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DETECCIÓN DE BIOMOLÉCULAS
POR TÉCNICA DE
ELECTROFORESIS
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA
1. Se polimeriza el gel de agarosa en un molde
que permite la formación de muescas, a
continuación se coloca a modo de lamina entre
dos placas de vidrio, con las muescas hacia
arriba, que se sitúan a su vez, entre la cubeta
superior e inferior .
2. En cada muesca superior se aplica con una micro
pipeta una muestra diferente, que contiene los
fragmentos de ADN (o proteína) que se desea
separar, disuelta en una solución tampón.
3. Se añade a cada muestra glicerol para que
aumente la densidad y no se mezcle con la
solución tampón de la cubeta superior. Se añade
un colorante de localización, que se desplaza más
rápidamente que el fragmento de ADN. Cuando
este colorante se aproxima al extremo inferior del
gel es la señal para detener la electroforesis
4. Las cubetas superior e inferior contienen una
solución de electrolitos tamponada en las que se
colocan los electrodos: en la cubeta superior, el
cátodo y en la inferior, el ánodo.
- Cubetas: cámara con los electrodos situados en
dos receptáculos que se conectan por un puente
salino cuya función es permitir el paso de la
corriente. A través de este puente pasara corriente
provocando la migración de las partículas en
función de su carga eléctrica.
5.Entre las cubetas se hace pasar una corriente
continua de 100V durante un tiempo suficiente
para que se produzca la separación del ADN de
cada muestra, que lo harán en función de su carga
neta y su tamaño → definen un parámetro
característico de cada fragmento (movilidad
electroforética).
Los grupos fosfato de ADN adquiere carga neta
negativa y migraran hacia el ánodo.
Evidentemente, los fragmentos con más carga
neta negativa se moverán más de prisa hacia el
ánodo, pero si son voluminosos verán frenado su
movimiento por el retículo formado por el gel.
6. Al cabo de un tiempo, la mezcla de fragmentos del
ADN se ha separado en bandas que se pueden
identificar y poner de manifiesto si tenemos la lamina
de agarosa con colorantes fluorescentes, como el
bromuro de etidio (agente intercalante usado
comúnmente como marcador de ácidos
nucleicos), que hace visible las bandas bajo la luz
ultravioleta
7. La movilidad electroforética de los distintos
fragmentos de ADN, medida en milímetros recorridos
por cada fragmento de ADN en gel, es proporcional a
su tamaño, medido en pares de bases.
FACTORES QUE INTERVIENEN
•
•
•
•
La carga neta de la sustancia en migración
La fuerza iónica del medio
La estructura y el tamaño de la sustancia
El potencial del campo eléctrico utilizado
durante el proceso
• El soporte utilizado
• La intensidad y características generales de la
corriente eléctrica aplicada
• El revelado
FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS
• Las moléculas ionizadas en un campo eléctrico
experimentan fuerza de atracción hacia el polo que
de carga opuesta
• Iones de = tamaño, el de > carga eléctrica migrara
más rápido. Iones con = carga migrara mas aquel
de < tamaño
• El movimiento de las moléculas depende de la Eo
cinética y de la temperatura generado por el voltaje
Esquema simplificado de la electroforesis
TIPOS DE ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ELECTROFORESIS CAPILAR
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
• Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras
simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre el gel,
se aplica un potencial de corriente continua a través del
mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se
han completado se interrumpe el paso de corriente y las
especies separadas se tiñen para visualizarse.
• La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección,
control de pureza, caracterización, cuantificación (por
comparación con controles) así como preparación y
purificación (por extracción de bandas desde el gel) de
moléculas y fragmentos de DNA y RNA.
• Mayor resolución. Ausencia de efectos cromatográficos (como
puede ser la absorción y el intercambio iónico. No reacciona
químicamente con la muestra analizada. Transparencia
completa
ELECTROFORESIS CAPILAR
• Esta técnica alternativa de la electroforesis convencional y
surge debido a que la velocidad de separación y resolución de
los compuestos mejora a medida que aumenta el campo
eléctrico aplicado, lo cual, no permite aumentar el potencial,
esto se debe a que el calentamiento de joule aumenta hasta
afectar la calidad de separación.
• Por lo tanto ésta se realiza en un tubo capilar de sílice con un
diámetro inferior a 0.1mm y una longitud de 50cm a 1m,
relleno de un tampón, que también contiene los electrodos de
platino. La introducción se lleva a cabo por uno de los
extremos y la detección en el otro.
• Una de las ventajas de la electroforesis capilar es su capacidad
de separar macromoléculas de interés en la industria
biotecnológica y en la investigación biológica y bioquímica, y
además en esta técnica se le puede aplicar altos voltajes
reduciendo el tiempo de análisis y altas eficiencias.
APLICACIONES
• En Proteínas
Es necesario desnaturalizar las proteínas con
detergente (dodecilsulfato sódico / dodecilfosfato
sódico )
Análisis del grado de pureza de una proteína
Identificación de proteínas inmunoprecipitadas
Determinación de su peso molecular.
Verificación de la concentración de proteínas.
Detección de proteólisis
• En ADN
Las moleculas presentan cargas eléctricas que
varían debido a sus plegamientos por fuerzas
no covalentes.
APLICACIONES CLÍNICAS
• Detección de ciertos antígenos
relacionados con el diagnostico de
ciertas enfermedades
• Se usa en exámenes como ELISA.
• Es aplicado en la prueba de
inmunoelectrotransferencia
(“WESTERN BLOT”)