Download enzimas de restricción

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
EQUIPO: 4
FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM
OBJETIVOS
 Conocer el principio de separación y detección de
ácidos nucleicos en geles de agarosa.
 Emplear la electroforesis en geles de agarosa para
visualizar ácidos nucleicos.
 Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos
separados en geles de agarosa
 Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en
la transformación genética y la biotecnología.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Nacimiento de
la ingeniería
genética.
Reconoce y
corta secuencias
de bases
especificas en el
DNA .
Cortan de 4 a 8
pares de bases.
cortan sobre la secuencia
que reconocen y NO tienen
actividad de metilasas de DNA
Protegen a
procariontes de
DNA extraño.
Más importante
las tipo II.
Existen tres
tipos: I, II y III.
Enzimas de Restricción
 Las endonucleasas se denominan enzimas de
restricción, debido a que es la forma de defensa de
las bacterias contra la invasión por virus, es decir,
restringen la invasión por el DNA viral.
Las enzimas de restricción reconocen
secuencias palindrómicas
 Palíndrome. segmentos de DNA que se leen igual de
derecha a izquierda que de izquierda a derecha.
Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de la
bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la
enzima proviene de Escherichia coli.
ROMOS
Formación del DNA recombinante
Una vez cortado
el
DNA
se
separa
por
electroforesis
Gel de agarosa:
especial
para
DNA
Los de menor
tamaño
corren
más
rápido.
Los fragmentos
de DNA corren
al positivo por
los
grupos
fosfato
Se tiñe
bromuro
etidio
con
de
Se
pueden
purificar
fragmentos de
DNA del gel y
utilizar.
Aplicaciones
 Reconocimiento de una determinada secuencia de DNA
para detectar un polimorfismo
a) Medicina legal; Técnica de hibridación de Southern
donde la enzima mas usada es HaeIII
b) Identificación
enfermedades
Adenovirus
de
patógenos
causante
de
 La clonación en una bacteria de un fragmento de DNA
 Eliminación de secuencias genómicas
 Hacer mapa de restricción de un plásmido o
bacteriófago.
 Generación de fragmentos para ser subclonados en los
vectores apropiados, creación de DNA recombinante.
¿Qué vamos ha hacer en la
práctica?
1. Usar células que fueron transformadas en
la clase experimental
Células que contendrán:
Vector de clonación o Vector
vacío
 Sitio múltiple de
clonación
Células transformantes con el
Vector recombinante
 El gen de interés se
inserto entre las
secuencias que cortan
las enzimas BamHI y
NedI.
 Ambas enzimas
producen extremos
cohesivos y en el vector
recombinante solo
cortan 1 vez cada una
Desarrollo experimental
Ensayo de restricción
Etiquetar 2
tubos
microfuga
Incubar
37°C/1.5h
Añadir
0.5µL de
sln. RNAsa
Centrifugar
5 seg.
Eliminar RNA
(opcional)
Colocar 10µL
plásmido+1µL
amortiguador
Tango 10x
Tubo 2: 1µL
BamHI +
1µL Ndel.
Colocar
tubos en
hielo
Transferi
r hielo
5min.
Añadir tubo
1: 1µL de
BamHI o
Ndel.
Tomar alícuota
10µL o todo el
ensayo para gel
de agarosa
Incubar
100°C/5min
¿Qué esperamos?
TRATAMIENTO
No. de bandas
o fragmentos
de DNA
Peso molecular
esperado
Plásmido sin digerir
1*
6500 pb
Plásmido digerido con 1
enzima de restricción
1
6500 pb
Plásmido digerido con 2
enzimas de restricción
2
5310 pb
1200 pb
* Revisaremos los topoisomeros en la sección de corrimiento electroforético
Bibliografía
 Madigan Martinko, et al, Brock biología de los
microorganismos, Pearson education, 2008, pp: 300350.
 Tortora J. Gierard. Introducción a la microbiología, Ed
Medica Panamericana, 2007 pp 256-257.
 http://uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.p
df. 12/10/11 8:40 am
 http://academic.uprm.edu/~jvelezg/Lab12.pdf. 12/10/11
8:41 am