Download Descargar pdf

¿Qué es una librería o genoteca?
Nuestro genoma
•Genoteca genómica – moléculas de vector que contienen
insertos de DNA genómico
•Genoteca de cDNA – moléculas de vector que contiene
insertos de cDNA
Recuerda: RNA
cDNA (específico de tejido)
¿Por qué necesitamos una genoteca?
Encontrar lo que buscamos es como buscar una aguja
(gen) en un pajar (genoma/mRNA)
r
ma
for
LIBRERÍA
La pregunta es: ¿qué plasmico contiene nuestro gen de
interés y como lo aislamos de la genoteca?
ns
LIBRERÍA
genoma
tra
Li
ve gar a
cto u
n
r
dig
eri
r
Nuestro gen!
BÚSQUEDA DE
COLONIAS USANDO
UNA
“SONDA”
¿Qué podemos usar como sonda?
La lógica de cribar una genoteca
Normalmente:
El cribado es un compromiso entre:
Un oligonucleótido
Una cadena corta de ácidos nucleicos
(sintetizada por nosotros) que hibrida
con nuestro DNA objetivo
Una sonda de cDNA Un trozo de DNA mayor
Un anticuerpo
El tamaño del genoma
A genomas más grandes mayor
número de colonias hay que
cribar
Tamaño del inserto
A medida que el tamaño del
inserto es mayor, menor
número de colonias que cribar
El vector debe producir la expresión de
proteínas!
1
Para P = 99% y F = 20,000 bp…..
ESPECIES
TAMAÑO DEL
N
GENOMA
N = LOG 10( 1 – P )
LOG 10( 1 – F )
E coli
4.6 x 10 6bp
1.1 x 10 3
Human o
3.0 x 10 9bp
6.9 x 10 5
N = no de recombinantes necesarios de cribar
P = probabilidad de obtener el clon
F = tamaño medio de inserto en vector
Para placas con 500 colonias, hay que cribar > 1000 plates
para tener un 99% de probabilidad para tener una colonia
positiva
TIPO LIBRERÍA
cDNA
Genomic
VECTOR
INSERTO MÁXIMO
plásmido
< 10kb
fago
23kb
cósmido
45kb
BAC
350kb
YAC
1000kb
Figure 9.2
Propiedades que un vector bacteriano debe
tener
1. Capaz de replicarse:
replicarse:
• replicarse de manera autónoma (su propio origen de
replicación)
• extracromosómico al cromosoma del huesped
2. Marcadores de selecció
selección:
• normalmente resistencia a antibiótico en E. coli
• actividad B-galoctosidasa
3. Sitios de restricció
restricción únicos:
nicos:
• sitio presente sólo una vez en el plásmido
• al linearizar el fragmento puede ser clonado
4. Alto nú
número de copias si es posible:
posible:
• 1-50 copias (mientras más mejor)
Vectores:
Vectores:
• llevan el DNA extraño (normalmente plásmidos
• origin of replicación, sitios de E.R. únicos
Vectores plasmí
plasmídicos:
dicos:
• ocurren de manera natural,
moléculas dsDNA
• Insertos de hasta 15kb de
RruI
longitud
PvuI
• se replica en células del
PstI
huesped
• 1,000 bp a 100 kb
pBR322 (generado
(generado por
ingenierí
ingeniería gené
genética)
tica)
• 2 genes antibióticosR
• sitios de restricción únicos
• solo 10-50 copias/
copias/c élula
2
Digiere DNA extraño con
el mismo enzima
Plásmidos
bacterianos se han
manipulado para que
sirvan de vehículos
(vectores) para la
replicación de nuestro
DNA
• Si el sitio de
reconocimiento es de 6 bp
está al azar en el genoma
corta cada 4096 bp (4 6)
Linearizar
plásmidos
con enzimas
de restricción
Propiedades:
• genoma humano
3 x 10 9 bp…>7 x 10 5
fragmentos
Una población
completa de
transfomantes
representa una
librería
genómica
• origen de replicación
• MCS (sitios de
restricción para
introducir el DNA
•Fragmentos individuales se
ligan a plásmidos
individuales de DNA
• métodos de selección
del plásmido en la
bacteria
• transformación introduce
plásmidos individuales
(clones) en bacteriasf
Pasos implicados en clonaje molecular
Selection
1. Digerir DNA purificado para clonar es decir obtener el inserto y
el vector con el MISMO E.R
2. Tomar los fragmentos de DNA digerido con un tamañ
tamañ o
adecuado para insertarlo en el vector
3. Ligar con DNA ligasa para formar DNA recombinante
Pasos implicados en clonaje molecular
4. Transfiere el vector con inserto a cé
cé lulas vivas
• Se llama Transformació
Transformación
• Se generan copias por replicació
replicación, y por tanto se
conocen como clones de DNA
• Cada clon es gené
genéticamente idé
idéntico
5. Seleccionar células que llevan plámidos recombinantes
• resistencia a antibiótico, producto coloreado
¿Cómo sabemos que un plá
plámido contiene un inserto?
inserto?
Selecció
Selección y cribado de molé
moléculas recombinantes:
recombinantes
Posibilidades en una bacteria transformada:
• La bacteria sola (no transformación) - 1x107 posib.
• bacteria + plá
plásmido religado
• Bacteria + inserto DNA religado (sin sitio ori)
• Bacteria + plá
plásmido + inserto (molé
moléculas
recombinantes)
recombinantes)
Necesitamos un modo de seleccionar fácil y rápido
por recombinantes
• ¿Cómo usamos los marcadores de selección?
pBR322
Uso de marcadores
de selecció
selección
pBR322 tiene 2 genes
AntibioticR cada uno con un
sitio único E.R.
• Inserto en sitio Sal1 se inactiva el
gen tet R
• se llama inactivació
inactivación por
inserció
inserción
• convierte el fenotipo de
la bacteria:
TetR
a
Tet S
3
Colonias con E. coli AmpR
Colonies missing on Tet plate
insert
Master Plate
Ampicillin in
media
Replica Plate
Tetracycline in
media
Volver a la placa original y picar colonias que
no crecen en placas Tet. Estas tendrán el
inserto de interés.
Seleccionar E. coli con plásmidos
1) crecer en medio LB con Amp (las E. coli con plásmidos serán AmpR)
-permite eliminar todas las E. coli sin transformar (no tendrán plásmido y serán
AmpS)
2) Pero estamos interesados en plásmidos con inserto – ¿como podemos identificar
estos clones usando marcadores de selección?
3) Hacer una placa réplica de una placa original Amp y transferir a placas con Tet.
Plásmidos con inerto no crecerán en Tet (al ser Tet S)
Selección de transformantes – el plásmido confiere
resistencia a un antibiótico
Amp r
Amp r
recombinante
transformantes
Ampicillina
Selección de transformantes recombinantes – p.e.
selección blanco/azul. El operón de la lactosa (Lac)
Lactose
B-galactosidase
INSERTO – inactiva el gen lacZ’:
colonias blancas
galactose + glucose (+allolactose)
Blue
mRNA policistrónico
X-gal
lacI
Alolactosa se une al represor lac e inhibe represión
El gen lacI está controlado aparte (situado aguas arriba)
Expresión de lac Z, posibilita a E. coli metabolizar glucosa
Expresión de lac Y permite a E. coli importar lactosa
lac A es una tiogalactosidasa transacetilasa
Cter
m
lacZ’
-ve
plasmid
IPTG
Genoma de la bacteria
4
Vectores pUC:
pUC:
β- galactosidasa (Lac Z) convierte lactosa en galactosa + glucosa
Amp r
recombinantes
transformantes
El cribado de colonias azules y blancas es lo más usado en procesos de clonación
Identificar Transformantes
Como identicar clones de interés en este plásmido
• Usar un producto sintético llamado X-gal
• β-galactosidasa brompe X-gal a galactosa + colorante azul
Select for White colonies on Ampicillin (AmpR)
and X-gal plates (LacZ
(LacZ-)
pUC Vector
Blue
white
Ampicilina + medio X-Gal
Medio con Ampicilina
Permite seleccción y cribado en una placa.
No hace falta réplica. Picar colonias blancas
Clonaje direccional
Evita autoligación y a menudos se quiere introducir en una
orientación determinada
• Se puede hacer usando dos enzimas de restricción
distintos en el vector
• Generar el DNA a clonar con los dos mismos enzimas
de restricción
• DNA sólo se puede insertar en una dirección
5
Los virus también se pueden usar para
clonar moléculas de DNA exógenos
debido a su capacidad de propagarse en
bacterias
Sub-clonación
plásmido A
plásmido B
• digerir DNA de
fago lambda
• eliminar sección
intermedia
(contiene genes
para lisogenia)
• ligar DNA
extraño a los
brazos del fago
lambda
•infect E.
coli
• mezclar con
proteínas de la
cápsida para
empaquetar DNA
recombinante
Crear una librería
genómica usando fago
lambda...
•Infectar una célula
bacteriana con un
fago recombinante
• mezclar con
bacteria sin infrectar
y plaquear
Todas las placas de
fago juntas es una
genoteca genómica
Cósmidos
smidos
(CLON)
• Es un plá
plásmido pequeñ
pequeño que contiene el sitio cos, un
origen de replicació
replicació n de un plá
plásmido y genes de
resistencia a antibió
antibió tico
• Se empaqueta como un bacterió
bacteriófago,
fago, pero el
plá
plásmido se replica como un plá
plá smido cuando el
DNA está
está en la bacteria
• Pueden insertarse fragments de DNA 35 y 45
kilobases
6
Cósmidos
• Vectores que son híbridos entre plásmidos y
fago lambda
• Se pueden replicar en la bacteria como un
plásmido y empaquetar como un virus
• Pueden contener fragmentos de DNA más
grandes que los plásmidos
Vectores en levaduras
Cromosomas artificiales en levaduras (YACs)
YACs)
1.
2.
Cromosomas artificiales de bacterias
(BACs)
BACs)
•
Vectores sinté
sint éticos que se han usado para clonar fragmentos grandes de
cromosomas de eucariotas ((entre
entre 100 y 300 kilobases
kilobases))
•
Usado en el an
aná
álisis de grandes fragmentos de genomas complejos,
complejos , genes
completos y construcci
construcció
ó n de mapas fí
f ísicos de genomas
•
Generado usando un pl
plá
ásmido pequeñ
peque ño, llamado factor F (fertilidad
( fertilidad),
), permite
la clonaci
clonació
ón y marcadores de selecció
selecció n
•
El factor F permite al vector integrar grandes fragmentos de DNA, siendo
hasta un 25% del tama
tamañ
ño del cromosoma bacteriano
Contiene los componentes siguientes:
siguientes :
Un centr
centró
ómero que permite al cromosoma que se transfiera a ccé
é lulas
hijas durante la divisió
división celular
•
Un tel
teló
ó mero al final del cromosoma de levadura que permite replicació
replicaci ón
correcta y evita degradació
degradaci ón
•
Una secuencia de replicaci
replicació
ón autó
aut ónoma (ARS) que consiste en
secuencias de DNA espec
especíífica que permite la replicació
replicació n de la mol
molé
écula
•
Un gen que permite un modo de detectar la detecció
detecci ón del fragmento
insertado
Util para clonar grandes fragmentos de DNA (entre 200 y 1500 kilobases)
•
Estudios genéticos
clásicos identifican
un gen con un
fenotipo
interesante…como
lo clonamos
La genoteca genómica
contiene >10 6 clones
individuales
Resumen de la
construcción de una
genoteca genómica
¿Cómo identificamos un
clon que contiene un gen
de interés en una
genoteca?
Nuestro genoma
¿Cómo identificamos un clon
que contiene un gen de interés
en una genoteca?
Nuestro gen!
7
r
ma
for
La pregunta es: ¿qué plasmico contiene nuestro gen de
interés y como lo aislamos de la genoteca?
¿Qué podemos usar como sonda?
ns
LIBRERÍA
tra
dig
eri
r
Li
ve gar a
cto u
n
r
LIBRERÍA
genoma
BÚSQUEDA DE
COLONIAS USANDO
UNA
“SONDA”
Información sobre la secuencia de proteína da información
sobre la síntesis de sondas de oligonucleótidos
Normalmente:
Un oligonucleótido
Una cadena corta de ácidos nucleicos
(sintetizada por nosotros) que hibrida
con nuestro DNA objetivo
Una sonda de cDNA Un trozo de DNA mayor
Un anticuerpo
El vector debe producir la expresión de
proteínas!
Cribado usando secuencias similares
• Si un tejido está enriquecido en un mRNA
determinado, éste se puede usar como sonda
– p.e. secuencias de genes de globina
• A veces es más fácil aislar una secuencia de un
organismo que de otro, y este gen relacionado se
puede usar para pescar el mismo gen de otro
genoma
– p.e. secuencias de genes de actina
• replica plate
plaques or
colonies onto
filter
Librería genómica
• denaturedeDNA
fago lambda
on filter
plaqueadas en placas
• incubate with
petri
radiolabeled
probe
Cada clone
ocupa
un that
• detect
cells
lugar específico
contain en
correct
una placagene by
autoradiography
• grow up
appropriate
clone
8
• replica de
placas o
colonias en un
filtro
• desnaturalizar
DNA en el filtro
• incubar con
sonda
radioactiva
• detectar las
células que
contienen el gen
por
autoradiografía
• crecer el clon
apropiado
Ejemplo:
Estamos interesado una proteína (P450) que metaboliza
drogas anti-HIV
Hemos purificado una proteína de 50kDa y reconstituimos una
actividad que metaboliza la droga (estamos bastante seguros
que hemos purificado la proteína correcta)
Secuenciamos los aminoácidos del amino N
La secuencia que obteniemos es:
MALIPDLAM????. ilegible….
Queremos saber la secuencia de aminoácidos completa y tener
el clon para manipularlo
Usamos el código genético para designar oligonucleótidos para el
cribado
No secuenciamos proteínas para tener su secuencia de aas
completa: técnicamente dificil
Deducimos la secuencia de aas a patir de su secuencia de cDNA
Necesitamos clonar el cDNA para el enzima P450
¿Qué hacemos?
1. Hacemos una genoteca de cDNA de un tejido que exprese
altos niveles de la proteína (si cantidad de proteína es alta, es
lógico que cantidad de mRNA sea alta y por tanto
enriquecemos el cDNA)
2. Cribamos la genoteca con una sonda:
- ¿oligonucleotido?
- ¿anticuerpo?
UN AU U/C/ CCN GA U/C
U/
C
A
Por ej. UUN AUG CCN GAC
5’ GTC NGG GAT NAA
ci ó
ma
for
GENOTECA
mRNA consenso
Reverso complementario
Secuencia de la sonda
AAAAAAAAAA
5’
n
Codones de mRNA
posibles
ns
5’ UUA AUU CCU GAU
G
C
C
C
CUU
A
A
C
G
A
G
Secuencia de proteína
tra
M A L I P D L A M
3’
5’
9
Hacer una copia en nilon de la placa de bacterias
OBJETIVOS
Cribar nuestra copia en nilon con nuestro oligo marcado
1. Qué es clonar
El oligo hibridará con nuestro plásmido recombinante que
contengo el reverso complementario de la secuencia del oligo
2. Enzimas que se usan en tecnología del DNA
recombinante
3. PCR
3 Generación y cribado de genotecas
*
*
*
Picar y
crecer
(clon)
*
NILON
AUTORA
DIOGRAFÍA
4. ¿PORQUÉ? – Expresión del gen / mutagénesis.
5. Secuenciación del DNA
PLACA DE AGAR
¿Por qué el peñazo de clonar? Razones posibles-
•Secuenciación de cDNA sequence …. Determinar la secuencia de
aminoácidos de una proteína
•Expresar el cDNA – proteína, producir grandes cantidades y
proteína pura
Purificar por cromatografía
de afinidad
bacteria
Ni
•Crear una proteína con etiqueta: p.e. Generar una etiqueta de His
HI
S
ligate
Ni
Ni
VECTOR
Eluir
HIS
Eg plasmid
Otras proteínas
Si podemos obtener nuestro vector recombinante:
Determinados resíduos de Aas se pueden mutar:
M A L I P D L A M
5’ UUA AUU CCU GAU
Secuencia de proteína
Posibles codones de
mRNA
Dentro de células humanas y si permaneciera estable y
expresada la proteína lo podríamos usar como terapia
génica
Si cambiamos UUA AUU CCU GAU a
UUA AGG CCU GAU o
UUA
CCU GAU o
UUA UAG
Mutación I/R
Delección
Sin embargo, no funciona – actualmente se están
intentando vectores virales
Truncar
stop
10
OBJETIVOS
Secuenciación del DNA
1. Qué es clonar
Nos informa de la secuencia del gen / cDNA / aminoácido
2. Enzimas que se usan en tecnología del DNA
recombinante
¿Cómo se hace? Método enzimático de Sanger- recordar DNA
polimerasas:
Necesitamos un cebador con un 3’OH libre
3. PCR
3 Generación y cribado de genotecas
DNA se sintetiza en una nueva cadena SIEMPRE en dirección
5’ 3’
4. ¿PORQUÉ? – Expresión del gen / mutagénesis.
Se basa en le parada de polimerización en los dideoxinucleótidos de
la nueva cadena
5. Secuenciación del DNA
5’
3’
3’OH
5’
Dideoxinucleotidos:
N
se usan para parar la síntesis en una base específica
5’
N
N
5’
P
+
P
N
P
N
P
P
DNApol
N
N
P
P
P
OH
OH
P
Análogo Dideoxy
NO TIENE 3’ OH
N
P
OH
Dideoxynucleótidos
N
5’
N
N
5’
P
+
P
N
P
N
P
DNApol
N
P
P
N
P
P
OH
P
N
H
P
H
PARADA!!
• Se preparan 4
reacciones de síntesis
de DNA diferentes
• comienza la síntesis
de un lugar donde se
ceba específicamente
• se añaden los
componentes para
síntesis de DNA +
ddNTP específico para
for cada una de las 4
reacciones
No
3’OH...
11
Correr las 4
reacciones
diferentes en un
gel de
electroforesis…
los fragmentos
más pequeños
(más cercanos
al cebador)
migra más lejos
A
A
T
C
T
G
G
G
C
T
A
T
T
C
G
G
G
C
G
T
Para la cadena
sintetizada ...
Leer
5’>3’
Secuenciación automática de
DNA:
• cada reacción se marca
específicamente con una
molécula fluorescente distinta
5’ a 3’ para la
cadena
sintetizada...
•Puesto que cada fragmento se
marca con un color distinto se
pueden cargar en la misma
calle
•Un laser incorporado en el
aparato puede iluminar las
bandas y grabar la señal
fluorescente cuando el DNA
pasa el detector…
computador
La salida del detector se envía directamente a un
computador y la secuencia de DNA se graba (en
tiempo real) a medida que se corre el gel…
Ejemplo de salida:
Señal azul
fluorescente
detectada
A
A
T
C
T
G
G
G
C
T
A
T
T
C
G
G
G
C
G
T
Resumen
1. ¿Qué es clonar?
Hacer múltiples copias de la misma cosa
2. Enzimas empleados en tecnología de DNA
recombinante
DNA polimerasa
RNA polimerasa
Transcriptasa reversa
Endonucleasas de restricción
DNA ligasa
Fosfatasa
Quinasa
12
3. Hacer genotecas
4. ¿Por qué? – expresión del gen / mutagénesis
DIGERIR / LIGAR / VECTOR / TRANSFORMACIÓN /
HUESPED
Estudios de función génica / purificación / mutagénesis
•
Genoteca genómica – moléculas de vector que contienen
insertos de DNA genómico
•
Genoteca de cDNA – moléculas de vector que contienen
insertos de cDNA – recuerda RNA
cDNA (específico
de tejido)
•
Tamaño del inserto / tipo de vector
•
Tipos de sonda
5. Secuenciación del DNA
DNA polimerasa / cebador / ddNTPs
MOLECULAR
BIOLOGY OF THE
GENE
4. PCR.
13