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IV CURSO AVANZADO
WHO GSS 2006
Buenos Aires, 15 - 24 de Mayo
“Validación de métodos cualitativos para
la detección de STEC en alimentos”
Martes 16 de mayo
Gerardo Leotta
Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología
INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
El 11 de mayo de 2004, se incluyó en el Código Alimentario Argentino el
artículo 156tris y se modificaron los artículos 255 y 302.
Especificaciones microbiológicas
Productos preparados a base de carne picada una vez cocidos:
ausencia de E. coli/g y ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de
65 g cada una
Carne picada fresca y chacinados frescos: E. coli máximo 5 x 102 UFC/g, y
ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65g cada una.
Para la detección de E. coli O157:H7 y O157:NM en productos cárnicos se
recomienda la metodología validada por USDA/FSIS.
Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS
Muestra
65 g
TAMIZAJE
Caldo de
enriquecimiento
ECm + novobiocina
585 ml, 37ºC, 18 h
(Figura 1)
AISLAMIENTO
Inmunocromatografía
ELISA
Resultado
positivo
Separación
inmunomagnética
PCR MK
Resultado
negativo
Medios selectivos
y diferenciales
37 ºC 20 h
PCR múltiple
Identificación y
caracterización de
una colonia aislada
Tipos de pruebas diagnósticas para la detección
de STEC O157:H7/NM
Tamizaje
inmunocromatografía
ELISA
aglutinación reversa pasiva (RPLA)
PCR
Aislamiento
separación inmunomagnética
inmunocaptura
inmunoconcentración
medios cromogénicos, fluorogénicos, selectivos
Confirmatorio
PCR
identificación bioquímica
serotipificación
citotoxicidad en células Vero
aglutinación reversa pasiva (RPLA)
Validación
Capacidad de medir aquello que se pretende
medir respecto a un patrón oro externo
Validación de métodos analíticos
Métodos del propio laboratorio (In house) para su uso adecuado
deben estar perfectamente documentados y validados.
Métodos de revistas científicas (Literature methods) deben usarse
con suma precaución y con previa validación.
Métodos oficiales son de uso exigido por organismos gubernamentales y
satisfacen
validados.
regulaciones
estatales.
Los
mismos
fueron
previamente
Métodos estándar son los de mayor calidad analítica. Son desarrollados
por organizaciones de prestigio y están rigurosamente validados.
Validación de métodos analíticos
Método cualitativo
Método de análisis cuya respuesta está basada en la presencia
o ausencia del analito, detectado directa o indirectamente
(AOAC 2002)
La mayoría de los parámetros cualitativos se expresan en
términos probabilísticos (Trullols 2004)
Validación de métodos analíticos
Método cualitativo
Rango de trabajo
Límite de detección
Límite de corte
Selectividad
Inclusividad
Exclusividad
Robustez
Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS
Muestra
65 g
TAMIZAJE
Caldo de
enriquecimiento
ECm + novobiocina
585 ml, 37ºC, 18 h
(Figura 1)
AISLAMIENTO
Inmunocromatografía
ELISA
Resultado
positivo
Separación
inmunomagnética
PCR MK
Resultado
negativo
Medios selectivos
y diferenciales
37 ºC 20 h
PCR múltiple
Identificación y
caracterización de
una colonia aislada
Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS
TAMIZAJE
Inclusividad: 98%
Exclusividad: 90%
Detección de falsos negativos: 2%
Detección de falsos positivos: 10%
TAMIZAJE
PCR MK para la detección de los genes
stx1 y stx2
Servicio Fisiopatogenia, Departamento de Bacteriología
INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Laboratorio de Microbiología de Alimentos
D.L.I.M. - D.G.H.y S.A., G.C.B.A.
PCR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
Secuencia nucleotídica de los primers utilizados
Primer
Secuencia del primer (5’-3’)
Tamaño del fragmento
amplificado (pb)
MK 1
TTTACGATAGACTTCTCGAC
224 - 227
MK 2
CACATATAAATTATTTCGCTC
Karch y Meyer, 1989.
PCR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
Cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2
Tº annealing: 48ºC
104 103 102 101 100
Tº annealing: 53ºC
104 103 102 101 100
+
-
s/t
PCR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
Cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2
ECm 8 h de incubación
Carne sin aditivo Carne con aditivo
ECm 18 h de incubación
Carne sin aditivo Carne con aditivo
1 10 102 103 1 10 102 103 1 10 102 103 1 10 102 103
C/S
+
-
s/t
Muestra negativa:
mal funcionamiento del termociclador
errores en la mezcla de reacción
baja actividad de la polimerasa
inhibidores en la matriz del alimento
¿Cómo nos aseguramos que la muestra es realmente negativa?
El Comité de Estandarización Europeo (CEN) y
la Organización Internacional de Estandarización (ISO)
propusieron la utilización de un control interno de amplificación
en cada mezcla de reacción de PCR
Control Interno de Amplificación (IAC)
Secuencia de ADN presente en el mismo tubo de reacción,
que es coamplificada simultáneamente con el extracto de ADN
obtenido de la muestra problema
IAC no competitivo
IAC competitivo
IAC NO COMPETITIVO
Origen del IAC: genoma del organismo blanco (16S o 23S)
ADN de otro microorganismo
No hay competencia por los primers
Diferente set de primers (dos reacciones diferentes simultáneamente)
Mismas condiciones de PCR
Inseguridad en la amplificación de la secuencia blanco
La reacción de PCR subeficiente para ambas reacciones
Puede utilizarse en diferentes PCR
Muestra +, IAC - : problemas en la reacción IAC
Muestra -, IAC - : problemas en la reacción IAC, muestra ??
Muestra -, IAC +: muestra ??
IAC COMPETITIVO
Origen del IAC: microorganismos recombinantes amplicones
Siempre hay competencia por los primers
Mismo set de primers
Mismas condiciones de PCR
Baja el límite de detección de la PCR, falsos negativos si hay exceso de IAC
Tamaño, debe ser inferior a la secuencia blanco e inferior a 500 pb
Muestra +, IAC - : OK
Muestra -, IAC - : problemas
Muestra -, IAC +: la muestra es negativa
CR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
Desarrollo del IAC
btención de la secuencia blanco por deleción
Clonado del fragmento IAC obtenido por PCR
Transformación de células competentes
Conservación de las células transformadas
CR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
AC competitivo
224-227 pb
170 pb
CR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
ATCC 25922
E. coli ONT stx1
E. coli O26 stx1
106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 +
E. coli O157 stx1/stx2 E. coli O145 stx2
106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 +
-
s/t
-
s/t
CR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
nclusividad (n:50)
xclusividad (n:30)
CR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
ROBUSTEZ
Día 2
Día 1
Día 3
Operador I, Termociclador I
4 5 6 7 8 9 10 + -
M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + -
M
4 5 6 7 8 9 10 + -
M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + -
M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + -
Operador II, Termociclador II
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + -
M
M
PCR MK + IAC. Análisis de los resultados
PCR MK + IAC
Citotoxicidad específica en
células Vero
positivo
positivo
A
Verdadero
positivo
∑
negativo
B
Falso negativo A + B
negativo
C
Falso positivo
D
Verdadero
negativo
∑
A+C
B+D
C+D
PCR MK + IAC. Análisis de los resultados
Inclusividad (%) = A : (A+B) x 100
Exclusividad (%) = D : (C+D) x 100
Valor predictivo positivo (%) = A : (A+C) x 100
Valor predictivo negativo (%) = D : (B+D) x 100
Precisión analítica (%) = (A+D) : (A+B+C+D) x 100
PCR MK + IAC. Análisis de los resultados
Comparación de los resultados obtenidos con el ADN correspondiente
a 105 UFC/50 µl de mezcla de reacción
UFC/50 µl
Inclusividad
Exclusividad
Valor
predictivo
positivo
Valor
predictivo
negativo
Precisión
analítica
1 x 105
100%
100%
100%
100%
100%
PCR MK para la detección de los genes stx1 y stx2
E. coli O145:NM stx2
E. coli O157:NM stx1/stx2
Carne con aditivo
1
10
Carne sin aditivo
102 103 1
10
Carne con aditivo Carne sin aditivo
102 103 1
E. coli ONT:H19 stx1
Carne con aditivo
0,01 0,1
1
1
102 103
1
10
102 103
+
- s/t M
+
- s/t M
E. coli O26:H11 stx1
Carne sin aditivo
10 0,01 0,1
10
Carne con aditivo Carne sin aditivo
10 0,1
1
10
102
0,1
1
10
102
Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS
Muestra
65 g
TAMIZAJE
Caldo de
enriquecimiento
ECm + novobiocina
585 ml, 37ºC, 18 h
(Figura 1)
AISLAMIENTO
Inmunocromatografía
ELISA
Resultado
positivo
Separación
inmunomagnética
PCR MK
Resultado
negativo
Medios selectivos
y diferenciales
37 ºC 20 h
PCR múltiple
Identificación y
caracterización de
una colonia aislada
CONFIRMACION
Validación de una técnica de PCR múltiple para la
detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga
G.A. LEOTTA, I. CHINEN, S. EPSZTEYN, E. MILIWEBSKY, I.C. MELAMED,
M. MOTTER, M. FERRER, E. MAREY, M. RIVAS
Servicio Fisiopatogenia, INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Laboratorio de Microbiología de Alimentos DLIM-DGHySA, G.C.B.A.
Revista Argentina de Microbiología 37 (1): 1-10
Productos de amplificación por PCR
para la detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157
Comparación de dos técnicas de extracción de ADN utilizando
la cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2.
UFC/50 µl de mezcla
de reacción de PCR
2 x 106
Tritón X-100 al 1% en
buffer TE 1X
stx2 rfbO157
stx1
Kit Wizard™ (Promega)
stx2
rfbO157
stx1
+
+
+
+
+
+
+
+D
+
+D
+
+D
+
+D
+
+D
-
-
-
2 x 103
+
+D
-
-
-
2 x 102
-
-
-
-
-
-
2 x 105
2 x 104
Comparación de dos técnicas de extracción de ADN utilizando
la cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2.
Con buffer Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X
se obtuvieron buenos resultados.
No hubo interferencias, es menos laboriosa,
más rápida y económica
PCR múltiple - Análisis de los resultados
Comparación de los resultados obtenidos con el ADN correspondiente
a 105 UFC/50 µl de mezcla de reacción
UFC/50 µl
Inclusividad
Exclusividad
Valor
predictivo
positivo
Valor
predictivo
negativo
Precisión
analítica
1 x 105
100%
100%
100%
100%
100%
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Servicio Fisiopatogenia, Departamento de Bacteriología
INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”