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Fisiologia de la Sangre Año 2010 Estructura y función de leucocitos - granulocitos y monocitos Dr Jorge Arbelbide Hospital Italiano de Buenos Aires Miercoles 23 de junio, 2010 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS LEUCOCITOS NEUTRÓFILOS GRANULOCITOS EOSINÓFILOS BASÓFILOS MONOCITOS/MACRÓFAGOS FAGOCITOS FAGOCITOS Células derivadas de la progenitora hematopoyética Engloban y digieren materia particulada Localizan, ingieren y destruyen agentes microbianos Síntesis y secreción de citoquinas, pirógenos y mediadores celulares Stem cell SCF, G-CSF, IL-1, IL-6, IL-10,bFGF, UFC-GEMM SCF, IL-3, IL-6, GM-CSF, GM-CSF, G-CSF, IL-3 UFC-GM UFC-B UFC-G Mieloblasto UFC-M UFC-E Eritroblasto Producción de granulocitos UFC-Meg Megacarioblasto Cinética de granulocitos neutrófilos y monocitos Neutrófilos Compartimiento mitótico MO Mieloblasto Promielocito Mielocito Compartimiento madurativo/depósito Metamielocito Cayados Neutrófilos Compartimiento vascular Circulantes Marginales Monocitos Compartimento mitótico en MO promonocitos Compartimiento no mitótico monocito Compartimiento vascular Compartimiento tisular Tránsito (horas) Celularidad (109/kg) 23 26-78 17-1266 0,14 0,51 1,95 8-108 12-96 0-120 2,7 3,6 2,5 4-10 4-10 0,3 0,4 160 0,006 24 36-104 días-meses 0,10 0,024 ? Estructura del Neutrófilo Célula compuesta por: Nucleo lobulado (3-4 lobulos). Citoplasma con granulos (primarios, secundarios y terciarios) Pocas mitocondrias y organelas Ap. de Golgi y el Sistema Reticuloendoplasmico pequeño Citoesqueleto con filamentos especializados Filamentos citoesqueléticos (locomoción, fagocitosis,exocitosis) Actina: periférica malla de exclusión de organelas proteínas de unión relacionan con membrana Microtúbulos: citoplasma perinuclear próximo al Golgi Contenido de gránulos de neutrófilos Primarios Azurófilos Membrana CD63 CD68 Secundarios Específicos Membrana Cd15 (LewisX) citocromo b558 recep formilpeptido Matrix G-prot mucopol. Ácido rec laminina alfa antitripsina Mac-1 (CD11b/CD18) alfa manosidasa Rap 1 Rap 2 azurocidina rec trombospondina prot incr permeab bact rec TNF colagenasas vitronectina catepsinas defensinas Matrix elastasa beta microglob prot de trasp heparina colagenasa lisozima histaminasa mieloperoxidasa gelatinasa sialidasa heparanasa lactoferrina Terciarios Vesículas Gránulos de gelatinasa secretoras Membrana Mac-1 rec formilpeptido diacilglicerol deacilasa Matrix gelatinasa acetiltransferasa Membrana fosfatasa alcalina citocromo b558 rec formilpeptido Mac-1 rec activador uroplasm Matrix proteína plasma FUNCIÓN NEUTRÓFILA 1- Migración e ingestión 2- Opsonización y fagocitosis 3- Degranulación 3- Actividad respiratoria 4- Toxicidad independiente de O2 Mecanismos de reconocimiento de patógenos por Macrófagos y Células Presentadoras de Antígenos (CPA) 1) Pattern-recognition receptor (PRR): Reconocen a los pathogen-associated molecular pattern (PAMP) Hay 3 clases: - Secretorios (actuan como opsoninas se unen a la bacteria y activan al complemento). - Endociticos (están en la superficie celular, reconocen los PAMP, favoreciendo su captura y endocitosis). - Amplicatorios de señales: Reconocen a los PAMP y traducen señales que inducen expresión de citoquinas. 2) Toll receptors: Reconocen al Lipopolisacarido (LPS) bacteriano unido a una proteína sérica Media expresión de CD80 y CD86 para la activación del linfocito T ante la presentación de antígenos. 3) Receptores del Sistema del complemento 4) Receptores para Fracción Fc de Inmunoglobulinas Macrófago: Presentación de antigenos Receptores involucrados en la respuesta inmune inepecifica y especifica de la celula presentadora de antigenos El reconocimiento del pathogen-associated molecular pattern (PAMP) por los pattern-recognition receptors (PRR), como el toll-like receptors (TLR), generan señales que activan el sistema inmune especifico. La endocitosis de los PRR, como el receptor manosa macrofagico, unido a componentes de la pared bacteriana estimula la captación y fagocitosis de los patógenos por las células presentadoras de antígenos (macrófagos y células dendríticas). Las proteínas derivadas de los microorganismos son procesadas por los lisosomas para generar péptidos antigénicos, que van a formar complejo con el complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC) en la superficie del macrófago. Estos péptidos son reconocidos por los linfocitos T. Cuando la señal es generada por el reconocimiento de los PAMP por los PRR como el TLR, se produce expresión de citokinas y moléculas co-estimuladoras que van a permitir la activación del linfocito T. Inicio de la respuesta inflamatoria por gramnegativos 1- Migración e ingestión Interacciones con endotelio durante la migración de neutrófilos Rolling Contacto al azar selectinas adherencia diapedesis quimiotaxis Integrinas y Ig-like Direc flujo Activación de célula endotelial Estímulo extravascular Activación leucocitos quimiotrayente QUIMIOATRAYENTES DE NEUTROFILOS Y MONOCITOS Receptores quimioatrayentes Estímulo extravascular Origen Estímulos Target Lípidos PAF LTB4 N,E,B,P,M N,M (met araq) Ionoforos Ca FMLP, micr N,E N,M,E Intercrinas α IL-8 GROα β γ NAP-2 M, endot, otras M, endot, otras P LPS, TNF, IlIL-1, TNF Plat activ N,B N N Intercrinas β MCP-1 (MCAF) RANTES M, endot, otras M IL-1,TNF,LPS, PDGF IL-1,TNF, M,B M,B Otros FMLP C5a Bacterias Activ complement N,M,E,B N,M,E,B GRO= growth related gene, PAF: platelet activation factor, LTB4: leukotriene B4, NAP-2: neutrophil activating peptide 2, MCAF: monocyte chemotactic and activating factor, FMLP: formil-metionil-leucil-phenilalanina, RANTES: regulated upon activation normal T cell expressed and presumably secreted Rolling (apariencia en M.O iontravital) P selectina Unión de baja afinidad endot – N Intervención de selectinas de endotelio P-selectina la de mayor importancia Dominio lectina Dominio EGF P selectina Estímulo extravascular L-selectina TNF IL-1 Cuerpos de Weibel-Palade E-selectina P-selectina Unión a carbohidratos grupos sialil N,M,L Linfo homing inflamación Endotelio inflamación Endotelio,P Adherencia Receptores de integrinas leucocitarios Intracellular adhesion molecules (ICAM) en endotelio Fragmentos de complemento en endotelio La adherencia depende de la concentración del quimioatrayente Integrinas (β2 CD18) LFA-1 Estímulo extravascular ligando distribución CD11a CD18 ICAM-1 ICAM-2 ICAM-3 leucocitos Mac-1 CD11b CD18 ICAM-1 C3bi Fibrinogeno Factor X Granulocitos M LGL p150,95 CD11c CD18 C3bi? Otros? Granulocitos M LGL ICAMs (intercellular adhesion molecules) Superfamilia de inmunoglobulinas Receptor Distribución Estímulo Contrareceptor Función ICAM-1 (CD54) Endot, otras Mac-1 Adhesión L ICAM-2 Endot TNF, IL-1 IFN, LPS No LFA-1 Adhesión L ICAM-3 Endot No p150,95 VCAM-1 Endot TNF,IL-1 LPS VLA-4 Adhesión L,M Integrinas y selectinas en la adhesión leucocitaria a endotelio Es en momentos de anormalidad cuando la Naturaleza revela sus secretos J.W.Goethe Alteraciones de CD18 (β2 integrinas) LAD I: leucocyte adhesion deficiency Estructura de CD18 y sitios de mutaciones identificados en LAD (leucocitosis, pobre cicatrización, infecciones bacterianas agudas repetidas) LAD II: deficit de selectina (desc reciente) Migración transendotelial (diapedesis) y quimiotactismo Diapedesis depende de β2 integrinas ICAM-1 Respuesta activa a gradiante de quimoatrayentes Liberación de colagenasa y gelatinasa rompe la MB quimiotrayente Quimiotaxis Movimiento direccional celular en un gradiente de concentración de una sustancia En los N movimiento con concentraciones menores que para degranulación y activación de cadena respiratoria Pseudópodos, lemelae, lamelopodios: en el área de empuje, sin organelas Núcleo en zona posterior del movimiento Requiere adhesión reversible (uPA – a GPI) Ensamblaje dinámico de la actina globular a filamentosa Ciclo de la actina en pseudópodos de Neutrófilos. 2- Opsonización y fagocitosis Favorecer reconocimiento Posibilitar la ingestión de partículas extrañas inmunoglobulinas opsonicas IgM,IgG1,IgG3 opsoninas Fragmentos de complemento C3 Ig--------- receptores Fc (miembros de superfamilia de genes de Ig) Neutropenia allo y autoinmune: Atc contra receptor FcIIIB de N Fagocitosis Fagocitosis: Se inicia con la union de partículas (material inerte, microrganismos o células muertas con receptores de la superficie celular. Esto genera el desarrollo de un corto pseudopodo en la superficie celular de los fagocitos (B). Las señales producidas actuan rapidamente sobre el citoesqueleto, principalmente sobre la actina que se reorganiza y permite la extensión del pseudopodo. En el proceso de fagocitosis, la formación del fagosoma sobre la membrana, ocurre por un proceso de invaginación (Aa). Por un proceso llamado exocitosis focal (Ab), se pueden reciclar los endosomas de la superficie celular, constituyendo una potencial fuente de membranas para la formación del fagosoma. Tambien participan en la fagocitosis como fuente de membranas, el Sistema Reticuloendotelial (ER) (Ac). En algunos casos, los lisosomas (Ly) y los granulos azurofilos (AG), de los neutrofilos, pueden fusionar sus membranas plasmaticas durante la fagocitosis (Ad). Despues de esta formación, los fagosomas se fusionan en forma secuencial con los endosomas, lisosomas, las proteinas de membrana asociada a lisosomas (LAMP) (C) o calnexina(D) se pueden observar en fagosomas aislados indicando la contribucion de las membranas del RE en la biogenesis de estos compartimientos. 3- Degranulación Fusión de gránulos con membrana de fagososma o plasmática Respuesta a aumento de concentración de Ca Vesículas secretorias (Mac-1) Ca (exocitosis) Gránulos azurófilos se unen a fagosoma Ca Vesícula secretoria fagosoma gránulo Parásitos intracelulares (–) degranulación: Micobacterias, Legionella, Toxoplasma Salmonella, Listeria Estímulo infeccioso: Fusión de gránulos: vacuolización granulaciones tóxicas (gr prominentes) cuerpos de Döhle (retículo endopl retenido) Cambios morfológicos = cambios en expresión de genes transcr trad mRNA mieloperoxidasa sólo mieloblastos y promielocitos transcr trad mRNA lactoferrina sólo mielo y metamielocitos 4-Toxicidad dependiente de O2 PMN en reposo activado “explosión” respiratoria segundos E= glicolisis Bajo consumo de O Aumento +100 veces Consumo de O2 Agte microbiano opsonizado NADPH oxidasa Radical superóxido Reacciones de actividad respiratoria en PMN 1= NADPH oxidasa 2= superoxido dismutasa 3= no enzimático catalizada por Fe 4= mieloperoxidasa 5= espontáneo 6= glutation peroxidasa 7= glutation reductasa 8= G6PD 9= glutation sintetasa Modelo de activación de NADPH oxidasa Citocromo b558 Subunidades solubles Complejo enzimático Multisubunidades Enf Granulomatosa Crónica 5-Toxicidad independiente de O2 Suplemento de toxicidad oxidativa Proteínas antibióticas en gránulos Lisozima Lactoferrina Factor de incremento permeabilidad bactericida Catepsina G Defensinas Catelicidinas Ensayos terapéuticos Serpocidinas Derivados porcinos Efectivas contras cepas resistentes de M tuberculosis GRANULOCITOS EOSINÓFILOS Y BASÓFILOS Eosinófilos 0,3% de celularidad en MO CFC-Eo estimulada por IL-5 Núcleo bilobado gránulos eosinófilos Funciones inmunomoduladoras Rol en infecciones helmínticas Mayor cantidad en tejidos que en sangre (1:300) Ritmo circadiano (+nocturno) de acuerdo a cortisol EOSINÓFILOS Procesos involucrados en la Eosinofilia: Los eosinofilos se desarrollan en la medula osea en respuesta a la estimulacion de las celulas progenitoras por la IL-5. Los eosinofilos maduros se adhieren en la sangre a las celulas endoteliales a traves de la interaccion de selectinas e integrinas(CD18 y VLA-4) con receptores endoteliales. La exposicion a sustancias quimiotacticas, permite que los eosinofilos migren por diapedesis desde las celulas endoteliales a los tejidos. La acumulación de los eosinofilos esta regulada por la produccion de factores que regulan su sobrevida y activacion (interleukina-3, interleukina-5 y granulocyte–macrophage colonystimulating factor [GM-CSF]) de las celulas T y mastocitos. EOSINÓFILOS Eventos que generan Eosinofilia en respuestas de fase tardía. Despues de la exposición al alergeno en personas sensibles hay 2 vías que llevan a la acumulación de eosinofilos: A) La exposición al alergeno interacciona con los receptores IgE de los mastocitos y basófilos produciendo la inmediata liberación de mediadores inflamatorios (histamina, prostaglandinas y leukotrienos).Los mastocitos generan citoquinas proinflamatorias (ej: Interleukina-1 y TNF ) que inducen en las células del epitelio respiratorio producción de citokinas de accion directa sobre el eosinofilo (ej: granulocyte–macrophage colony-stimulating factor [GM-CSF]). B) Otra via, el alergeno es reconocido por una celula presentadora de antigeno y presentado al linfocito T helper tipo 2 y esta celula regula la reaccion alergica y acumulacion de eosinofilos por generacion de citokinas ( IL-5 que estimula la produccion de eosinofilos y IL-4 que induce produccion de IgE y expresion de VCAM-1. EOSINÓFILOS El Eosinofilo y su contenido: Los granulos del eosinofilo contienen la proteína mayor básica (PMB) en su cubierta y su matriz esta compuesta por proteína cationica del eosinófilo (PCE), peroxidasa (MPO) y neurotoxina derivada del eosinófilo (NDE). El Eosinófilo también produce una variedad de citokinas algunas almacenadas en sus granulos y mediadores lipídicos que se generan luego de la activación celular. Expresan receptores para citokinas que le permiten interactuar con múltiples citokinas. Gránulos eosinófilos Primario promielo • peroxidasa eo • lisofosfolipasa (polim: Charcot-Leiden) Secundarios o específicos mielo eosinófilos • prot. básica mayor • prot catiónica eos. • neurotoxina del eos Terciarios mielo eosinófilos • fosfatasa ácida • sulfatasa Proteína básica mayor (MBP) • 50% proteína contenida en los gránulos del eosinofilo • Adherencia a Schistosoma mansoni y Trichinella spiralis, produciendo lesion de su membrana. • Liberación de histamina por basófilos Proteína catiónica de eosinófilos (ECP) • Inmunológicamente distinta a MBP • 30% del total de proteína de gránulos • Tóxica contra parásitos (8-10 veces mas potente que la MBP) • No es bactericida. • Se une y neutraliza heparina Peroxidasa de eosinófilos (EPO) • Mayor actividad que MPO • Inmunológica y genéticamente distinta de MPO • Efectos bioquímicos similares a MPO Neurotoxina derivada de eosinófilos • Actua sobre fibras mielinizadas • Fenómeno de Gordon: administrada por via intratecal produce toxicidad sobre sustancia blanca • Acción neurotóxica de elevada potencia • Manifestaciones neurológicas de síndrome hipereosinofílico Función eosinófila Acción antihelmíntica y protozoarios Adhesión a superficie peroxidación con EPO toxicidad a larvas por MBP • Libera PgE1/E2 inh degranulación de basófilos Modular las reacciones • Libera histaminasa. de hipersensibilidad • Inactiva a sust liberacion lenta de anafilaxis y ag.quimiotacticos (aril-sulfatasa) • Fosfolipasa B y D que inhiben al PAF. • MBP une a heparina de mastocitos • Lisofosfolipasa modula las reacciones alergicas BASÓFILOS Mediadores reacciones de hipersensibilidad asma urticaria rinitis alérgica anafilaxia Estimulados por mediadores solubles (IgE) Degranulación . Metabolitos araquidonato Progenitor común con mastocitos? ESTRUCTURA DEL BASÓFILO • Núcleo bilobulado • Citoplasma • Gránulos basófilos Heparina Glicosaminoglicanos sulfatados (metacromasia) Histamina Tripsina-Quimiotripsina Kalicreina • Membrana Leukotrieno C4 IgE receptores Receptores de citoquinas( IL-2, IL-3,IL-4, IL-5) FUNCION DEL BASÓFILO Participa en la Reacción Anafiláctica: • Se degranula por interacción de IgE con su receptor o ante estimulos (C3a, C5a, proteínas lisosomicas del neutrófilo, frio, hormonas). • Libera sustancia quimiotacticas para el eosinófilo • Es importante en las fases tardias de las reacciones alergicas (aquellas que ocurren horas despues de la exposición al antigeno, por lo general en piel y pulmón) FAGOCITOS MONONUCLEARES 10 – 18 u Células residentes tisulares: macrófagos Caract estearasa inespecífica Caract CD14 activación IFN gamma Jak/STAT Fagocitosis Presentación de antígenos a linfocitos Producción de factores de crecimiento Producción de linfoquinas Reparación de heridas Mecanismos de remoción de detritos Linfocito T Cinética de neutrófilos y monocitos Neutrófilos Compartimiento mitótico MO Mieloblasto Promielocito Mielocito Compartimiento madurativo/depósito Metamielocito Cayados Neutrófilos Compartimiento vascular Circulantes Marginales Monocitos Compartimento mitótico en MO promonocitos Compartimiento no mitótico monocito Compartimiento vascular Compartimiento tisular Tránsito (horas) Celularidad (109/kg) 23 26-78 17-1266 0,14 0,51 1,95 8-108 12-96 0-120 2,7 3,6 2,5 4-10 4-10 0,3 0,4 160 0,006 24 36-104 días-meses 0,10 0,024 ? Sistema retículo endotelial Sistema fagocítico mononuclear Bazo Hígado (células de Kupfer) Ganglios linfáticos Pulmones Médula Ósea Submucosa de tracto intestinal Osteoclastos Distinto progenitor: Células de Langerhans en epidermis Productos secretados por fagocitos mononucleares Enzimas Ceramidasa DNAsa Alfa naftil estearasa Catepsinas, elastasa Lisozima Fosfolipasa A Oxidantes Radicales hidroxilos Anión superóxido NO Proteínas transportadoras Haptoglobina gelsolina Proteínas de coagulación Factor tisular Activador de P PAI Metabolitos lipídicos PGE, PGF2 Leukotrienos Citoquinas IFN gamma IL-1 IL-6 G-CSF, GM-CAF, M-CSF Función antimicrobiana Ingestión y destrucción de parásitos intracelulares Mycobacterium Listeria Leishmania Toxoplasma hongos Interacción con linfocitos B y T Inmunidad humoral y celular Actividad tumoricida Muchas gracias