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DETECCIÓN DE BIOMOLÉCULAS POR TÉCNICA DE ELECTROFORESIS DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA 1. Se polimeriza el gel de agarosa en un molde que permite la formación de muescas, a continuación se coloca a modo de lamina entre dos placas de vidrio, con las muescas hacia arriba, que se sitúan a su vez, entre la cubeta superior e inferior . 2. En cada muesca superior se aplica con una micro pipeta una muestra diferente, que contiene los fragmentos de ADN (o proteína) que se desea separar, disuelta en una solución tampón. 3. Se añade a cada muestra glicerol para que aumente la densidad y no se mezcle con la solución tampón de la cubeta superior. Se añade un colorante de localización, que se desplaza más rápidamente que el fragmento de ADN. Cuando este colorante se aproxima al extremo inferior del gel es la señal para detener la electroforesis 4. Las cubetas superior e inferior contienen una solución de electrolitos tamponada en las que se colocan los electrodos: en la cubeta superior, el cátodo y en la inferior, el ánodo. - Cubetas: cámara con los electrodos situados en dos receptáculos que se conectan por un puente salino cuya función es permitir el paso de la corriente. A través de este puente pasara corriente provocando la migración de las partículas en función de su carga eléctrica. 5.Entre las cubetas se hace pasar una corriente continua de 100V durante un tiempo suficiente para que se produzca la separación del ADN de cada muestra, que lo harán en función de su carga neta y su tamaño → definen un parámetro característico de cada fragmento (movilidad electroforética). Los grupos fosfato de ADN adquiere carga neta negativa y migraran hacia el ánodo. Evidentemente, los fragmentos con más carga neta negativa se moverán más de prisa hacia el ánodo, pero si son voluminosos verán frenado su movimiento por el retículo formado por el gel. 6. Al cabo de un tiempo, la mezcla de fragmentos del ADN se ha separado en bandas que se pueden identificar y poner de manifiesto si tenemos la lamina de agarosa con colorantes fluorescentes, como el bromuro de etidio (agente intercalante usado comúnmente como marcador de ácidos nucleicos), que hace visible las bandas bajo la luz ultravioleta 7. La movilidad electroforética de los distintos fragmentos de ADN, medida en milímetros recorridos por cada fragmento de ADN en gel, es proporcional a su tamaño, medido en pares de bases. FACTORES QUE INTERVIENEN • • • • La carga neta de la sustancia en migración La fuerza iónica del medio La estructura y el tamaño de la sustancia El potencial del campo eléctrico utilizado durante el proceso • El soporte utilizado • La intensidad y características generales de la corriente eléctrica aplicada • El revelado FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS • Las moléculas ionizadas en un campo eléctrico experimentan fuerza de atracción hacia el polo que de carga opuesta • Iones de = tamaño, el de > carga eléctrica migrara más rápido. Iones con = carga migrara mas aquel de < tamaño • El movimiento de las moléculas depende de la Eo cinética y de la temperatura generado por el voltaje Esquema simplificado de la electroforesis TIPOS DE ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS CONVENCIONAL ELECTROFORESIS CAPILAR ELECTROFORESIS CONVENCIONAL • Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse. • La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza, caracterización, cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y RNA. • Mayor resolución. Ausencia de efectos cromatográficos (como puede ser la absorción y el intercambio iónico. No reacciona químicamente con la muestra analizada. Transparencia completa ELECTROFORESIS CAPILAR • Esta técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado, lo cual, no permite aumentar el potencial, esto se debe a que el calentamiento de joule aumenta hasta afectar la calidad de separación. • Por lo tanto ésta se realiza en un tubo capilar de sílice con un diámetro inferior a 0.1mm y una longitud de 50cm a 1m, relleno de un tampón, que también contiene los electrodos de platino. La introducción se lleva a cabo por uno de los extremos y la detección en el otro. • Una de las ventajas de la electroforesis capilar es su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y en la investigación biológica y bioquímica, y además en esta técnica se le puede aplicar altos voltajes reduciendo el tiempo de análisis y altas eficiencias. APLICACIONES • En Proteínas Es necesario desnaturalizar las proteínas con detergente (dodecilsulfato sódico / dodecilfosfato sódico ) Análisis del grado de pureza de una proteína Identificación de proteínas inmunoprecipitadas Determinación de su peso molecular. Verificación de la concentración de proteínas. Detección de proteólisis • En ADN Las moleculas presentan cargas eléctricas que varían debido a sus plegamientos por fuerzas no covalentes. APLICACIONES CLÍNICAS • Detección de ciertos antígenos relacionados con el diagnostico de ciertas enfermedades • Se usa en exámenes como ELISA. • Es aplicado en la prueba de inmunoelectrotransferencia (“WESTERN BLOT”)