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TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: CINÉTICA ENZIMÁTICA II
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y SU DEPENDENCIA CON LAS CONCENTRACIONES DE
SUSTRATO Y ENZIMA
Recordemos que las reacciones catalizadas por enzimas pueden ser expresadas como:
E + S
k1
k-1
[ES]
(1)
[ES]
k2
k-2
E + P
(2)
De acuerdo a la ecuación (2) la velocidad inicial (Vo) de una reacción catalizada por enzimas
estaría determinada por la desaparición del ES y, por lo tanto, es proporcional a su concentración:
Sin embargo, k2 y [ES] son difíciles de determinar directamente por lo que Michaelis y Menten
V
=
k
[
E
S
] (
3
)
o
2
derivaron la ecuación (3) en términos de otras variables que pueden ser medidas
experimentalmente:
Vo =
V ma x [ S ]
( 4)
K m + [S ]
El efecto de la velocidad al variar la concentración de sustrato [S], mientras se mantiene constante
la concentración de enzima [E], se observa en la siguiente gráfica:
Vo
Vmáx
3
2
-K m
1
[S]
Figura 1: Efecto del sustrato sobre la velocidad de una
reacción enzimática
En la Figura 1 observamos que a bajas [S], V0 incrementa casi linealmente con el incremento de la
[S] (1). A concentraciones mayores de sustrato, los incrementos de velocidad inicial en respuesta a
los incrementos de la concentración de sustrato son cada vez menores (2). Finalmente alcanzamos
un punto donde los aumentos de velocidad son despreciables frente a los incrementos de S. En
este momento decimos que la reacción enzimática tiende a velocidad máxima (3). La curva es una
hipérbola rectangular que pasa por el origen y, cuyas asíntotas son [S] = -Km y Vo = Vmáx.
Las constantes en la ecuación (4) son Vmáx y Km. La Vmáx depende únicamente de la concentración
de enzima y Km es independiente de la concentración de enzima y de la concentración de sustrato.
Km se define (en la deducción de la ecuación 1 y 2) como el cociente entre la suma de las
constantes de disociación del complejo [ES] y las constantes de formación de dicho complejo.
k
k
-1+
2
K
=
(5
)
m
k
1
Si consideramos en la ecuación de Michaelis-Menten que Vo es igual a 1/2 Vmáx (ecuación 6), se
deduce que Km es numéricamente igual a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la
mitad de la velocidad máxima (ecuación 7) y por eso se expresa en unidades de sustrato.
2
V max
=
2
V m ax [S]
K m + [S] = 2 [S]
K m + [S]
K m = 2 [S] - [S]
(6)
El conocimiento de Km nos indica la afinidad de la enzima por un determinado sustrato. Cuanto
menor es Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. El cálculo de Km se utiliza, por
ejemplo, para comparar la afinidad de una misma enzima por sustratos diferentes o de enzimas
diferentes por un mismo sustrato (Figura 2).
Vo
(A)
Vmax
Vo
(B)
Vmax
Sus trato 1
Enzima 1
ato 2
Sustr
Vmáx
2
Vmáx
2
Enzima 1 : Hexoquinasa
a 2 Enzima 2 : Glucoquinasa
Enzim
Enzima: Hexoquinasa
Sustrato 1: glucosa
Sustrato 2: fructosa
Km1
K m2
[S]
Sustrato : glucosa
K m=1 0,1 mM
K m=2 10 mM
K m1
[S]
Figura 2: Curvas de sustrato. (A)Una enzima con dos sustratos. (B)Dos enzimas con el mismo sustrato.
Vo
El conocimiento de Vmáx nos da información sobre la cantidad
de enzima presente ya que la Vmáx es directamente
proporcional a la concentración de enzima.
A medida que aumenta la concentración de enzima aumenta
el complejo [ES] y por lo tanto aumenta la velocidad de la
reacción (Figura 3). Cuando se trabaja con concentraciones
de sustrato saturantes, toda la enzima está formando el
complejo [ES] y el aumento de la velocidad es proporcional al
aumento de la concentración de enzima, es decir que estamos
trabajando en condiciones de Vmáx. Si la concentración de
[Enzima]
sustrato deja de ser saturante el aumento de la actividad deja
3: Efecto de la concentración de enzima en una
de ser proporcional, y la velocidad deja de ser máxima (Figura Figura
reacción enzimática
3).
Teniendo en cuenta estas consideraciones, cuando se necesita conocer la cantidad de enzima
presente en una muestra se recurre a la velocidad de la reacción enzimática que cataliza, en
condiciones saturantes de sustrato (Vmáx). Cabe aclarar que los kits comerciales están diseñados para
medir actividad enzimática dentro de un rango de concentración de enzima. Si la concentración de
enzima es demasiado alta, puede suceder que la concentración de sustrato deje de ser saturante y en
esos casos lo correcto es diluir la muestra problema y luego repetir la medición.
FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La actividad de una enzima se puede expresar en términos de unidades de enzima o unidades
internacionales (UI). La UI (recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica) de cualquier
enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de sustrato en un
minuto (µmol/min). La actividad específica es el número de unidades internacionales de enzima
por miligramo de proteína (UI/mg de proteína).
Asimismo, es útil definir una constante de velocidad general, kcat, para describir la velocidad
limitante de cualquier reacción enzimática a saturación. En una reacción michaeliana k cat=
Vmáx/[Et]. La kcat, denominada también número de recambio, es una constante de velocidad de
primer orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al número de moléculas de
3
sustrato convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola molécula de enzima,
cuando la misma está saturada de sustrato.
Vmáx es proporcional a la [Et]. Entonces, Vmáx = cte. x [Et]. Dicha cte. es kcat = Vmáx / [Et]
MÉTODOS GRÁFICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE
LAS ENZIMAS
Diversos métodos han sido propuestos para determinar Km y Vmáx en forma gráfica: Hanes- Woolf,
Eadie-Hofstee, Lineweaver-Burk, etc. Todos ellos se basan en modificaciones de la ecuación de
Michaelis-Menten para que responda a la ecuación de una recta.
MÉTODO DE LA DOBLE INVERSA (Lineweaver-Burk)
Invirtiendo y reordenando la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene la ecuación de una recta:
1
Vo
1
=
V m ax
+
Km
1
V m ax
x
( 8)
[ S]
Al graficar 1/Vo en función de 1/[S] se obtiene la Figura 4B. De la intersección de la recta con la
ordenada se obtiene 1/Vmáx y de la intersección de la recta con la abscisa se obtiene –1/Km.
Vo
Vmax
(A)
(B)
1
Vo
Pendiente =
Vmax
2
Km
Vmax
1
Vmax
Km
[S]
1
Km
1
[S]
Figura 4: Curvas de sustrato. (A) Representación de la ecuación de Michaelis-Menten (hipébola rectangular).
(B) Representación lineal de Lineweaver-Burk (doble recíproca).
La ventaja del uso del método de la doble recíproca respecto a los otros métodos gráficos radica en
la determinación más precisa de Vmáx y como veremos más adelante será de utilidad en el análisis
de la inhibición enzimática.
En la actualidad se usan métodos de regresión no lineal que están disponibles en diversos
programas para PC, los que por aproximaciones matemáticas sucesivas (iteraciones) encuentran
los valores de los parámetros cinéticos. Cabe aclarar que todas las técnicas de cálculo por métodos
gráficos son menos precisas que los métodos de regresión no lineal.
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Los inhibidores de enzimas son moléculas que interfieren con la catálisis disminuyendo la velocidad
de las reacciones. Varias sustancias pueden inhibir la actividad enzimática, tales como: análogos de
sustratos, toxinas, drogas, complejos metálicos, anticoagulantes, etc.
Los estudios sobre inhibición enzimática nos dan información sobre las vías metabólicas, una visión
acerca de los mecanismos de acción de drogas y toxinas, y una mejor comprensión de los
mecanismos de las reacciones enzimáticas. La determinación de Km y Vmáx tiene gran importancia y
utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se puede determinar la
presencia y tipo de inhibidor.
Los inhibidores de enzimas se dividen en dos clases: reversibles e irreversibles.
INHIBIDORES REVERSIBLES
4
1- INHIBICIÓN COMPETITIVA
Un inhibidor competitivo, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima e impide la unión
del sustrato.
Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen estructuralmente al
sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo [EI]. Debido a que el inhibidor se
une de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competición en favor del
sustrato simplemente añadiendo más sustrato. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la
probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor por lo que la reacción muestra la misma V máx
que la reacción sin inhibidor, pero Km aumenta en presencia del inhibidor (K´m) (Figura 5).
(A)
Vmax
n
Si
or
ibid
h
in
1
Vo
(B)
Co
ni
nhi
bid
or
Vo
idor
inhib
Con
n
Si
or
bid
i
inh
Vmax
2
1
Vmax
Km
K´m
[S]
1
Km
1
[S]
1
K´m
Figura
Figura 9:
5: Efecto de un inhibidor competitivo en una reacción enzimática. (A) Curva de sustrato en presencia
y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recíproca en presencia y en ausencia del inhibidor.
2- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
Vo
(A)
Vmax
1
Vo
Co
ni
bidor
inhi
n
i
S
Vḿax
Co
Vmax
2
nh
ibi
do
r
Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato. La fijación
del inhibidor puede o no bloquear la fijación del sustrato, pero si este último se une al sitio activo
no se puede transformar a P o lo hace a menor velocidad. El inhibidor disminuye de manera
efectiva la concentración de enzima activa por lo que disminuye la Vmáx aparente (V´máx).
Frecuentemente el efecto sobre Km es nulo (Figura 6).
n
Si
1
r
hibido
n in
(B)
r
ido
b
i
inh
Vḿax
1
Vmax
V´max
2
Km
[S]
1
Km
1
[S]
Figura
Figura10:
6: Efecto de un inhibidor no competitivo en una reacción enzimática. (A) Curva de sustrato en presencia
y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recíproca en presencia y en ausencia del inhibidor.
3- INHIBICIÓN ACOMPETITIVA
En este caso el inhibidor se une al complejo [ES], con lo cual el valor de Km disminuye (como si la
enzima tuviera más afinidad por el S). También disminuye la Vmáx ya que el complejo [SEI] es
inactivo (Figura 7).
5
Vo
(A)
Vmax
(B)
1
Vo
r
do
ibi
h
r
n
n i ido
Co nhib
ni
Si
bidor
inhi
Sin
Vḿax
ibidor
n inh
Co
Vmax
2
1
Vḿax
Vḿax
2
1
Vmax
K´m
Km
[S]
1
Kḿ
1
Km
1
[S]
Figura7:11: Efecto de un inhibidor acompetitivo en una reacción enzimática. (A) Curva de sustrato en presencia
Figura
y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recíproca en presencia y en ausencia del inhibidor.
INHIBIDORES IRREVERSIBLES
Con el uso de inhibidores irreversibles es frecuente la formación de un enlace covalente entre
un inhibidor y la enzima. Los inhibidores irreversibles son muy útiles para estudiar los mecanismos
de reacción. Estos juegan un papel central en los métodos modernos para obtener nuevos agentes
farmacéuticos, proceso que se denomina diseño racional de fármacos. Debido a que el inhibidor se
ha diseñado para una enzima específica y no es reactivo hasta que se encuentre en el sitio activo
de la enzima, los fármacos basados en este método son con frecuencia muy efectivos y tienen
pocos efectos secundarios.
Método continuo para la determinación de actividad enzimática
Los métodos utilizados para determinar las actividades enzimáticas pueden ser de dos tipos: los
métodos Punto Final (como el utilizado hasta aquí) y los métodos Continuos.
Abs
Un método continuo para la determinación de la actividad de una enzima consiste en la lectura
de muchos puntos de datos primarios (podría ser absorbancia o fluorescencia) durante el tiempo
que dura la determinación. Si el sustrato o producto de la reacción no presentan absorbancia o
fluorescencia fácilmente detectable se emplean reacciones acopladas a la reacción enzimática a
determinar. Se utiliza el producto de la reacción como sustrato de una segunda reacción
“acoplada” que producirá un cambio que se puede monitorear fácilmente en un espectrofotómetro.
A menudo la reacción acoplada también está catalizada por una enzima. Esta reacción no debe
ser limitante de la velocidad, lo que se logra agregando una gran cantidad de la enzima que
cataliza la reacción acoplada, para que todo el producto formado por la primera reacción sea
consumido en la reacción acoplada inmediatamente después de su formación.
En la mayoría de los casos las reacciones enzimáticas se acoplan a una segunda reacción en la
que interviene una enzima que tiene como cofactor
al NAD+ o al NADH. Como resultado de estas
reacciones acopladas la concentración de NADH
100
irá disminuyendo o aumentando en función del
80
tiempo, en forma proporcional a la aparición del
producto de la primera reacción.
60
NADH + H+
NAD+ + 2H+ + 2 e-
El cofactor tiene un espectro de absorción
diferente en su forma oxidada (NAD+) o en su
forma reducida (NADH) (ver Figura 8). La
concentración de NADH se puede determinar
espectrofotométricamente siguiendo el cambio de
absorbancia a 340 nm.
NADH + H+
40
20
NAD
+
0
220
260
300
340
380
Longitud de onda (nm)
Figura 8. Espectro de absorción del NAD+ y NADH.
6
Objetivos del Trabajo Práctico:
1) Determinar las constantes cinéticas, Vmáx y Km, de la ureasa de soja.
2) Analizar el efecto de inhibidores sobre las constantes cinéticas de la ureasa de soja.
3) Medir la actividad enzimática de ureasa por un método continuo.
PARTE EXPERIMENTAL
IMPORTANTE: repasar todos los conceptos del práctico Nº3 (Cinética Enzimática I) y los
resultados obtenidos y discutidos en el laboratorio. Traer delantal, papel milimetrado,
calculadora, marcador indeleble para tubos, lápiz, regla, y goma de borrar a la clase de
laboratorio.
1) Determinación de constantes cinéticas de la ureasa de soja
La actividad de ureasa de soja se determinará con distintas concentraciones de sustrato por el
método de punto final ensayado en el práctico anterior (repasar los fundamentos del método y los
ensayos realizados).
El siguiente protocolo experimental se seguirá para determinar las velocidades iniciales para
diferentes concentraciones de sustrato, utilizando para ello la [E], el pH, la temperatura y el tiempo
de incubación considerados más adecuados según los resultados del práctico anterior.
Curva de sustrato
TUBO
UREA
5 mM
B
--------
BUFFER
pH: 7
ENZIMA
dil ........
0,8 ml
0,2 ml
Incubar Reactivo
37oC
A
10 '
Reactivo
B
Incubar
37oC
2 ml
2 ml
20 '
1
0,1 ml
0,7 ml
"
"
"
"
"
2
0,2 ml
0,6 ml
"
"
"
"
"
3
0,3 ml
0,5 ml
"
"
"
"
"
4
0,4 ml
0,4 ml
"
"
"
"
"
5
0,5 ml
0,3 ml
"
"
"
"
"
6
0,6 ml
0,2 ml
"
"
"
"
"
7
0,7 ml
0,1 ml
"
"
"
"
"
Abs.
540 nm
 Calcular la concentración de urea en cada tubo teniendo en cuenta la concentración de la
solución de trabajo de urea (5 mM) y las diluciones realizadas.
 Calcular los moles de producto formado con las absorbancias obtenidas, usando la curva
patrón para amoníaco (ver Guía TPN 3). Dividiendo estos valores en el tiempo de incubación,
obtener los valores de velocidad inicial ( Vo ).
 Graficar Vo en función de la concentración de sustrato.
 Calcular las inversas de Vo y [S] y determinar las constantes cinéticas con el método gráfico de
Lineweaver-Burk (doble inversa).
2) Determinación de constantes cinéticas de la ureasa de soja en presencia de
inhibidores
Para ello se realizarán curvas de sustrato en presencia de distintos inhibidores de la enzima.
Los inhibidores usados serán:
Cloruro de Guanidina: Solución 20 mM en buffer fosfato-citrato 10 mM, pH 7
Glicina: Solución 20 mM en buffer fosfato-citrato 10 mM, pH 7
CuCl2: Solución 1 M en ácido clorhídrico 10 mM
H2N
N
H
-C
H
-C
O
O
H
2
2
C = NH
H2N
Guanidina
G
lic
in
a
7
Curvas de sustrato en presencia de Inhibidores
TUBO
B
5 mM
Inhibidor BUFFER
pH: 7
X mM
--------
0,1 ml
UREA
ENZIMA
dil X
0,7 ml
0,2 ml
Incubar Reactivo Reactivo Incubar
37oC
A
B
37oC
10 '
2 ml
2 ml
20 '
1
0,1 ml "
0,6 ml
"
"
"
"
"
2
0,2 ml "
0,5 ml
"
"
"
"
"
3
0,3 ml "
0,4 ml
"
"
"
"
"
4
0,4 ml "
0,3 ml
"
"
"
"
"
5
0,5 ml "
0,2 ml
"
"
"
"
"
6
0,6 ml "
0,1 ml
"
"
"
"
"
7
0,7 ml "
0 ml
"
"
"
"
"
Abs.
540 nm
 Calcular las Vo y las [S] según se indica en el apartado anterior. Graficar.
 Determinar las constantes cinéticas en presencia de los inhibidores, aplicando el método de
Lineweaver-Burk. Determinar el tipo de inhibición en cada caso comparando los valores de las
constantes en presencia y ausencia de los inhibidores.
3) Fundamentos del método continuo para la determinación de la actividad de
ureasa
La determinación de la actividad de ureasa se basa en el siguiente esquema de reacción:
ureasa
urea + H2O
2 NH3 + CO2
GlDH
NH3 + NADH + H+ + 2-oxoglutarato
L-glutamato + NAD+ + H2O
La actividad de la ureasa es proporcional al consumo de NADH, que se sigue por disminución de
la absorbancia a 340 nm.
PROCEDIMIENTO
a) Determinación de la actividad de ureasa. 1- Llevar a cero el espectrofotómetro con un blanco
de agua destilada. Equilibrar los reactivos a la temperatura de trabajo (37ºC). 2- En una cubeta
colocar 1 ml de Reactivo de Trabajo y medir la abs. 340 nm. 3- Agregar 20 l de sustrato, mezclar
inmediatamente y disparar simultáneamente un cronómetro. 4- Tomar una lectura de absorbancia
inmediatamente (T0) y continuar tomando los valores de absorbancia cada 1 min durante 10 min.
5- Graficar los valores de absorbancia en función del tiempo y calcular la Vo a partir de la
pendiente, usando el coeficiente de extinción mmolar del NADH (NADH: 6,22 mM-1 cm-1).
Comparar y discutir las ventajas y desventajas de este procedimiento con respecto al método de
punto final para la determinación de actividad de la ureasa de soja (por cuantificación de
amoníaco formado) utilizado en los Trabajos Prácticos Nº 3 y 4.
b) Efecto de inhibidores. Se sabe que los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la
acción de la ureasa. Probaremos el efecto inhibitorio del mismo repitiendo una reacción como la de
a) en la que se agrega 100 mM NaF antes del agregado de urea. Comparar con la reacción no
inhibida mediante gráficos y numéricamente.
Reactivos (almacenar en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento):
Sustrato: solución de urea 15 mM.
Buffer: solución de buffer Goods 100 mmol/l, pH 7,9.
Liofilizado: viales conteniendo 2-oxoglutarato, NADH, ureasa y glutamato deshidrogenasa
(GlDH).
Para preparar el Reactivo de Trabajo disolver el contenido de un vial de liofilizado en un frasco de
buffer. Mezclar suavemente por inversión hasta disolución completa, evitando la formación de
espuma, y fechar. Una vez preparado el Reactivo de Trabajo es estable 30 días en refrigerador (2
a 10ºC). El Reactivo de Trabajo se deteriora y debe descartarse cuando las lecturas de
Absorbancia a 340 nm contra agua son inferiores a 1.
El método cinético continuo que ensayamos en el práctico es una adaptación del que se utiliza en los laboratorios de análisis clínicos para la
determinación de urea en suero o plasma (Urea cinética AA. Wiener Laboratorios SAIC. Riobamba 2944, 2000, Rosario, Arg. www.wienerlab.com.ar).