adapta al
contorno de la nuez
Propiedades de las enzimas
Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser
proteínas y de actuar como catalizadores.
Como proteínas, poseen una conformación natural más estable
que las demás conformaciones posibles. Así, cambios en la
conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad
catalítica. Los factores que influyen de manera más directa
sobre la actividad de un enzima son:
pH
temperatura
cofactores
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Los enzimas poseen grupos químicos
ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2;
tiol -SH, etc.) en las cadenas laterales de
sus aminoácidos. Según el pH del medio,
estos grupos pueden tener carga eléctrica
positiva, negativa o neutra. Como la
conformación de las proteínas depende,
en parte, de sus cargas eléctricas, habrá
un pH en el cual la conformación será la
más adecuada para la actividad
catalítica. Este es el llamado pH óptimo.
Como ligeros cambios del pH pueden
provocar la desnaturalización de la
proteína, los seres vivos han desarrollado
sistemas más o menos complejos para
mantener estable el pH intracelular: Los
amortiguadores fisiológicos.
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
En general, los aumentos
de temperatura aceleran
las reacciones químicas.
Las reacciones catalizadas
por enzimas siguen esta
ley general. Sin embargo,
al ser proteínas, a partir de
cierta temperatura, se
empiezan a desnaturalizar
por
el
calor.
La
temperatura a la cual la
actividad catalítica es
máxima
se
llama
temperatura óptima.
Por encima de esta temperatura, el aumento
de velocidad de la reacción debido a la
temperatura es contrarrestado por la
pérdida de actividad catalítica debida a la
desnaturalización térmica, y la actividad
enzimática decrece rápidamente hasta
anularse
Una enzima es un catalizador que acelera la velocidad
de una reacción quimica
Modo de acción de los catalizadores
Perfil energético de una
reacción espontánea
Perfil energético de una reacción
catalizada
Energía
de
activación
Reacción
catalizada
La acción de los catalizadores consiste en disminuir la energía de
activación (Ea )
Reacciones espontáneas: G < 0
Modo de acción de las enzimas
La enzima (E), se combina con el substrato (S) formando el complejo de
transición, enzima-substrato (E-S), mediante una reacción reversible, cuya
energía de activación es menor que la de la reacción no catalizada. Cuando
se forma el producto de la reacción (P), se regenera de nuevo la enzima (E)
de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molécula de
substrato (S).
E + S  ES  E + P
CINÉTICA ENZIMÁTICA
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información
directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la
especificidad de la enzima
La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas y se utilizan
concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de
reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede
determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición
de los reactivos.
CINÉTICA
Método de las velocidades iniciales:
Consiste en medir la velocidad inicial de
la reacción (v0) para diferentes
concentraciones.
v0 = pendiente de la curva de avance a
tiempo cero.
Condiciones
Mediciones antes de que se consuma el
10% del total del sustrato, ([S]= constante
a lo largo del experimento.)
Además, en estas condiciones no es
necesario
considerar
la
reacción
inversa, ya que la cantidad de producto
formada es tan pequeña que la
reacción inversa apenas ocurre. De esta
forma se simplifican enormemente las
ecuaciones de velocidad.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
La primera clave en cuanto al
comportamiento enzimáticos lo
aportaron
Henri
(1903)
y
Michaelis y Menten (1913).
Durante su trabajo observaron
que
cuando
mantenían
constante E y variaban la S
obtenian
una
relacion
hiperbolica entre la velocidad y
la S
Cinética de orden 0
v=k
Cinética de orden 1
v = k S
Propusieron entonces describir la grafica hiperbólica
como una transición entre una cinética de orden 1 a 0
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Cuando [S]0 es pequeña, la
velocidad
inicial
es
directamente proporcional a la
concentración de sustrato, y por
tanto, la reacción es de primer
orden. A altas [S]0, la enzima se
encuentra saturada por el
sustrato, y la velocidad ya no
depende de [S]0. En este punto,
la reacción es de orden cero y la
velocidad es máxima (Vmax).
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos
etapas:
1- Formación del complejo enzima-sustrato (ES)
2- El complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del
producto, liberando el enzima libre (E + P)
k2
k3
E + S  ES  E + P
k1
Ecuación de Michaelis-Menten:
Relación entre v0 y la
concentración de
sustrato
Hay enzimas que no obedecen la ecuación
de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética
no es Michaeliana. Esto ocurre con los
enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a
[S] no es una hipérbola, sino una sigmoide
(Figura de la derecha). En la cinética
sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S]
en una zona crítica (cercana a la KM) se
traduce en grandes variaciones en la
velocidad de reacción.
Significado de la constante de Michaelis-Menten (KM)
1- KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción
es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de
Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.
•El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato:
- a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato
- a mayor KM, menor afinidad.
•Los valores de KM de muchos enzimas son próximos a los de la
concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas
variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de
toda una ruta metabólica.
Significado de la constante de Michaelis-Menten (KM)
La cantidad de glucosa requerida para el 50% de la saturación es 1000
veces menor que la requerida para alosa. La enzima es mas eficiente para
glucosa y para manosa
k2
k3
E + S  ES  E + P
Significado de la velocidad máxima (Vmax)
k1
1- Es la expresión de la eficiencia del funcionamiento enzimático.
Sin embargo, resulta mas conveniente expresar la eficiencia en términos de
la cantidad molar de cada enzima: la ACTIVIDAD MOLECULAR O NÚMERO DE
RECAMBIO DE LA ENZIMA que representa los moles de sustrato transformado
por mol de enzima por unidad de tiempo
Ejemplo:
anhidrasa carbonica
CO2 + H2O
H2CO3
Un ensayo tipo Michaelis-Menten en condiciones optimas (pH próximo a 7 y
T: 35-37ºC) muestra que 1g de la enzima presenta una Vmax de 1.2 x 10-3
moles de CO2 transformados por minuto. El PM de la enzima es 30000; por lo
tanto 1g representa:
0.000001/30000 moles de enzima = 3.3 x 10-11 moles, entonces:
actividad molecular 

Vmax
moles de E presente
1.2 x 103 moles de CO2 transformados / min
3.33 x 1011 moles de enzima
 36 x 106  moles de CO2 / min/ mol de enzima
CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a
[S]0) es una hipérbola La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la
curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a
la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.
CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo
utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es
una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de
representación de Lineweaver-Burk Es una recta en la cual:
La pendiente es KM/Vmax
La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM
La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax
1
vo

KM
1
Vmax S 0

1
Vmax
De esta forma, a partir de los datos
experimentales
se
puede
calcular
gráficamente, los valores de KM y Vmax de
un enzima para diversos sustratos.
CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
En el estudio de la actividad catalítica de una enzima se obtuvieron los
siguientes datos experimentales, a partir de los cuales deben
determinarse los valores de KM y Vmax Rta: KM :2.27 mM y Vmax: 0.51
mg/min
S
(mM)
Producto
formado
(mg/min)
1.5
0.21
2.0
0.24
3.0
0.28
4.0
0.33
8.0
0.40
16
0.45
1
vo

KM
1
Vmax S 0

1
Vmax
Inhibición enzimática
Algunos antibióticos, medicamentos quimioterapéuticos, insecticidas y
herbicidas son sustancias que interfieren en el funcionamiento de enzimas
específicas. En las células naturalmente se producen inhibiciones de
enzimas lo que se conoce como biorregulación.
Los inhibidores pueden unirse reversible o irreversiblemente a las enzimas.
Los inhibidores irreversibles se unen covalentemente a residuos
aminoacídicos de la enzima impidiendo su acción. Este es el efecto de
Hg+2, Pb+2 , los gases neurotóxicos y los compuestos arsenicales.
Los inhibidores reversibles se unen a la enzima por el mismo tipo de
interacciones que se producen entre las enzimas y los sustratos y dentro de
ellos se encuentran los inhibidores competitivos y no competitivos.
Casos
1- Competitiva
2- No competitiva
3- Irreversible
Inhibición enzimática competitiva
sitio
activo
Sustrato
E
inhibidor
ES
productos
el inhibidor
evita la
unión del
sustrato al
sitio activo
EI
Tanto el
sustrato
como el
inhibidor
pueden
unirse al
sitio activo
No se afecta la Vmax pero KM tiene
un valor mayor
El
inhibidor
competitivo
tiene
generalmente una estructura similar a
la del sustrato.
El complejo EIcomp no da productos y
disminuye el número de moléculas de
E
libres
en
condiciones
de
interaccionar con el S.
¿Cómo se detecta?
Se mide v0 en función de S en
presencia y ausencia de I
Inhibición enzimática competitiva
El Inhibidor es análogo químicamente al
sustrato
Tanto el
sustrato
como el
inhibidor
pueden
unirse al
sitio activo
Bezamidina inhibe a tripsina..
Inhibición enzimática no competitiva Cuando el efecto de una sustancia
sitio
activo
sitio
del
inhibidor
S
I
E
EI
EIS
En ausencia del
inhibidor
procede la
formación del
producto
La unión
del
inhibidor
distorsiona
la enzima
el
sustrato
y el
Inhibidor
pueden
unirse al sitio
activo
simultáneamente
el inhibidor
disminuye la
velocidad de
formación del
producto
inhibidora no se puede revertir
aumentando la [S], el inhibidor es no
competitivo.
EL I se une a un sitio distinto al sitio
activo y por eso puede formarse el
complejo
enzima-sustrato-inhibidor
(EIS) que no da productos.
La presencia del I actúa como si
disminuyera la [E] presente y por eso
nunca se llega a la Vmax por más que
se aumente la [S]. Las moléculas de E
libre que están en condiciones de
actuar y dar producto, se comportan
como si no hubiera inhibidor y por eso
KM no varía.
Si la afinidad de S es la misma por E y EI y la afinidad de
I es la misma por E y ES es una inhibición no
competitiva pura
Si las afinidades son diferentes cambia tanto Vmax como
KM y se trata de una inhibición no competitiva mixta
Eventos en el sitio activo
El sitio activo contiene residuos de aminoácidos que participan
directamente en la producción y ruptura de los enlaces. Estos residuos se
denominan grupos catalíticos.
Aunque las enzimas difieren ampliamente en estructura, especificidad y
modo de acción se pueden establecer algunas generalizaciones:
es una pequeña
porción del
volumen total
de la E
es una entidad
tridimensional
formada por
grupos laterales
de los
aminoácidos de
la proteína
Sitio activo
la unión ES
ocurre por
numerosas
fuerzas debiles
son hoyos o
hendiduras
(microambientes)
su disposición
en cuanto a los
átomos
determina la
especificidad
de la enzima
(llavecerradura, etc)
Eventos en el sitio activo
¿Quiénes son estos residuos catalíticos responsables de la actividad de las
enzimas?
Son aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas
• serina
• treonina
• cisteina
• ácido aspártico
• ácido glutámico
Serina
• lisina
• arginina
• tirosina
• histidina
Treonina
Ácido Aspártico
Cisteina
Ácido Glutámico
Eventos en el sitio activo
¿Cómo operan estos residuos catalíticos?
1- Catálisis por tensión de enlace: Las interacciones entre los grupos R de
las proteínas y el sustrato originan perturbaciones en los ángulos de enlace
o la longitud de la molécula de Sustrato
2- Catálisis ácido-base: los grupos R pueden actuar como donores o
aceptores de protones (ácidos o bases de Bronsted) o electrones (ácidos o
bases de Lewis)
3- Catálisis por orientación: los grupos R y el sustrato están en una
orientación optima para reaccionar unos con otros
Eventos en el sitio activo
Carboxipeptidasa A
actúa sobre el extremo
carboxilo terminal de los
polipéptidos (se utiliza para
determinar la secuencia de
manera similar a la tripsina)
Consta de 307 residuos de
aac, su PM es 34000 contiene
Zn2+ como cofactor
La ruptura C-N ocurre debido
a un aumento en la
polarización del enlace C=O
debido a la influencia el Zn2+ y
la donación de protones de
tirosina, entre otros eventos
residuos catalíticos
polinucleótido
cofactor
ESPECIFICIDAD ENZIMATICA
La especificidad de las enzimas es una consecuencia del alto grado de
organización del sitio activo (secuencia de aminoacidos)
Tipos de especificidad
Absoluta
cada E cataliza
solo una reacción
Sitio activo
altamente
ordenado y rígido.
(Modelo llave
cerradura)
Relativa
pueden catalizar el mismo
tipo de reacción con mas
de un sustrato similar
Sitio activo flexible, puede
sufrir ligeras modificaciones
(Modelo del encaje
inducido)
Estereoespecificidad
La enzima “distingue” o “reconoce” grupos quimicos identicos (estereoisomeros)