Download inhibicion citoplasmica de la expresion genetica.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : C12N 15/83
11 Número de publicación:
2 180 641
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ESPAÑA
C12N 15/11
C12N 15/53
C12N 15/52
C12N 5/10
A01H 5/00
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 95921458.6
kFecha de presentación: 26.05.1995
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 804 600
kFecha de publicación de la solicitud: 05.11.1997
T3
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k
54 Tı́tulo: Inhibición citoplásmica de la expresión genética.
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73 Titular/es: Large Scale Biology Corporation
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72 Inventor/es: Kumagai, Monto H.;
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74 Agente: Gil Vega, Vı́ctor
30 Prioridad: 16.06.1994 US 260546
Suite 1000, 3333 Vaca Valley Parkway
Vacaville, CA 95688, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
ES 2 180 641 T3
16.02.2003
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.02.2003
Aviso:
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Della-Cioppa, Guy R.;
Donson, Jonathan y
Harvey, Damon A.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 180 641 T3
DESCRIPCION
Inhibición citoplásmica de la expresión genética.
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Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de la regulación genética mediante moléculas inhibitorias
de ARN anti-sentido producidas de forma endógena, como ARN anti-sentido y ARN cosupresor.
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Antecedentes
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Uno de los objetivos principales de la ingenierı́a genética ha sido controlar la expresión de genes seleccionados en organismos eucarióticos de interés. Mientras que ha sido relativamente simple insertar
nuevos genes para su expresión en células eucarióticas, la consecución de genes endógenos para expresión
reducida ha sido más difı́cil de lograr. La inactivación dirigida al sitio de genes en organismos mayores
ha requerido manipulaciones genéticas extremadamente complejas, y no es aplicable a una gran variedad
de organismos. Un método que reduce la expresión de genes especı́ficos en organismos eucarióticos ha
sido el uso de ARN anti-sentido y la cosupresión.
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El documento WO-A-93/03161 describe ácidos nucleicos vı́ricos vegetales recombinantes y huéspedes
infectados con ellos. Los ácidos nucleicos vı́ricos vegetales comprenden un promotor subgenómico vı́rico
vegetal nativo, al menos un promotor subgenómico vı́rico vegetal no nativo, una secuencia codificadora
de proteı́na de envoltura vı́rica vegetal y, opcionalmente, al menos una secuencia de ácido nucléico no
nativa para ser transcrita o expresada en la planta huésped infectada.
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El ARN anti-sentido ha sido utilizado para reducir la expresión de genes preseleccionados tanto en
plantas como en animales. Las descripciones del uso de ARN anti-sentido para reducir la expresión de
genes seleccionados se encuentran, entre otros, en la patente norteamericana 5.107.065, Smith et al., Nature 334: 724-726 (1988), Van der Krol et al., Nature 333: 866-869 (1988), Rothstein et al., Proc. Natl.
Aca. Sci USA 84:8439-8443 (1987), Bird et al., Bio/Technology 9:635-639 (1991), Bartley et al., Biol.
Chem. 267:5036-5039 (1992), y Gray et al., Plant Mol. Bio. 19:69-87 (1992).
Otro método de reducir la expresión de genes especı́ficos en organismos eucarióticos es mediante el
uso de ARN cosupresor. Éste, al contrario que el ARN anti-sentido, está en la misma orientación que el
ARN transcrito del gen diana, o sea, la orientación “de sentido”.
Es posible que las sendas bioquı́micas en plantas transfectadas con virus hı́bridos se vean alteradas
por el exceso de producción de un enzima envuelto en un paso limitador de cantidad, o mediante la
inhibición de la sı́ntesis de un enzima a través de ARN anti-sentido. Aunque la expresión de numerosos
genes en plantas transgénicas ha sido reprimida por el ARN anti-sentido, el mecanismo y localización
reales de la inhibición son desconocidos.
En el núcleo, el ARN anti-sentido puede interferir directamente con la transcripción o formar duplicados con el nuclear heterogéneo (hnRNA). Hay pruebas de que la inhibición de genes endógenos puede tener
lugar en plantas transgénicas que contengan ARN sensorial A. R. Van der Krol et al., Nature 333:866-869
(1988) y C. Napoll et al., Plant Cell 2:279-289 (1990). Se piensa que el mecanismo de esta baja regulación o “cosupresión” está causado por la producción de ARN anti-sentido mediante una transcripción
meticulosa desde promotores distales colocados en la hebra opuesta del ADN cromosómico. (Greison et
al., Trends in Biotech 9:122-123 (1991)). Alternativamente, en el citoplasma, el ARN anti-sentido puede
formar una molécula de doble hebra con el mRNA complementario, y evitar ası́ la traslación de mRNA
a la proteı́na.
Los tobamovirus, cuyos genomas consisten en una hebra de ARN positivo de aproximadamente 6,4
kb, replican sólo en el citoplasma, y se pueden utilizar como vectores episomales de ARN para alterar
las sendas bioquı́micas de las plantas. Los virus hı́bridos del mosaico del tabaco (TMV) y de anillo
odontogloso (ORSV) han sido utilizados con anterioridad para expresar enzimas heterólogos en plantas
transfectadas (Donson et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88:7204 (1991) y Kumagal et al., Proc. Natl.
Aca. Sci. USA 90:427-430 (1993), hebra de ADN de sentido negativo, (Miller et al.). Las transcripciones
infecciosas de ARN procedentes de clones vı́ricos cDNA codifican proteı́nas implicadas en la replicación
de ARN, el movimiento y la encapsidación (10). El ARN subgenómico para la sı́ntesis de ARN mensajero
está controlado por promotores internos que se encuentran en la hebra de sentido negativo de ARN (se
les inocularon a las plantas N. benthamiana transcripciones in vitro, como ha descrito con anterioridad
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W. O. Dawson et al., proc. natl. Aca. Sci. USA. 83:1832 (1986)). La inserción de genes extraños en un
lugar especı́fico bajo el control de un promotor de ARN subgenómico adicional ha dado como resultado
una expresión sistemática y estable de neomicina fosfotransferasa y α-tricosantina (Donson et al., Proc.
Natl. Aca. Sci. USA 88:7204 (1991) y Kumagal et al., Proc. natl. Aca. Sci. USA 90:427-430 (1993)).
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Una de las muchas sendas bioquı́micas que podrı́a servir de objetivo para la manipulación genética
es la biosı́ntesis de carotenoides. En el primer paso importante de la sı́ntesis carotenoide en plantas
mayores se da la condensación de dos moléculas de pirofosfato geranil-geranilo a fitoeno, un hidrocarbono
incoloro de C40, por la fitoeno sinteasa del enzima. En ejemplares maduros de Lycopersicon esculentum,
la fitoeno sinteasa es una proteı́na monomérica cloroplasto localizada con una masa molecular relativa
de aproximadamente 42kDa. Este encima se sintetiza inicialmente como una preproteı́na 47-kDa, y se
procesa mediante la eliminación de un péptido de tránsito durante la importación al quicroplasto (Bartley et al., J. Biol. Chem. 267:5036-5039 (1992)). Las plantas transgénicas de tomate que contienen
mRNA anti-sentido a la fitoeno sinteasa producen frutos amarillos y flores pálidas. Aunque los carotenos
especı́ficos de la fruta están reducidos en un 97 %, los niveles de carotenoides en las hojas de plantas
transgénicas no se ven afectados. (Bird et al., Bio. Technology 9:635-639 (1991)). Se ha propuesto que
un conjunto de genes biosintéticos adicionales tiene lugar en las plantas, lo que regula la expresión de
carotenoides especı́ficos de las hojas.
El siguiente paso en la senda biosintética es la modificación del fitoeno incoloro a fitoflueno y
ζ-caroteno por fitoeno desaturasa. En plantas mayores, el aislamiento del gen que codifica este enzima ha sido descrito para el tomate, Pecker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4962 (1992), y
Arabidopsis thaliana (Scoinick y bartley, Plant Physiol 103:147 (1993)). La fitoeno desaturasa es inhibida
por norflurazón, herbicida decolorante, de forma irreversible y no selectiva (Sandman et al., Target Sites
of Herbicide Actions, G. Sandman, P. Boger Es. (RC Press, Boca Rotan (1989)). La aplicación de este
compuesto produce una gran disminución en carotenoides de hojas y clorofilas, con la consiguiente acumulación de fitoeno. Esta reducción de los carotenoides fotoprotectores derivada del fitoeno puede provocar
una destrucción rápida de la clorofila mediante foto-oxidación. Hay una necesidad de nuevos métodos
para reducir la expresión de genes especı́ficos en eucariotas. La invención descrita en estas páginas ofrece
nuevos métodos para reducir la expresión de genes seleccionados, construcciones genéticas para practicar
los métodos y células transformadas por estas construcciones genéticas, y organismos mayores que comprenden las células transformadas.
Sumario de la invención
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Un aspecto de la invención es ofrecer nuevas construcciones genéticas para la expresión de ARN inhibitorio en el citoplasma de células vegetales, como se define en la reivindicación 1. Las construcciones
genéticas de la invención son capaces de replicar en el citoplasma de una célula vegetal y comprender una
región promotora en combinación funcional con ARN inhibitorio que codifica polinucleótido, o sea, que
codifica un ARN anti-sentido o ARN cosupresor. Las construcciones genéticas de la invención pueden
estar preparadas para replicar en el citoplasma de células vegetales. En una célula vegetal, la construcción
genética se deriva preferentemente de un virus vegetal de ARN, o sea, un virus de ARN positivo de una
sola hebra. Las construcciones genéticas derivadas de virus vegetales de ARN incluyen por lo menos
un promotor subgenómico de virus vegetal procedente de tobamovirus, en combinación funcional con la
región codificadora de ARN inhibitorio.
Otro aspecto de esta invención es ofrecer células que incluyan las construcciones genéticas de la invención, y ofrecer plantas que incluyan una pluralidad de dichas células.
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Otro aspecto de la invención es ofrecer métodos de reducir la expresión de un gen de interés en células
vegetales, o sea, métodos para producir células vegetales que muestren niveles reducidos de un gen de
interés. Los métodos de la invención incluyen el paso de transformar una célula con una construcción
genética de la invención en la cual la región codificadora de ARN inhibitorio sea especı́fica a ese gen de
interés. Otro aspecto de la invención es ofrecer células vegetales que produzcan altos niveles del fitoeno
carotenoide. Los altos niveles de fitoeno se consiguen a través de la inhibición de la expresión en la fitoeno
desaturasa del enzima utilizando los vectores de la invención.
Breve descripción de las figuras
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Fig. 1. Vector de expresión del fitoeno TTO1/PSY+. Este plásmido contiene el TMV-U1 126-, 183-,
y ORFs 30kDa, el gen de proteı́na de envoltura ToMV (ToMVcp), el promotor SP6, el gen de fitoeno
sinteasa del tomate, y parte del plásmido pBR322. Se subraya el codón de terminación TAA en el ORF
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30-kDa. El promotor subgenómico TMV-1 colocado en la hebra negativa del ORF 30-kDa controla la
expresión de la fitoeno sinteasa. El punto de partida de la transcripción putativa (tsp) del ARN subgenómico está indicado por un punto (.).
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Fig. 2. Comparación de la secuencia de nucleótido de fitoeno desaturasa de una hoja de N. benthamiana (PDS1-Nb) y fitoeno desaturasa de tomate (PDS-Le). Los nucleótidos están alineados para
maximizar la semejanza de la secuencia.
Descripción de las realizaciones especı́ficas
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Definiciones
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El término “ARN inhibitorio”, como se usa en este documento, se refiere a una molécula de ARN
que interfiere con la expresión de un gen diana. Un “ARN inhibitorio” es especı́fico para uno o más
genes diana. Un ARN inhibitorio puede ser un ARN anti-sentido con respecto de una molécula de ARN
transcrita del gen diana.
Alternativamente, el ARN inhibitorio del gen diana puede ser un ARN cosupresor con respecto a una
molécula de ARN transcrita del gen diana.
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El término “ARN anti-sentido”, como se usa en este documento, se refiere a una molécula de ARN
capaz de formar un duplicado con una segunda molécula de ARN. Ası́, se dice que una molécula de
ARN determinada es una molécula de ARN anti-sentido con respecto a una segunda molécula de ARN
complementaria o parcialmente complementaria, o sea, la molécula diana. Una molécula de ARN antisentido puede ser complementaria de una región trasladada o no de una molécula diana de ARN. El ARN
anti-sentido no tiene por qué ser perfectamente complementario al ARN diana. El ARN anti-sentido
puede o no ser de la misma longitud que la molécula diana; la molécula de ARN anti-sentido puede ser
más larga o más corta que la molécula diana.
El término “ARN cosupresor” se refiere a una molécula de ARN que afecta la supresión de la expresión de un gen diana en el cual el ARN es parcialmente homólogo a una molécula de ARN transcrita
del gen diana. Una molécula de ARN cosupresor que afecta la cosupresión, como se describe en la patente
norteamericana 5.231.020. Krol et al., Biotechniques 6: 958-976 (1988), Mol et al., FEBS Lett. 268:427430 (1990), y Grierson et al., Trends in Biotech. 9:122-123 (1991) y publicaciones similares. Un “ARN
cosupresor” se encuentra en la orientación de sentido con respecto al gen diana, o sea, la orientación
contraria a la orientación anti-sentido.
El término “polinucleótido codificador de ARN inhibitorio”, como se usa en este documento, se refiere
a un polinucleótido, por ejemplo ADN, ARN, etc., capaz de ser transcrito, cuando está en combinación
funcional con un promotor, para producir una molécula de ARN inhibitorio, por ejemplo un ARN antisentido o un ARN cosupresor. Los polinucleótidos codificadores de ARN inhibitorio y los polinucleótidos
codificadores de cosupresor son ejemplos palpables del polinucleótido codificador de ARN inhibitorio.
Cuando el ARN inhibitorio es un ARN anti-sentido, el ARN inhibitorio transcrito de la región del polinucleótido codificador de ARN inhibitorio de las construcciones genéticas de la invención es con preferencia
perfectamente complementario de toda la longitud de la molécula o moléculas de ARN para las cuales
el ARN anti-sentido es especı́fico, o sea, las dianas. El polinucleótido codificador de ARN anti-sentido
en los vectores puede codificar un ARN anti-sentido que forme un duplicado con una región de ARN
no trasladada de una transcripción de ARN, como una región intrón, o una región 5’ no trasladada,
etc. Del mismo modo, un polinucleótido codificador cosupresor en los vectores puede codificar un ARN
que sea homólogo a porciones trasladadas o no de un ARN diana. Los polinucleótidos codificadores de
ARN anti-sentido pueden ser convenientemente producidos por el uso de la hebra no codificadora, o una
porción de ella, de una secuencia de ADN que codifique una proteı́na de interés.
El término “expresión reducida”, como se usa en este documento, es un término relativo que se refiere
al nivel de expresión de un gen determinado en una célula producido o modificado por los métodos reivindicados, comparado con una célula comparable no modificada, o sea, una célula que no tenga el vector,
bajo unas condiciones ambientales parecidas. Ası́, una célula modificada por los métodos presentados, o
sea, una célula que tenga “expresión reducida” del gen de interés, puede expresar niveles más altos de ese
gen bajo unas condiciones ambientales determinadas que los producidos por una célula similar no modificada bajo otras condiciones ambientales diferentes, si éstas segundas condiciones son muy favorables a
la expresión génica.
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La invención
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La invención aquı́ descrita explota el descubrimiento de que el ARN puede reducir la expresión de un
gen diana mediante interacciones de ARN inhibitorio con mRNA diana que tienen lugar en el citoplasma
de una célula vegetal más que en el núcleo. Antes de la invención, no se sabı́a si el ARN inhibitorio
reducı́a la expresión génica mediante una interacción que tiene lugar en el citoplasma o una interacción
que tiene lugar en el núcleo. Ası́, antes de la invención, era necesario producir ARN inhibitorio en el
núcleo para estar seguro de que se conseguirı́a la inhibición. Además, no se sabı́a si las concentraciones
adecuadas de ARN inhibitorio se podı́an ofrecer en el citoplasma. La expresión citoplásmica de ARN
inhibitorio (especı́fica para genes diana) tiene numerosas ventajas sobre la expresión nuclear, entre otras
la posibilidad de usar vectores de expresión de alto nivel que no son adecuados para la expresión nuclear.
El uso de estos vectores es particularmente ventajoso en las plantas, ya que los vectores capaces de infectar sistemáticamente las plantas pueden ser utilizados para producir el ARN inhibitorio. La invención
descrita aquı́ tiene muchos aspectos. Estos incluyen nuevas construcciones genéticas para la expresión de
ARN inhibitorio del gen diana en el citoplasma de células vegetales, células transfectadas con estas construcciones genéticas, organismos multicelulares que incluyen las células transfectadas, y métodos para
reducir la expresión de genes seleccionados en una célula transformando una célula con una construcción
genética de la invención.
Hay muchas formas de producir las construcciones genéticas de la invención. Las técnicas para manipular polinucleótidos, por ejemplo la digestión y ligación de endonucleasa de restricción, son bien
conocidas para las personas formadas en esta ciencia. Estas técnicas convencionales de manipulación de
polinucleótidos pueden utilizarse para producir y utilizar las construcciones genéticas de la invención. Si
bien se puede llevar a cabo alguna optimización de las técnicas convencionales para producir las construcciones genéticas tratadas, no hace falta experimentar demasiado para producir las construcciones
genéticas ni para practicar los métodos reivindicados.
Las construcciones genéticas de la invención incluyen una región promotora en combinación funcional
con un polinucleótido codificador de ARN inhibitorio. La región promotora se selecciona para que sea
capaz de provocar la transcripción de una secuencia de polinucleótido en una célula huésped de interés.
Ası́, por ejemplo, en una célula vegetal, se selecciona el promotor para que sea capaz de producir la transcripción en células vegetales. Los promotores capaces de provocar transcripciones en células de interés
pueden encontrarse, entre otros, en Goeddel et al., Gene Expression Technology Methods in Enzymology,
volumen 185, Academic Press, San Diego (1991), Ausubel et al., Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience (1994), y publicaciones similares. Cuando la célula para transformar es una célula vegetal,
los promotores subgenómicos de virus de ARN son preferentemente utilizados como regiones promotoras.
Los promotores subgenómicos de virus de ARN se describen, entre otros, en Dawson y Lehto, Advances
in Virus Research 38:307-342. Solicitud WO93/03161 publicada por PCT.
Las construcciones genéticas de la invención son capaces de replicación o mantenimiento, por lo menos
momentáneamente, en el citoplasma de células vegetales de interés, o sea, un vector de bases. Ası́, las
construcciones genéticas de la invención incluyen necesariamente una región de polinucleótido derivada
de un vector capaz de ser replicado o mantenido de forma estable en una célula vegetal de interés. Se
conocen muchos vectores capaces de replicación (o mantenimiento estable) en diferentes tipos de células
vegetales. Los vectores para usar en plantas incluyen los derivados del virus del mosaico de la coliflor, el
virus del mosaico del tabaco, el virus del mosaico del tomate, etc. Se puede encontrar más información
sobre los vectores de células vegetales y su uso en células vegetales, entre otros, en la publicación de PCT
de la solicitud WO93/03161, y en Donson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88:7204-7208 (1991).
La transcripción impulsora del promotor de la región codificadora de ARN inhibitorio de las construcciones genéticas tratadas puede ser seleccionada para que tenga un nivel de actividad transcriptora
suficiente para alcanzar el grado deseado de expresión del ARN inhibitorio del gen diana de interés.
El promotor puede ser nativo o heterólogo a la célula para modificación genética. El promotor puede
también ser nativo o heterólogo al vector de bases, o sea, la porción del vector que no es el promotor y la
región codificadora de ARN inhibitorio. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Preferiblemente,
los promotores fuertes se utilizan para provocar la transcripción del polinucleótido codificador de ARN
inhibitorio cuando el ARN diana está altamente expresado.
La invención también ofrece métodos para reducir la expresión de un gen o genes de interés en una
célula vegetal. Como consecuencia de ofrecer estos métodos de reducir la expresión génica en una célula
vegetal, la invención también presenta métodos para producir una célula vegetal que tenga expresión
reducida de un gen de interés, y células vegetales que tengan expresión reducida de un gen de interés
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producida por los métodos de la invención. La reducción de la expresión génica se consigue introduciendo
uno o más de los vectores de la invención en una célula eucariótica. El vector utilizado para transformar la
célula de interés incluye un polinucleótido codificador de ARN inhibitorio que codifica un ARN inhibitorio
especı́fico para el gen en el cual se busca la expresión reducida. El método de reducir la expresión del gen
de interés incluye el paso de introducir el vector genético sujeto en una célula huésped capaz de expresar
el gen de interés bajo ciertas condiciones ambientales. El vector puede ser introducido en una célula de
interés mediante cualquiera de los varios métodos conocidos de transformación, como la infección, transfección, electroporación, transformación de proyectil balı́stico, conjugación, etc. El aspecto innovador de
los métodos tratados no depende de los medios particulares de introducir el vector codificador de ARN
inhibitorio en la célula en cuestión. El método particular de introducir el vector en una célula de interés
depende en parte de la célula para modificación en cuestión y el tipo preciso de vector seleccionado.
Para las células vegetales, los vectores se derivan preferentemente de virus vegetales de ARN. Los
vectores de virus vegetales de ARN preferidos son los virus de ARN de una sola hebra positiva. Los
vectores de virus vegetales de ARN pueden ser convenientemente manipulados e introducidos en células
en forma de ADN en vez de trabajar directamente con vectores de ARN. El vector vı́rico derivado de
tobamovirus es el preferido. Se pueden encontrar descripciones de vectores vı́ricos vegetales adecuados y
sobre cómo utilizarlos, entre otros, en la publicación de PCT WO93/03161, Kumagal et al., Proc. Natl.
Aca. Sci. USA90:427-430 (1993).
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La invención también ofrece polinucleótidos codificadores de fitoeno sinteasa y fitoeno desaturasa,
ası́ como varios vectores para la expresión de ARN inhibitorio de genes diana especı́fico para genes de
fitoeno sinteasa o genes de fitoeno desaturasa. El primer paso en la biosı́ntesis de carotenoides en plantas
mayores es la condensación de dos moléculas de pirofosfato de geranil-geranilo a fitoeno, hidrocarbono
C40 incoloro, por la fitoeno sinteasa del enzima. El siguiente paso en la senda biosintética es la modificación del fitoeno incoloro y ζ-caroteno por fitoeno desaturasa. La invención ofrece polinucleótidos que
codifican la fitoeno desaturasa de la especie Nicotiana y numerosos derivados de ella. En particular, la
invención ofrece polinucleótidos, en forma purificada, que codifican la fitoeno desaturasa de Nicotiana
benthamiana. Además, la invención presenta polinucleótidos que codifican fitoeno sinteasa y fitoeno desaturasa del tomate (Lycopersicon esculentum). Los polinucleótidos codificadores de fitoeno sinteasa y
fitoeno desaturasa aquı́ descritos pueden utilizarse para producir ARN inhibitorios especı́ficos para genes de fitoeno sinteasa y fitoeno desaturasa de una variedad de especies vegetales. Los ARN inhibitorio
de fitoeno sinteasa y fitoeno desaturasa se producen preferentemente mediante la transcripción de polinucleótidos codificadores de ARN inhibitorio de fitoeno sinteasa y fitoeno desaturasa en combinación
funcional con una región promotora.
La secuencia de aminoácido de los varios enzimas de fitoeno desaturasa y fitoeno sinteasa descritos
en este documento y las secuencias naturales de polinucleótidos que codifican estos enzimas permiten
al investigador de biologı́a molecular diseñar y construir una serie de moléculas relacionadas que tengan
propiedades útiles parecidas a estos enzimas y a los polinucleótidos obtenidos directamente de la clonación
de los cDNAs que codifican estos enzimas. En el caso de los polinucleótidos, la degeneración del código
genético permite al investigador producir numerosos polinucleótidos diferentes que codifiquen el mismo
polipéptido, o sea, los polinucleótidos isocodificadores. La secuencia de polinucleótido precisa obtenida
puede ser seleccionada para optimizar la expresión en un tipo particular de célula huésped, teniendo en
cuenta factores que afectan la expresión, como la frecuencia de codón, las posibles estructuras secundarias
de mRNA, la metilación, etc. La invención ofrece asimismo una serie de polipéptidos que tienen la misma
actividad enzimática que la fitoeno desaturasa y la fitoeno sinteasa, pero que difieren en uno o más residuos de aminoácidos para producir variantes de polipéptidos de fitoeno desaturasa y fitoeno sinteasa. Las
variantes de polipéptidos pueden ser producidas y diseñadas de varias maneras. Las variantes de fitoeno
desaturasa y fitoeno sinteasa se pueden obtener introduciendo mutaciones (aleatorias o premeditadas) en
una secuencia de polinucleótido que codifique el enzima, transformando el enzima mutado codificador de
polinucleótido (ligado operativamente a un promotor adecuado) en una célula huésped, y luego ensayando
la célula huésped para la expresión de la actividad enzimática deseada.
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La identidad de las mutaciones en polinucleótidos codificadores de SRF I introducidos aleatoriamente
puede ser determinada al secuenciar el polinucleótido que codifica el enzima.
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La invención ofrece asimismo la expresión recombinante de ADN de fitoeno desaturasa y fitoeno sinteasa (con sus variantes). La expresión recombinante de estos enzimas se puede conseguir mediante la
tecnologı́a existente para la expresión recombinante de ADN. Estos métodos se pueden encontrar, entre
otros, en Goeddel et al., Gene Expression Technology; Methods in Enzymology, volumen 185, Academic
Press, San Diego (1991). El enzima se puede expresar en una variedad de células huésped, incluidas las
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células huésped eucarióticas y procarióticas. Una ventaja de presentar los enzimas en cuestión mediante
métodos recombinantes de ADN es la producción de cantidades mayores de enzimas a partir de cantidades
menores de material celular.
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Otra ventaja de la producción recombinante de enzimas es la capacidad de producir el enzima libre
de ciertos contaminantes. La fitoeno sinteasa y la fitoeno desaturasa (con sus respectivas variantes) producidas mediante técnicas recombinantes de ADN pueden ser purificadas por procedimientos similares
a los descritos para la purificación del enzima no recombinante. Para más información sobre el diseño
y modificación de procedimientos para la purificación de enzimas, ver, entre otros, Deutscher Guide to
Protein Purification Methods in Enzymology, volumen 182, Academic Press, San Diego (1990), Scoopes
Protein Purification: Principles and Practices, 3a¯ edición, Springler-Verlag, Nueva York (1993), etc.
La invención se puede comprender mejor refiriéndonos a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se
ofrecen con el propósito de ilustrar la invención, y no se deberı́an interpretar como limitación del mismo.
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Ejemplos
Ejemplo 1
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Aislamiento de cDNA del virus del mosaico del tomate
Un fragmento de 861 bp (5524-6384) del virus del mosaico del tomate (hebra F de la necrosis de la
fruta; ToMV-F) que contiene el promotor subgenómico de cápsula putativa de proteı́nas, el gen de cápsula
de proteı́nas, y el extremo 3’ ha sido aislado por PCR utilizando cebador ToMV 5’ CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3’ (ID SEQ NO: 1) (arriba) y 5’CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG3’ (ID SEQ NO: 2) (abajo) y subclonado en el sitio Hincll de pBluescript KS-. Un virus
hı́brido consistente en TMV-U1 t ToMV-F fue construido trocando un fragmento Xhol-kpnl de ToMV de
874-bp en pBGC152 (Kumagal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:427-430 (1993)), creando plásmido
TTO1. El fragmento insertado fue verificado por secuenciación de didesoxi-nucleótido. Se insertó un sitio Avrll único fue insertado debajo del sitio Xhol en TTO1 por mutagénesis PCR, creando plásmido
TTO1A, utilizando los siguientes oligonucleótidos:
5’ TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA 3’
5’ CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3’
(ID SEQ NO: 3) (arriba)
(ID SEQ NO: 2) (abajo)
35
Ejemplo 2
Aislamiento de fitoeno sinteasa de tomate codificadora de cDNA y una fitoeno desaturasa parcial de tomate codificadora de cDNA
40
45
50
Se aisló a cDNAs parciales de un ejemplar maduro de ARN tomate mediante reacción en cadena de
polimerasa (PCR) utilizando los siguientes oligonucleótidos: PSY, 5’ TATGTATGGTGCAGAAGAACAGAT 3’ (ID SEQ NO: 4) (arriba), 5’ AGTCGACTCTTCCTCTTCTGGCATC 3’ (ID SEQ NO: 5) (abajo);
PDS, 5’ TGCTCGAGTGTGTTCTTCAGTTTTCTGTCA 3’ (ID SEQ NO: 6) (arriba), 5’ AACTCGAGCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTT 3’ (ID SEQ NO: 7) (abajo). Se rastrearon aproximadamente 3 X
104 colonias de una biblioteca de cDNA de Lycopersicon esculentum por hibridación de colonia utilizando
un producto PCR de fitoeno sinteasa de tomate etiquetado 32 P. La hibridación fue llevada a cabo a 42◦C
durante 48 horas en un 50 % de foramida, 5X SSC, tampón de fosfato de 0,02 M, solución de Denhart
5X, y 0,1 mg/ml de timo de ADN de ternero cizallado. Los filtros se lavaron a 65◦ C en SSC 0,1X, 0,1 %
de SDS antes de la auto-radiografı́a. Los productos de PCR y los clones de cDNA de fitoeno sinteasa
fueron verificados mediante secuenciación de didesoxi-nucleótido.
Ejemplo 3
55
60
Secuenciación de ADN y análisis computarizado
Un fragmento de BamHl de 1,2 Kb Pstl que contenı́a el cDNA de fitoeno sinteasa y un cDNA de fitoeno desaturasa parcial de 1,7 Kb fueron subclonados en pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, Calif.).
La secuenciación de nucleótido de KS+/PDS # 38 y KS+/5’3’PSY fue llevada a cabo por terminación de
didesoxi utilizando plantillas de una sola hebra. El análisis de secuencia de nucleótido y las comparaciones
de secuencia de aminoácidos fueron llevadas a cabo utilizando los programas PCGENE y DNA Inspector
IIE.
7
ES 2 180 641 T3
Ejemplo 4
Construcción del vector de expresión de fitoeno sinteasa del tomate
5
Un fragmento 1253 Xhol de par de bases que contiene el cDNA de fitoeno sinteasa de tomate fue
subclonado en TTO1. El vector TT01/PSY+ (Fig. 1) contiene el cDNA de fitoeno sinteasa (orientación
positiva) bajo el control del promotor subgenómico de cápsula de proteı́nas TMV-U1; a su vez, el vector
TTO1/PDS- contiene el cDNA de fitoeno desaturasa en la orientación anti-sentido.
10
Ejemplo 5
Construcción de un vector vı́rico que contiene un cDNA de fitoeno desaturasa parcial de tomate
15
Un fragmento Xhol que contenı́a el cDNA de fitoeno desaturasa del tomate parcial fue subclonado
en TTO1. El vector TTO1/PDS+ contiene el cDNA de fitoeno desaturasa (orientación positiva) bajo
el control del promotor subgenómico de proteı́na de cápsula TMV-U1; a su vez, el vector TTO1/PDScontiene el cDNA de fitoeno desaturasa en la orientación anti-sentido.
20
Una fitoeno desaturasa codificadora de cDNA parcial fue aislada de ARN de hoja de N. benthamiana
por RT-PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: PDS, 5’ GGCACTCAACTTTATAAACC 3’ (ID
SEQ NO: 8) (arriba),5’ CTTCAGTTTTCTGTCAAACC 3’ (ID SEQ NO: 9) (abajo) y verificada por
secuenciación de didesoxi-nucleótido.
25
Ejemplo 6
Transfección y análisis de N. benthamiana [TT01/PSY+, TTO1/PSY, TTO1/PDS700+, TTO1/PDS700]
30
35
40
45
Se prepararon mediante transcripción in vitro ARNs infecciosos de TT01/PSY+ (Fig.
1),
TTO1/PSY-, TTO1A/PDS+, TTO1/PDS- utilizando polimerasa SP6 de ARN dependiente de ADN,
y se utilizaron para inocular mecánicamente N. benthamiana (Dawson et al., Adv. Virus Res. 38:307
81990)). Los virus hı́bridos se extendieron por todas las hojas superiores no inoculadas, como se pudo
verificar por microscopı́a electrónica de transmisión, ensayo de infección de lesión local y amplificación
de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los sı́ntomas vı́ricos consistı́an en la torsión de las hojas
sistémicas, atrofia de la planta y clorosis leve. Las plantas transfectadas con TTO1/PSY+ mostraron
al menos un incremento del doble de actividad de fitoeno sinteasa en plantas transfectadas con controles de vector vı́rico. Las hojas de plantas sistemáticamente infectadas con TTO1/PSY+ desarrollaron
un fenotipo naranja brillante y acumularon altos niveles de fitoeno (Tabla 1). Las hojas y sépalos de
plantas TTO1/PDS- desarrollaron un fenotipo decolorante blanco parecido al que se ve en el herbicida
norflurazón. La estructura de los cloroplastos de plantas transfectadas con TTO1/PSY+ y TTO1/PDS, cuando se analizó por microscopı́a electrónica de transmisión, pareció normal. Las hojas de plantas
sistemáticamente infectadas con TTO1A/PDS+ desarrollaron un fenotipo decolorante blanco aproximadamente una semana después que en las hojas de plantas de TTO1A/PDS- anti-sentido, y también
acumularon altos niveles de fitoeno. La electroforesis de gel agaroso de cDNA PCR aislada de ARN virión
y el análisis de transferencia Northern de ARN virión indican que los vectores se mantienen en un estado
extracromosómico y no han sufrido ningún reajuste intramolecular visible.
TABLA I
50
n Cuantificación de hojas de fitoeno de N. benthamiana transfectadas con transcripciones vı́ricas
Planta
55
60
N.
N.
N.
N.
N.
benthamiana
benthamiana
benthamiana
benthamiana
benthamiana
—
TTO1/PDSNorflurazón
TTO1/PSY+
TTO1/PSY8
µg FW de
fitoeno
% Incremento
4,6
234,8
339,8
52,4
1,0
1
51,0
73,9
11,4
0,2
ES 2 180 641 T3
Ejemplo 7
Purificación y análisis de fitoeno de plantastransfectadas
5
10
15
20
Se extrajo fitoeno en metanol, y se identificó por su tiempo máximo de retención y sus espectros
de absorción en una columna Spherisorb ODS-1 5 µm de 25 cm. utilizando aceto-nitrilo / metanol /
2-propanol (85:10:5) como solvente de desarrollo a un ritmo de flujo de 1 ml/min. El fitoeno aislado de
tejido infectado sistemáticamente tenı́a un tiempo de retención idéntico al fitoeno de plantas tratadas con
norflurazón. El máximo de fitoeno de N. benthamiana transfectada con TTO/PSY+ tenı́a un máximo
de absorción caracterı́stico de 276, 286 y 298 nm. Una semana después de la inoculación, las plantas
transfectadas con fitoeno sinteasa vı́rica codificada mostraron un incremento del 100 % en fitoeno en comparación con los niveles de las plantas no infectadas, como se pudo comprobar mediante una separación
HPLL de carotenoides. Los carotenoides se extrajeron en metanol y fueron identificados por su tiempo
de retención máximo y sus espectros de absorción en una columna Spherisorb CDS-1 5µm de 25 cm.
usando aceto-nitrilo / metanol / 2-propanol (85:10:5) como disolvente de desarrollo. La expresión de
ARN sentido (TTO1A/PDS+) y anti-sentido (TTO1/PDS-) a una fitoeno desaturasa parcial en plantas
transfectadas inhibió la sı́ntesis de carotenoides de color y provocó que las hojas infectadas desarrollaran
un fenotipo blanco. El análisis HPLC de estas plantas reveló que también acumularon altos niveles de
fitoeno. La decoloración de las hojas se reprodujo en plantas controladas tratadas con el herbicida norflurazón, un inhibidor no selectivo de la fitoeno desaturasa.
Ejemplo 8
Aislamiento de una fitoeno desaturasa de N.benthamiana codificadora de cDNA parcial
25
30
Un clon parcial de cDNA codificante de fitoeno desaturasa de N. benthamiana fue aislado del tejido de
una hoja nueva. La comparación de la secuencia de nucleótido de 369 bp en las regiones correspondientes
entre el tomate y la fitoeno desaturasa de N. benthamiana indican que son similares en un 92 % (Fig.
2). Ya que los dos genes vegetales tienen zonas de gran homologı́a, la inhibición citoplásmica del gen
vegetal endógeno por ARN anti-sentido derivado de un virus puede realizarse mediante la formación de
moléculas hı́bridas de doble hebra. La baja regulación de fitoeno desaturasa en plantas transfectadas
con TTO1A/PDS+ puede estar provocada por interferencia directa durante la traslación de mRNA en
proteı́nas o por duplicados formados entre mRNA y ARN de hebra negativa derivado de virus, aunque
el mecanismo exacto de acción no necesita conocerse para llevar a cabo la invención.
35
Ejemplo 9
Construcción de vectores de expresión TTO1 y TTO1A
40
45
Un fragmento de 861 bp (5524-6384) del virus del mosaico del tomate (hebra F de la necrosis de
la fruta; ToMV-F) que contenı́a el promotor subgenómico de proteı́na de envoltura cápsula y el gen de
proteı́na de envoltura, y el extremo 3’ fue aislado por PCR utilizando los cebadores 5’ CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3’ (ID SEQ NO: 1) (arriba) y 5’ CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3’ (ID SEQ NO: 2) (abajo) y subclonado en el sitio Hincll de pBluescript KS-. Se construyó un virus hı́brido consistente en TMV-U1 y ToMV-F trocando un fragmento de Xhol-KpnlToMV
en pBGC152 (I. Pecker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4962 (1992)) y creando plásmido TTO1.
El fragmento insertado fue verificado mediante secuenciación de didesoxi-nucleótido. Se insertó un sitio
Avrll único debajo del sitio Xhol en TTO1 mediante mutagénesis PCR, creando plásmido TTO1A y
utilizando los siguientes oligonucleótidos:
50
5’ TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA 3’ (arriba) (ID SEQ NO: 3)
5’ CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3’ (ID SEQ NO: 2) (abajo)
55
Ejemplo 10
Construcción de TTO1/PDS-, TTO1A/PDS+
60
Utilizando mutagénesis PCR, un fragmento Xhol codificador de fitoeno sinteasa de tomate fue amplificado de un clon de Lycopersicon esculentum aislado de una biblioteca de cDNA de fruta, y colocado
bajo el control del promotor subgenómico de proteı́na de envoltura TMV-U1 subclonándolo en TTO1.
9
ES 2 180 641 T3
Ejemplo 11
Inhibición de la expresión de un gen vegetal endógeno especı́fico (fitoeno desaturasa) utilizando un vector
vı́rico de ARN: Transfección y análisis de N. benthamiana [TTO1/PSY-]
5
10
15
Se prepararon mediante transcripción in vitro ARNs infecciosos de TTO1/PDS- y TTO1/PDS- utilizando polimerasa de ARN dependiente de ADN, y se utilizaron para inocular mecánicamente N. benthamiana. Los virus hı́bridos se extendieron por todas las hojas superiores no inoculadas, como se pudo
verificar por microscopı́a electrónica de transmisión, ensayo de infección de lesión local y amplificación
de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los sı́ntomas vı́ricos consistı́an en la torsión de las hojas
sistémicas, atrofia de la planta y clorosis leve. Las hojas y sépalos de plantas TTO1/PDS- desarrollaron
un fenotipo blanco decolorante parecido al del herbicida norflurazón. La estructura de los cloroplastos
de plantas transfectadas por TTO1/PDS-, cuando se analizó con microscopı́a electrónica de transmisión,
pareció normal. Las hojas de plantas sistemáticamente infectadas con TTO1/PDS- desarrollaron un fenotipo blanco decolorante aproximadamente una semana después que las hojas de plantas TTO1/PDS
anti-sentido, y también acumularon altos niveles de fitoeno.
Ejemplo 12
20
25
30
35
Inhibición de la expresión de un gen vegetal endógeno especı́fico (fitoeno sinteasa) utilizando un vector
vı́rico de ARN: Transfección y análisis de N. benthamiana [TTO1/PSY-]
Se prepararon mediante transcripción in vitro ARNs infecciosos de TTO1/PSY- utilizando polimerasa de ARN dependiente de ADN, y se utilizaron para inocular mecánicamente N. benthamiana. Los
virus hı́bridos se extendieron por todas las hojas superiores no inoculadas, como se pudo verificar por
microscopı́a electrónica de transmisión, ensayo de infección de lesión local y amplificación de la reacción
en cadena de polimerasa (PCR). Los sı́ntomas vı́ricos consistı́an en la torsión de las hojas sistémicas,
atrofia de la planta y clorosis leve. Las plantas transfectadas con TTO1/PSY+ mostraron al menos
un incremento del doble en actividad de fitoeno sinteasa comparadas con las plantas con controles de
vector vı́rico (datos no mostrados), Las hojas de plantas sistemáticamente infectadas con TTO1/PSY+
desarrollaron un fenotipo naranja brillante y acumularon altos niveles de fitoeno (Tabla 1). Las hojas de
plantas de TTO1/PDS- desarrollaron un fenotipo decolorante blanco. La estructura de los cloroplastos
de TTO1/PSY-, cuando se analizó por microscopı́a electrónica de transmisión, parecı́a normal. Las hojas
de plantas sistemáticamente infectadas con TTO1A/PSY- no acumularon fitoeno.
Ejemplo 13
Aislamiento de una fitoeno desaturasa parcial de N. benthamiana codificadora de cDNA
40
45
Un clon de cDNA parcial que codifica para fitoeno desaturasa de N. benthamiana fue aislado del tejido
de una hoja nueva. La comparación de secuencia de nucleótido de 380 bp en las regiones correspondientes
entre el tomate y la fitoeno desaturasa de N. benthamiana indican que se parecen en un 92 % (figura 2).
Ya que los dos genes vegetales tienen zonas de alta homologı́a, la inhibición citoplásmica del gen vegetal
endógeno por ARN anti-sentido derivado de virus puede tener lugar mediante la formación de moléculas
hı́bridas de ARN de doble hebra. La baja regulación de fitoeno desaturasa en plantas transfectadas
con TTO1A/PDS+ puede estar provocada por interferencia directa durante la translación de mRNA en
proteı́nas o por duplicados formados entre mRNA y ARN de hebra negativa derivado de virus.
Ejemplo 14
50
55
60
Análisis de mRNA PDS en células de nicotina que producen ARN anti-sentido especı́fico derivado de
PDS de tomate
Se llevaron a cabo experimentos de Transcriptasa Inversa de PCR para medir la presencia o ausencia de transcripciones detectables de mRNA en células de N. benthamiana que contienen TTO1/PDS(produciendo ARN anti-sentido PDS). Se aisló ARN de plantas transfectadas por el método de Galliano
et al. Los cebadores utilizados para detectar TTO1/L. esculentum fueron 5’TAATCGATGATGATTCGGAGGCTAC3’ (ID SEQ NO: 11) (arriba) 5’GGCACTCAACTTTATAAACC3’ (ID SEQ NO: 8)
(abajo). El cebador utilizado para detectar transcripciones de N. benthamiana fue 5’GGCACTCAACTTTATAAACC3’ (ID SEQ NO: 8) (arriba) y 5’CTCCTTTAATTGTACTGCCA3’ (abajo). Los experimentos de PCR fueron incapaces de detectar mRNA PDS endógeno en las plantas transfectadas por
vector, mientras que la transcripción anti-sentido de 452 bp esperada sı́ se pudo detectar. El mRNA PDS
de 219 bp sólo se pudo detectar en las plantas N. benthamiana de control no infectadas.
10
ES 2 180 641 T3
REIVINDICACIONES
1. Vector genético vı́rico positivo de una sola hebra capaz de replicación en el citoplasma de una célula
vegetal, que comprende:
5
10
15
- un primer promotor subgenómico vı́rico vegetal en combinación funcional con una primera secuencia
de ácido nucléico que codifica un ARN anti-sentido o un ARN cosupresor especı́fico de un gen de
interés en una planta, en el que la transcripción de la primera secuencia de ácido nucléico es regulada
por el primer promotor subgenómico vı́rico vegetal; y
- un segundo promotor subgenómico vı́rico vegetal ligado de forma funcional a una segunda secuencia
de ácido nucléico que codifica una proteı́na de envoltura vı́rica vegetal, en el que la transcripción
del segundo ácido nucléico es regulada por el segundo promotor subgenómico vı́rico vegetal,
donde al menos uno de los promotores subgenómicos proviene de un tobamovirus.
2. Vector según la reivindicación 1, en el que dicho vector proviene de un virus vegetal positivo de
ARN de una sola hebra.
20
3. Vector según la reivindicación 1, en el que dichos vectores promotores subgenómicos primero y
segundo son heterólogos uno al otro.
4. Vector según la reivindicación 1, en el que dicho gen de interés es la fitoeno desaturasa.
25
30
5. Vector según la reivindicación 1, en el que dicho gen de interés es la fitoeno sinteasa.
6. Procedimiento de producción de una célula vegetal que tiene una expresión reducida de un gen de
interés; el procedimiento comprende las etapas de transfección de una célula vegetal con el vector según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia de ácido nucléico que codifica un ARN
anti-sentido o un ARN cosupresor es especı́fica del gen de interés.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho vector es derivado de un virus vegetal de
ARN positivo de una sola hebra.
35
40
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dichos promotores subgenómicos primero y segundo son heterólogos a la célula vegetal.
9. Procedimiento de producción de una célula vegetal que tiene una expresión reducida de un gen de
interés; el procedimiento comprende las etapas de transfección de una célula con un vector genético según
la reivindicación 4 o 5.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la célula vegetal es una célula de Nicotiana.
45
11. Célula vegetal que comprende un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12. Célula vegetal según la reivindicación 11, en el que el vector es derivado de un virus vegetal positivo de ARN de una sola hebra.
50
13. Célula vegetal según la reivindicación 11, que comprende el vector según la reivindicación 4 o 5.
55
60
11
ES 2 180 641 T3
14. Célula vegetal según la reivindicación 13, en el que dicha célula vegetal es una célula de Nicotiana.
15. Planta que comprende una pluralidad de células según una cualquiera de las reivindicaciones 11
a 14.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
12
ES 2 180 641 T3
13
ES 2 180 641 T3
14