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Curso Posgrado 2014 Dra. María Gabriela Lacoste El diseño de los primers para una PCR es FUNDAMENTAL. Longitud Especificidad Temperatura de Hibridación Complementariedad de secuencias Contendido GC Reconocer una SECUENCIA UNICA dentro del ADN templado Especificidad de un primer depende de la LONGITUD del mismo. SECUENCIA CORRECTA!! La longitud de la secuencia es fundamental para la asociación ESPECIFICIDAD Por ejemplo: Hay una probabilidad de ¼ (4-1) de encontrar una A, G, C o T en una secuencia dada. Hay una probabilidad de 1/16 (4-2) de encontrar una secuencia de dinucleótidos. Hay una probabilidad de 1/256 (4-4) de encontrar una secuencia de tetranucleótidos. Si tenemos una secuencia de 17 pb, estadísticamente, esta estará presente una vez cada 4-17 bases o aproximadamente 17 billones de bases. LONGITUD IDEAL: 18-24 nt Muy largos: fallas en el annealing bajo rendimiento Depende de la LONGITUD y la COMPOSICION del primer. T° annealing depende de la Temperatura de melting o fusión (Tm) de los primers. Tm= temperatura a la cual la mitad de las moléculas de primer están apareadas con el ADN molde. Tm=2 (A+T) + 4(G+C) Tm longitud contenido GC Los primers no deben tener T°a muy diferentes entre si (no mas de 5°C). T°annealing: 5° C por debajo del Tm más bajo del par de primers (T°a=al menos 50°C) BAJO RENDIMIENTO O NO AMPLIFICACION OPTIMA INESPECIFICIDAD T°annealing 40-60% CONTENIDO GC Asegura la unión estable entre el primer y el ADN templado Evitar tramos de polipurinas o polipirimidinas PoliT, PoliA o PoliA/T unión más débil: se puede separar el complejo primer-templado en esa zona. PoliC, PoliG o PoliG/C unión más fuerte: hibridación no específica. G o C en el extremo 3´ Elongación empieza en el extremo 3´del primer. Asegura la unión correcta del primer al molde en el extremo 3´ (unión más fuerte que A/T) aumenta la eficiencia de la reacción PROBLEMA: Si el extremo 3´tiene 3 o mas G/C se puede unir establemente a casi cualquier secuencia con tres G/C. IDEAL: Extremo 5´ estable con 1 o 2 bases G/C y extremo 3´con no mas de UNA base G/C Complementariedad intra-primer Más de 3 pb: el primer se pliega sobre si mismo en una estructura doble cadena interfiere con el annealing al ADN templado. Complementariedad inter-primer Formación de dímeros competencia disminuye la formación de producto por BUSQUEDA DE LA SECUENCIA DE INTERÉS Y DISEÑO DE PRIMERS CON PRIMER-BLAST National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Si queremos buscar un gen completo, por ejemplo, el CFTR humano 2° 1° 3° OMIM: información acerca de la asociación del gen con enfermedades humanas En este caso el gen es demasiado grande para el programa Primer BLAST, por lo que tenemos que buscar un fragmento menor de interés dentro del gen. Si queremos buscar un fragmento del gen, por ejemplo, el exón 10 del CFTR humano 2° 1° 3° Seleccionar el tamaño de amplicón deseado Elegimos pares de primers para controlar estructura secundaria y alineación. OTROS PROGRAMAS DE DISEÑO DE PRIMERS PrimerQuest: http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index COMO UBICAR MI PRIMER EN LA SECUENCIA Forward Reverse OJO!!!! ATGGGAGAACTGGAGCCTTC 5´ 3´ ORIGIN 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 gcagagtacc tttacaaata gcgtgatttg tgattatggg tctgttctca tttcctatga gaaactatgt atttggctcc tactgtgaat atgaaataaa ttatgaaatg tatatggcat tgaaacagga agaatataca ataatgacct agaactggag gttttcctgg tgaatataga gaaaactttt atattcaatc ggatcaatta tgcaatttat gtgagaattt gcatataagt ACCGATTGAATATGGAGCCAA 5´ 3´ AACCGAGGTATAAGTTAGCCA 3´ 5´ TTGGCTCCATATTCAATCGGT complementaria agtattttaa cttctgctta aataatgatg ccttcagagg attatgcctg tacagaagcg tgattatgca ggttagtcta ataaaacaca tttttaaata tgttcactca gatatgtggt atattttgaa ggatgataat ggttttattt gtaaaattaa gcaccattaa tcatcaaagc tatgaaccct catatattta tgacctatgc atgggttcat ttagtgagac atctttttaa tcaaatgagt tggaggcaag ccagacttca gcacagtgga agaaaatatc atgccaacta tcacactacc tgtttcctct tttaagaagc ttgatcacaa aaacgtcctc aagataccac taatagaatc tgaatcctga cttctaatga agaatttcat atctttggtg gaagaggtaa caaattatat atgggtaagc ttgcaaacac taaatgcatt aatggttatt aaaatatgca ANALISIS DE PRIMERS OLIGO ANALYZER 3.1 Analizamos el Primer FORWARD Parámetros generales Hairpin El Tm debe ser menor que la temperatura de annealing propuesta para la reacción. Se sugiere que el Tm del hairpin debe ser al menos 50°C menor que la T de annealing. Self-Dimer El valor de ∆G debe estar entre 0 y -9 kcal/mol. Hetero-Dimer Copiamos la secuencia del primer reverse Hetero-Dimer El valor de ∆G debe estar entre 0 y -9 kcal/mol. NCBI Blast Alineamos nuestro primer con la base de datos, para comparar su similitud con otras secuencias. Repetimos el procedimiento con el primer REVERSE… … y también podemos analizar otros pares de primers propuestos por el programa de diseño hasta seleccionar el par que cumpla con las mejores características…