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k OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS 19 k kInt. Cl. : A61K 38/00 11 Número de publicación: 2 133 333 6 51 ESPAÑA k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA 12 kNúmero de solicitud europea: 92925330.0 kFecha de presentación : 20.11.92 kNúmero de publicación de la solicitud: 0 625 050 kFecha de publicación de la solicitud: 23.11.94 T3 86 86 87 87 k 54 Tı́tulo: TGF-beta para mejorar la recuperación de las neuronas. k 73 Titular/es: GENENTECH, INC. k 72 Inventor/es: Gluckman, Peter; k 74 Agente: Ponti Sales, Adelaida 30 Prioridad: 22.11.91 NZ 240696 460 Point San Bruno Boulevard South San Francisco California 94080, US AUCKLAND UNISERVICES LIMITED 45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: 16.09.99 45 Fecha de la publicación del folleto de patente: ES 2 133 333 T3 16.09.99 Aviso: k k Nikolics, Karoly y Williams, Christopher k En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid 1 ES 2 133 333 T3 DESCRIPCION TGF-beta para mejorar la recuperación de las neuronas. Campo de la invención Esta invención hace referencia al tratamiento o prevención de lesiones en el sistema nervioso central (SNC) y hace referencia en particular al tratamiento que comprende el incremento de la concentración del factor de crecimiento beta 1 transformador (TGF-β1) y/o análogos del mismo en el sistema nervioso central del paciente para tratar una lesión o enfermedad que cause daños en las células del SNC, en particular las células neuronales no colinérgicas y/o las células gliales. Antecedentes de la invención Después de agresiones por asfixia, traumáticas, tóxicas, degenerativas, metabólicas, isquémicas o hipóxicas al sistema nervioso central (SNC) del hombre, puede darse como resultado un cierto grado de lesión neural. Por ejemplo, dicha lesión neural puede tener lugar en casos de asfixia perinatal asociada con sufrimiento fetal intraparto como tras desprendimiento de placenta, oclusión del cordón umbilical o asociado con retraso del crecimiento uterino; asfixia perinatal asociada con fallo de la resucitación adecuada o apnea; lesiones neurales severas asociadas con un percance de ahogamiento de sumersión, inhalación de monóxido de carbono, intoxicación por amonı́aco gaseoso u otros gases, paro cardı́aco, colapso, coma, meningitis, hipoglucemia, o estado epiléptico; episodios de asfixia cerebral asociada con cirugı́a de derivación coronaria; anoxia o isquemia cerebral asociada con ataque súbito, episodios de hipotensión, crisis de hipertensión; trauma cerebral; o enfermedades degenerativas cerebrales como la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple. Dicho daño neural puede implicar diferentes tipos celulares del SNC. Por ejemplo, leucomalacia periventricular, una lesión que afecta los oligodendrocitos periventriculares considerada generalmente como una consecuencia de lesión hipoxicisquémica al cerebro pretérmino. Bejar, y col., Am. J. Obstet. Gynecol., 159:357-363 (1988); Sinha, y col., Arch. Dis. Child., 65:1017-1020 (1990); Young, y col., Ann. Neurol., 12: 445448 (1982). Además, los cuerpos celulares de las neuronas colinérgicas están ausentes en muchas regiones del córtex de los primates (Mesulam, y col., Neurosci., 12:669-686 (1984)) y ratas (Brownstein, y col., en Handbook of Chemical Neuroanatomy, Classical Transmitters in the CNS, pág. 23-53 (Elsevier, 1984)). El daño en la corteza cerebral por trauma, asfixia, isquemia, toxinas o infección es frecuente y puede causar déficits sensoriales, motores o cognitivos. En el SNC, las células gliales, que no son células neuronales, son necesarias para la función normal del SNC. Los infartos son un componente principal del daño inducido por isquemia hipóxica y la pérdida de células gliales es un componente esencial del infarto. La esclerosis múltiple está asociada con la pérdida de mielina y oligodendrocitos, de modo similar, la enfermedad de Parkinson está asociada con la pérdida de neuronas dopaminérgicas. Se ha publicado que diversos factores de crecimiento se 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2 inducen después de la isquemia hipóxica transitoria en el cerebro. Después de las convulsiones postasfixia, el proto-oncogen c-fos se induce en las neuronas supervivientes y en las células gliales en las regiones infartadas. Gunn, y col., Brain Res., S31: 105-116 (1991). La sı́ntesis del factor de crecimiento nervioso(NGF) se incrementa tras la hipoxia o tras convulsiones en el hipocampo y en la corteza cerebral. Lorez, y col., Neurosci. Lett., 98:339-344 (1989); Gall y col., Science, 245:758761 (1989). Sin embargo, se conoce poco el papel de las citocinas en la lesión cerebral. Se ha demostrado que las células gliales producen varias citocinas incluyendo la interleucina 3 (IL-3) y la interleucina 6 (IL-6). Se ha publicado que la interleucina 1 (IL-1) aumenta en el lı́quido cefalorraquı́deo después de un traumatismo craneal en el hombre. McClai, y col., J. Lab. Clin. Med., 110:48-54 (1987). El factor de crecimiento beta transformador (TGF-β) es otro ejemplo de una citocina y es un polipéptido multifuncional implicado en la regulación de la respuesta celular o tisular frente a una lesión o estrés. Para una revisión general de TGF-β y sus acciones, ver Sporn, y col., Science, 233:532-534 (1986); Sporn y col., J. Cell Biol., 105:1039-1045 (1987); Sporn, y col., Nature, 3232: 217-219 (1988); y Sporn, y col., en Peptide Growth Factors and Their Receptors I, pág. 419472 (Springer-Verlag, 1990). El TGF-β se halla en diversos tejidos animales, como el hueso, las plaquetas y la placenta; y se han descrito los procedimientos para la purificación del polipéptido a partir de dichas fuentes naturales, ası́ como también para su producción en cultivo de células recombinantes. Ver, por ejemplo, Assoian, y col., J. Biol. Chem., 258:7155-7160 (1983); Frolik, y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 80:3676-3680 (1983); Heimark, y col., Science, 233: 1078-1080 (1986); Sporn, y col., patente americana U.S. 5.104.977; Derynck, y col., Nature, 316:701-∗ ∗ ∗(1985); Derynck, y col., patente americana U.S. 4.886.747. Existen diversas formas moleculares de TGFβ, incluyendo aquellas formas comúnmente referidas como TGF-β1 (Derinck, y col., Nature, 316:701-∗ ∗ ∗(1985)), TGF-β2 (deMartin, y col., EMBO J., 3673-∗∗∗(1987); Madison, y col., DNA, 7:1-8 (1988)), TGF-β3 (Jakowlew, y col., Mol. Endocrin., 2:747-755 (1988); Ten Dijke, y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 85:4715-4719 (1988); Derynck, y col., EMBO J., 7:3737-∗ ∗ ∗(1988)), TGFβ4 (Jakowlew, y col., Mol. Endocrin. 2:11861195 (1988) y TGF-β5 (Kondaiah, y col., J. Biol. Chem., 265:1089-∗ ∗ ∗(1990). Es un objetivo de la invención proporcionar un tratamiento o una prevención del daño o lesión del SNC. La invención se basa en la investigación sobre el papel y los efectos del TGF-β en el SNC, llevada a cabo con éxito por los inventores. La patente internacional WO91/02067 describe la utilización de un grupo de citocinas que incluyen el TGFβ1 para regular la expresión del NGF in vitro en el cultivo de astrocitos e in vivo en el cerebro de ratas, con el objetivo de tratar diversos trastornos neurológicos. Resumen de la invención Según ello, la invención proporciona en un primer aspecto la utilización de TGF-β1 o un 3 ES 2 133 333 T3 análogo de TGF-β1 activo biológicamente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central en donde la lesión afecta a las células neuronales no colinérgicas y/o las células gliales. El término “tratar” cuando se utiliza aquı́ hace referencia al efecto de una reducción en la gravedad del daño al SNC, mediante la reducción del infarto y la pérdida de células gliales, células neuronales no colinérgicas, u otras células neuronales, padecido después de una lesión en el SNC. Abarca la minimización de dicho daño tras una agresión al SNC. Preferentemente, el TGF-β1 y/o análogos de éste son para la administración directa al paciente. Alternativamente, puede utilizarse un compuesto, que tras la administración al paciente, incremente la concentración activa de TGF-β1 o la de los análogos que tienen lugar de forma natural del TGF-β1 en el SNC del paciente. Por ejemplo, se pueden administrar las proteı́nas de unión al TGF-β1 de regulación positiva, o los análogos de éste que tienen lugar de forma natural. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas descritas aquı́ son para la administración durante el periodo que abarca desde el momento de la agresión a 100 horas después del daño en el SNC y más preferentemente de 0,5 a 8 horas después de la agresión en el SNC. En una realización de la invención, dicho TGF-β1 y/o un análogo o análogos de éste se administran mediante inyección cerebro ventricular lateral en el cerebro de un paciente durante el periodo que incluye desde el momento que se produce el daño en el SNC a 8 horas más tarde. En otra realización, el TGF-β1 y/o un análogo o análogos de éste se administran a través de una derivación en el ventrı́culo cerebral de un paciente durante el periodo que incluye desde el momento que se produce la agresión en el SNC a 8 horas más tarde. En otra realización, el TGF-β1 y/o un análogo o análogos de éste se administran de forma periférica en un paciente para pasar al ventrı́culo lateral del cerebro durante el periodo que incluye desde el momento que se produce la agresión en el SNC a 8 horas más tarde. Preferentemente, es el propio TGF-β1 el que se administra mediante inyección al ventrı́culo cerebral lateral o mediante la utilización de la desviación insertada quirúrgicamente. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran de acuerdo con el patrón del daño o tiempo transcurrido después de la agresión producida en el SNC. Preferentemente, la dosificación varı́a desde aproximadamente 0,0001 a 100 µg de TGF-β1 o dicho análogo o dicho compuesto que incrementa la concentración de éste por cada 100 gramos de peso corporal. El TGF-β1 puede utilizarse sólo o en combinación con otros agentes terapéuticos, que incluyen otros factores de crecimiento diseñados para mejorar frente a la pérdida de células del SNC como glias y neuronas no colinérgicas. Por “prevenir” se entiende una reducción de la gravedad del daño del SNC sufrido después de una agresión en el SNC y puede incluso incluir la 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4 inhibición de los sı́ntomas del daño en el SNC. En otra realización, la invención proporciona la utilización de TGF-β1 o un análogo de TGFβ1 activo biológicamente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la lesión en el sistema nervioso central en donde la lesión afecta las células neuronales no colinérgicas y/o las células gliales y en donde el medicamento comprende adicionalmente el IGF-1. Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra dibujos compuestos que ilustran la distribución del ARNm del TGF-β1 tras la hipoxia isquémica para el Ejemplo 1. La Figura 2 es un histograma que ilustra la pérdida neuronal para las ratas tratadas con TGF-β1 y ratas control en el Ejemplo 2. La Figura 3 es un histograma que ilustra la pérdida neuronal para las ratas tratadas con TGF-β1 y ratas control en el Ejemplo 3. Descripción de las realizaciones preferidas La invención hace referencia a la utilización del TGF-β1 o de un análogo del TGF-β1 activo biológicamente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de lesión en el sistema nervioso central, en donde la lesión afecta a las células neuronales no colinérgicas y/o células gliales. Por ejemplo, el paciente puede haber sufrido una asfixia perinatal o una asfixia cerebral o una isquemia asociada a un ataque súbito u otros ejemplos no limitantes de agresiones neurales que se han descrito más arriba. En estas circunstancias, es deseable reducir o eliminar los sı́ntomas de daño neural. El daño en el SNC puede cuantificarse por ejemplo mediante el nivel de déficit neural permanente de la función cognitiva y/o la propensión de trastornos convulsivos. Es deseable que la concentración de TGF-β1 y/o análogos de éste en el sistema nervioso central y en el cerebro del paciente en particular se incremente con el fin de tratar el daño neural. Según ello, se puede administrar el TGF-β1 y/o análogos de éste directamente al paciente. TGFβ1 hace referencia al factor de crecimiento beta1 transformador. Los “Análogos” (o “análogos activos biológicamente”) de TGF-β1 hacen referencia a los compuestos que ejercen un efecto biológicamente similar al del TGF-β1 y que incluyen los análogos que se producen de forma natural (p.ej., TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5) o cualquiera de los análogos sintéticos de TGF-β1. Estos compuestos pueden derivarse de humanos u otros animales. El TGF-β1 y los análogos se pueden purificar a partir de fuentes naturales o producirse mediante técnicas del ADN recombinante. Alternativamente, se pueden administrar compuestos que, tras la administración al paciente, incrementan la concentración activa de TGF-β1 y/o análogos de éste que se producen de forma natural en el sistema nervioso central. Por “concentración activa” se entiende la concentración biológica de TGFβ-1 y/o análogos en el sistema nervioso central del paciente para ejercer un efecto sobre la lesión neural. El TGF-β1, sus análogos y los compuestos que aumentan las concentraciones activas de éste se 3 5 ES 2 133 333 T3 pueden administrar de forma central o sistémica. Deseablemente, las composiciones se administran directamente al SNC del paciente y en particular a la región donde haya tenido lugar el daño más importante. Según ello, las composiciones se administraran directamente al cerebro o al lı́quido cefalorraquı́deo mediante técnicas que incluyen la punción ventricular lateral a través de una trepanación o fontanela anterior, lumbar o cisternal osimilar. Las composiciones también se administran por vı́a intravenosa, intracefalorraquı́dea, intratraqueal o intrasinovial. Además, se pueden administrar con otros agentes o factores de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento semejante a la insulina 1 (IGF-1). Para la prevención o el tratamiento de la lesión del SNC, la dosificación adecuada de TGFβ1 o uno de sus análogos o un compuesto capaz de aumentar las concentraciones fisiológicas del TGF-β1, dependerá del tipo de lesión a tratar, como se definió anteriormente, de la gravedad y curso del daño, si tales composiciones de TGFβ1 se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clı́nica del paciente y la respuesta a las composiciones de TGF-β1 y de la discreción del médico encargado. Las composiciones de TGF-β1 se administran de modo adecuado al paciente en una sola vez o durante una serie de tratamientos. Los ejemplos anteriores muestran que la expresión de TGF-β1 después de una agresión neural sigue un curso temporal especı́fico y tiene lugar en áreas especı́ficas del cuerpo. Según ello, las composiciones deberı́an administrarse de acuerdo con el patrón de lesión en el SNC y consiguiente tiempo transcurrido desde la agresión a fin de producir los resultados más deseables. Las composiciones pueden administrarse por ejemplo aproximadamente de las 0,5 a 100 horas después de una agresión. Alternativamente, la composición puede administrarse antes de una agresión potencial en el SNC (p.ej., antes de cirugı́a de desviación cardı́aca) a fin de prevenir o reducir el grado de daño neural sufrido tras la agresión. Una dosificación adecuada puede variar, por ejemplo, aproximadamente de 0,0001 a 100 µg de TGF-β1 y/o análogos o compuestos que aumentan la concentración de éste por cada 100 g de peso corporal, siendo la composición administrada por vı́a central. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento del daño neural sufrido tras una agresión. Las composiciones farmacéuticas comprenden el TGF-B1 y/o análogos de éste o un compuesto que aumenta la concentración de TGF-β1 en el SNC. El TGF-β1, sus análogos y los compuestos que aumentan la concentración de éste se pueden fabricar mediante técnicas de ADN recombinante como las descritas en la patente americana U.S. 4.886.747. Alternativamente, dichas sustancias se pueden aislar a partir de fuentes naturales. Opcionalmente, dichas composiciones farmacéuticas se proporcionan en un vehı́culo o diluyente farmacológicamente adecuado que inherentemente no es ni tóxico ni terapéutico. Ejemplos de dichos vehı́culos incluyen intercambiadores iónicos, alu4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6 minio, estearato de aluminio, lecitina, proteı́nas séricas, tal como la albúmina sérica humana, sustancias tamponantes como las fosfatasas, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos como el sulfato de protamina, el hidrógeno fosfato disódico, polisacáridos como la celulosa o la metilcelulosa, hidrógeno fosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sı́lice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona y polietilén glicol. Diluyentes adecuados incluyen soluciones acuosas estériles que comprenden uno o más de dichos vehı́culos. El TGF-β1 se formula tı́picamente a un pH acı́dico en el que es biológicamente activo. La invención se basa en los siguientes resultados experimentales. En los estudios descritos en los siguientes ejemplos, se halló que: 1) El ARNm del TGF-β1 se expresa después de una agresión neural a lo largo de un periodo de tiempo definido en regiones especı́ficas de la lesión y el propio TGF-β1 se puede detectar mediante inmunocitoquı́mica. 2) Las alteraciones en los niveles del sistema nervioso central del TGF-β1 pueden alterar el resultado neural que se produce como una consecuencia de una agresión neural estandarizada. 3) Dosis inferiores de TGF-β1 mejoran su eficacia en el tratamiento de la lesión neural. Estos ejemplos, sin embargo, se ofrecen sólo a tı́tulo de ilustración y no intentan limitar la invención de ninguna manera. Todas las referencias de patentes y literatura citadas a lo largo de la especificación están expresamente incorporadas. Ejemplo 1 El objetivo de este estudio fue estudiar la expresión del TGF-β1 en el sistema nervioso central después de una agresión neural. Ratas de veintiún dı́as se sometieron a ligación de carótida unilateral mediante asfixia por inhalación en condiciones definidas para producir una pérdida neuronal atenuada o severa en el sitio ligado. Se indujo una pérdida neuronal atenuada o severa en ratas de 21 dı́as de la manera siguiente: la arteria carótida derecha se ligó bajo anestesia suave con halotano. Se colocaron en un incubador a 34◦ C y 85 % de humedad. Los gases inspirados se reemplazaron por O2 al 8 % en nitrógeno durante 15 minutos (suave) o 90 minutos (severa) y luego se devolvieron al aire. A diversos momentos después de la hipoxia (1 hora, 5 horas, 3 y 5 dı́as) se anestesiaron los animales con pentobarbitan (Nembutal), se retiraron los cerebros y se trocearon porcongelación en hielo seco para la hibridación in situ. Para la histologı́a, las ratas se sacrificaron 5 dı́as después de la hipoxia y luego se perfusionaron con solución salina al 0,9 % seguido de formaldehido-ácido acético- metanol (1:1:8). Las ratas se sacrificaron a tiempos determinados después de la asfixia para la histologı́a. Al cabo de 90 minutos se determinó mediante tinción con tionina/ácido fucsı́nico que la pérdida neuronal por asfixia (severa) se habı́a extendido dentro del córtex ligado. Hubo una pérdida severa de neuronas en el territorio arterial del cerebro medio, incluyendo el córtex lateral, el hipocampo, el cuerpo estriado y el tálamo. La hibridación in 7 ES 2 133 333 T3 situ histoquı́mica se realizó utilizando una sonda de ADNc de TGF-β1 que comprende casi totalmente la secuencia codificante de TGF-β1, proporcionada por el Dr. R. Derynck. La hibridación histoquı́mica se realizó esencialmente como describen McCabe, y col., J. Histochem. Cytochem., 34:45-50 (1986) y Smith, y col., Ann. Neuropathol., 64:319-332 (1984). Después de la hibridación, las secciones se lavaron 4 veces en 2xSSC más β-mercaptoetanol 10 mM a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez, 4 veces en 2xSSC a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez, dos en 2xSSC a 50◦C durante 10 minutos cada vez. Los controles se realizaron utilizando ARNasa A (40 µg/ml de NaCl 0,5M/Tris 20 mM, pH 7,5/ EDTA 1 mM a 37◦ C). El pretratamiento con ARNasa elimina casi completamente la señal en las transferencias de Northern de la banda mayor anticipada de 2,5 Kb revelada con cada sonda. La señal que resulta para el ARNm del TGFβ1 cuantificada mediante hibridación in situ mostró una inducción del ARNm de TGF-β1 restringida a las áreas de lesión neuronal. Después de asfixia atenuada (15 minutos), se observó inducción del ARNm de TGF-β1 en el cerebro ligado en el nivel 3 de la corteza cerebral, la circunvolución dentada, las regiones CA1 y CA2 de la capa piramidal del hipocampo. Después de la asfixia severa (90 minutos), el ARNm del TGF-β1 fue detectable durante una hora después de la agresión en la circunvolución dentada del hipocampo, las regiones CA1 y CA2 y el plexo coroidal. Durante 5 horas fue detectable en el córtex y cuerpo estriado en el sitio ligado. Durante 72 horas se observó una expresión marcada a través de la corteza cerebral y puriforme, del tálamo y del hipocampo del sitio ligado pero no se observó expresión en el sitio no ligado, en el que no se observó muerte neuronal (Figura 1). La especificidad de la inducción se demostró mediante la expresión unilateral predominantemente en el sitio ligado, menor inducción en animales sometidos a una agresión menor y por los controles negativos utilizando ARNasa. La sonda también se utilizó para hibridar una transferencia de Northern de muestras de ARN poli(A) de hı́gado de rata. Las bandas después de la hibridación con la sonda de TGF-β1 están de acuerdo con los resultados publicados en la bibliografı́a. La inmunohistoquı́mica se realizó utilizando un antisuero policlonal anti-h TGF-β1 de conejo. Las células teñidas para el TGF-β1 pudieron ser identificadas en la región dañada del hemisferio ligado. Esta tinción fue observada en las células con apariencia semejante a macrófagos. Los resultados sugieren que tras una agresión isquémica por hipoxia, se induce TGF-β1 en los macrófagos, en particular en el área de la lesión. Ejemplo 2 El objetivo de este estudio fue valorar el efecto de la administración de TGF-β1 después de una agresión neural. Se utilizaron ratas adultas (250-350 gramos). El experimento implicó el tratamiento de las ratas con TGF-β1 después de una agresión neural. Estas ratas presentaban una lesión isquémico por hipoxia en un hemisferio cerebral inducida de una 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8 manera estándar. Una arteria carótida se ligó y el animal se sometió dos horas más tarde a un periodo definido de hipoxia inhalacional. El grado de hipoxia, la duración de la hipoxia, la temperatura ambiente y la humedad se definieron para estandarizar el grado de lesión. Las condiciones fueron oxı́geno (6 %) inhalado, 10 minutos de hipoxia a temperatura ambiente de 31◦C y 85 % de humedad. Los animales se mantuvieron en un incubador durante una hora, luego se devolvieron a sus jaulas estándares. Se sacrificaron cinco dı́as más tarde para el análisis histólogico utilizando tinciones especı́ficas (fucsina ácida) para neuronas necróticas. En dichos experimentos, la muerte neuronal tı́pica está restringida al lugar del sitio de la ligación arterial y es principalmente en el hipocampo, circunvolución dentada y córtex lateral del hemisferio ligado. Se indujo una lesión por isquemia hipóxica en ratas Wistar machos adultos (300±10g). Las ratas sufrieron ligación de la carótida unilateral con anestesia suave por halotano. Después de una hora de recuperación, se colocaron en un incubador a 31◦C y 85±5 % de humedad durante una hora antes de la agresión. Se sometieron durante 10 minutos a asfixia inhalacional (FiO2 al 6 %)y se mantuvieron en el incubador durante una hora después de la asfixia. Dos horas después de finalizar el ataque inhalacional, se dio una inyección única cerebroventricular lateral controlada estereotáxicamente de 0,05 µg de TGF-β1 recombinante o lı́quido cefalorraquı́deo artificial (LCF). El TGF-β1 recombinante o diluyente se preparó y se administró a parejas similares en pesode la manera siguiente: después de dos horas de asfixia se administró a las ratas una anestesia suave por halotano, y una inyección única de ICV de 20 µl de CSF (n=6) o 20 µl de CSF más 0,05 µg de TGF-β1 (n=6). El TGF-β1 recombinante (Genentech, Inc., South San Francisco, California 94080 USA) se disolvió en el diluyente para CSF a 2,5 µg/ml. Esta solución se diluyó 9 veces con PBS 0,15 M (solución salina tamponada con fosfato) proporcionando un pH de 7,0. Los animales se mantuvieron entonces durante 120 horas, se anestesiaron y los cerebros se fijaron in situ con formaldehido-ácido acético-metanol (1:1:8) para valoración histológica. Las neuronas supervivientes se discriminaron de las muertas mediante la utilización de una técnica de tinción con tiocina/fucsina ácida. Williams, y col. Ped. Res., 27: 561-565 (1990); Brown, y col., J. Neurol. Sci., 16:59-84 (1971). El grado de lesión neural sufrida se cuantificó mediante cuantificación de la puntuación de pérdida neuronal. Las puntuaciones de pérdida neuronal son la media a partir de las regiones susceptibles del hipocampo y corteza cerebral (100 % equivale a la pérdida total de neuronas, 0 % equivale a pérdida 0). El porcentaje de neuronas muertas se estimó mediante dos observadores independientes, uno de los cuales fue ciego para el experimento. La correlación entre las puntuaciones obtenidas por los dos observadores fue de r=0,92 p, 0,0001. El efecto de tratamiento se evaluó con MANOVA seguido por las comparaciones en series de parejas 5 ES 2 133 333 T3 9 de cada región utilizando el procedimiento de la diferencia menos significativa de Fisher. Los resultados se muestran en la Figura 2. La terapia del TGF-β1 redujo la extensión de la muerte neuronal en la hemiesfera ligada comparada con los controles tratados con CSF (p<0,01). Una inyección central única de TGF-β1 después de una agresión por asfixia en la rata adulta se asoció con una mejora marcada en el resultado, valorado histológicamente (Ver Tabla 1). TABLA 1 Efecto del tratamiento con TGF-β1 sobre el porcentaje de pérdida neuronal después de la lesión isquémica-hipóxica (6 grupos; media±sem) Región (0,05 µg) Hipocampo CA1-2 Hipocampo CA3 Hipocampo CA4 Circunvolución dentada Córtex piriforme Córtex lateral % Pérdida neuronal tras tratamiento con CSF (control) TGF-β1 98,4+4 7,6±5 100,0 4,0±4 100,0 0,0 5 10 15 20 25 97,2±3 93,2±7 98,0±2 0,0 0,0 5,0±5 Ejemplo 3 El objetivo de este estudio fue confirmar las observaciones del Ejemplo 2 y establecer el margen de dosificación más efectivo. El experimento fue el mismo que el del Ejemplo 2 excepto que dos grupos más se trataron con dosis elevadas de TGF-β1. La lesión isquémica-hipóxica se indujo en ratas como se discutió para el Ejemplo 2. Se administró a las ratas (n=6 para cada tratamiento) CSF, CSF+0,05 µg de TGF-β1, CSF + 0,5 µg de TGF-β1 o CSF + 5 µg de TGF-β1 dos horas después de la agresión por inhalación. Las ratas (n=1) de cada tratamiento se trataron simultáneamente. Se utilizaron las misma técnicas para cuantificar el grado de lesión que las utiliza- 30 35 40 45 50 55 60 65 6 10 das para el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se puede ver, 5 µg de TGF-β1 no tuvieron efecto significativo sobre la pérdida neuronal. Por otra parte, 0,5 µg de TGF-β1 redujeron la pérdida neuronal (p<0,05) en la corteza cerebral, pero 0,05 µg de TGF-β1 fueron significativamente más efectivos. Efectos similares se observaron en otras áreas neuronales. Experimentos posteriores han demostrado que las dosificaciones en el margen de aproximadamente 0,01 µg a 0,05 µg son más efectivas. Discusión Los resultados de los experimentos descritos anteriormente fueron altamente significativos estadı́sticamente. En los Ejemplos 2 y 3, donde se administró TGF-β1 post-asfixia, la terapia de TGF-β1 a dosis inferiores a 0,5 µg/rata mejoró marcadamente el resultado comparado con los controles tratados. Por ello concluimos que el aumento terapéutico de TGF-β1 en el lı́quido cefalorraquı́deo cerebral directa o indirectamente después de una agresión es ventajoso para el resultado. Los resultados en el Ejemplo 3 muestran además que la mayor eficacia se observa a dosis pequeñas de TGF-β1. La presente invención, por ello, reconoce el papel de una administración de TGF-β1 y/o otros compuestos de efecto similar en un paciente antes de, simultáneamente con, o a continuación de una agresión en el SNC con el consiguiente resultado de minimizar la lesión del SNC mediante la prevención de otra lesión subsecuente que de otra manera podrı́a tener lugar a continuación del ataque. La invención proporciona los procedimientos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento o para la prevención de lesiones neurales. La lesión neural puede estar asociada con asfixia, hipoxia, toxinas, isquemia o trauma. Sin embargo, se comprenderá que la principal aplicación de la invención es para los humanos, la utilidad de la invención no está por ello limitada y el tratamiento de los animales no humanos (especialmente mamı́feros) se halla también dentro del ámbito de la invención. 11 ES 2 133 333 T3 REIVINDICACIONES 1. Utilización de TGF-β1 o un análogo activo biológicamente de TGF-β1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión del sistema nervioso central, donde la lesión afecta las células neuronales no colinérgicas y/o las células gliales. 2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, donde la lesión del sistema nervioso central es una lesión por hipoxia. 3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, donde la lesión del sistema nervioso central es una lesión isquémica. 4. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, donde la lesión del sistema nervioso central es una lesión traumática. 5. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, donde la lesión del sistema nervioso central es una consecuencia de la enfermedad de Parkinson. 6. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, donde la lesión del sistema nervioso central es una consecuencia de la esclerosis múltiple. 7. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, donde la lesión del sistema nervioso central es una consecuencia de un trastorno de desmielinización. 8. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el TGF-β1 o el análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para la administración en el periodo que abarca desde el momento de producirse la lesión en el sistema nervioso central hasta 100 horas después. 9. Utilización de acuerdo con las reivindica- 5 10 15 20 25 30 12 ciones 1 a 7, donde el TGF-β1 o el análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para la administración de al menos una vez en el periodo que abarca desde el momento de producirse la lesión en el sistema nervioso central hasta aproximadamente las 8 horas siguientes. 10. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el TGF-β1 o un análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para la administración al mamı́fero en una cantidad de aproximadamente 0,0001 a 100 µg de TGF-β1 por cada 100 g de peso corporal del mamı́fero. 11. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el análogo activo biológicamente de TGF-β1 se selecciona entre el grupo consistente en TGF-β2, TGF-β1,2, TGF-β3, TGF-β2,3, TGF-β4 y TGF-β5. 12. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el TGF-β1 o el análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para la administración al mamı́fero mediante una desviación insertada quirúrgicamente en el ventrı́culo del cerebro del mamı́fero. 13. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el TGF-β1 o el análogo activo biológicamente de TGF-β1 es para la administración periférica en el mamı́fero para su paso al ventrı́culo lateral del cerebro. 14. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medicamento comprende el TGF-β1 o un análogo biológicamente activo de TGF-β1 en combinación con IGF-1. 35 40 45 50 55 60 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales. 65 Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada reserva. 7 ES 2 133 333 T3 8 ES 2 133 333 T3 9 ES 2 133 333 T3 10