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CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Licenciatura en Alimentos
ENZIMOLOGÍA Y CINÉTICA ENZIMÁTICA
Definiciones útiles
 Unidad de enzima (U): cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1
mol de sustrato en producto(s) en 1 minuto de reacción, bajo condiciones
previamente determinadas.
 Actividad enzimática o concentración de enzima: unidades de enzima por
ml de solución. (U/ml)
 Actividad específica (U/mg): actividad enzimática (U/ml)/concentración de
proteínas (mg/ml) de la solución.
 Índice de recambio (min-1 ó s -1):
a) número de moles de sustrato transformados por minuto por mol de
enzima (actividad molar ó molecular).
b) si es una enzima con n subunidades, cada una con un sitio activo, es el
número de moles de sustrato transformados por minuto por mol de
subunidad activa o centro catalítico (actividad de centro catalítico)
 Ciclo catalítico (min ó s): tiempo que transcurre un ciclo catalítico.
 Katal: cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 mol de sustrato
en producto (s) en 1 segundo. Actividad específica: katal/kg de proteína.
Para resolución de tablas de purificación:
.Actividad total: Actividad enzimática x volumen total.
.Proteínas totales: Concentración de proteínas x volumen total.
.Rendimiento parcial (%): (Actividad total etapa/Actividad total etapa anterior) x
100.
.Rendimiento total (%): (Actividad total etapa/Actividad total primera etapa) x 100.
.Purificación parcial: Actividad específica etapa/ Actividad específica etapa anterior.
.Purificación total: Actividad específica etapa/ Actividad específica primera etapa.
ENZIMOLOGÍA:
PROBLEMAS:
1- Sea la reacción A+B  AB. Concentraciones iniciales de A y de B de 1 mM y 2 mM
respectivamente llegan al equilibrio después de 45 horas de incubación. Las
concentraciones en el equilibrio son [A]= 0,5mM, [B]=1,5 mM y [AB]=0,5 mM. En
presencia de una enzima adecuada el equilibrio se alcanza en un minuto. ¿Cuales
serán las concentraciones alcanzadas en este caso? ¿Cuál es el valor de la Keq en
ambos casos?
2- Un extracto libre de células de Escherichia coli contiene 24 mg de proteína por
mililitro. Veinte microlitros de este extracto en un volumen de incubación patrón de 0,2
ml catalizaron la incorporación de la glucosa-14C al glucógeno con una velocidad de 1,6
2
nmoles/min. Calcular la actividad expresada (U/ml) y la actividad específica (U/mg) en
la cubeta y en la muestra.
3- Un extracto crudo libre de células contiene 20 mg de proteína por mililitro. Diez microlitros de este extracto en un volumen de reacción total de 0,5 ml catalizaron la formación de 30 nmoles de producto en un minuto en condiciones de ensayo óptimas (pH
y fuerza iónica, concentraciones saturantes de todos los sustratos, coenzimas, activadores y otros). (a) Expresar la velocidad inicial vi en mM/min. (b) ¿Cuál será vi si los
mismos 10 µl del extracto se ensayaran en un volumen total de 1,0 ml? (c) ¿Cuál es la
concentración de enzima en la mezcla de ensayo y en el extracto (en U/ml)? (d) ¿Cuál
es la actividad específica de la preparación?
4- Quince microlitros de la preparación de una enzima catalizaron la producción de 0,52
µmoles de producto en un minuto en condiciones óptimas en un ensayo patrón (a)
¿Cuánto producto se producirá en un minuto por 150 microlitros de la preparación en
las mismas condiciones de reacción? (b) ¿Cuánto tiempo necesitarán los 150 microlitros de la preparación para producir 0,52 micromoles de producto en las mismas condiciones de ensayo?
5- Una enzima pura tiene una actividad específica de 120 unidades/mg de proteína.
(a) Calcular el índice de recambio si el PM= 360000. (b) Calcular el tiempo requerido
para un ciclo catalítico.
6- Un microgramo de una enzima pura (PM= 92000) catalizó una reacción a la velocidad de 0,5 µmoles/min en condiciones óptimas. Calcular (a) la actividad específica de
la enzima expresada en U/mg de proteína y en U/mol, (b) el índice de recambio y (c)
¿cuánto tiempo dura un ciclo catalítico?
7- Una preparación comercial de enzima tiene una actividad específica de 42 U/mg de
proteína y contiene 12 mg de proteína por mililitro. Para corroborar estos datos un
operador ensaya una medida de actividad de la enzima en un medio de reacción de 1
ml. El método utiliza una concentración de sustrato en el medio de 30 mM y un tiempo
mínimo de lectura de 1 min. El volumen mínimo de la preparación enzimática que se
puede utilizar es de 5 l. (a) ¿Puede el operador hacer el ensayo o debe diluír
previamente la preparación? (b) En caso de que deba diluír y suponiendo que la
enzima se descompone si lo hace, ¿qué actitud debería tomar el operador?
8- Las -lactamasas son enzimas capaces de hidrolizar la penicilina según la reacción:
penicilina + H2O  ácido peniciloico.
Esta reacción puede estudiarse monitoreando el descenso de absorbancia a 230 nm
(coeficiente de absorción = 1,09 mM-1cm-1). Se determina la actividad de -lactamasa
en una muestra cuya concentración de proteína es de 20 g/ml empleando penicilina a
concentración saturante (1mM) en amortiguador de pH 7 y t =30C, observándose una
diferencia en la absorbancia de 0,3 para un tiempo de 100 segundos. El volumen final
en la cubeta de reacción es 2 ml, el camino óptico 1 cm y el volumen de muestra
empleado es 15 l. ¿Cuáles son la actividad en U/ml y la actividad específica de la
muestra?
9- La actividad de una muestra de láctico deshidrogenasa (LDH) pura con una
concentración de proteína de 2 mg/ml se ensayó por un método discontínuo (aparición
de piruvato). Diez microlitros de la muestra se incubaron con concentraciones
3
saturantes de lactato y NAD+ en un volumen final de 3 ml. Luego de 3 minutos la
reacción se detuvo por la adición de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Después de
10 minutos se agregaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midió la absorbancia de la
hidrazona formada a 505 nm. Se obtuvo una variación de absorbancia de 0,6. Para
realizar la curva de calibración de la reacción del piruvato con la DNFH se trabajó en
idénticas condiciones utilizando una solución de ácido pirúvico (PM= 88) conteniendo
4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en la tabla. Calcule el número de
recambio de la LDH considerando que el PM de la enzima es 130000 y que posee dos
sitios activos por molécula.
ml de testigo
absorbancia
0,00
0,05
0,05
0,15
0,10
0,25
0,20
0,44
0,30
0,66
0,40
0,85
10- Cincuenta mililitros de un extracto libre de células que contenían 24 mg de proteína
por ml del mismo y cuya actividad era de 0,08 U/ml se fraccionaron por precipitación
con sulfato amónico. La fracción que precipitaba entre el 30% y 50% de saturación se
redisolvió en un volumen total de 10 ml y se dializó. La disolución después de la diálisis
ocupaba 12 ml y contenía 30 mg de proteína por ml. Veinte microlitros de la fracción
purificada catalizaron la reacción de la fosforilasa con una velocidad de 5,9
nnmoles/minuto en condiciones de un ensayo patrón. Calcular (a) la recuperación de la
enzima y (b) el grado de purificación obtenido mediante la etapa del sulfato amónico.
11- Un extracto crudo libre de células de músculo esquelético contiene 32 mg de proteína por ml. Diez microlitros del extracto catalizaron una reacción con una velocidad de
0,14 moles/min en condiciones óptimas en un ensayo patrón. Cincuenta ml del extracto se fraccionaron por precipitación con sulfato amónico. La fracción que precipitó entre
el 20% y 40% de saturación se redisolvió en 10 ml. Esta solución contenía 50 mg de
proteína/ml. Diez microlitros de esta fracción purificada catalizaron la reacción con una
velocidad de 0,65 moles/min. Calcular (a) el porcentaje de recuperación de enzima en
la fracción purificada, y (b) el grado de purificación obtenido por el fraccionamiento.
12- Se purificó una enzima obteniéndose los datos que se indican a continuación:
FRACCIÓN
I
II
III
IV
VOLUMEN
(ml)
1800,0
75,0
20,0
1,5
ACTIVIDAD
(U/ml)
0,23
3,00
5,00
40,00
PROTEÍNA
(mg/ml)
12,5
14,0
1,0
0,5
Construya una tabla de purificación.
13- Con los siguientes datos confeccione una tabla de purificación para una deshidrogenasa indicando luego: (a) ¿Cuál es la purificación total alcanzada?; (b) ¿Cuál es la
etapa individual que dio mayor purificación? (c) ¿Cuál es el rendimiento total? (d) Analice la tabla obtenida y señale si todas las etapas empleadas están justificadas. Fundamente su respuesta.
FRACCIÓN
VOLUMEN
(ml)
A/min
PROTEÍNA
(mg/ml)
4
Extracto crudo
Sulfato de amonio
CM-celulosa
Sephadex-G25
1000,0
20,0
100,0
100,0
124
3100
496
496
5
10
2
1
Coeficiente de absorción a 340 nm = 6,2 mM-1cm-1.
14- La enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+ dependiente) cataliza la
siguiente reacción:
1,3-bisfosfo-glicerato + NADPH + H+  gliceraldehido-3-fosfato + NADP+ + Pi
Al purificar esta deshidrogenasa de A. nidulans, se obtuvieron por sonicación de células
enteras 120 ml de un extracto crudo conteniendo 25 mg/ml de proteína y 20 U/ml de
actividad enzimática. Posteriormente se realizó un fraccionamiento salino. La actividad
enzimática se recuperó en la fracción 40-70 % de saturación con sulfato de amonio, esta fracción se redisolvió en 40 ml dando una concentración de proteína de 20 mg/ml y
una actividad de 40 U/ml. Luego se realizó una cromatografía de afinidad con Rojo
Proción (análogo de NADP+) donde la deshidrogenasa quedó unida pudiendo ser eluída con 0,7 M NaCl, recuperándose así 5 ml con una actividad de 240 U/ml y una concentración de proteína 0,4 mg/ml. Finalmente se realizó una cromatografía de exclusión
molecular en Sephacryl-S300 donde se recuperaron 6 ml y 0,2 mg/ml de proteína. La
actividad de la enzima fue medida como consumo de NADPH, cuyo coeficiente de extinción a 340 nm es 6200 M-1 cm-1 en un volumen de reacción de 3 ml y una cubeta de
1cm de paso de luz. El agregado de 2 l de esta última fracción produjo una disminución de absorbancia de 0,992 al cabo de 2 minutos. Construya la tabla de purificación.
Indique cuál es el rendimiento y la purificación total alcanzados. Indique cuál es la etapa de mayor purificación y cuál la de mayor rendimiento. Indique si todos los pasos se
justifican fundamentando su respuesta.
15- La enzima malato deshidrogenasa NADP+ dependiente cataliza la reacción
malato + NADP+  oxalacetato + NADPH + H+
A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con
una concentración de proteína de 20 mg/ml. La actividad se determinó con una alícuota
de 30 microlitros midiéndose por un método continuo la aparición de NADPH a 340 nm
(coeficiente de absorción del NADPH= 6200 M-1cm-1) en una cubeta de 3 ml y 1 cm de
camino óptico obteniéndose una variación de absorbancia para 10 minutos de 1,24. Se
realizó luego una cromatorafía en DEAE celulosa recogiéndose 180 ml que contenían
10 U/ml de actividad enzimática y 12,5 mg/ml de proteína. El paso posterior fue una
columna de hidroxilapatita recogiéndose 10 tubos de 4 ml c/u con actividad de
deshidrogenasa. La concentración de proteína en el conjunto fue de 0,94 mg/ml con
una actividad de 22,5 U/ml. Como último paso se realizó una cromatografía en columna
de Sepharosa 6B y se recuperó un volumen de 15 ml con una actividad de 50 U/ml y
una concentración de proteína de 2,1 mg/ml. En base a estos datos construya la tabla
de purificación indicando además (a) cuál es la purificación y el rendimiento total
alcanzados, (b) cuál es la etapa individual de mayor purificación y cuál la de mayor
rendimiento, (c) señale si todas las etapas empleadas se justifican; fundamente su
respuesta.
16- A partir de un extracto libre de células se intenta purificar una enzima que cataliza
la reacción:
M + N  R + S
5
La actividad enzimática se determina espectrofotométricamente aprovechando la
propiedad del sustrato M de poseer un pico de absorbancia a 550 nm (coeficiente de
extinción = 10,00 mM-1cm-1) que desaparece cuando se produce la reacción. Esta se
realiza en cubetas de 1 cm de paso de luz, en un volumen de 2 ml. En una primera
etapa se realizó un fraccionamiento con sulfato de amonio. La enzima precipitó entre el
60 y el 40 % de saturación. El precipitado obtenido fue resuspendido en un buffer de
fosfato de potasio 100 mM y dializado contra el mismo. En el dializado se determinó
actividad enzimática obteniéndose una variación de absorbancia (A/min) de 0,15. La
concentración de proteína fue de 3 mg/ml. El volumen total dializado (100 ml) fue
dividido en dos volúmenes iguales. Una de las fracciones fue sometida a filtración
molecular por Sephadex G-100 mientras que la otra fue sometida a una cromatografía
de intercambio iónico en DEAE celulosa. Las fracciones activas provenientes de la
filtración molecular rindieron una preparación de 200 ml conteniendo 0,04 mg/ml de
proteína. Del ensayo de actividad se obtuvo un A/min= 0,03. En cambio, las
fracciones activas provenientes de la cromatografía de intercambio iónico rindieron una
preparación de 50 ml conteniendo 0,02 mg/ml de proteína y el ensayo de actividad dió
un A/min= 0,02. En todos los casos se emplearon 0,01 ml de las preparaciones
correspondientes para el ensayo de actividad. (a) Calcule el rendimiento y la
purificación para cada uno de los procedimientos alternativos empleados. (b) ¿Cuál de
los dos procedimientos (Sephadex o DEAE celulosa) elegiría para purificar esta
enzima? Fundamente.
17- Una enzima bacteriana que metaboliza la destrucción de un antibiótico ha sido
estudiada en vías de obtener un método de purificación de la misma. La enzima
cataliza la destrucción del antibiótico según una reacción que puede seguirse
espectrofotométricamente a 540 nm con un coeficiente de extinción de 10 mM-1cm-1. La
actividad del extracto crudo se determinó empleando una alícuota de 10 microlitros que
produjo la aparición de 0,02 micromoles de producto en 5 minutos. Luego se intentaron
dos protocolos de purificación a partir de un extracto crudo que tenía una concentración
de proteína de 2 mg/ml en un volumen de 5 litros. La primera etapa, común a los dos
protocolos, fue una precipitación con sulfato de amonio, etapa en la que se obtuvo un
60% de rendimiento y una purificación de 5 veces. El precipitado se redisolvió en 100
ml y con la mitad del material se realizó una cromatografía de afinidad seguida de una
filtración por gel recogiéndose en esta última 25 ml con una actividad de 10 U/ml y una
concentración de proteína de 2 mg/ml (método A). La otra mitad se sometió a una
cromatografía de adsorción seguida de una de intercambio iónico obteniéndose un
volumen de 5 ml con una actividad de 20 U/ml y una concentración de proteína de 1
mg/ml (método B). Calcule la actividad inicial del extracto crudo y las actividades finales
obtenidas con cada método de purificación. Indique cuál método (A o B) emplearía para
purificar la proteína y por qué. ¿Qué actividad recuperaría a partir del volumen total
inicial?
18- Un grupo de investigadores que están estudiando la enzima L-glutamato deshidrogenasa de una bacteria deciden realizar la purificación de la misma. Luego de varios intentos diseñan un método de purificación. En la tabla que sigue se detallan los resultados obtenidos.
FRACCIÓN
Extracto crudo
VOLUMEN
(ml)
220
ACTIVIDAD
(U/ml)
42,0
PROTEÍNA
(mg/ml)
21,0
6
DEAE-celulosa
Sulfato de amonio
Sephadex-G50
Crom. de afinidad
35
20
60
10
224,0
157,5
50,0
279,8
16,0
10,5
2,5
1,6
(a) Complete la tabla. (b) Se decide omitir uno de los pasos de purificación a partir de
los datos obtenidos, ¿cuál debería ser ese paso y por qué? ¿Cuál fue el paso que produjo la mayor purificación y cuál el de mejor rendimiento? (c) Dicha enzima reduce oxoglutarato a glutamato asociado a la oxidación de NADH a NAD+, lo que fue utilizado
para seguir espectrofotométricamente la actividad de la enzima. En una preparación
anterior 0,01 ml de enzima con una concentración de 10 mg/ml de proteína produjeron
una variación de absorbancia de 0,125/min en condiciones óptimas. ¿Qué actividad
específica tenía esa preparación? Volumen del ensayo: 1 ml; 340NADH: 6,22 mM-1
cm-1.
19- La asparaginasa cataliza la reacción:
asparagina + H2O  aspartato + H3N
Esta enzima es usada con fines terapéuticos en caso de leucemia. Las células tumorales en rápida división necesitan cantidades mayores de asparagina que las normales.
La administración de asparaginasa reduce los niveles de asparagina disponible en los
individuos enfermos, lo que reprime la viabilidad del tumor. Un laboratorio farmacéutico
que desea comercializar asparaginasa le encarga que realice la purificación de la enzima del hongo Boticamyces pharmaceae. A tal fin, parte de 200 ml de un extracto crudo libre de células conteniendo 20 mg/ml de proteína. Para medir actividad enzimática
incuba una alícuota de 10 l del extracto con el sustrato a 37C en 0,2 ml de medio de
reacción, finalizándose ésta a los 5 min directamente por el agregado de 1 ml de reactivo de color para H3N. La lectura de absorbancia a 540 nm (descontando el blanco) en
una cubeta de 1 cm de camino óptico fue de 0,44 ( para la reacción de color = 2200 M1
cm-1). Luego realiza un fraccionamiento salino, recuperando la asparaginasa en la
fracción 40-80 % de sulfato de amonio. Al redisolver esta fracción en 20 ml del buffer
de purificación Ud. recupera el 95% de actividad enzimática y 3800 mg de proteína.
Luego realiza una cromatografía en columna de DEAE-celulosa y recupera 80 ml que
contenían 600 U de asparaginasa (U es la cantidad de enzima que produce 1 mol de
H3N por minuto en las condiciones de ensayo) purificada 20 veces respecto al extracto
crudo. Como último paso realiza una cromatografía en columna de hidroxi-apatita de la
que recupera 20 ml conteniendo 0,12 mg/ml de proteína y 17 U/ml de actividad enzimática.
a- Construya la tabla de purificación y analícela, indicando la purificación y el rendimiento total alcanzados. Señale la etapa de mayor purificación y la de mayor rendimiento.
b- ¿Aconseja iniciar la preparación de la asparaginasa en gran escala usando los mismos pasos de purificación o sugiere alguna modificación? Justifique su respuesta.
20- Se purificó prácticamente a homoqeneidad la dUTPasa (deoxiuridinatrifosfatasa) de
Escherichia coli. Esta enzima hidroliza el dUTP a dUMP y PPi jugando un importante
rol en la biosíntesis del dTTP para la replicación de DNA, ya que provee el sustrato para Ia timidilato sintetasa. Las etapas del procedimiento de purificación se indican en la
siguiente tabla. Complete la tabla de purificación.
7
FRACCIÓN
VOLUMEN (ml)
ACTIVIDAD
PROTEÍNA
(U/ml)
(mg/ml)
I
1690,0
0,134
2350,0
II
340,0
0,503
6060,0
III
440,0
0,208
173,0
IV
196,0
0,224
4,0
V
19,0
2,420
10,5
I = sobrenadante del lisado celular, II = fraccionamiento con sulfato de amonio, III =
cromatografía en DEAE celulosa, IV = cromatografía en fosfocelulosa y V = filtración en
Biogel P-150.
21- Se realizó la purificación de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente
reacción:
glucosa-6-fosfato + H20  glucosa + fosfato
Se partió de 200 g de hígado bovino obteniéndose un extracto inicial de 1200 ml que
tenía una concentración de proteína de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimática se
incubó una alícuota de 50 microlitros con el sustrato a 30C en 1 ml de medio de reacción, cortándose ésta a los 10 min directamente por agregado de 2 ml de reactivo de
color para fosfato. La lectura de Abs a 740 nm en una cubeta de 1 cm de camino óptico
fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12 (el coeficiente de extinción para la reacción de color es de 3700 M-1 cm-1). Se realiza luego un corte con sulfato de amonio al
50 % rescatándose la fosfatasa en el precipitado. Este precipitado fue redisuelto en un
volumen de 80 ml, siendo la concentración de proteína de 21 mg/ml y la actividad 6,3
U/ml. Posteriormente se realizó una cromatografía en Sephadex G-200 recogiéndose
10 tubos de 12 ml c/u con actividad enzimática. La concentración de proteína en el conjunto fue de 10,8 mg/ml y la actividad de 3,36 U/ml. Como último paso se realizó una
cromatografía de afinidad y se obtuvieron 20 ml de preparación con una actividad de
7,2 U/ml y una concentración de proteína de 0,5 mg/ml. En base a estos datos construya la tabla de purificación e indique:
a-¿Cuál es la purificación y el rendimiento alcanzado?
b-¿Cuál es la etapa individual que proporcionó mayor rendimiento y cuál la de mayor
purificación?
c- Señale si todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.
22- La piruvato carboxilasa (PCasa) es una enzima que usa biotina como cofactor catalizando la reacción:
piruvato + ATP + HC03  oxaloacetato + ADP + Pi
A fin de realizar la purificación de la PCasa de Eschericia coli Ud. parte de 300 ml de un
extracto crudo libre de células conteniendo 1500 mg proteína. La actividad enzimática
se midió por un método continuo determinando la producción de oxaloacetato a 272 nm
( 272 = 920 M-1 cm-1) a 30C y en un volumen final de 3 ml. Utilizando 10 l del extracto
crudo para medir la actividad Ud. obtiene un A = 0,46 luego de 5 min de reacción
(medido en cubeta de 1 cm de camino óptico). Luego realiza un fraccionamiento salino,
recuperando la PCasa en la fracción 30-50% de sulfato de amonio. Esta fracción se redisolvió en 5 ml del buffer de purificación que contenían 30 mg/ml de proteína y el 90 %
de la actividad enzimática. A continuación realiza una cromatografía en columna de
Sephadex G-200, recuperando 30 ml que contenían 150 mg de proteína y 270 U/ml (U
está expresada en mol/min) de actividad enzimática. Como último paso realiza una
cromatografía en columna de CM-celulosa de la que recupera 45 ml conteniendo 6750
U de PCasa purificada 900 veces respecto del extracto crudo. En base a estos datos
a- Construya la tabla de purificación.
8
b- Analice la tabla indicando purificación y rendimiento total alcanzados, así como el
paso de mayor purificación y el de mayor rendimiento.
c- Indique si todos los pasos se justifican, explicando su respuesta
23- Durante la purificación de la enzima ureasa (urea + H2O  2 NH4+ + CO2 ) se obtuvieron 900 ml de extracto crudo con una concentración de proteína de 3,33 mg/ml. Su
actividad se siguió midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm utilizando la reacción acoplada NH4+ +  cetoglutarato + NADH + H+  glutamato + NAD+ (NADH= 6200
M-1 cm-1). El agregado de 20 l de extracto crudo a 1 ml de la mezcla de reacción
produjo una A = -0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Un corte
con sulfato de amonio dio lugar a un precipitado que se redisolvió en 150 ml de buffer.
De esta manera la ureasa se purificó 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Esta
fracción se cromatografió en una columna de Sephadex G25 recolectándose 80 ml de
eluato con el 90 % de la actividad de la etapa anterior conteniendo 45 mg de proteína y
siendo la purificación respecto del extracto crudo de 50. Su actividad se determinó por
el metodo discontínuo ( NH4+ + fenol + hipoclorito azul de indofenol ) cuya curva de
calibración de NH4+ presentó una pendiente de 0,6557 UA/mol NH4+ . Las condiciones de la colorimetría fueron las mismas para la curva y la muestra.
a) ¿Cuál fue la absorbancia medida por este último método para la muestra si se emplearon 40 l de ureasa obtenida en la última etapa?
b) Realice la tabla de purificación.
24- Su profesor de Bioquímica le ha asignado como trabajo práctico para aprobar la materia que determine la masa molecular de la -lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20.
Como material de partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicación de
un cultivo del microorganismo en fase logarítmica de crecimiento.
Mediante una búsqueda bibliográfica Ud halla la siguiente tabla de purificación:
TABLA 1: Purificación de la -lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20.
Actividad
específica
(U/mg)
4
Actividad
total
(U)
3,349
Purificación
(veces)
Rendimiento
(%)
1
100
8
3,208
2
96
CM-Sephadex
1251
1,847
301
55
Chromatografía de afinidad
2155
1,373
518
41
ETAPA
Extracto crudo
Ppción con sulfato de amonio
La determinación de la actividad enzimática del extracto crudo empleando nitrocefina como
sustrato (=16000 M-1cm-1) resultó en una variación de absorbancia de 0,32 en dos minutos cuando emplea 20 l de muestra (volumen de cubeta=1ml, camino óptico=1cm).
Para determinar la masa molecular de la enzima realiza una electroforesis en condiciones
desnaturalizantes y obtiene los resultados que se muestran. La calle A corresponde a la
enzima purificada y la B a los marcadores de masa molecular: albúmina bovina sérica (67
kDa), ovalbúmina (43 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y
-lactalbúmina (14,4 kDa).
a-¿Cual es la actividad del extracto crudo?
9
b-¿Cuántas unidades de enzima espera obtener luego de realizar la purificación?¿Qué actividad específica espera obtener?
c-¿Qué masa molecular informará?. ¿Qué otro método podría haber usado para realizar
esta determinación?
A
B
25- Se desea purificar una deshidrogenasa de planta (Punto Isoeléctrico 3,1) a partir de
5 litros de extracto crudo. Con el propósito de poner a punto el método de purificación
se ensaya un protocolo que consta de tres etapas: fraccionamiento salino (etapa 1),
cromatografía de intercambio iónico (etapa 2) y cromatografía de afinidad (etapa 3). Se
midió espectrofotométricamente la actividad de muestras provenientes de cada etapa
empleando 5 l de muestra, en un volumen de reacción de 1ml, durante 3 minutos a
25ºc (340= 6000 M-1.cm-1). Los valores de variación de absorbancia obtenidos, la concentración de proteína y los volúmenes totales se muestran en la tabla.
Etapa
Extracto crudo
1
2
3
Volumen
(ml)
50
7
10
2
Proteína
(mg/ml)
3
10
0,5
0,05
A
(340nm)
0,09
0,45
0,225
0,675
a-Complete la tabla de purificación.
b-Indique cuál será la cantidad de enzima (U totales) y la actividad específica obtenida
si purifica la enzima a partir del resto de extracto crudo.
c-Explique brevemente el fundamento de la cromatografía de intercambio iónico e indique qué tipo (aniónico o catiónico) emplearía para purificar la deshidrogenas del enunciado y a qué pH lo haría.
26- Su profesor de Bioquímica le ha asignado como trabajo práctico que purifique la lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20 y determine su masa molecular. Como material
de partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicación de un cultivo del
microorganismo en fase logaritmica de crecimiento con una actividad de 8 U/ml y una concentración de proteína de 2 mg/ml.
Mediante una búsqueda bibliográfica Ud halla un método de purificación que arroja los datos de la siguiente tabla.
10
Actividad
específica
(U/mg)
4
Actividad
total
(U)
3,349
8
CM-Sephadex
Cromatografía de afinidad
ETAPA
Extracto crudo
Purificación Rendimiento
(veces)
(%)
1
100
3,208
2
96
1251
1,847
301
55
2155
1,373
518
41
Ppción con sulfato de amonio
Ud realiza todos los pasos de purificación y obtiene 8 ml de enzima purificada. La determinación de la actividad enzimática de la proteína purificada empleando nitrocefina como
sustrato (=16000 M-1cm-1) resultó en una variación de absorbancia de 0,48 en dos minutos cuando emplea 3 l de muestra (volumen de cubeta =1ml, camino óptico = 1cm) siendo
la concentración de proteína 0,002 mg/ml .
La determinación de masa molecular la realiza mediante una cromatografía de filtración
molecular empleando una columna previamente calibrada según se indica en la siguiente
tabla:
Proteína marcadora
Volumen de elución (ml))
Masa molecular (kDa)
Ribonucleasa
250
13,7
Quimotripsinógeno
230
25,0
Ovoalbúmina
210
43,0
Albúmina
195
67,0
Aldolasa
165
158,2
Catalasa
150
231,9
El volumen de elución de la proteína en estudio fue de 220 ml, el volumen total de la columna fue de 260 ml y el volumen de exclusión de 100 ml.
a-¿Cual es la actividad específica de la enzima por Ud. purificada?
b- Cual es el rendimiento y la purificación obtenidas por Ud. con respecto a los publicados?
c-¿Qué masa molecular informará? (determinación por método gráfico) ¿Cómo determinaría si se trata de una enzima monomérica o no?
RESPUESTAS:
1- a) Las mismas. B) Keq= [A B]/ [A] [B] = 0,67/mM
2- Cubeta: 8 x 10-3 U/ml ; 3,3 x 10-3 U/mg
Muestra: 8 x 10-2 U/ml ; 3,3 x 10-3 U/mg
3-
a) 6 x 10-2 mM/min
b) 30 nanomoles/min ml
c) 0,06 U/ml 3 U/ml (ext)
d) 0,15 U/mg
11
4-
a) 5,2 moles (Se deben verificar condiciones de linealidad)
b) 6 segundos
5- a) 720 s-1; 43200 min-1
b) 0,0014 s
6- a) 500 U/mg; 4,6 x 1010 U/mol
b) 46000 min-1
c) 1,3 x 10-3 s
7- a) debe diluir
b) agregar glicerol, gelatina , albúmina bovina sérica, etc. Otra forma es aumentar la concentración de sustrato en el medio de reacción.
8- 22 U/ml ; 1100 U/mg
9- 271 s-1
10- a) R= 88,5 %
b) P= 2,94
11- a) 93%
b) P= 3
12- Rt= 14%
Pt= 4347
13- a) 20
b) II
c) 40 %
d) No. Se puede eliminar la etapa III
14- Rt= 30 %; Pt= 750; Etapa de mayor purificación= III; Etapa de mayor rendimiento= III; se eliminaría la etapa IV
15- a) Pt= 240; Rt= 25 %
b) la de mayor purificación es la etapa III, la de mayor rendimiento la IV
c) No. Se podría eliminar la etapa IV
16- a) Filtración molecular: R= 80 %, P= 15
Intercambio iónico: R= 13 %, P= 20
17- Actividad extracto crudo= 0,4 U/ml
Actividades finales: Método A= 10 U/ml
Método B= 20 U/ml
Emplearía B
Actividad recuperada= 200 UT
18- b) el paso omitido debería ser III y IV
Mayor purificación= paso V
Mayor rendimiento= paso IV
12
c) 0,2 U/mg
19- a) Pt= 592; Rt=35 %
Mayor purificación= IV
Mayor rendimiento= II
b) se eliminaría la etapa II
20- Pt= 4044; Rt=20 %
21- a) Pt= 240; Rt=20 %
b) Mayor rendimiento= paso III
Mayor purificación= paso IV
c) No. Se eliminaría la etapa III (podría dejarse para desalar la muestra)
22- b) Pt=900; Rt=75 %
Mayor rendimiento= paso II
Mayor purificación= paso IV
23- a) Abs= 0,34
b) Pt= 50; Rt=75 %
24- a) 0,5 U/ml
b) 5125 U – 2155 U/mg
c) 31000 – Filtración molecular
25- 4950 U totales; 150 U/mg
26- a) 2500 U/mg
b) rendimiento 20 % - menor; purificación 625- mayor
c) 31000
13
CINÉTICA ENZIMÁTICA
PROBLEMAS:
1- Utilizando la ecuación de Michaelis-Menten demuestre que v = Vmáx/2 cuando
[S]= Km.
2- Estudiando el efecto del pH sobre la actividad de una enzima se trabajó de acuerdo
a dos protocolos diferentes. En uno de ellos (A) se preincubó la enzima a distintos pHs
y luego se midió la actividad de la misma a pH 7. En el otro caso (B) se determinó la
actividad de la enzima a distintos pHs. Los resultados obtenidos se muestran a
continuación.
ACTIVIDAD
Protocolo A
Protocolo B
7,9
1,0
8,1
1,9
8,0
3,2
8,2
4,9
7,8
7,3
8,0
9,0
8,0
8,0
8,1
6,3
4,0
2,5
2,0
1,0
0,2
0,0
pH
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
Explique el comportamiento enzimático en cada caso .
3-Una enzima posee la curva de actividad versus pH que aparece en la figura:
(a) Explique este comportamiento
(b) ¿Como probaría su hipótesis?
(c) Suponga que se informó que un
residuo de Asp es el responsable de
una parte de esta curva de pH,
¿cómo explicaría este
comportamiento ?
100
d
a
d
iv
it
c
A
%
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
pH
6
7
8
9
14
4- En la figura se muestra el comportamiento de la actividad de una enzima en función
del pH. ¿Qué aminoácidos del sitio activo serían los responsables del comportamiento
observado? No tenga en cuenta el efecto de la falta de ionización causada por el medio
hidrofóbico.
100
d
a
id
vi
tc
A
%
80
60
40
20
0
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH
5- La actividad de una enzima se determinó a diferentes temperaturas obteniéndose los
valores que se indican a continuación.
Temperatura ()
Actividad (U/ml)
0
5
10
10
20
21
25
30
30
20
40
10
Cuando la enzima se preincubó a cada una de las temperaturas anteriores y su
actividad se ensayó a la temperatura óptima se obtuvieron los mismos valores de
velocidad, excepto para las alícuotas de enzima provenientes de la incubación a 30C y
40C , las que fueron significativamente menores. Con los datos anteriores, indique:
a) ¿Cuál es la temperatura óptima de reacción? b)¿Por qué la actividad enzimática
cuando se ensayó a la temperatura óptima no fue constante para todas las muestras
previamente incubadas a distintas temperaturas?
6- La Km para el etanol de la alcohol deshidrogenasa de levadura es de 1,3.10-2 M. Si la
concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59,2 µg/ml ¿qué proporción de
enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato?, ¿cuando la
velocidad de reacción sea igual a Vmax ,qué valores tomarán estas proporciones?
7- Calcular qué velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad
máxima es igual a 100 mol/min y la concentración de sustrato es a) 10 Km y b) Km/3.
8- Calcular qué concentración de sustrato expresada en función de la Km nos dará una
velocidad de reacción enzimática igual al 60 % de la Vmax.
9- Una disolución al 1% de almidón se digiere a pH 6,7 mediante 15 µg de amilasa (PM
= 152000). La velocidad inicial máxima de liberación de maltosa es de 8,5 mg/min.
Calcular el número de recambio de dicha enzima.
10- Una enzima tiene un peso molecular de 60000 y 6 sitios activos por mólecula. La
velocidad inicial de la reacción que cataliza es 12 µmoles de sustrato cada 12 min en
15
presencia de 18 µg de enzima. Calcule la actividad molecular por centro catalítico de la
enzima.
11- Los datos de velocidad y concentración que se muestran en la tabla se obtuvieron
para una enzima que cataliza una reacción S  P.
a- Calcular Km y Vmáx.
b- Comprobar que la enzima sigue una cinética de saturación hiperbólica
[Sustrato]
M
2,5 10-6
3,3 10-6
4,0 10-6
5,0 10-6
1,0 10-5
2,0 10-5
4,0 10-5
1,0 10-4
2,0 10-3
1,0 10-2
velocidad
nmol/l.min
24
30
34
40
60
80
96
109
119
120
12- Una enzima con un Km de 2,4 10-4 M se ensayó con las siguientes concentraciones
de sustrato: (a) 2,0 10-7 M, (b) 6,3 10-5 M, (c) 1,0 10-4 M, (d) 2,0 10-3 M y (e) 5,0 10-2 M.
La velocidad observada a 5,0 10-2 M fue de 128 nmol/l/min. Calcular las velocidades
iniciales con las otras concentraciones de sustrato.
13- Si la concentración de enzima del problema anterior se aumentara 5 veces, ¿cuál
sería la velocidad inicial a cada una de las concentraciones dadas? ¿y si se aumentara
la concentración de sustrato cinco veces?
14- Se hicieron diez mezclas de reacción. Cada una contenía la misma concentración
de enzima, a varias concentraciones de sustrato, y las velocidades iniciales se
determinaron como se muestra en la tabla. Utilizando la ecuación de Lineweaver-Burk,
determine gráficamente el Km y la Vmáx. Observe que uno de los factores críticos en la
exactitud de esta determinación son las escalas seleccionadas para la ordenada y la
abcisa. Cuáles son los intervalos de concentraciones de sustrato son más útiles para
estas determinaciones?
[Sustrato]
velocidad
[Sustrato]
velocidad
M
nmol/min
M
nmol/min
-3
-5
1,0 10
65,0
2,0 10
27,0
5,0 10-4
63,0
1,0 10-5
17,0
-4
-6
1,0 10
51,0
5,0 10
9,5
5,0 10-5
42,0
1,0 10-6
2,2
-5
-7
33,0
5,0 10
1,1
3,0 10
15- Se hicieron varias mezclas de reacción que contenían concentraciones iguales de
una enzima, a las concentraciones de sustrato indicadas en la tabla y se determinaron
las velocidades de reacción iniciales. Utilizando la ecuación de Eadie-Hofstee, (v =
f(v/S)determine gráficamente la Km y la Vmáx. ¿Cuál es la ventaja de este tipo de gráfica
sobre la de Lineweaver-Burk?
16
[Sustrato]
M
4,0 10-4
2,0 10-4
1,0 10-4
5,0 10-5
4,0 10-5
2,5 10-5
2,0 10-5
velocidad
nmol/min
130,0
110,0
89,0
62,0
53,0
38,0
32,0
16- Dos estudiantes A y B aislaron independientemente la enzima lactato
deshidrogenasa de músculo de caballo que cataliza la reducción de piruvato siguiendo
los mismos pasos de purificación. Una vez obtenida una solución concentrada de
enzima midieron actividad en función de la concentración de sustrato obteniendo los
siguientes datos:
Sustrato] (M)
2,0 10-6 5,0 10-6 1,0 10-5 5,0 10-5 1,0 10-4 2,0 10-4 1,0 10-3
16
33
50
83
90
95
100
VA mol.min.mg-1
-1
25
50
75
125
136
143
150
VB mol.min.mg
a- Sin graficar haga una estimación aproximada de Km y Vmáx observando los datos de
A y B. Justifique.
b- Intente una explicación para la discrepancia observada entre los parámetros
cinéticos de A y B.
c- Qué variables graficaría para obtener Km y Vmáx. Justifique.
17- A partir de un experimento de inhibición se obtuvieron los datos de la tabla. Mediante una gráfica de Lineweaver-Burk. Determine si el compuesto en estudio es un inhibidor competitivo o no competitivo. Determine Ki (la concentración del inhibidor es 1M)
[ Sustrato ]
(moles/l)
0,50.10-4
0,67.10-4
1,00 10-4
1,30 10-4
2,70 10-4
5,30 10-4
v sin inhibidor
(mol/min)
0,42
0,50
0,60
0,66
0,80
0,88
v con inhibidor
(mol/min)
0,17
0,20
0,24
0,27
0,32
0,36
18- Calcule el Km y la Vmáx de la enzima E y de la enzima E en presencia del compuesto
I a partir de los datos que se indican en la siguiente tabla:
[S] (mM)
0,100 0,125 0,250 0,500 0,750 1,000
vcontrol (U/mg)
0,154 0,185 0,250 0,345 0,370 0,400
v con inhibidor (U/mg) 0,065 0,081 0,133 0,217 0,263 0,294
Indique qué tipo de inhibidor es el compuesto agregado.
17
19- Sobre una enzima que cataliza la reacción S  P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y obteniéndose los datos de velocidad que se muestran en la tabla. Determinar qué tipo de inhibidor es cada uno de ellos. Calcule Km y Vmáx.
[S] (mM)
2,00
2,50
3,33
4,00
5,00
sin agregado
66,67
71,40
76,92
80,00
83,33
[x]=12M
40,00
45,45
52,63
57,14
62,50
[I]=60M
22,22
23,81
25,64
26,67
27,77
Los datos de velocidad de están expresados en U/ml.
20- El salicilato inhibe la acción catalítica de la glutamato deshidrogenasa
a) Determine el tipo de inhibición mediante el análisis gráfico de los datos de la tabla. b)
Calcule la Km para el sustrato.
Suponga que la concentración de salicilato se mantiene constante y es de 40 mM.
[Sustrato]
(mM)
1,5
2,0
3,0
4,0
8,0
16,0
V (mg de producto/min)
sin salicilato
con salicilato
0,21
0,08
0,25
0,10
0,28
0,12
0,33
0,13
0,44
0,16
0,45
0,18
21- A partir de los siguientes datos obtenidos al estudiar el efecto de un inhibidor sobre
una reacción enzimática, determine el tipo de inhibición y la Km para el sustrato.
[Sustrato]
(mM)
2,0
3,0
4,0
10,0
15,0
V (g de producto/min)
[inhibidor] = 0mM [inhibidor]=6mM
139
88
179
121
213
149
313
257
370
313
22- Se determinaron los parámetros cinéticos de una enzima en ausencia y en
presencia de una serie de compuestos, algunos de los cuales se supone podrían ser
inhibidores de la misma. Los resultados obtenidos con la enzima sin agregados se
detallan en la tabla 1. En la tabla 2 se presentan los valores de Vmáx y de Km obtenidos
en presencia de los compuestos en estudio.
a- Calcule los valores de Vmáx y de Km a partir de los datos de la tabla 1.
b- Indique qué tipo de inhibidor es cada uno de los compuestos agregados.
TABLA 1
[S]
Act.
(M) (mol/min/mg)
2,0
0.029
2,5
0.032
18
3,3
5,0
10,0
50,0
100,0
0.037
0.043
0.053
0.063
0.063
TABLA 2
Vmax (mol/min/mg)
0,033
0,065
0,064
0,033
Compuesto
A
B
C
D
Km (M)
2,5
5,0
2,4
1,3
23- Al estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la enzima hexoquinasa
(Glc + ATP  Glc-6-P + ADP) se observó que es inhibida por piruvato. La tabla
muestra los valores de actividad en mol/min obtenidos cuando se varía la
concentración de sustrato y/o de piruvato.
[I] (mM)
[S]=1,00 mM [S]=1,82 mM [S]=2,50 mM [S]=10,00mM
0,0
1,25
2,00
2,50
5,00
0,2
0,83
1,33
1,67
3,33
0,4
0,63
1,00
1,25
2,50
0,6
0,50
0,80
1,00
2,00
0,8
0,42
0,67
0,83
1,67
1,0
0,36
0,57
0,71
1,43
En base a estos datos indique:
a- qué tipo de inhibidor es piruvato
b- el valor de Km
c- el valor de Vmáx
d- el valor de Ki.
24- Para estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la actividad de una
enzima se incuba la misma con los mismos durante 5 min. Luego se agrega el sustrato
en la misma cubeta y se determina la velocidad inicial de la reacción. Se obtienen los
siguientes resultados:
Preincubación
con
A
B
C
D
Vi(M/min)
10,10
12,5
9,8
5,30
0,50
¿Qué efecto ejerce c/u de los compuestos sobre la enzima? ¿Cómo puede determinar
si la interacción en cuestión es reversible o irreversible?
25- Se ha determinado que dos compuestos B y C son inhibidores irreversibles de la
enzima E. Con el objeto de caracterizar la inactivación se realizó lo siguiente:
19
a- Se incubó la enzima con distintas concentraciones del compuesto en estudio durante
distintos tiempos.
b- Se tomó una alícuota de la mezcla anterior y se midió la actividad enzimática. Se
obtuvieron los siguientes resultados:
CONTROL
Tiempo (min)
0
1
2
5
10
20
Vi (U/ml)
1,89
1,87
1,90
1,88
1,86
1,89
COMPUESTO B
[B]=20µM
[B]=30µM
[B]=50µM
[B]=70µM
[B]=100µM
t (min)Vi(U/ml) t (min)Vi (U/ml) t (min)Vi (U/ml) t (min)Vi (U/ml) t (min)Vi (U/ml)
1
1,78
1
1,74
1
1,63
1
1,55
1
1,47
5
1,34
5
1,25
2
1,40
2
1,23
2
1,17
10
0,98
10
0,83
5
0,89
5
0,72
5
0,57
15
0,70
12
0,57
7
0,65
7
0,49
7
0,36
20
0,50
20
0,37
10
0,41
10
0,26
10
0,17
COMPUESTO C
Tiempo
(min)
0,5
1,0
2,0
3,0
4,0
Vi (U/ml)
[C]=5M
1,68
1,47
1,17
0,89
0,72
Vi (U/ml) Vi (U/ml) Vi (U/ml)
Vi (U/ml)
Vi (U/ml)
[C]=10M [C]=20M [C]=50M [C]=100M [C]=200M
1,59
1,55
1,51
1,47
1,45
1,34
1,29
1,21
1,15
1,13
0,96
0,89
0,76
0,72
0,66
0,68
0,60
0,49
0,44
0,41
0,49
0,42
0,32
0,27
0,25
De acuerdo a los datos obtenidos ¿qué mecanismo de inactivación puede postularse
para cada uno de los compuestos? Calcule las constantes de velocidad y de equilibrio
involucradas.
26- La acción terapéutica de la mayoría de las drogas actualmente utilizadas está
basada en la inhibición que estas causan sobre determinadas enzimas. La
quimioterapia moderna tuvo sus comienzos con el uso de las sulfas, compuestos que
han sido ampliamente usados para tratar infecciones bacterianas. Las bacterias no
pueden absorber ácido fólico (AF) del medio y deben sintetizarlo ya que este
compuesto es escencial para el crecimiento celular porque es una coenzima de
diversas vías metabólicas. La síntesis de AF involucra una serie de reacciones, entre
ellas la catalizada por la enzima dihidropteroato sintetasa (DHPT STasa). La acción de
las sulfas se basa en que inhiben la DHPT STasa y la bacteria queda privada de AF no
pudiendo crecer y dividirse. Ya que las células del individuo infectado obtienen AF de la
dieta (el AF es vitamina para el hombre) la sulfa no es tóxica en las dosis usadas. Al
20
estudiar el efecto de la dimetilsulfanilamida (DMSF) sobre la actividad de la DHPT
STasa se obtuvieron los siguientes resultados:
i- La incubación de la enzima con DMSF, seguida de diálisis por 6 horas no afectó la
actividad enzimática.
ii- El ensayo de actividad usando concentraciones variables de PABA (el otro sustrato
se mantiene fijo y saturante) y diferentes concentraciones de DMSF resultaron los
valores de velocidad que muestran en la tabla.
[PABA]
(mM)
0,10
0,15
0,20
0,40
0,80
[DMSF] = 0
1,67
2,00
2,50
3,33
4,00
Velocidad (U/mg)
[DMSF] = 16 M
1,00
1,25
1,67
2,50
3,33
[DMSF]= 50 M
0,60
0,70
1,00
1,67
2,50
En base a estos datos:
a- Determine qué tipo de inhibidor es DMSF y postule el modelo de inhibición
correspondiente.
b- Determine el Km para PABA, la Vmax de la DHPT STasa y el Ki para DMSF.
c- Indique si los niveles de PABA en la célula bacteriana afectan la efectividad de la
sulfa como medicamento. Justifique la respuesta.
27- Se estudia el efecto de un compuesto I sobre la actividad de una enzima. Para ello
se midió la actividad de la enzima preincubada a distintos tiempos con distintas concentraciones del compuesto obteniéndose los resultados de la tabla:
[I]=1M
[I]=2M
[I]=5M
[I]=10M
t (min)
Vi/V0
t (min)
Vi/V0
t (min)
Vi/V0
t (min)
Vi/V0
0
1,00
0
1,00
0
1,00
0
1,00
2
0,92
2
0,86
1
0,83
1
0,69
4
0,85
4
0,75
2
0,68
2
0,47
10
0,68
10
0,50
4
0,45
3
0,32
15
0,56
15
0,35
7
0,25
4
0,22
20
0,46
20
0,24
10
0,45
5
0,15
a- Calcular las constantes de pseudo primer orden k.
b- A partir del análisis del comportamiento de k en función de [I] de los resultados obtenidos, indique qué mecanismo puede postular para la inhibición.
28- Se estudia el efecto de un compuesto I sobre la actividad de una enzima. Para ello
se midió la actividad de la enzima preincubada a distintos tiempos con distintas concentraciones del compuesto obteniéndose los resultados de la tabla:
[I]=1M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,95
2
0,91
4
0,82
9
0,64
14
0,50
[I]=2M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,90
2
0,80
4
0,63
9
0,34
14
0,19
[I]=4M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,80
2
0,69
4
0,46
9
0,17
[I]=8M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,65
2
0,40
3
0,25
4
0,06
[I]=14M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,56
2
0,30
3
0,10
4
0,005
21
a- Calcular las constantes de pseudo primer orden k.
b- A partir del análisis del comportamiento de k en función de [I] de los resultados obtenidos indique que mecanismo puede postular para la inhibición.
29- Una de las enzimas más importantes de la vía de biosíntesis de ácido fólico (coenzima indispensable en la síntesis de purinas y pirimidinas) es la dihidrofolato reductasa.
Se purificó esta enzima a partir de leucocitos humanos obteniéndose un extracto altamente purificado (concentracion de proteína: 0,1 mg/ml ) al que se le midió la actividad
espectrofotométricamente ( Coeficiente de extinción: 6220 M-1cm-1) empleando distintos
volúmenes del mismo (1 µl, 2 µl y 3 µl) en una cubeta de reacción de 1 ml y 1 cm de
camino óptico. Se obtuvieron las variaciones de absorbancia en el tiempo que se
muestran a continuación:
0.9
0.8
0.7
Variacion de absorbancia
Explique las formas de las curvas observadas en
los distintos ensayos. Cuál elige para calcular la
actividad de la enzima y por qué? Calcule la actividad específica de la enzima purificada.
El metotrexato se emplea en el tratamiento de niños con leucemia, ya que se trata de un potente
inhibidor de la enzima mencionada. Con el objeto
de conocer cuál es el mecanismo de inhibición se
ha determinado la velocidad de reacción de la enzima a distintas concentraciones de sustrato en
presencia de distintas concentraciones del inhibidor obteniéndose los resultados que se indican en
la tabla.
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo (s)
[S] mM v (nM/min) v (nM/min) v (nM/min) v (nM/min)
[I]=0
[I]=0.2 nM [I]=0.4nM [I]=0.6nM
0,1
1,25
0,83
0,58
0,50
0,2
2,00
1,42
1,04
0,91
0,4
2,86
2,22
1,72
1,54
0,8
3,63
3,07
2,56
2,35
1,2
4,00
3,53
3,05
2,85
1,6
4,21
3,81
3,38
3,20
2,0
4,35
4,00
3,62
3,44
2,4
4,44
4,14
3,79
3,63
Indique cuál es el mecanismo de inhibición, calcule el Ki para el metotrexato. ¿Considera que el nivel de dihidrofolato en la célula es capaz de alterar el efecto del metotrexato?
30- La hidroxiurea (U-OH) es un medicamento utilizado para el tratamiento de tumores.
El uso de esta droga está basado en que es un inhibidor reversible de la enzima ribonucleótido reductasa (RRasa), la que cataliza la síntesis de deoxirribonucleótidos
(dNDP) a partir de los ribonucleótidos (NDP) correspondientes según la reacción:
NDP + tiorred red  dNDP + tiorred ox
Así, la U-OH inhibe la proliferación de células tomorales ya que disminuye considerablemente la síntesis de los dNDP necesarios para la replicación del DNA. Al estudiar la
inhibición reversible de la U-OH sobre la RRasa se midió actividad enzimática a con-
22
centraciones variables de NDP (el otro sustrato se mantuvo fijo y saturante) en ausencia o presencia del inhibidor.
[NDP]
(M)
6,25
8,30
12,50
25,00
[U-OH] = 0
0,80
1,00
1,33
2,00
Velocidad (U/mg)
[U-OH] = 4 M
0,40
0,50
0,67
1,00
[U-OH]= 12 M
0,20
0,25
0,33
0,50
Esta tabla muestra los resultados obtenidos. En base a ellos:
a- Determine que tipo de inhibidor es U-OH, indicando el modelo de la reacción de inhibición.
b- Determine Km y Vmax para NDP de la RRasa y el Ki para U-OH.
c- Indique si los niveles de NDP en la célula tumoral afectan la efectividad de la U-OH
como medicamento. Justifique su respuesta.
31- El compuesto I es un inhibidor irreversible de la enzima E. Se preincubó E con distintas concentraciones de I tomándose, a distintos tiempos muestra en las que se determinó la actividad residual. A todas las concentraciones de I ensayadas se observó
un decaimiento exponencial simple de la actividad, lo que permitió calcular las constantes de pseudo-primer orden (kobs) mostradas en la tabla. En base a estos datos postule
un mecanismo para la inactivacion observada y calcule las constantes cinéticas y/o de
equilibrio correspondientes.
[I] (M)
2,5
3,3
5,0
10,0
20,0
kobs (min-1)
0,050
0,067
0,100
0,200
0,400
32- Se estudió el efecto de un medicamento sobre la actividad de una enzima oligomérica. Para este estudio se midió actividad de la enzima frente a este reactivo, obteniéndose los siguientes resultados:
Concentración de susVelocidad control (U/ml) Velocidad frente a reactrato (mM)
tivo 1 mM (U/ml)
0,2
2,0
0,02
0,3
2,9
0,08
0,4
3,8
0,3
0,8
7,4
3,9
1,0
9,1
9,1
5,0
33
98
10,0
50
99
Explique como actúa este medicamento y que efecto produce sobre la actividad de la
enzima. Se podría utilizar en terapias, suponiendo que los productos de la actividad
enzimática son cancerígenos? (Se sabe que la concentración intracelular de sustrato
es aproximadamente 9 mM).
Por otro lado se tomaron 0,2 ml de solución de enzima y se la incubó con un inhibidor
reversible. Se dejó pasar el tiempo que aparece en la tabla, se tomó una alícuota de
23
0,02 ml y se midió actividad enzimática en 1 ml de un medio adecuado. Lo mismo se
hizo con otros 0,2 ml, pero en presencia de otro inhibidor, en este caso irreversible.
Anote en la tabla siguiente (con números arbitrarios) los valores esperados de actividad
enzimática, sabiendo que la actividad de la enzima no inhibida a tiempo 0 es 5 U/ml.
1 min
3 min
5 min
10 min
Inh reversible
Inh irreversible
33- Los siguientes datos se obtuvieron para una reacción catalizada enzimáticamente.
Determinar si la enzima sigue una cinética hiperbólica o sigmoidea y calcular o estimar
las constantes cinéticas apropiadas ( Km y Vmax o o K', [S]0,5 , nap y Vmax)
Concentración inicial de sustrato (M 10-4)
6,25
12,5
25,0
50,0
100,0
200,0
400,0
800,0
Velocidad inicial
( mol l-1min-1)
1,54
5,88
20,00
50,00
80,00
94,12
98,46
99,61
34- ¿ Cuál es el valor de nap de una enzima si [S]0,9/[S]0,1 es 9?
35- Calcular la proporción [S]0,9/[S]0,1 de una enzima alostérica en el que nap = 4.
36- Ud. está caracterizando el efecto de un fármaco X sobre una enzima clave de un
camino metabólico. En la tabla se muestra el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad en presencia y en ausencia del fármaco X. Sabiendo que la concentración intracelular de sustrato de la enzima es 0,5 mM, describa el efecto del fármaco y
calcule los parámetros cinéticos de la enzima en presencia y en ausencia de X.
Sustrato
(mM)
0,0
0,1
0,2
0,4
0,8
1,0
2,0
4,0
Control
(U/mg)
0,0
2,85
4,90
7,60
10,50
11,40
13,70
15,20
RESPUESTAS:
1- consultar clases de teoría
2- ver curvas de actividad y de estabilidad enzimáticas
Fármaco X
(U/mg)
0,0
0,05
0,23
1,02
4,00
5,70
12,00
15,70
24
3- a) Un residuo de His no protonado (pKa= 6) y un grupo amino terminal protonado (pKa alrededor de 8) o un grupo sulfidrilo (pKa = 8,1), necesarios para la actividad enzimática, serían los responsables, respectivamente, de las partes ascendentes y descendentes de la curva. b) Cristalografía de rayos X c) Un medio
no polar suprime la ionización de los grupos cargados. Tal efecto podria elevar el
pKa del grupo carboxilo del Asp a pH 6
4- ver aminoácidos cuyos pKa de grupo R estén entre 6 y 8.
5- ídem respuesta preg. 2
6- 9 % combinada, 91 % libre; 100 % combinada
7- a) 91 mol/min
b) 25 mol/min
8- [s]= 1,5 Km
9- 253.333 min-1 o 4168 s-1
10- 555 min-1 o 9 s-1
11- Km = 1,0 x 10-5 M; Vmáx= 120 nmol/l/min
12- a) 0,1 mmol/l/min; b) 27 mmol/l/min; c) 38 nmol/l/min; d) 114 mmol/l/min
13- a) 0.5 mmol/l/min; b) 73 mmol/l/min; c) 86 mmol/l/min; d) 125 mmol/l/min; e) aumentaría 5 veces la V0.
14- 0,33 S < Km < 2,0 S
15- Km= 7,5 x 10-5 M; Vmáx= 154 nmol/min. La gráfica de Eadie-Hofstee puede
desplazar los datos en un intervalo mayor de concentraciones de sustrato. De este
modo, los datos que se presentan lineales en una gráfica de Lineweaver-Burk, algunas veces exhiben desviaciones significativas de la linealidad con la gráfica de
Eadie-Hofstee.
16- consultar teoría
17- Km= 0,67 x 10-4 moles/l; Vmáx= 0,99 mol/min; Kmi= 0,68 x 10-4 moles/l;
Vmáxi= 0,40 mol/min; Inhibidor no competitivo
18- Km= 0,21 mM; Vmáx= 0,48 U/mg; Kmi= 0,63 mM; Vmáxi =0,48 U/mg; Competitivo.
19- Km= 1 mM; Vmáx= 100 U/ml; Kmx= 3 mM; Vmáxx =100 U/ml; Kmy= 1 mM;
Vmáxy =33 U/ml; x competitivo; y no competitivo.
20- a) Inhibidor no competitivo
b) Km= 2,4 mM
21- Inhibidor competitivo
Km= 5,2 mM
22- a) Km= 2,55 M; Vmáx= 0,065 mol/min/mg
b) A: no competitivo
B: competitivo
C: no tiene efecto
D: acompetitivo
23- a) no competitivo
b) Km= 5 mM
c) Vmáx= 7,5 mol/min
d) Ki= 0,385 mM
24- ver clases de teoría
25- B: mec. 1; C: mec 2
B: K1= 3 10-3 M; C: Ki= 5 M, K2=0,54 min-1
26- a) competitivo
b) Km= 0,21 mM; Vmáx= 5,26 U/mg; Ki= 16,5 M
c) Afecta
27- k1= 0,038 M; mecanismo 1
25
28- k1= 0,053 M
29- Competitivo; Ki= 0,25 nM
30- a) no competitivo
b) Km= 26 M, Vmáx=4 U/mg, Ki= 3,9 M
c) no afecta
31- Mec nº 1 k1= 0,02 M
32- El medicamento produce un cambio en la cinética de la enzima, convirtiéndola
de hiperbólica en sigmoidea. No se podría utilizar ya que a la concentración intracelular
de sustrato la velocidad de formación de producto es mayor con el reactivo que sin el.
Inh reversible: (arbitrario) 5,5,5,5
Inh irreversible: (arbitrario) 4,3,2,1
33- K´= 25 mM, Vmáx= 100 mol/l/min, [S]0,5= 5 mM
34- 2
35- 3
36- El fármaco produce un cambio en la cinética de la enzima, convirtiéndola de
hiperbólica en sigmoidea.
Sin fármaco: Vmax= 18,2 U/mg;
Km= 0,59 mM.
Con fármaco: nap= 2 ;
[S] 0,5= 1,58 mM ;
K’= 2,51 mM
Gráficas de Lineaweaver Burk
Inhibidor reversible competitivo
Inhibidor reversible no competitivo
Inhibidor reversible acompetitivo
26
Gráficas de Dixon
Gráficas de Cornish-Bowden
27
Inhibición irreversible