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MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA Bogotá D.C. 16 de febrero de 2009 MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL Trabajo de grado Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIOLOGO AGRICOLA Y VETERINARIO. MICROBIOLOGO INDUSTRIAL. NOTA DE ADVERTENCIA: Artículo 23 de la resolución No.13 julio de 1946. “la universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no tengas ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellos el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL APROBADO _ ________________________ Dra. Margarita Chaves Clavijo Bacterióloga MSc Directora. ______________________ Dr. Fredy Gamboa Bacteriólogo Ph. D. Jurado. ______________________ Dra. Mery Santaella Bacteriòloga Jurado. MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL APROBADO __________________________ Ingrid Schuler. Bióloga Ph. D. Decana Académica. ______________________ Janeth Arias Bacterióloga M.Sc-M. Ed Directora de carrera AGRADECIMIENTOS Especialmente a nuestros padres, hermanas y amigos que apoyaron nuestro trabajo a través de nuestra carrera. A la Dra. Margarita Chaves Clavijo por su paciencia, dedicación y apoyo por todo el largo proceso de finalización de nuestra carrera y por hacernos excelentes personas y alcanzar la meta de ser excelentes profesionales. TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCION…………………………………………………….. 1 2. OBJETIVOS…………………………………………………………... 4 2.1 Objetivo General……………………………………………………... 4 2.2 Objetivos específicos………………………………………………… 4 3. MARCO TEORICO………………………………………………….. 5 3.1 MICROBIOLOGIA DE LA CAVIDAD ORAL…………………… 5 3.1.1 Adquisición de la flora microbiológica oral…………………… 6 3.2 LA PULPA DENTAL……………………………………………….. 7 3.2.1 Funciones de la pulpa…………………………………………...7 3.2.2 Exposición de la pulpa………………………………………….. 9 3.2.3 Filtraciones marginales de las restauraciones…………………... 10 3.2.4 Contigüidad……………………………………………………... 10 3.3 VIAS DE ACCESO DE LOS MICROORGANISMOS A LA PULPA.11 3.3.1 Acceso mediante túbulos dentinarios……………………………. 11 3.3.2 Acceso Vía Periodontal…………………………………………..14 3.3.3 Vía Hematógena………………………………………………….15 3.3.4 Papel de los microorganismos en la patología pulpar…………...16 3.4 EL MEDIO ENDODONTICO……………………………………..18 3.4.1 Requerimientos para un patógeno endodóntico…………………19 3.4.2 Fisicoquímicos………………………………………………….. 20 3.4.3 Factores de Adhesión, Agregación y Coagregación……………..21 3.4.4 Nutricionales……………………………………………………. 22 3.4.5 Protectores del huésped…………………………………………..22 3.4.6 Antagónicos intermicrobianos………………………………….. 22 3.4.7 Modelos de relación microbiana……………………………….. 22 3.4.8 Actividad enzimática bacteriana………………………………... 25 3.5 MICROORGANISMOS MAS FRECUENTES ASOCIADOS A LAS LESIONES PULPARES…………………………………………...26 3.5.1 Fusobacteriumnucleatum………………………………………...26 3.5.2 Porphyromonas gingivalis………………………………………..27 3.5.3 Prevotella spp…………………………………………………….29 3.5.4 Peptostreptococcus spp…………………………………………..30 3.5.5 Streptococcus mutans………………………………………….....31 3.5.6 Enterococcus spp…………………………………………………33 3.5.7 Candida albicans……………………………………………….....34 3.5.8 Filifactor alocis……………………………………………………35 3.6 MICROORGANISMOS POCO FRECUENTES EN LESIONES PULPARES……………………………………………………………….37 3.7 MEDIOS DE CULTIVO……………………………………………..40 3.7.1 Análisis Microbiológico…………………………………………..42 3.8 TÉCNICAS MOLECULARES………………………………………45 3.8.1 Reacción de Hibridación………………………………………….48 3.8.2 Tipos de Hibridación……………………………………………...50 3.8.3 Amplificación de Ácidos Nucleícos……………………………....51 3.8.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)……………………52 3.8.4.1 Detección del Producto Amplificado…………………… 53 3.8.4.2 Modificaciones de la PCR………………………………..54 3.8.5 NASBA…………………………………………………………54 3.8.6 ADN Ramificado……………………………………………….55 3.8.7 Técnicas Moleculares Aplicadas a Taxonomías Microbianas…..56 3.8.7.1 Contenido G+C…………………………………………...56 3.8.7.2 Hibridación ADN-ADN…………………………………..56 3.8.7.3 Patrones de enzimas de Restricción……………………….57 3.8.7.3.1 Polimorfismos de la Longitud de lo Fragmentos De Restricción (RFLP)…………………………...57 3.8.7.3.2 Electroforesis en Gel del Campo Pulsátil (PFGE).58 3.8.8 Secuenciación de Ácidos Nucleícos…………………………….58 3.8.9 Técnicas ARNr16S……………………………………………...59 4. ANALISIS BIBLIOGRAGICO DE ESTUDIOS REALIZADOS…...63 5. CONCLUSIONES…………………………………………………….82 6. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………...83 7. ANEXOS………………………………………………………………96 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Principales géneros y especies de microbiota oral………37 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Microfotografía al Microscopio Electrónico de Barrido mostrando. Candida spp……………………………………………………………..71 INDICES DE ANEXOS ANEXO 1. Fusobacterium nucleatum………………………………………... 96 ANEXO 2. Porphyromonas gingivalis……………………………………….. 96 ANEXO 3. Prevotella intermedia…………………………………………….. 97 ANEXO 4. Peptostreptococcus spp………………………………………….. 97 ANEXO 5. Streptococcus mutans…………………………………………….. 98 ANEXO 6. Enterococcus faecalis…………………………………………….. 98 ANEXO 7. Candida albicans………………………………………………….. 99 ANEXO 8. Microorganismos referentes en el estudio bibliográfico……… 100 ANEXO 9. Tipos de Medios de Cultivo………………………………………. 101 ANEXO 10. Tecnica Reaccion en Cadena de Polimerasa (PCR)………..112 1. INTRODUCCION La pulpa es un tejido blando de origen mesenquimatoso con células especializadas, los odontoblastos, que se colocan periféricamente en contacto directo con la matriz dentinal. La íntima relación entre los odontoblastos y la dentina es una de las razones por la que la dentina y la pulpa deben considerarse como una entidad funcional, a veces denominada complejo dentino pulpar. (Cohen, 2006). La pulpa constituye un sistema microcirculatorio cuyos componentes vasculares más grandes son las arteriolas y las vénulas. Ninguna arteria o vénula sale o entra de la pulpa. El tejido pulpar está protegido en su parte externa por el esmalte y la dentina y la dentina a nivel coronal, a nivel radicular por la dentina y cemento. Cuando algún agente externo genera una lesión a estos tejidos puede comprometer la integridad de la pulpa y ocasionar cambios inflamatorios o degenerativos a nivel de este tejido que puede variar en magnitud y severidad (Rodríguez et al 2008) Según Bascones et al (1995) y Brau et al. (1995) la caries dental es la razón fundamental por la que la pulpa se ve afectada por procesos infecciosos, aunque también se pueden producir colonizaciones bacterianas a través de los márgenes de obturación o por fracturas dentarias, así mismo, los procesos periodontales pueden ser el camino por el que lleguen bacterias a la pulpa. Otras causas que motivan una afectación pulpar pueden ser iatrogénicas, y en concreto la manipulación dental con instrumental rotatorio sin la adecuada refrigeración o la aplicación de fármacos cavitarios o materiales de restauración, que son procedimientos que, por la frecuencia de su empleo, se encuentran entre las causas más frecuentas de patología pulpar. La pulpitis hace referencia a un estado inflamatorio de la pulpa que puede ser agudo o crónico y en distintas formas evolutivas según criterios clínicos o histopatológicos (Regezi et al, 2000) La gran variedad anatómica y tisular existente en la cavidad oral, entre otros factores, hace posible la convivencia de diferentes ecosistemas microbianos, cada uno con características metabólicas y nutricionales específicas y todos ellos conviviendo dentro de un delicado equilibrio ecológico (Gutiérrez, et al 2004) Ahora bien como comenta Rodríguez et al, (2008) ante el hallazgo de muerte pulpar y posterior daño a tejidos del periápice se cuestiona el origen de estos mismos a partir de factores iatrogénicos bacterianos o químicos, por tanto ellos determinaron cuales son los microorganismos que se hallan en estos dientes y pudiendo establecer su procedencia. Por esto mismo es de vital importancia y de conocimiento, saber que son propios de la enfermedad pulpar microorganismos que se ven vinculados en la etiología tales como: Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Treponema, Actinomyces, Streptococcus, Peptostreptococcus y muchos otros. La naturaleza polimicrobiana de las infecciones en la cavidad oral, permite que se produzcan fenómenos de simbiosis y de sinergia bacteriana. Hasta el inicio de la pulpitis, las bacterias implicadas serán principalmente aerobias; sin embargo su proliferación originará condiciones de anaerobiosis y la necrosis vasculonerviosa pulpar, creándose así condiciones favorables para el crecimiento de bacterias anaerobias facultativas y, posteriormente, de anaerobias estrictas principales responsables de los procesos infecciosos (Gutiérrez, et al 2004). El número de bacterias que colonizan la pulpa o el periápice es directamente proporcional a la magnitud de la puerta de entrada de las mismas. Cuanto más importante sea la invasión bacteriana, en poco intervalo de tiempo, mayor será la respuesta inflamatoria reactiva. Sin embargo, más que el número, tiene mayor relevancia la capacidad que tengan las bacterias de multiplicarse (Canalda-Brau, 2006); Por tanto las bacterias pueden utilizar diversas puertas de entrada hacia la cavidad pulpar. En función de su magnitud y proximidad, la patología se instaura rápidamente o de forma prolongada. Así desde que se demostró que la invasión microbiana de la pulpa casi siempre cursaba con una respuesta inflamatoria pulpar, se han abierto numerosas líneas de investigación dirigidas a identificar los ecosistemas bacterianos de la cavidad pulpar. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general: Realizar una revisión bibliográfica del tema: “Microbiología en lesiones pulpares”, y las metodologías aplicadas para la identificación de estos microorganismos relacionados en esta patología. 2.2 Objetivos específicos: • Revisar las especies de microorganismos más frecuentes en lesiones pulpares. • Describir las características microbiológicas y ecológicas de los microorganismos presentes en lesiones pulpares. • Analizar las técnicas utilizadas en la determinación de la flora microbiológica de las lesiones pulpares. 3. MARCO TEORICO 3.1 MICROBIOLOGIA DE LA CAVIDAD ORAL La cavidad oral se compone de un conjunto de tejidos, asociados a numerosos microorganismos constituyendo ecosistemas, con modificación constante. Según la composición de la microbiota y los tejidos se dividen en saliva, superficie epitelial del surco crevicular, superficie dental del surco crevicular, dorso de la lengua y epitelio bucal. Cuando este sistema ecológico esta en equilibrio se denomina eubiosis, y cuando se altera dicho equilibrio se conoce como disbiosis, correspondiendo a una boca enferma a partir de la cual puedan iniciarse procesos que desencadenen la destrucción del diente y o sus tejidos de soporte. (Fraile, 2003). En la cavidad oral se pueden aislar más de 500 especies de microorganismos; la mayoría corresponde a la microbiota transitoria o de paso, quedando como microbiota residente o habitual unas 20 especies y predominado entre ellas la microbiota Gram positiva, principalmente los estreptococos del grupo viridans componiendo el 90% de la microbiota oral. El resto de microorganismos presentes se distribuyen entre cocos Gram negativos como Neisseria; bacilos Gram positivos anaerobios ramificados como Actinomyces, bacilos Gram positivos como Lactobacillus y Bifidobacterium; bacilos Gram negativos anaerobios como Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium etc. Aunque en menor proporción, podemos encontrar en la cavidad oral normal espiroquetas, comensales y hongos como Candida albicans. (Fraile, 2003). (Tabla 1) 3.1.1 Adquisición de la flora microbiológica oral. La flora bacteriana se instala en la cavidad oral en forma progresiva desde el nacimiento. El niño nace con una cavidad oral estéril y la primera contaminación se produce en el parto por las bacterias de la flora vaginal. Los siguientes microorganismos que colonizan son los que se encuentran en el ambiente en estado libre o que se trasmiten al niño por personas más cercanas a él. A los tres meses de vida aun se pueden encontrar Streptococcus en el 95% de la población. Con la erupción de los primeros dientes aparecen también nuevos hábitats para la colonización, como el esmalte dental y el surco gingival. Esto permite la aparición de nuevas bacterias como Fusobacterium, Actinomyces y Veillonella. En esta etapa los anticuerpos maternos ya han desaparecido del suero del niño y este empieza a crear sus propias defensas inmunológicas, constituidas por inmunoglobulinas séricas IgA secretadas en la saliva. Cuando se produce la erupción de dientes permanentes, el período de recambio se acompaña de fenómenos inflamatorios, que permite que se favorezca la colonización de bacterias potencialmente patógenas. La conformación de la flora oral definitiva se concreta desde la adolescencia, en donde los cambios hormonales permiten el crecimiento de la mayoría de Bacteroides. La prevalencia de Prevotella intermedia y Treponema denticola es especialmente elevada, pero la prevalencia de A. actinomycetemcomitans y Porphyromonas gingivalis, se mantienen bajas. La totalidad de factores habitacionales del ecosistema oral se establecen completamente en la edad adulta y comprende una amplia diversidad de microorganismos. (Liébana, 1997). 3.2 PULPA DENTAL La pulpa dental es el tejido blando localizado en el centro del diente; forma, soporta y está rodeado por dentina. En general, se considera a la pulpa como un tejido blando laxo especializado. La pulpa dental alberga un gran número de elementos titulares, incluido los nervios, el tejido vascular, fibras de tejido conectivo, sustancia fundamental, líquido intersticial, los odontoblastos, los fibroblastos y otros componentes celulares menores. (Walton, 1996). La función primaria de la pulpa es formativa, debido a que de ahí surgen los odontoblastos que forman la dentina. En el desarrollo temprano del diente, los odontoblastos también interactúan con las células del epitelio dental para formar esmalte. Después de la formación dental la pulpa proporciona varias funciones secundarias relacionadas con la sensibilidad, hidratación y defensa del diente. (Walton, 1996). 3.2.1 Funciones de la pulpa Durante toda su vida la pulpa lleva a cabo cinco funciones: • Inducción: La pulpa participa en la inducción y el desarrollo de odontoblastos y dentina, que cuando se forman inducen a la formación de esmalte. Estos procesos tienen actividades interdependientes, de tal manera que los ameloblastos influyen en la diferenciación de odontoblastos, y los odontoblastos y la dentina en formación de esmalte. Esta interacción epitelial mesenquimatosa es la esencia de la formación dental. (Walton, 1996). • Formación Los odontoblastos forman dentina; estas células altamente especializadas participan en la formación de dentina de tres maneras: a) al sintetizar y secretar matriz orgánica; 2) al transportar de manera inicial componentes inorgánicos a la matriz de nueva formación. 3) al crear un ambiente que permita la mineralización de la matriz. Durante el desarrollo temprano del diente, la dentogènesis primaria por lo general es un proceso rápido después de completar la maduración dental, la formación de dentina continúa de una forma mucho más lenta y en un patrón menos simétrico. (Walton, 1996). • Nutrición Por medio de los túbulos dentinarios, la pulpa suministra nutrientes que son esenciales para la formación de dentina e hidratación. (Walton, 1996). • Defensa Los odontoblastos forman dentina en respuesta a la lesión, en particular cuando el grosor original de la dentina está afectado por caries, desgaste, traumatismo o procedimiento de restauración. Los odontoblastos (o sus células de reemplazo) también tienen la capacidad de formar dentina en sitios donde se perdió la continuidad (exposición pulpar), por medio de la diferenciación de nuevos odontoblastos o células parecidas a los odontoblastos en el sitio de exposición. Sin embargo, la cantidad de dentina producida en respuesta a la lesión no es la misma que se produce de manera fisiológica ni proporciona el mismo grado de protección al tejido pulpar subyacente. (Walton, 1996). La pulpa también tiene la capacidad de producir una respuesta inflamatoria e inmunológica en un intento por neutralizar o eliminar la invasión de la dentina por microorganismos causantes de caries y sus productos. (Walton, 1996). • Sensibilidad A través del sistema nervioso la pulpa trasmite las sensaciones mediadas por el esmalte o dentina a los centros nerviosos más altos, estos estímulos se expresan a nivel clínico como dolor, aunque estudios fisiológicos y psicofisiológicos indican que la pulpa también siente temperatura y tacto. También trasmite sensaciones de dolor profundo causado por enfermedad, principalmente de tipo inflamatorio. (Walton, 1996) 3.2.2 Exposición de la pulpa La exposición pulpar directa, sea de origen traumático, como la fractura coronaria o iatrogénica causada por procedimientos operatorios, rompe la barrera física impuesta por las estructuras dentarias, poniendo la pulpa en contacto con el ambiente séptico de la cavidad oral (Estrela, 2005) Debido a la exposición de la pulpa a la flora oral, ésta y su dentina circundante Pueden dar asilo a las bacterias y a sus productos derivados. Dependiendo de la virulencia de las bacterias, la resistencia del huésped, la cantidad de flujo sanguíneo y el grado de drenaje, el tejido pulpar puede permanecer inflamado durante un largo periodo de tiempo o necrotizarse rápidamente. Tras la necrosis pulpar, todo el sistema de canal radicular se infecta con distintas especies de bacterias, las cuales pueden extenderse desde este sistema hacia el ligamento periodontal a través del foramen apical o de los canales laterales. La presencia de bacterias en el sistema del canal radicular suele dar a lugar al desarrollo de lesiones perirradiculares y, en ocasiones laterales. (Cohen, 1999) Si la pulpa queda expuesta, como ocurre por ejemplo en la caries esta queda expuesta a toda flora oral. Los estreptococos alfa-hemolíticos, los Enterococos spp. Y Lactobacilos spp. Son los que se encuentran con más frecuencia. A medida que aumenta el espesor de la pulpa necrótica, se establece un mayor número de especies anaeróbicas obligadas, entre las cuales se incluyen los cocos anaeróbicos Gram positivos y los bacilos Gram negativos, que son favorecidos por la baja concentración de oxigeno existente en las zonas necróticas de la pulpa (Cohen, 2002) 3.2.3 Filtraciones marginales de las restauraciones Se producen a través de la interface existente entre el material de restauración y el diente. Errores en la técnica operatoria, como adaptaciones inadecuada en los márgenes de la corona a la línea de terminación del tallado, errores en el manejo de los materiales de obturación, o la fatiga o alteraciones de los mismos que se produce con el paso del tiempo, pueden dar lugar a discrepancias significativas en el material de restauración y la estructura dentaria restaurada. (Liébana, 2002). 3.2.4 Contigüidad La infección de la pulpa dental puede acontecer a consecuencia de procesos infecciosos adyacentes, las alteraciones óseas como la osteítis y la osteomielitis y la presencia de quistes en áreas apicales en el propio diente conducen con frecuencia a la necrosis pulpar. (Liébana, 2002). Independientemente de las vías de entrada, una vez que han penetrado en el tejido pulpar, las bacterias colonizan, se multiplican y contaminan todo el sistema radicular. Dependiendo del nivel de la concentración de oxigeno y de la presencia o ausencia de los nutrientes esenciales en el sistema radicular, existen grupos específicos de bacterias que sobreviven y forman la flora de los canales radiculares infectados. (Adriaens, 1988) Las bacterias anaerobias producen ácidos grasos de cadena corta, como el ácido propiónico, butírico e isobutírico. Estos son factores de virulencia que afectan la quimiotaxis de los neutrófilos y la fagocitosis. Estas bacterias están en un estado dinámico influido por la interacción entre las bacterias y el hospedero. Aunque esta microbiota es menos compleja que la microbiota subgingival, se produce una serie de relaciones ecológicas interbacterianas. (Walton, 1996). 3.3 VÍAS DE ACCESO DE LOS MICROORGANISMOS A LA PULPA DENTAL El acceso de microorganismos a la estructura pulpar se puede dar básicamente por el acceso vía túbulos dentinarios y a través de vías periodontal y hematógenas. 3.3.1 Acceso mediante túbulos dentinarios Como consecuencia de la pérdida del esmalte o del cemento, los túbulos dentinales están expuestos a las bacterias presentes en la cavidad oral. Los túbulos dentinales se extienden desde la pulpa hasta las uniones esmalte dentina y cemento dentina. Debido al tamaño y el número de túbulos en la dentina, los microorganismos pueden penetrar, multiplicarse e invadir los numerosos túbulos expuestos. La lentitud de la invasión de la dentina viable por las bacterias pueden deberse a la presencia de factores de resistencia naturales en la dentina y tejido pulpar. (Liébana, 2002). Hoshino et.al (1992) utilizaron procedimientos anaeróbicos para comprobar la rápida invasión bacteriana de las pulpas dentales no expuestas, las cuales se cubrían con dentina clínicamente sana por debajo de las lesiones producidas por caries. Seis de cada nueve dientes sufrían invasión bacteriana, siendo los organismos predominantes los anaerobios obligados. La presencia de bacterias, de sus productos derivados y de otros irritantes en los túbulos dentinales suelen generar respuestas inflamatorias en el tejido pulpar. La inflamación de la pulpa también puede producirse cuando los túbulos dentinales transportan sustancias irritantes desde las caries incipientes a la pulpa o cuando los túbulos contienen y permiten el paso de los microorganismos existentes bajo los materiales dentales de restauración o cerca de las bolsas periodontales. (Cohen, 2006). La eliminación del cemento durante el tratamiento periodontal puede exponer numerosos túbulos dentinales a la flora oral, lo que en ocasiones permite que los microorganismos penetren el tejido pulpar. La producción de un barrillo dentinario durante la manipulación de la raíz, así como los iones de calcio y fósforo de la saliva, pueden retardar la invasión de los túbulos dentinales por los microorganismos orales. (Cohen, 2006). Sen et al. (1995) definen el barrillo dentinario como una capa de material amorfo, irregular y granular, compuesta por dentina, restos de tejido pulpar y procesos odontoblásticos y, en ocasiones, por bacterias. Cuando los canales radiculares se instrumentan durante el tratamiento endodóntico, siempre se forma esa capa en las paredes del canal. La mayoría de autores opinan que las bacterias productoras de ácido invaden los túbulos y desmineralizan las paredes. Las especies proteolíticas, que actúan sobre la matriz orgánica, la cual es denudada en los túbulos dentinales ensanchados, los ácidos, metabolitos y productos tóxicos se difunden más rápidamente que las bacterias, con lo cual los odontoblastos resultan afectados y, posiblemente, destruidos. Si las bacterias pueden ser eliminadas en su avance, es posible conseguir la curación. La caries dental es la causa más común de las lesiones pulpares, y muchas reacciones de la pulpa pueden ser infecciones prolongadas de los túbulos dentinales, que se originan desde el fondo de la cavidad y las paredes como consecuencia de la filtración de materiales de relleno. Si no se tratan, las bacterias acaban por afectar el tejido pulpar y dan lugar a la inflamación. El número de bacterias aumenta, los leucocitos neutrófilos polimorfonucleares se infiltran y se forma un absceso, provocando la muerte del tejido pulpar. (Cohen, 2006) A partir de la expansión de la lesión cariosa en sentido centrípeto o durante intervenciones odontológicas, los microorganismos pueden utilizar esta vía para llegar a la pulpa; es la vía más comúnmente utilizada, siendo la lesión de caries la fuente más frecuente de infección (Estrela, 2005) además Dahlen-Moller (1991) y Siqueira (1997) a partir de sus estudios llegaron a la conclusión que esa invasión solamente ocurre cuando el grosor de la dentina alcance como máximo 0.2 mm entre los limites cariosos y pulpar, y que es garantizada gradualmente por el proceso de división celular, favorecida, a veces, por el efecto mecánico de la masticación. 3.3.2 Acceso Vía Periodontal Muchas veces tenemos una injuria y/o compromiso pulpar en dientes con ausencia de caries (coronas íntegras) y con presencia de restauraciones. Las piezas dentarias comprometidas periodontalmente, suelen sufrir una invasión microbiana proveniente de microorganismos presentes en las bolsas periodontales y que tiene acceso a la pulpa mediante los conductos laterales, conductos accesorios y a través del delta apical, (De Lorenzo 2004., Liébana, 1997). Existen múltiples anastomosis entre vasos sanguíneos y linfáticos de la pulpa y del periodonto, lo que facilita el pasaje de los microorganismos. (Liébana 1997). Adriaens et al. (1988) examinaron la presencia de bacterias en la dentina de dientes con complicaciones periodontales y las comparó con la dentina de dientes sanos, encontrando más microorganismos en la dentina y pulpa de los dientes con compromiso periodontal. La eliminación del cemento durante un tratamiento periodontal puede exponer numerosos túmulos dentinarios a la flora oral, permitiendo que los microorganismos penetren hasta la pulpa. Estrela et al. (2005) y a partir de estudios realizados por Dahlen-Moller (1991) comentan que esa vía puede ser facilitada a los microorganismos, por ejemplo, durante la realización de una profilaxis dentaria, y a consecuencia de una luxación y, más significativamente, a partir de la migración de la inserción epitelial durante el establecimiento de una bolsa periodontal. En relación con esa vía, es pertinente considerar que la capacidad de locomoción de ciertos microorganismos periodontopatógenos, como Wolinella y Selenomonas, les garantiza las condiciones ecológicas para llegar hasta la pulpa y eventualmente colonizarlas. Existe una relación causa-efecto entre la infección del canal radicular, lesiones perirradiculares o laterales y la penetración de las bacterias en la dirección opuesta (hacia la pulpa). Teóricamente, los canales laterales limpios y el foramen apical adyacente a las bolsas periodontales deberían proporcionar el acceso a los microorganismos orales al sistema del canal radicular. Cuando se infecta la pulpa a través del foramen apical, un requisito previo parece ser siempre la existencia de un mal estado de la pulpa para que se produzca la infección. Grossman (1967) aplico Serratia marcescens sobre la encía labial de dientes de perros y monos, y los traumatizo con una pesa metálica. Al encontrar este microorganismo en el tejido pulpar, llego a la conclusión de que el ligamento periodontal proporcionaba una vía para el paso de estos organismos hacia el tejido pulpar. (Cohen, 1999) 3.3.3 Vía Hematógena La infección vía hematógena es rara. Esta vía de infección está dada por el fenómeno de la anacoresis, que se define como la atracción positiva de los microorganismos presentes en la circulación sanguínea hacia los tejidos inflamados o necróticos durante una bacteremia. Se considera así pues, que para que se dé una instalación de bacterias circulantes en el torrente sanguíneo, generalmente se requiere una inflamación o necrosis previa de la pulpa. La detección de microorganismos que no pertenecen a la microbiota normal de la cavidad oral, nos sugiere una infección por esta vía. Otra manera de que la pulpa se infecte es la presencia de un foco infeccioso adyacente. (Adriaens, 1988) Cuando la pulpa se infecta a través de cualquiera de los mecanismos explicados, el mal estado de ésta es prerrequisito para que se produzca dicha infección. Cuando tienen lugar infecciones retrógradas, generalmente están involucradas pocas especies bacterianas. (Liébana, 2002). En los casos de necrosis asépticas (que se puede producir por la supresión de la irrigación sanguínea) motivada por un traumatismo, el tejido necrótico se mantendrá libre de bacterias hasta su posterior infección, la cual se puede dar por cualquiera de las vías antes ya expuestas. (Adriaens, 1988) 3.3.4 Papel de los microorganismos en la patología pulpar Ha sido reconocido ampliamente que los microorganismos juegan un papel fundamental en el desarrollo y mantenimiento de las patologías pulpares y periapicales. Normalmente la pulpa dental es un tejido estéril y está principalmente involucrada en la producción de dentina y en la sensibilidad del diente. (Kettering J, 1999). Cualquier lesión de la pulpa puede desencadenar una respuesta inflamatoria de la misma. Si bien los irritantes pueden ser de naturaleza física, térmica o química, los microorganismos son considerados el principal agente etiológico. Las patologías pulpares y periapicales suelen ser un resultado directo o indirecto de la presencia de bacterias y otros microorganismos en el medio bucal. (Dahlen et al. 2000). Dado que los microorganismos desempeñan un papel primordial en la patogénesis de las lesiones pulpares y perirradiculares es preciso manejar los fundamentos de la microbiología endodóntica para entender el papel que desempeñan en estas afecciones, las vías de difusión de la infección pulpar y periapical, las respuestas de los tejidos ante estos agresores y los métodos utilizados para controlar y erradicar las infecciones del sistema de conductos radiculares. (Love et al. 2002). La pulpa y la dentina forman un complejo funcional el cual es protegido tanto por sustancias exógenas de la cavidad bucal como por estructuras dentarias (el esmalte y el cemento). Cuando el complejo dentino-pulpar es infectado, los tejidos reaccionan en contra de los microorganismos invasores a fin de erradicarlos. La capacidad de este complejo de realizar esta función no ha sido subestimada, ya que los tejidos están dotados con procesos inmunocompetentes. Sin embargo, en términos clínicos, si la infección no es erradicada a través de esos procesos naturales o procedimientos operatorios, los microorganismos invaden el complejo dentino-pulpar venciendo las defensas y causando la enfermedad pulpar, e infectando la cámara pulpar y el sistema de conductos radiculares. (Love et al. 2002). El sistema de conductos radiculares está en abierta comunicación con los tejidos periapicales (ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar) por las vías del foramen apical, conductos laterales y accesorios. Los metabolitos y productos tóxicos son producidos principalmente por las bacterias presentes dentro del sistema de conductos radiculares y se difunden a los tejidos periapicales desencadenando la respuesta inflamatoria (periodontitis apical), la cual se caracteriza por resorción del hueso alveolar. La enfermedad periapical inducida por microorganismos por lo general comienza como una inflamación de tipo crónico y se manifiesta histopatológicamente como un granuloma. (Love et al. 2002). La invasión de los túbulos dentinarios por microorganismos ocurre cuando la dentina está expuesta al medio bucal. Esto puede ocasionarse por lesiones de caries, procedimientos restauradores o periodontales, fisuras de esmalte o dentina, o traumatismo dental. (Peters et al. 1995). El avance de las bacterias del proceso carioso traerá como consecuencia la infección de la pulpa dental y del sistema de conductos radiculares y el consecuente desarrollo de lesión perirradicular. Sin embargo, las bacterias asociadas a la caries dental difieren de las asociadas a la infección pulpar. (Love et al. 2002) 3.4 EL MEDIO ENDODÓNTICO El medio endodóntico es un sistema complejo y dinámico. Complejo, púes tenemos el conducto radicular, con sus características particulares en cuanto a forma y a distribución (conductos amplios, atrésicos, curvos, rectos, bifurcados, conductos accesorios, conductos laterales, deltas apicales) conforman una red amplia de “microambientes” de difícil acceso y que favorecen (por contener tejido necrótico como fuente de nutrientes) el crecimiento de microorganismos. Dinámico, pues los microorganismos implicados en una lesión inicial de la pulpa no serán los mismos que se encuentren en una necrosis pulpar, en la que se forma un ecosistema radicalmente diferente. En este medio ambiente particular, que es el endodóntico, cobra importancia el concepto de sucesión microbiana (Liébana, 1997). La sucesión microbiana es el proceso mediante el cual se produce una variación o un cambio de microorganismos condicionado por alteraciones en el hábitat. Es lógico, por tanto, esperar un cambio en cuanto a la composición de la flora bacteriana, pues se produce una alteración radical del medio ambiente endodóntico. De pulpas recientemente infectadas, son aisladas mayores proporciones de bacterias Gram positivas, anaerobias facultativas y sacarolíticas, tales como Lactobacillus y Actinomyces spp. (Liébana, 1997). Con la evolución del proceso infeccioso, estas bacterias van consumiendo gradualmente el oxígeno presente en el medio y las condiciones en el interior del conducto se van paulatinamente alterando, favoreciendo el desarrollo de bacterias anaerobios estrictos, siendo la mayoría de éstas Gram negativas y proteolíticas. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996). La particularidad de estas bacterias, tales como: Prevotella, Porphyromonas y Fusobacterium, es su ubicación inicial en el periápice, región de la cual pueden obtener fácilmente el exudado rico en contenido proteico y en donde las condiciones de anaerobiosis son las más propicias. Con el desarrollo de la necrosis, éste exudado pasa a todo el canal, aportando el contenido proteico y permitiendo el predominio de estas bacterias a lo largo de todo el sistema endodóntico. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996). Toda infección endodóntica es de carácter polimicrobiana. (Brook et al. 1996). Los anaerobios no son encontrados en cultivos puros porque su naturaleza sinérgica requiere de nutrientes específicos para su crecimiento, los mismos que son aportados por otro tipo de microorganismos. (Sundqvist, 1992). 3.4.1 REQUERIMIENTOS PARA UN PATÓGENO ENDODONTICO Para que un microorganismo logre su objetivo deben darse ciertos requerimientos: • Los microorganismos suficientes • deben estar presentes en cantidades para iniciar y mantener una lesión periapical Poseer factores de patogenicidad, que puedan expresarse durante el proceso infeccioso • Deben localizarse espacialmente en el canal radicular para que sus factores de patogenicidad alcancen los tejidos periapicales • El canal radicular debe permitir la supervivencia y crecimiento de los microorganismos. • Las relaciones antagónicas entre los microorganismos no deben darse o presentarse en baja proporción. • El huésped debe defenderse, inhibiendo la diseminación de la infección, éste proceso puede resultar en daño del tejido periapical. (Siqueira et al. 2002). Los microorganismos que componen la microflora oral, coexisten en ecosistemas primarios que están regulados por una serie de factores conocidos como determinantes ecológicos que son de cinco tipos: (Liébana, 1997). • Fisicoquímicos • De adhesión, agregación y coagregación • Nutricionales • Protectores del huésped • Antagónicos interbacterianos 3.4.2 Fisicoquímicos: a) Humedad Las bacterias dependen de ella para el intercambio de nutrientes, para las reacciones metabólicas y para la eliminación de productos inhibidores de desecho. (Liébana, 1997). b) pH En la cavidad oral en condiciones normales oscila entre 6.7 y 7.5, pero constantemente esta sometido a variaciones que afectan el metabolismo bacteriano. (Liébana, 1997). c) Temperatura La temperatura oral está próxima a los 37º C pero tiende a variar transitoriamente por la ingesta de alimentos calientes o fríos por lo que se eliminan microorganismos de forma transitoria. (Liébana 1997). d) Potencial de óxido-reducción El hábitat de los gérmenes anaerobios tiene una baja tensión de oxígeno y un potencial de óxido reducción disminuido, resultado de la actividad metabólica de los microorganismos que consumen oxígeno mediante su respiración. (Liébana 1997). 3.4.3 Factores de Adhesión, Agregación y Coagregación a) Adhesión Es la interrelación que se da entre los microorganismos y el huésped, lo que permite la colonización de los tejidos. b) Agregación y Coagregación Unión entre bacterias de la misma o diferente especie respectivamente que les permite acumularse y formar colonias. (Liébana 1997). Entre las especies mas comunes en los canales radiculares necróticos, se encuentra, Fusobacterium nucleatum, el cual muestra una alta habilidad para coagregarse in vitro con la mayoría de las bacterias orales (Sundqvist G. 1992). 3.4.4 Nutricionales La microbiota oral obtiene sus nutrientes de tres fuentes distintas: de los tejidos o secreciones del huésped (fuentes endógenas), de otros microorganismos (fuentes interbacterianas) y de la dieta alimentaría (fuentes exógenas). (Liébana, 1997) 3.4.5 Protectores del huésped Son todos aquellos factores que limitan por parte del huésped el ingreso penetración y colonización bacteriana tales como: Integridad de mucosas y del tejido dental, masticación, deglución, tejidos linfoides, y la saliva por su acción mecánica, química e inmunitaria. (Liébana, 1997). 3.4.6 Antagónicos intermicrobianos A nivel microbiano se dan relaciones entre especies bacterianas que determinan la supervivencia de unas y la eliminación de otras lo cual llega a establecer un tipo de microflora determinado. (Liébana, 1997). 3.4.7 Modelos de relación microbiana Un ecosistema oral, constituye una comunidad microbiana que habita en la cavidad oral, y como comunidad existen relaciones entre las diferentes especies allí presentes. Las relaciones que se dan entre las bacterias, tienden a dividirse en relaciones positivas, neutras y negativas. (Liébana, 1997). a) Relaciones positivas Son relaciones en que dos microorganismos obtienen ventaja de la asociación. Entre las relaciones positivas destaca el mutualismo o simbiosis. (Liébana, 1997). b) Relaciones neutras En esta relación, ninguna de las especies se ve afectada, se puede obtener ventaja de una de ellas pero sin perjudicar a la otra. Entre ellas el comensalismo, en la que se destaca la presencia de anfibiontes, los cuales son microorganismos que mantienen una relación comensal con otro, pero que en determinadas condiciones , como por ejemplo una disminución en la capacidad de defensa del hospedador, pueden llegar a establecer una relación de parasitismo.(Liébana,1997). c) Relaciones negativas Se dan cuando uno de los microorganismos se ve perjudicado por la relación con otro microorganismo. La principal relación negativa es la antibiosis o antagonismo que se da cuando un microorganismo impide el crecimiento de otro, obteniéndose de esta forma una ventaja ecológica ya que se disminuye la competencia. Esto se da por la producción de bacteriocinas que son sustancias inhibitorias del crecimiento de otras bacterias, entre las que se pueden citar las mutacinas que son bacteriocinas producidas por algunas cepas de Streptococcus mutans orales. (Liébana, 1997). La depredación es otro tipo de relación negativa en que uno de los microorganismos mata al otro y se alimenta de él. Otra relación negativa es el parasitismo en que una de las especies vive en o sobre la otra obteniendo beneficio del hospedador a costa del perjuicio de éste. Un ejemplo de relación negativa es la que se da cuando determinadas especies de estreptococos orales que producen peróxido de hidrógeno, ejercen una acción tóxica sobre otras bacterias que carecen de sistemas detoxicantes. (Liébana,1997). Los lactobacilos y los estreptococos son importantes productores de bacteriocinas, que juegan un papel muy importante en la ecología de la microflora de la mucosa oral. Esta producción de bacteriocinas puede inhibir el acceso de bacterias exógenas a la cavidad oral y al tracto respiratorio. (Sundqvist G. 1992). De esta forma se ha observado que, las interacciones microbianas tanto positivas como negativas, pueden regular significativamente la presencia de diferentes especies microbianas en un mismo nicho (Sundqvist G. 1992). Se han reportado varias asociaciones bacterianas en conductos radiculares de dientes necróticos, entre ellos: Fusobacterium nucleatum con Peptostreptococcus micros, Selenomonas sputigena, Campylobacter rectus y Porphyromonas endodontalis. Prevotella intermedia es afín a Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus anaerobius y Eubacterium spp; mientras que se ha observado que Porphyromonas endodontalis inhibe el crecimiento de Prevotella intermedia. (Sundqvist G. 1992). Algunas combinaciones de bacterias resultan más potentes que otras, por ejemplo, la unión entre Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium y Peptostreptococcus, incrementan el grado de destrucción periapical. Experimentalmente la inducción de infecciones radiculares en monos utilizando únicamente Enterococcus faecalis, indujo una modesta destrucción periapical en comparación con la combinación entre Enterococcu faecalis, Streptococcus milleri y ctinomyces bovis, que demostró ser mas agresiva. (Liébana, 1997). 3.4.8 Actividad Enzimática Bacteriana. Hoy en día se asume que la microbiota endodóntica está representada, principalmente, por microorganismos Gram negativos, los cuales viven, se multiplican y eventualmente mueren en el conducto radicular infectado, liberando en este proceso endotoxinas. La actividad endotóxica está fuertemente relacionada con la presencia y el número de bacterias Gram negativas en el canal radicular (Pajari et al. 1993) éstas en un determinado momento, pueden superar el foramen apical e iniciar una lesión a ese nivel. (Dalby, 2000). Las endotoxinas contenidas en la pared celular de las bacterias Gram negativas son las sustancias responsables de los mecanismos inflamatorios que se desencadenan a nivel pulpar. Son liberadas al medio después de la desintegración de la bacteria, lo que produce diversos efectos biológicos, como fiebre o estimulación de la actividad linfocítica. (Dalby, 2000). Las endotoxinas están presentes en altas concentraciones en conductos radiculares de dientes con necrosis pulpar sintomática y son antígenos no específicos que pueden desencadenar reacciones inflamatorias específicas e inespecíficas, donde intervendrán células fagocitarias de defensa (linfocitos, macrófagos y neutrófilos), las cuales liberarán diferentes sustancias químicas que actuarán como potenciadores, mediadores o inhibidores de la patología pulpar y periapical. (Jawetz et al.1999). Algunos microorganismos anaerobios producen enzimas extracelulares como colagenasas y proteasas que al parecer estimulan la invasión bacteriana de los tejidos. (Dalby, 2000). 3.5 MICROORGANISMOS MÁS FRECUENTES ASOCIADOS A LAS LESIONES PULPARES. 3.5.1 Fusobacterium nucleatum: Son bacterias pleomorfas que aparecen con formas muy variables: en huso, globulosas, redondeadas, finas, etc. Son moderadamente sacarolíticas, aunque sintetizan material de reserva intracelular a expensas de polímeros de glucosa. Sus fuentes nutricionales y energéticas mas importantes provienen del catabolismo de péptidos y aminoácidos, elaborando como producto metabólico final especialmente acido butírico. A diferencia de otros bacilos Gram negativos anaerobios estrictos son resistentes al verde brillante. Puede aislarse como hábitat primario en la cavidad oral y además aislarse del intestino, vías respiratorias aunque se encuentra por lo general en el surco gingival. (ANEXO 1) (Liébana 2002). Aun así, in vivo, los factores de virulencia de F. nucleatum no están claramente definidos, su poder patógeno se relaciona con la endotoxina, leucotoxina, compuestos solubles que inhiben la quimiotaxis de los neutrófilos, fosfatasas, etc. Si parece importante su capacidad de coagregarse con otras bacterias favoreciendo los procesos de colonización y formación de placas. También se sabe que los ácidos grasos de cadena corta (especialmente el ácido butírico) y el amoniaco obtenido a partir de aminoácidos (p. ej. cisteína o metionina) pueden comportarse como tóxicos tisulares, igualmente, producen dos compuestos malolientes que están implicados en la halitosis (SH, metilmercaptano). (Liébana, 2002) 3.5.2 Porphyromonas gingivalis: Comprende bacterias asacarolíticas, es decir que no metabolizan los hidratos de carbono ni por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (glucólisis) ni por la ruta pentosa de fosfatos, debido a que carecen de enzimas como la glucosa6-fosfato deshidrogenasa y gluconato-6-fosfato-deshidrogenasa. Emplean compuestos nitrogenados como fuentes energéticas, no se desarrollan en presencia de bilis al 20%. Este microorganismo se encuentra en el surco gingival, de forma especial cuando hay lesiones periodontales avanzadas; mas raramente puede detectarse, quizás a modo de reservorio, en el dorso de la lengua, amígdalas y saliva. No se le considera como parte integrante de la microbiota oral normal sino como un patógeno exógeno ausente en individuos sanos. Se le relaciona con multitud de procesos patológicos: gingivitis, pulpitis, abscesos periodontales y periapicales. Para su aislamiento, los medios de cultivo deben incluir vitamina K y de forma especial, por su dependencia del hierro, hemina o sangre, habitualmente a de carnero lacada, esto es, congelada y descongelada para que, al romperse la membrana de los hematíes, se liberen mejor los nutrientes. Para hacer los medios selectivos se añaden antibióticos no activos sobre P. gingivalis; es el caso de kanamicina, tobramicina, acido nalidíxico, colistina o bacitracina (medio preconizado por Hunt). Las colonias, claramente diferenciadas, aparecen tras una incubación de al menos 48 horas a 36 +/- 1 °C; muestran la típica pigmentación marrón oscura o negra y no fluorescente bajo una luz ultravioleta. Las características in vitro para su identificación, son aparte de las del género, la producción de indol a partir del triptófano y el hecho de poseer una enzima proteolítica semejante a la tripsina que hidroliza un sustrato incoloro, la Benzoil.D-L- arginina-B –naftilamida (BANA) dando origen a un compuesto coloreado (B-naftilamida). (Liébana, 2002). Sus factores de virulencia: Capsula: es de naturaleza polisacárida que aparte de permitir la subdivisión de la especie en seis serotipos, tiene una acción antifagocitaria por su efecto antiopsónico. Membrana externa: tiene gran interés fisiopatológico por poseer proteínas que se comportan como adhesinas que participan en fenómenos de adhesión y coagregacion bacteriana y, por tanto, en la colonización de células epiteliales y fibroblastos y en la formación y mantenimiento de la placa subgingival. Con respecto a esto ultimo cabe destacar los procesos coagregativos de P. gingivalis con Fusobacterium nucleatum y Actinomyces naeslundii. (Liébana, 2002). La endotoxina asociada al lipopolisacárido (LPS) cuya actividad endotóxica, con respecto a otras bacterias Gram negativas, no parece muy importante. Formar vesículas superficiales que se liberan con facilidad del resto del soma celular; dichas vesículas atraviesan barreras impermeables a la célula completa y transportan, de esta forma, factores de virulencia que serian trasladados a distancia. (Liébana, 2002). Fimbrias: como las proteínas de la membrana externa y con sus mismas consecuencias, se comportan como adhesinas e intervienen en fenómenos de coagregacion y adhesión a superficies epiteliales y dentales, en este caso con la mediación de la saliva. (Liébana, 2002). Proteasas: P. gingivalis produce una amplia gama de enzimas proteolíticas; algunas se asocian a la membrana externa y otras se liberan al exterior o son transportadas a distancia por las vesículas superficiales. El efecto destructivo de estas enzimas se extiende también a elementos del sistema inmunitario, permitiendo la evasión bacteriana de la respuesta del hospedador. Se comprende que estas proteasas, al comportarse como agresinas e impedinas, desempeñan un papel importante en el surco gingival para producir periodontitis. (Liébana, 2002). Otros compuestos proteicos: es el caso de la superóxido dismutasa, que permite a P. gingivalis resistir la acción oxidante de los radicales superoxido generados en el interior de los leucocitos polimorfonucleares. Otras exoenzimas que también contribuyen al daño tisular como hialuronidasa, fosfatasa alcalina; y una exotoxina del tipo epiteliotoxina de gran importancia en el proceso penetrante de los tejidos. (Liébana, 2002). Metabolitos tóxicos tisulares: son ácidos grasos de cadena corta, amoniaco, compuestos azufrados volátiles, metilmercaptano, que aumenta la permeabilidad de la mucosa oral. (Liébana, 2002). Moléculas antibacterianas: muchos de los metabolitos citados ejercen un efecto competitivo con otras bacterias; a ellos hay que añadir la producción de bacteriocinas por parte de algunas cepas de P. gingivalis. Todas estas moléculas están implicadas en las amplias interrelaciones que las bacterias establecen en la cavidad oral. (ANEXO 2) (Liébana, 2002). 3.5.3 Prevotella spp. Comprende bacterias moderadamente sacarolíticas por la vía Embdem Meyerhof Parnas pero no metabolizan los glúcidos por la vía de las pentosas fosfato ya que carecen de las enzimas glucosa-6 –fosfato deshidrogenasa y gluconato-6 –fosfato- deshidrogenasa. No se desarrolla en presencia de bilis al 20%. Son resistentes a la vancomicina. Especies pigmentadas: P. melaninogenica, P. intermedia, P. nigrescens, P. corporis, P. loescheii, P. pallens, P. denticola (algunas de cuyas cepas no son pigmentadas). Se les relaciona con mayor o menor grado con multitud de procesos, como infecciones pulpares, absceso periapical, alveolitis, etc. En la mayoría de los casos su patogenicidad no es muy bien conocida, de forma que participarían en estos procesos unidas a otras bacterias de carácter sinérgico. Con respecto a las enfermedades periodontales la mas implicada son P. intermedia y P. nigrescens cuyas colonias al contrario de P. gingivalis, emiten fluorescencia; la primera especie esta presente en el surco gingival en una de cada dos personas con buena salud periodontal y su prevalencia pasa a tres de cada cuatro sujetos con problemas de gingivitis o periodontitis; por ello resulta difícil atribuirle un papel claro como periodontopatogena; con respecto a P. nigrescens se aísla aun con mayor frecuencia en individuos sanos. P. intermedia, P. melaninogenica, P. loescheii se han descrito fimbrias como adhesinas y residuos proteicos y glucoproteicos superficiales, pueden actuar como receptores de otras adhesinas. También se ha comprobado la capacidad para degradar inmunoglobulinas, su acción toxica sobre los fibroblastos y su actividad fibronolítica. La boca es un reservorio habitual para estas bacterias. Especies no pigmentadas (Koneman. 1999). Son P. buccae, P. buccalis, P. oris, P. oulorum, P. veroralis y P. zoogleoformas, P tanerae y P. enoeca. La mayoría de ellas tienen como hábitat primario el surco gingival, algunas especies son más abundantes en las enfermedades periodontales aunque su grado patógeno real se desconoce. (ANEXO 3) (Liébana, 2002). 3.5.4 Peptostreptococcus spp: Son cocos de cadenas cortas o emparejados Gram positivos, no formadores de esporas, anaerobios su factor de virulencia está en la enzima de la colagenasa y betalactamasa. Se aíslan frecuentemente en procesos infecciosos supurados que tienen carácter mixto y polimicrobiano: en el cerebro y los senos, pleuropulmonares, peritoneales, etc. También se detectan con el mismo carácter con lesiones de caries de dentina, formas avanzadas de periodontitis, abscesos de origen dental, conductos radiculares infectados, etc. Ante una identificación preliminar de cocos Gram positivos anaerobios, la sensibilidad mediante la técnica de disco-placa a polianetol sulfonato sódico (SPS) indica la identificación de Peptostreptococcus anaerobius y así la fácil diferenciación de este último por su morfología microscópica (tamaño) y porque se identifica muy bien con los micrométodos que detectan enzimas preformados, un cromatograma abigarrado, incluyendo hasta ácido isocaproico en los productos finales del metabolismo. Únicamente en el caso de P. anaerobius la cromatografía separa un género y una especie concreta, en el resto, y según los últimos cambios taxonómicos, los productos finales del metabolismo son los mismos para los distintos géneros. Aquí se da la paradoja de que con los caracteres fenotípicos usualmente estudiados, hay que llegar al diagnóstico de especie para poder llegar al género adecuado. Cuando esto no sea posible, quizás sea bueno conocer en que grupo se está. (ANEXO 4) (Alcalá et al, 2004). 3.5.5 Streptococcus mutans Se aísla en el 70.90% de la población no desdentada y resistente a la caries (portadores). En individuos con caries activa o especialmente predispuestos su cantidad aumenta significativamente. Se considera el microorganismo cariogeno por excelencia. Por su especial capacidad de colonizar superficies duras se aísla en la cavidad oral, sobre todo a partir de placa supragingivales, radiculares y saliva, en cuyo caso su origen es secundario a la localización en las placas. Igualmente su papel es importante en las endocarditis subagudas, representando entre el 7.14% de todas las originadas por los estreptococos. (ANEXO 5) (Liébana, 2002). Sus colonias en agar sangre son α y γ hemolíticas y excepcionalmente βhemolíticas. En su estructura antigénica hay que destacar que poseen los polisacáridos parietales c, e y f, y, proteínas asociadas a la mureina conocidas como antígenos I y II estas proteínas u otras similares participan en procesos adhesivos: a) como adhesinas interactuando con receptores de la película adquirida, tales como proteínas ricas en prolina. b) como glucosiltransferasas y receptoras de glucano en fenómenos agregativos y coagregativos entre bacterias que colonizan los dientes. (Liébana, 2002). Los factores de virulencia a destacar son: a) Síntesis de polisacáridos intracelulares. b) Síntesis de polisacáridos extracelulares de tipo glucano insolubles y solubles y fructanos c) Movilización de polisacáridos intracelulares por glucógeno fosforilasa y extracelulares solubles por dextranasas y fructanasas. d) Poder acidogeno, acidofilo y acidurico, inicio de crecimiento a pH 5 y corto efecto post-pH. e) Importante capacidad adhesiva por las proteínas parietales, que facilitan su adhesión en superficies duras en ausencia de glucanos, agregativa y coagregativa, a través de glucanos y proteínas receptoras de glucanos. f) Producción de bacteriocinas con actividad sobre otras bacterias Gram positivas que podrían tener una significación ecológica, aunque no esta demostrada in vivo su importancia como factor selectivo de la microbiota. (Liébana, 2002). 3.5.6 Enterococcus spp Pertenecen a este genero numerosas especies, la mas frecuente en patología humana es Enterococcus faecalis, seguida de Enterococcus faecium. Se asocian en parejas y cadenas cortas; en cultivo son muy parecidas a los estreptococos. Pertenecen al serogrupo D pero fueron separadas de los estreptococos por carácter quimiogénico. Sus factores de virulencia no son muy bien conocidos. Su hábitat es el intestino. Producen una gran variedad de procesos infecciones extraorales que plantean un problema particular de tratamiento antibiótico. Por su metabolismo anaerobio son intrínsecamente resistentes a los aminoglucósidos que, sin embargo pueden penetrar si se unen a otros compuestos que inhiben la síntesis del peptidoglucano al ingresar en el interior de las bacterias, pero aun así no serán útiles si las cepas muestran altos niveles de resistencia por la producción de enzimas inactivantes; por otra parte, las cefalosporinas no son eficaces por la baja afinidad de sus PBP a las misma. (Koneman, 1999). Enterococcus faecalis: Coco anaerobio facultativo Gram positivo que habita el tracto gastrointestinal y genitourinario femenino. La mayoría de sus cepas son homofermentativas, no producen gas, no poseen enzimas citocrómicas y se obtiene ácido láctico por fermentación de la glucosa. En su pared celular poseen antígenos del grupo D y un acido lipoteicoico intracelular asociado a la membrana citoplasmática. Puede crecer en temperaturas entre 10o y 450 C. Es un microorganismo oportunista, causa infecciones nosocomiales en diferentes grados de compromiso. Crece con facilidad en medios difíciles con poca cantidad de oxigeno y nutrientes y forma biopeliculas entre si o con microorganismos de otras especies. Otro factor que favorece su crecimiento, es el potencial de oxido reducción elevado. (ANEXO 6) (Liébana, 2002). Se asocia fuertemente a casos de fracaso de tratamientos de conductos, aunque eventualmente, se ha visto en presencia de lesiones primarias de origen pulpar. Enterococcus faecalis se puede encontrar asociado a Streptococcus, Lactobacillus y otras bacterias facultativas así como bacterias anaerobias lo que puede crear una flora mixta aun más virulenta. (Liebana 2002). 3.5.7 Candida albicans: Las especies Candida crecen como células de levaduras típicas de 4-6 µm redondas u ovaladas con gemación en la mayoría de las condiciones y en casi todas las temperaturas, crecen en condiciones de anaerobiosis en medios de cultivo a pH con rango entre 2,5 y 7,5 y la temperatura oscila entre 20o y 38o, el crecimiento de colonias se puede detectar entre 48 y 72 horas después de la siembra. (Liébana, 2002). Los microorganismos del genero Candida son oportunistas se encuentran como comensal en la cavidad bucal, intestino, vagina, secreción bronquial y piel del hombre. macroscópicamente: Las color colonias crema de esta cerosa, especie húmedas, se observan redondas. Y microscópicamente son blastosporas redondas u ovales. (Liébana, 2002). Candida albicans a lo largo de la historia ha sido causante de diferentes enfermedades en humanos, las cuales generalmente se produce por tres mecanismos: por invasión de cepas colonizantes del tracto gastrointestinal o la piel; como consecuencia de transmisión vertical en el neonato o en raras ocasiones por trasmisión horizontal además esta especie puede llegar a producir infección cuando el hospedero tiene algún factor predisponente y de esta manera ocasionar un grupo de manifestaciones clínicas que pueden presentarse en la zona cutánea, mucocutánea o de formas sistemáticas (Castrillon. et al. 2005). C. albicans tiene varios atributos de virulencia para colonizar el hospedero y ocasionar daños de forma directa al activar, resistir o desviar los mecanismos de defensa del mismo. Estos atributos que contribuyen a la patogénesis de C. albicans incluye la morfogénesis (transición entre las células levaduras unicelulares y las formas de crecimiento filamentosas), las enzimas secretadas aspartil proteasas (SAP) y fosfolipasas y las biomoléculas de reconocimiento del hospedero (adhesinas), que le permiten iniciar el proceso de formación de biopeliculas. Así mismo, el cambio de fenotipo se acompaña por alteraciones en la expresión de antígenos, morfología colonial afinidades de C. albicans a los tejidos. (Castrillon et al 2005) Candida albicans es un microorganismo muy versátil, por su capacidad para sobrevivir como comensal en varios sitios anatómicamente distintos como la piel, intestino, cavidad vaginal y oral. En el esputo expectorado y en la vejiga urinaria de los pacientes con catéteres a permanencia; ya que en promedio del 25 al 30% de los individuos son portadores de C. albicans en estas cavidades. Además de el reservorio endógeno (cavidades naturales del hombre), también se puede adquirir de fuentes exógenas y se aíslan de superficies ambientales. (ANEXO 7) (Bonardello et al. 1999). 3.5.8 Filifactor alocis: Es un bacilo, no esporulado, anaeróbico obligado, Gram negativo, las células miden de 0.4-0.7 µm de ancho por 1.5-7.0 µm de largo. Tienen forma cónica redondeada. Algunas cepas han demostrado algún tipo de movilidad esto sin observar flagelo alguno. Las colonias en agar sangre son pequeñas puntiformes con 1.0 mm de diámetro. Son circulares, convexos, lisas, translucidas a transparentes, brillantes y no hemolíticos. (Siqueira-Rocas, 2003). Los principales productos metabólicos en caldo de glucosa son pequeños a moderadas cantidades de butirato y acetato. Con abundante H2 que puede ser detectado como halos alrededor, estos es, cuando hay suficiente crecimiento. Las cepas de estas especies muestran un mínimo crecimiento y no reaccionan a pruebas bioquímicas y es muy utilizado para la diferenciación de otras especies de Fusobacterium a partir de determinar las proteínas celular solubles por electroforesis y por el contenido de G+C de ADN. El principal hábitat de F. alocis aparecen en el surco gingival y estudios ha demostrado que está envuelta en la patogénesis de la periodontitis. Debido al escaso crecimiento que tiene este microorganismo y los métodos de identificación bioquímica no son suficientes y lo hace más difícil detectar y relacionar con enfermedades endodónticas. Su detección se hace más eficiente con métodos moleculares como el PCR. (Tabla 1) (Siqueira-Rocas, 2003). Principales Géneros y Especies de la Microbiota Oral. Tabla 1. Principales géneros y especies de microbiota oral. (Aguilar 2004) 3.6 MICROORGANISMOS POCO FRECUENTES EN LESIONES PULPARES Se han realizado estudios que revelan la presencia de otros microorganismos poco comunes entre ellos se encuentra Coxiella burnetii y según Abuodharam et al (2002), además de su detección pudo corroborar la teoría de la colonización de la pulpa dental a partir de la invasión del torrente sanguíneo en ausencia de inflamación (anacoresis) Bajo este reporte se pudo sustentar con resultados que por primera vez la colonización por C. burnetii en la pulpa dental por vía sanguínea es un hecho. Su trabajo fue desarrollado en inicio con la inoculación intraperitoneal en conejillos de indias y posteriormente con la técnica de amplificación PCR y secuenciación directa, C. burnetii fue recuperada hasta en un 50 % de los animales. Dialister pneumosintes es un bacilo no fermentativo, anaeróbico, Gram negativo, que crece en agar sangre formando colonias pequeñas, circulares, transparentes, lisas, y brillantes. Se ha recuperado de la profundidad de la cavidad periodontal y se ha relacionado la enfermedad periodontal con el microorganismo, Doan, et al (2000), hace referencia a la identificación por la técnica de PCR a partir de la muestra periodontal. Cabe destacar que previamente al realizar pruebas bioquímicas no hay consistencia para la identificación de Dialister Pneumosintes además que no es frecuente encontrar tal microorganismo en la placa subgingival ya que es muy poco lo reportado. Por esto Doan y colaboradores dieron a conocer una identificación definitiva de D. pneumosintes como un organismo que se encuentra en muestras de placa subgingival, así como desarrollar un método de detección PCR para D. pneumonsintes y comparar la eficacia entre los métodos de detección entre medios de cultivo y PCR. Otro tipo de microorganismo rara vez encontrado en lesiones pulpares es Yersinia pestis en un plano histórico Drancourt et al (1998) identificaron ADN de Yersinia pestis en pulpa dental de hace 400 años lo que evidencia su presencia y esto gracias a la durabilidad de la pulpa dental así como también mantenerse una esterilidad natural en ella. Cabe mencionar que fueron recolectadas las muestras de dos esqueletos del siglo 16 que se suponen que murieron por la “plaga dental” de la época. El uso de PCR para la extracción de ADN antiguo e incorporación de primers específicos para el gen humano beta-globina demostró la ausencia de inhibidores. La incorporación de primers específicos para Y. pestis rpoB (el gen codificante de la subunidad-beta para la ARN polimerasa) y asociado a la virulencia (gen codificante para la activación del plasminógeno) con esto se logro obtener una indistinguible secuencia de nucleótidos para su identificación de la bacteria. También dedujeron los autores que a partir de la pulpa dental promete ser un blanco atractivo para determinar la etiología de enfermedades septicémicas ancestrales. (Drancourt et al.1998). Otros microorganismos Mogibacterium ssp, son: Bifidobacterium Lachospiraceae spp, ssp, Lactobacillus spp, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Megasphaera spp, Leptotricia buccalis, Selemonas sputigena, Serratia mercescens, Gemella spp, Tannerella forsythensis. (ANEXO 8) 3.7 Medios de cultivo Son preparados que intentan reproducir artificialmente las condiciones del hábitat natural de los agentes bacterianos. Sus componentes deben cubrir todas las necesidades nutricionales de las bacterias que se van a estudiar y deben incorporarse en una mezcla justa y equilibrada. (Liébana, 2002) Clasificación de los medios de cultivo se hace en función de su contenido, de su estado y de su utilidad, según Liébana (2002) 1. Según su contenido. a.) Definidos o sintéticos: Se conoce perfectamente la composición química, ya que se elaboran añadiendo productos puros e individualizados. b.) No sintéticos o empíricos: No se conoce la composición exacta; se prepara con extractos de carne, de levadura, peptonas etc. su empleo se basa en la experiencia y son los medios más utilizados (ej., agar cerebro corazón o agar Mueller Hilton) 2. Según su estado. a.) Líquidos: Son llamados caldos (ej., caldo tioglicolato, caldo cerebro corazón) los constituyentes están disueltos en el agua sin sustancias solidificantes. Se utilizan sobre todo para inocular muestras o cuando se cultiva un único microorganismo, para obtener una masa microbiana u observar las características de crecimiento. b.) Semisólidos: Contienen agar en escasa proporción (menos del 1%) se utilizan como medios para analizar alguna característica especial de las bacteria, como por ejemplo la movilidad o la capacidad oxidativa fermentativa. También se emplean como medios de transporte de muestras clínicas (ej., medio Stuart) c.) Sólidos: Se obtienen agregando agar al medio liquido en una cantidad suficiente para que solidifiquen, según su utilización, se distribuyen en tubos o platos de petri, se utilizan principalmente para pruebas de identificación bioquímica (ej., bilis esculina agar) 3. Según su utilización: a.) Básicos o comunes: Son aptos para las bacterias no exigentes y contienen los nutrientes mínimos para el desarrollo. b.) Enriquecidos: Son medios básicos que se suplementan con sustancias muy nutritivas para bacterias exigentes, como la sangre, el suero, etc. c.) Selectivos: Estos medios permiten el crecimiento de algunas bacterias e inhiben el de otras se utilizan en casos que interese recuperar ciertos tipos de microorganismos y se desee impedir el crecimiento de otros. d.) Diferenciales: Estos medios llevan incorporados determinadas sustancias que pondrán de manifiesto visualmente la presencia de alguna característica bioquímica de la bacteria. Cada microorganismo requiere una variedad de condiciones especiales para su crecimiento. Para conseguir su desarrollo, es fundamental otorgarle tanto condiciones físico-químicas óptimas como un medio de cultivo que contenga los nutrientes necesarios para su multiplicación. (ANEXO 9) (Liébana 2002). 3.7.1 Análisis Microbiológico Reconociendo la evidencia de la participación de los microorganismos en el establecimiento y manutención de los procesos en el conducto radicular y en la región periapical, el análisis microbiológico como recurso de la determinación del efecto terapéutico no se constituye en técnica de rutina en las clínicas de endodoncia y en instituciones académicas (Siqueira, 1997). Los procedimientos microbiológicos, relativos a la recolección, transporte, siembra e incubación, con el objeto de preservar y microorganismos anaerobios presenta poca practicidad, propagar los son costosos y consumidores de tiempo; las técnicas genéticas presentan restricciones a nivel de la practica y evaluaciones clínicas; el resultado negativo puede expresar falta de sensibilidad de la técnica; el uso de eficientes sustancias antimicrobianas durante el tratamiento químico-mecánico y en la medicación intracanal optimizan el control microbiano. Aun con aquellas limitaciones, actualmente el análisis microbiológico con base en el cultivo de microorganismos oriundos del conducto radicular parece constituirse en recursos de laboratorio valioso en el contexto de la técnica endodóntica. (Estrela 2005). En la investigación, su importancia es significativa una vez que permite el estudio de la etiopatogenia del proceso; soporta la evaluación de la efectividad antimicrobiana de sustancias usadas en el tratamiento; y por consiguiente, contribuye para el perfeccionamiento de la técnica endodóntica. Finalmente el análisis microbiológico de los conductos radiculares es útil en la evaluación y acompañamiento de los casos recidivantes, porque permite, por ejemplo, el aislamiento de microorganismos de los géneros Enterococcus, Actinomyces y Propionibacterium (originalmente Arachnia) (Molander et al. 1998), facilitando su identificación y posteriormente permitiendo la determinación de su perfil de sensibilidad a antibióticos y/o quimioterápicos (Molander et al. 1998). El protocolo para el ensayo microbiológico de naturaleza cultivable, concluido el tratamiento químico-mecánico, consisten lo siguiente: a. Adición de la solución de muestreo, haciendo movimientos de introducción y retirada con la ayuda de una lima. b. Repetición del procedimiento c. Retirada del material adherido a las paredes del conducto con lima endodóntica y, en la secuencia, su corte en el segmento activo, con subsiguiente inmersión del mismo en medio de transporte d. Homogenización de la mezcla y transferencia del segmento de la lima para el medio de cultivo correspondiente y/o repique de la suspensión microbiana e. Incubación f. Lectura e interpretación de los resultados. Es importante destacar que lo referido anteriormente debe ser realizado integralmente en condiciones asépticas, evitando que microorganismos contaminantes interfieran en el resultado. De la misma manera, el uso de sustancias neutralizantes del agente antimicrobiano utilizado durante el tratamiento provoque resultados falsos negativos. (Estrela 2005). Los medios de transporte tienen por finalidad la preservación de los microorganismos, eventualmente generados en el material clínico, desde su recolección hasta el adecuado procesamiento en laboratorio. Por su composición y características esos medios tienen acción stática, impidiendo, de ese modo, que ocurran alteraciones en la proporción original de los microorganismos, así como condiciones capaces de proteger la microbiota endodóntica de los efectos tóxicos del oxigeno molecular; el uso de esos medios actualmente constituyen un recurso universal a medida que los microorganismos conservan su viabilidad en los mismos. Entre los medios de transporte comúnmente recomendados, se encuentran: Medio de Transporte Reducido (RTF), Medio III Microbiostatico de Viabilidad y Mantenimiento (VMGA III) y el Caldo Tioglicolato (THM). (Siqueira, 1997). La etapa correspondiente al cultivo exige la utilización de medios de cultivos líquidos, semisólidos y/o sólidos, dependiendo del propósito del estudio. Esos medios deben ser ricos en sustancias nutritivas, de modo que soporten el crecimiento y multiplicación de la gama variada de microorganismos endodónticos, abarcando aquellos con gran capacidad de síntesis y también aquellos exigentes de sustancias nutritivas más complejas. Las sustancias enriquecedoras son hemina y vitamina K, complementariamente, en medio sólido, debe ser adicionada sangre desfibrinada de carnero. (Siqueira, 1997). Entre los medios líquidos, se destacan el Caldo Tripticasa Soya (TSB) y Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI). En el caso de utilizarse medios semisólidos, la selección recae en el Caldo Tioglicolato (THM), ya que presenta excelente desempeño como medio de transporte y como medio de cultivo para los microorganismos oriundos de conductos radiculares infectados (Carlsson et al, 1980). El medio sólido mas utilizado parece ser el Agar Brucella que, enriquecido con algunas sustancias, soporta el aislamiento de los principales microorganismos de las lesiones pulpares. (Estrela, 2005). La incubación del material debe priorizar los microorganismos anaerobios, considerando que la presencia de microorganismos aerobios estrictos es fugaz o inexistente. La incubación debe ser realizada en anaerobiosis, alcanzada por medio físico (vacuo e insuflación con una mezcla con el 80% de N2 el 10% H2 y el 10% de CO2) o medio químico (sistema Gazpak o Anaerobac). El tiempo de incubación varía entre 3, 6 y 14 días. (Molander et al, 1998). En el medio líquido o semisólido, la lectura tiene como referencia la presencia o ausencia de turbidez del mismo, indicativa, o no, del crecimiento y multiplicación de microorganismos. El medio sólido va a permitir el aislamiento de microorganismos, la determinación de su capacidad hemolítica, la obtención de cultivo puro y subsecuentemente, su caracterización morfológica, fisiológica y/o genética y, cuando es necesario, el análisis de sensibilidad a antimicrobianos. (Siqueira, 1997). 3.8 TÉCNICAS MOLECULARES La introducción de técnicas para la manipulación del ADN in vitro ha tenido un enorme impacto en el progreso de cada una de las áreas de la investigación biológica. El primer reporte de la aplicación de la genética molecular en estreptococos se obtuvo alrededor de 1980, y en la actualidad se cuenta con más de 40 genes del Streptococcus mutans que han sido clonados y secuenciados. (Liébana, 1997 ) Recientemente, la metodología molecular de identificación microbiana (reacción de la cadena de polimerasa (PCR), sondas genómicas de ADN y técnicas de hibridación molecular ADN-ADN) han permitido, por un lado, obtener muestras positivas casi en un 100 % de los casos de identificación de especies bacterianas que, hasta el momento, no habían sido relacionadas con la patología periapical. (Canalda-Brau, 2006) En los últimos años se han implementado nuevas técnicas de identificación microbiana de base molecular, como por ejemplo, la reacción de cadena polimerasa (PCR). Estos métodos han demostrado una ventaja considerable para la identificación de microorganismos y ya han sido aplicados para analizar la flora endodóntica (Chaves, 2005) sin embargo, uno de los problemas mas resaltantes que acarrea la aplicación de dichas técnicas moleculares en la microbiología endodóntica es que muchos de los microorganismos que son identificados por medio de estos métodos no pueden ser cultivados en condiciones normales de laboratorio. Esta condición puede ser explicada debido a que luego de la extracción del ADN cromosómico y del ADN no cromosómico, los microorganismos sujetos a dichas extracciones ya no pueden ser reproducidos. Chaves señala además que con tal carencia de reproducibilidad en medios de cultivos, las características patógenas de dichos microorganismos "no cultivables" no podrían ser analizadas in vitro; y así no poder validar la implicancia de dichas técnicas de identificación como, por ejemplo, en infecciones resistentes en el tratamiento de conductos donde es mas importante poder reproducir los microorganismos que crecen y sobreviven en el conducto radicular a que solamente identificarlos molecularmente partiendo de un extracto de ADN. Otro factor negativo para la aplicación de técnicas moleculares es la falta de protocolo cuidadoso para la recolección de muestra de ADN. (Chaves, 2005). Aunque para demostrar el potencial y el futuro que aun mantiene una técnica molecular se puede señalar a Fouad et al (2000), quienes a partir de un estudio de PCR en los canales radiculares de una pulpa necrótica, revelaron la presencia de un microorganismo relacionado al genero Olsenella el cual no ha sido previamente descrito dentro de las infecciones endodónticas. (Fouad et al. 2002). Rolph et al. (2001), utilizaron la técnica de reacción de hibridación fundamentada en el apareamiento de dos cadenas sencillas de ácidos nucleicos que sean complementarias entre si para formar un hibrido, para realizar un estudio de identificación de microorganismos situados en canales radiculares y demostrar que las técnicas moleculares pueden detectar la presencia de bacterias vinculadas a las infecciones endodónticas cuando las técnicas de cultivo dan un resultado negativo, y además puede ser usado en la identificación de un amplio rango de bacterias relacionadas a la infección endodóntica así estas no sean cultivables. A partir de estos métodos de laboratorio, se han detectado, en orden de frecuencia las bacterias mas prevalentes en la periodontitis apicales tales como Treponema denticola (68%) Porphyromonas endodontalis (61%) Tannerella forsythia (58%). (Canalda-Brau, 2006) También las técnicas moleculares aplicadas a la taxonomía son de indiscutible importancia dado que por estos métodos se puede basar en características fenotípicas y genotípicas de los organismos, un ejemplo claro de ello hace Saito et al (2006) al lograr la identificación de nuevos filotipos asociados con infecciones endodónticas y sugerir que aun esta por revelar una porción de taxas sin caracterizar. Las técnicas de biología molecular han revolucionado el campo del diagnostico microbiológico, ya que constituyen la alternativa de mayor utilidad para la caracterización de ciertos microorganismos que presentan dificultades para su detección mediante los métodos convencionales. Gracias a su relativa sencillez y gran sensibilidad, son de especial ayuda en múltiples situaciones que requieran su identificación. Extracción de ácidos nucleicos: Existen diversos métodos de extracción y el procedimiento elegido depende del tipo de muestra, la cantidad de microorganismos presente y la naturaleza del ácido nucleico. Por ejemplo, si se trata de una colonia microbiana puede ser suficiente una extracción con calor o con detergentes; la proteasa K es útil en diversas muestras que contengan células o detritos celulares: la extracción mediante fenolcloroformo es la técnica de referencia, pero requiere muchos pasos y entraña el riesgo de contaminación de la muestra. Actualmente, existen equipos comerciales de extracción que combinan la acción de agentes químicos (p.ej., tiocianato de guanidina), enzimáticos (p.ej., proteasa K) solventes orgánicos (p.ej., alcohol o acetona) y medios físicos (p. ej., partículas de sílice o filtración por membranas); estos métodos están al alcance de la mayoría de los laboratorios y tienen las ventajas de su gran sensibilidad y relativa sencillez. Una vez extraída la diana, se puede proceder a la detección de los ácidos nucleicos propiamente dicha. (Liébana, 2002) 3.8.1 Reacción de hibridación Descripción: Consiste en el apareamiento de dos cadenas sencillas de ácidos nucleicos (ADN-ADN, ARN-ARN o ADN-ARN) que sean complementarias entre sí para formar un hibrido. En ella, se conoce la composición de una de las moléculas de acido nucleico y se asocia con un sistema que posteriormente ponga de manifiesto su presencia: enzimas, antígenos, moléculas fluorescentes o radioisótopos. (Liébana, 2002). Fundamento y procedimiento: Se basa en la capacidad de desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleidos. Cuando una molécula de ADN de doble cadena se somete a un choque térmico (elevación de la temperatura por encima de 90 °C) o a un choque de pH (soda concentrada), los puentes de hidrogeno que mantienen su estructura se desnaturalizan (se rompen), separándose las dos cadenas complementarias entre si; si se restablecen las condiciones iníciales de temperatura (temperatura ambiente) o de pH (neutro) las dos hebras de ADN son capaces de volver a unirse para formar la doble cadena mediante el proceso que se conoce como renaturalización. Estas dos propiedades son inherentes a los ácidos nucleicos y en ellas se basa la reacción de hibridación. Para llevar a cabo esta reacción lo primero que se hace es desnaturalizar la diana, que previamente se habrá extraído; tras la desnaturalización, se introduce en el medio de reacción la sonda (segmento de ADN) y en vez de restablecer las condiciones iníciales de temperatura, tomando una temperatura de hibridación superior al ambiente, entre 35 y 65 °C. Esta depende directamente de la composición de la cadena de ADN de la sonda y es la necesaria para que el proceso de renaturalización tenga lugar entre la sonda y su cadena complementaria, es decir, para que tenga lugar la hibridación. Y una vez formado, el hibrido se detecta siguiendo el formato de revelado inmunológico que determina el sistema de marcaje empleado en la sonda (enzimas, radioisótopos, fluorocromos o incluso antígenos). (Liébana, 2002). 3.8.2 TIPOS DE HIBRIDACION Los más utilizados son: hibridación en microplaca (formato de enzimoinmunoanálisis) o en solución (el acido nucleico y la sonda se encuentra en solución, lo que acelera el proceso de hibridación). (Liébana, 2002). Enzimoinmunoanálisis: se basa en la capacidad en que tienen Ag y Ac de adherirse a una superficie inerte como el poliestireno sin perder sus propiedades y en la posibilidad de marcar una inmunoglobulina con una enzima. (Liébana, 2002). Dot blot: consiste en desnaturalizar el acido nucleico diana y luego fijarlo por calor o luz UV en una membrana de nylon; posteriormente se añade la sonda, lo que permite la detección cualitativa de un agente infeccioso en una muestra. (Liébana, 2002). Southern y Northern blot: el primero permite determinar el tamaño del fragmento de ADN que hibrida con la sonda; el ADN se digiere previamente con enzimas de restricción y se separan por tamaño los fragmentos resultantes mediante electroforesis; estos se transfieren por la acción de un tampón de gran fuerza iónica a una membrana de soporte como nylon o nitrocelulosa y posteriormente se sigue como en el Dot blot. La técnica es compleja y larga y requiere gran cantidad de muestra, lo cual limita su aplicación. El Northern blot es una variación de Southern blot utilizando ARN en lugar de ADN. (Liébana, 2002). Hibridación in situ: se utiliza para la detección directa en tejidos, ya que se realiza en el contexto morfológico del tejido infectado, confirmando, en su caso, que el microorganismo está implicado en el proceso infeccioso. (Liébana, 2002). 3.8.3 Amplificación de ácidos nucleicos Las técnicas de hibridación pueden carecer de la suficiente sensibilidad cuando el microorganismo buscado se encuentra en escasa cantidad en la muestra. Para esto se recurre a métodos químicos o enzimáticos para aumentar específicamente la cantidad de una secuencia de ácido nucleico del microorganismo. (Liébana, 2002). Se puede describir dos grandes grupos de técnicas en función de lo que se amplifica: Amplifica la diana: el primero que comprende la mayoría de los métodos existentes, entre estos están la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que es la más extendida y la Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) aunque además existen otras como la reacción en cadena de ligasa (LCR) Amplifica la señal: obtenida tras producirse el hibrido, entre los que hay que destacar el método conocido como ADN ramificado. (Liébana, 2002). 3.8.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Componentes: ADN diana: es el ADN que se desea amplificar; también se llama ADN molde. Su cantidad y calidad son factores determinantes de la eficacia de la reacción. Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP): aportan las bases que componen el ADN (dATP, dTTP, dGTP) y debe encontrarse en cantidades iguales. Cebadores: también se conocen como primers o iniciadores; son oligonucleótidos (secuencia de ADN de 15-20 bases de longitud complementarias de los extremos 3´ de cada una de las cadenas de ADN diana). (Liébana, 2002). Taq polimerasa: ADN polimerasa obtenida de la bacteria termófila Thermus aquaticus, que tiene una temperatura máxima de actuación de 72-90°C y es estable a las temperaturas de la reacción. Su función consiste en alargar la cadena de ADN hibridada con el cebador mediante la incorporación de los dNTP. (Liébana, 2002). Cloruro de magnesio: Influye en la hibridación de los cebadores con el ADN diana y en la actividad de la Taq polimerasa. (Liébana, 2002). Tapón de hibridación: asegura la fuerza iónica y el pH óptimos de la reacción enzimática. Reacción: Consta de 3 etapas que se repiten cíclicamente, entre 25 y 40 veces, dependiendo del protocolo: - Desnaturalización del ADN: Temperatura de 90-95°C, se separan las dos hebras de ADN, quedando disponibles para hibridar con los cebadores. - Hibridación del ADN con los cebadores: se produce a una temperatura que oscila entre 35-65°C, dependiendo de la composición de los cebadores. (Liébana, 2002). - Extensión o polimerización de la cadena de ADN: La Taq actúa alargando el nuevo hibrido formado a una temperatura de 72°C a partir del extremo 3´ del cebador, incorporando los dNTP complementarios del molde de ADN diana. El producto de este primer ciclo sirve como diana para el siguiente ya que se somete a unA nueva desnaturalización y a las etapas sucesivas. (ANEXO 10) (Liébana, 2002). 3.8.4.1 Detección del producto amplificado: Una vez finalizada la PCR, se recurre a detectar la presencia del producto amplificado (amplicon), para ello se realiza la electroforesis y si se requiere mayor sensibilidad. Como se conoce el tamaño del fragmento amplificado, delimitado por la zona en la que se hibridan los cebadores, la electroforesis es un método sencillo y útil en la detección, sobre todo en aquellos casos donde la cantidad es elevada. Se realiza en gel de agarosa o poliacrilamida y posteriormente se aplica una tinción con bromuro de etidio, que fluórese con mayor intensidad en presencia de ADN de doble cadena. Para confirmar que se trata del fragmento de ADN buscado, es conveniente realizar la electroforesis usando como control un marcador de peso molecular para verificar el tamaño correcto del amplificado. (Liébana, 2002). 3.8.4.2 Modificaciones de la PCR - RT PCR: si el acido nucleico diana es ARN, tras la extracción este se debe convertir en ADN complementario (ADNc) ya que la Taq polimerasa es especifica de ADN. Se utiliza la enzima retrotranscriptasa, para transcribir el ARN a ADN monocatenario y luego la Taq polimerasa lo convierte en ADN bicatenario. (Liébana, 2002). - Nested-PCR: se trata de dos reacciones de PCR consecutivas y se utiliza para aumentar la sensibilidad de la amplificación; en una primera reacción se emplean cebadores externos y en la segunda cebadores internos que amplifican un fragmento interno al amplificado en la primera PCR. Así se logra aumentar la sensibilidad de la reacción. (Liébana, 2002). - Múltiple PCR: Permite la identificación de múltiples fragmentos pertenecientes a un mismo gen o a distintos genes. Para ello, se utilizan tantas parejas de cebadores como productos se desee amplificar. (Liébana, 2002). - PCR in situ: el tejido se pone en contacto con la mezcla de reacción en termocicladores adaptados, los cebadores están marcados con algún sistema indicador y luego se revela directamente el producto amplificado. (Liébana, 2002). 3.8.5 NASBA Se trata de un método de amplificación de la diana, aunque a diferencia de la PCR es una reacción que tiene lugar a una sola temperatura (isotérmica) por lo que no es necesario emplear un termociclador, además la diana para este método es ARN. (Liébana, 2002). Para conseguir la amplificación del ARN se utiliza una estrategia enzimática y no es necesaria la desnaturalización, ya que la diana se encuentra en forma de cadena sencilla. Se utiliza una cascada de reacciones a través de tres enzimas, una retrotranscriptasa (que es una ADN polimerasa que puede utilizar como molde una molécula de ARN, aunque también es capaz de copiar a partir de ADN. Una ARNasa H (degradadora de ARN, pero solo cuando éste está hibridado con ADN). Y una T7 ARN polimerasa (que sintetiza entre 10 y 100 copias de ARN a partir de una doble cadena de ADN). (Liébana, 2002). 3.8.6 ADN ramificado Esta técnica amplifica la señal y no la diana. La señal que se amplifica es la obtenida tras la hibridación de tres tipos de sondas: de captura, de anclaje, de marcaje. Una vez liberada, la diana se inmoviliza gracias a su hibridación con las sondas de captura que se hallan fijadas sobre la superficie de una microplaca. Posterior a esta primera reacción de hibridación, se recurre a la incorporación a este hibrido de una segunda sonda de anclaje produciéndose una segunda reacción de hibridación. Las sondas de anclaje son moléculas de ADN capaces de hibridarse con la diana y tienen la peculiaridad de disponer de un verdadero esqueleto que soporta a su vez múltiples brazos o ramificaciones de ADN. Y por último se da la tercera reacción de hibridación con la inclusión de una sonda de marcaje, y esta tercera reacción consiste en la unión de numerosas sondas de marcaje a los múltiples lugares de unión. Después de añadir el sustrato después de esta tercera hibridación, la señal obtenida se habrá amplificado y esto se debe a que utilizando esta cascada de reacciones de hibridación se consigue incorporar mayor cantidad de moléculas marcadoras que es, en esencia, de lo que depende la intensidad de la señal producida. (Liébana, 2002). 3.8.7 TECNICAS MOLECULARES APLICADAS A TAXONOMIA MICROBIANA 3.8.7.1 CONTENIDO G+C: Corresponde al número de bases de guanina + citosina en relación con el número total: adenina (A) timina (T). guanina (G) y citosina (C). El porcentaje de G+C es constante dentro de una especie y dentro de un mismo género las variaciones de dicho contenido son generalmente menores del 10%. Sin embargo aunque dos microorganismos tengan un contenido G+C similar no se puede suponer que las secuencias sean iguales; por ello, esta característica debe ser analizada con otros datos complementarios. (Liébana, 2002). 3.8.7.2 HIBRIDACION ADN-ADN: Se utiliza hibridación como término que indica una comparación de similitudes existentes entre el ADN de dos microorganismos. El ADN de ambos microorganismos se desnaturaliza por calor y se ponen en contacto en presencia de un tampón de hibridación. Si las cadenas son complementarias, si poseen el mismo ADN, se formarán híbridos estables de ADN bicatenario a una temperatura 25°C inferior a la que se disoció el ADN. Si las cadenas no son complementarias, seguirán entonces como ADN de simple cadena. (Liébana, 2002). Además se utiliza esta técnica para estudiar el grado de homología entre dos bacterias. Prácticamente se desnaturaliza el ADN de una de las dos bacterias a estudiar y las cadenas sencillas de ADN se fijan en una cadena de nitrocelulosa; se añade entonces el ADN de otro microorganismo marcado con radioisótopos y se incuba a temperatura de hibridación. Después se lava la membrana para eliminar el ADN marcado y no unido, se determina la radiactividad ligada a la membrana, que es proporcional a la cantidad de ADN hibridado, y por tanto, a la semejanza entre ambos microorganismos. La homología se utiliza para le definición de especie. (Liébana, 2002). 3.8.7.3 PATRONES DE ENZIMAS DE RESTRICCION Su fundamento radica en la utilización de una enzima de restricción (ER), endonucleasa que corta el ADN en un sitio de reconocimiento específico, generalmente compuesto de cuatro a seis pares de bases. Estas enzimas van leyendo la cadena de ADN hasta encontrar la secuencia que reconocen y, si está presente lo rompen originando lo que se conoce como fragmentos de restricción. Basándose en los patrones de dichos fragmentos se establece la homología o diferencia entre las cepas de los microorganismos que se quieran comparar. (Liébana, 2002). 3.8.7.3.1 POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION (RFLP) El análisis de los sitios de restricción del ADN compara el número y el tamaño de fragmentos producidos por la acción sobre este con una (ER). Debido a la gran especificidad de estas enzimas, la digestión completa del ADN proporciona un orden reproducible de fragmentos, que pueden separarse por medio de electroforesis y es conocido como fingerprinting. En esencia se trata de la huella dactilar de cada microorganismo. El análisis de RFLP puede realizarse sobre ADN genómico. También se puede efectuar sobre el producto amplificado de ADN por PCR, método denominado PCRRFLP; en este caso aumenta considerablemente la sensibilidad del método. (Liébana, 2002). Cuando el análisis de los RLFP se hace sobre RNA ribosómico (ARNr) entonces la técnica recibe el nombre de ribotipificación. El ARNr bacteriano contiene regiones conservadas en todas las procariotas y otras regiones variables, lo que permite comparar el grado de diferenciación entre dos o más cepas bacterianas. (Liébana, 2002). 3.8.7.3.2 ELECTROFORESIS EN GEL DEL CAMPO PULSATIL (PFGE) En ocasiones, las ER cortan un gran porcentaje del genoma microbiano en fragmentos tan grandes de ADN que la electroforesis convencional es incapaz de separarlos. En este caso se utiliza la PFGE, que consigue separar estos fragmentos utilizando cambios en el sentido de la electroforesis por acción de una corriente que regularmente invierte su polaridad. De esta forma se obtiene un electroferograma y para identificar un microorganismo, este se compara con el de otros conocidos. (Liébana, 2002). 3.8.8 SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS: Es la mejor manera de comparar las secuencias de ADN o ARN de dos microorganismos. Es el método de referencia, ya que proporciona la composición exacta del acido nucleico. Para la identificación bacteriana se elige secuenciar ARNr de las subunidades ribosómicos 30s y 50s y para el estudio del ARNr, se debe realizar un RT-PCR para transformarlo en ADN. (Liébana, 2002). 3.8.9 TECNICA ARNr16S La comparación de las secuencias del ARNr16S ha facilitado enormemente la identificación de bacterias, incluyendo microorganismos no cultivables, y la elucidación de sus relaciones naturales. Consecuentemente, estas pueden ser utilizadas para determinar relaciones taxonómicas entre especies que presentan poca interrelación en su ADN. (Herrera, 2001) Inicialmente realizaron estudios de secuenciación del ARNr16S. Posteriormente, los estudios se extendieron al ARNr23S. Las secuencias nucleotídicas constantes del ARNr16S presentan la ventaja de proporcionar un sitio de iniciación adecuada para la elongación de los cebadores y así aplicar de forma más fácil la técnica de secuenciación (Herrera, 2001). El análisis del ARNr16S parece ser el más adecuado con los microorganismos, ya que contiene aproximadamente a 1550 pb frente a los 75-120 del ARNr5S, por lo que pequeñas diferencias en los nucleótidos del ARNr5S afectan mucho mas al resultado final que en el caso del ARNr16S (Herrera, 2001). Además de su utilidad en los estudios taxonómicos, la secuenciación del ARNr se ha aplicado en identificación bacteriana. Mediante el análisis de las secuencias parciales del ARNr16S es posible encontrar patrones de secuencias específicos para grupos, especies o incluso serotipos bacterianos. Para la identificación de los microorganismos a ese nivel, se han desarrollado pequeñas sondas específicas de la región variable del ARNr16S. Las diferencias en las regiones conservativas proporcionan así mismo secuencias para el diagnostico de grupos de organismos relacionados y pueden ser usados como dianas para sondas especificas de oligonucleótidos. Sondas específicas de ARNr16S y 23S han sido aplicadas para establecer diferentes grupos y especies, así como la identificación de bacterias (Herrera, 2001). La hibridación con sondas específicas permite la identificación rápida de un gran número de aislados, al mismo tiempo que posibilita la detección directa de microorganismos concretos en las muestras, usando un extracto de ácidos nucleicos como diana. La sensibilidad de las pruebas puede ser aumentada in vitro aplicando a la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A partir de un pequeño fragmento de ADN, es posible amplificar una secuencia diana hasta unos cuantos microgramos, los cuales pueden ser secuenciados directamente o pueden ser utilizados como diana de una sonda especifica. El uso combinado de sondas universales y específicas permite también estimar la fracción de determinados microorganismos dentro de un conjunto. Por último se puede realizar estimaciones de unidades formadoras de colonias utilizando métodos de hibridación de colonias in situ (FISH) (Herrera, 2001). En cuanto a la metodología de este análisis, el ARNr16S es secuenciado utilizando una modificación de la técnica de Sanger (1977) de dideoxinucleótidos, en la que conocidos primers complementarios a las regiones conservadas del ARNR16S, son elongados utilizando una transcriptasa inversa. Las pequeñas cadenas de ADN producidas pueden ser amplificadas mediante la PCR o por clonación, y después secuenciadas mediante un proceso automatizado por electroforesis en geles de poliacrilamida (Herrera, 2001). Anteriormente, la metodología utilizada para estudiar estas secuencias, recaían en el aislamiento exitoso del ARNr, seguido de la secuencia directa utilizando transcriptasa inversa. Actualmente, estas secuencias pueden ser clonadas y detectadas por hibridación, con genes que codifican para sondas de ARNr (ADNr) de un organismo diferente. La utilización del PCR, permite amplificar específicamente la región a secuenciar, utilizando una corta selección de primers. Estas secuencias amplificadas específicamente, pueden ser clonadas para secuenciarse por métodos convencionales (Herrera, 2001). Se usan dos estrategias a la hora de aislar genes de ARNr del total de los ácidos nucleicos. Una aproximación es clonar fragmentos al azar de ADN del medio ambiente y analizar aquellos que contienen genes de ARNr. Como la cantidad de ADN clonado que contiene genes de ARNr es pequeña, el segundo paso, casi obligado, es la utilización de la PCR para amplificar este ARNr. Como el ARNr está altamente conservado en la naturaleza los investigadores usan primers universales para los tres dominios de organismos (eucariota, bacterias, arqueobacterias), desde todos los puntos parece aconsejable el uso de la PCR pues se necesita amplificar el ARNr que antes solo formaba una pequeña parte del total (Herrera, 2001). La manera más rápida de obtener los constituyentes de los ecosistemas microbianos es pues mediante el uso de la PCR. En principio la PCR realizada con estos primers amplifica los genes de ARN de todos los tipos de organismos presentes en un ambiente. Los tipos individuales de genes en la mezcla son separados en principio por clonación y posteriormente son secuenciados (Herrera, 2001). Existen bases de datos como el Ribosomal Database Project, el GenbanK y el laboratorio europeo de biología molecular (EMBL), las cuales contienen miles de secuencias de ARNr, perteneciente a una gran cantidad de microorganismos. Estas bases de datos pueden consultarse libremente, para realizar una comparación estadística de las secuencias obtenidas de un aislamiento, contra las que ya están publicadas, y así poder elaborar dendrogramas, en los que se indique la posición del nuevo microorganismo recién identificado (Herrera, 2001). Aplicación La secuencia del ARNr es el método de elección para determinar relaciones taxonómicas altas (arriba del nivel de género) debido a que la molécula de ARNr16S contiene regiones altamente variables es usualmente posible el encontrar regiones de 20 a 30 bases que son completamente exclusivas de una solo especie de bacterias (Herrera, 2001). La caracterización filogenética de los organismos es más que un ejercicio de taxonomía, puesto que las relaciones evolutivas están establecidas en una forma creíble y cuantitativa. Se espera que los organismos cercanamente relacionados sean similares en sus propiedades bioquímicas generales; por el contrario, la diversidad en las secuencias de ARNr indica diferencias bioquímicas potenciales (Herrera, 2001). 4. ANALISIS BIBLIOGRAFICO DE ESTUDIOS REALIZADOS En 1894, Miller (Miller W, 1894) fué el primero en demostrar la invasión bacteriana de los túbulos dentinarios tanto de dentina cariada como no cariada así como en tejido pulpar necrótico, reportando que esta microflora tubular consistía en cocos y bacilos. Luego de este argumento se desarrollaron múltiples investigaciones sobre la microbiota de los conductos radiculares las cuales reportaron la presencia de numerosas especies bacterianas. Dependiendo del medio de cultivo y las técnicas utilizadas para la identificación bacteriana, los tipos y el número de organismos aislados variaban significativamente. Cuando Kakehashi et al. (1965), proporcionaron evidencia experimental y establecieron claramente el papel fundamental de las bacterias en la enfermedad pulpar y periapical. Señaló el efecto de los microorganismos sobre el tejido pulpar y demostró la aparición de enfermedad pulpar y periapical en pulpas dentales de molares de ratas quirúrgicamente expuestas sólo cuando existían bacterias en la cavidad bucal. En ratas gnotobioticas (libres de microorganismos) las pulpas expuestas permanecieron sanas e iniciaron la reparación formando un puente dentinario a nivel de la exposición pulpar. En las primeras investigaciones se reportó una pequeña incidencia de bacterias anaerobias en infecciones primarias, (Hedman et al.1951, Melville et al.1967, Nair et al. 1990, Winkler et al.1972) mientras que en estudios posteriores se informó de una prevalencia del 90% de estas bacterias en conductos radiculares infectados. (Baumgartner et al.1999, Fabricius et al. 1982 Hancock et al. 2001). Estos resultados son confirmados posteriormente por Korzen et al (1974) quienes analizaron los efectos de la microbiota bucal normal y de la infección por Streptococcus mutans en la pulpa y los tejidos periapicales de ratas comunes y gnotobioticas. En dicho trabajo, los autores concluyen que la severidad de la inflamación pulpar y periapical estaba directamente relacionada con la cantidad de microorganismos existentes en el sistema de conductos radiculares y con el tiempo de permanencia de los mismos dentro del sistema, así como comprobaron que el grado de inflamación es de mayor intensidad en infecciones mixtas que en infecciones producidas por microorganismos pertenecientes a una sola especie. Hasta principios de 1970, la mayoría de los estudios microbiológicos señalaban fundamentalmente la presencia de bacterias anaerobias facultativas en el sistema de conductos radiculares infectados. Sin embargo, con el advenimiento de las nuevas tecnologías en el aislamiento de bacterias anaerobias y el progreso en el conocimiento del papel fundamental de estos microorganismos en diversas patologías humanas, han cambiado sustancialmente la bacteriología médica y bucal. Los estudios de Sundqvist, et al (1976), cambian diametralmente los conceptos hasta los momentos establecidos en la microbiología endodóntica. La presencia de un alto porcentaje de anaerobios estrictos reportados en su investigación, demostraron la necesidad de emplear medios de cultivo adecuado y técnico para la identificación de microorganismos anaerobios en beneficio del avance en el conocimiento de la microbiología del sistema de conductos radiculares. Las pulpas necróticas presentan una flora polimicrobiana caracterizada por una amplia variedad de combinaciones de bacterias, un promedio de 4-7 especies por conducto, predominantemente anaerobias y en igual proporción de bacterias Gram positivas y Gram negativas. (Baumgartner et al.1999, Hancock et al. 2001, Peters et al. 2002, Sundqvist et al. 1989). Demostró que sólo podían ser detectados signos de reacción inflamatoria en los tejidos periapicales de dientes que presentaran infección bacteriana dentro del sistema de conductos radiculares. Este autor realizó un estudio en 32 dientes unirradiculares con historia previa de traumatismo, los cuales presentaban pulpas necróticas y su corona clínica intacta. Diecinueve de estos dientes presentaban imagen radiolúcida; en 18 de estos dientes se encontró la presencia de microorganismos. Por otra parte, no se encontraron microorganismos en aquellos dientes traumatizados sin área periapical. Sumado a estos hallazgos, sus resultados sugieren también, una asociación entre la sintomatología y combinaciones específicas de bacterias. Un 90% de las especies aisladas por Sundqvist (Sundqvist 1976) fueron anaerobias; éstas comprenden un grupo de especies restringido, si se compara con la totalidad de la microbiota de la cavidad bucal. Como se mencionó anteriormente, los estudios de Sundqvist, en 1976, marcan pauta en la tipificación de microorganismos anaerobios estrictos y anaerobios facultativos involucrados en las lesiones pulpares y periapicales, con la introducción de las técnicas de anaerobiosis Fabricius, et al (1982) desvitalizaron mecánicamente pulpas de monos, las expusieron al medio bucal durante una semana y posteriormente las sellaron durante 3, 6 y 35 meses. Los análisis bacteriológicos de estos períodos de observación mostraron que el 85-98% 24 observaron que los microorganismos hallados con mayor frecuencia fueron Bacteroides (Prevotella y Porphyromonas) y bacilos anaerobios Gram positivos, también se aislaron pequeñas cantidades de bacterias anaerobias facultativas. Sundqvist et al (1989) evaluaron la microbiota de conductos radiculares infectados y más específicamente la prevalencia de Bacteroides pigmentados de negro, actualmente tipificados como Porphyromonas y Prevotella. En una muestra de 72 conductos se identificaron 173 cepas microbianas. Se identificaron estos microorganismos en un 30% de los conductos radiculares. Las especies más frecuentemente encontradas fueron Fusobacterium nucleatum, Bacteroides intermedius, Peptostreptococcus anaerobius, Eubacterium lentum y E. alactolyticum. Los bacilos anaerobios pigmentados de negro (Porphyromonas spp. y Prevotella spp.) han sido implicados con mucha frecuencia en la etiología de las patologías pulpares y perirradiculares. Es probable que la actividad proteolítica de estas bacterias sea un factor de virulencia altamente significativo debido a que las proteinasas producidas por estos microorganismos tienen efectos sobre las proteínas plasmáticas envueltas en los procesos de defensa. (Sundqvist et al. 1989). Siqueira et al (2003), estudiaron el género Porphyromonas que incluye doce especies pigmentadas y una no pigmentada. De las cuatro especies aisladas en seres humanos, sólo P. endodontalis y P. gingivalis han sido aisladas consistentemente en infecciones endodónticas, y se ha determinado que juegan un papel importante en la etiología de las diferentes formas de lesiones perirradiculares incluyendo los abscesos perirradiculares agudos. Las bacterias pigmentadas de negro están siempre asociadas con otras bacterias, confirmando las relaciones sinérgicas entre las bacterias encontradas en infecciones polimicrobianas, especialmente con microorganismos Gram positivos. Estas bacterias poseen requerimientos nutricionales muy específicos los cuales son aportados por bacterias específicas tales como Peptostreptococcus micros, Eubacterium spp. y Campylobacter rectus. (Sundqvist, 1994). Sundqvist, et al (1992), investigó las relaciones comensales o antagónicas entre los microorganismos en los conductos radiculares de dientes con periodontitis apical. Se tomaron muestras de 65 conductos radiculares humanos infectados y se analizaron según especies, frecuencia de aparición y proporción de la flora aislada total. Las especies más frecuentes fueron Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus anaerobius, Eubacterium alactolyticum, Eubacterium lentum y Wolinella recta. Las asociaciones positivas más evidentes fueron encontradas entre F. nucleatum y P. micros, Porphyromonas endodontalis, Selenomona sputigena y Wolinella recta. También se evidenció una asociación positiva entre Prevotella intermedia y Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus anaerobius y Eubacterium. Los resultados de este estudio son consistentes con el concepto de que existe un ambiente especial y selectivo dentro del sistema de conductos radiculares, esto se debe, en parte, a la naturaleza de cooperación y antagonismo de las relaciones entre las bacterias. Gomes et al (1994), realizaron un estudio con el propósito de determinar si algún grupo de bacterias estaba relacionada con dolor, inflamación o con cualquier otro síntoma endodóntico. De 30 canales radiculares examinados se aislaron un total de 57 especies bacterianas, de las cuales, el 60% fueron anaerobios estrictos. Fusobacterium nucleatum fue aislado y relacionado a todos los casos clínicos examinados pero no se determinó una asociación significativa con otros géneros bacterianos. Debelian et al. (1995), realizaron un estudio para determinar la presencia de bacterias en los conductos radiculares posterior a la instrumentación de piezas dentarias con diagnóstico de necrosis pulpar asociada a lesión periapical aguda. De un total de 26 piezas dentarias evaluadas, se determinó que todos los canales contenían microorganismos, en su mayor parte anaerobios estrictos, hallándose a Fusobacterium nucleatum en el 53% de los casos. Pocos estudios han reportado la presencia de hongos en infecciones primarias endodónticas. Sen et al. (1995) evidenciaron hongos en las paredes de los conductos radiculares en dientes infectados. En cuatro de las muestras se presentaron en forma de levaduras y en una se presentaron en forma de hifas. El estudio realizado con Microscopía Electrónica (SEM) para investigar la topografía de la flora microbiana de los canales radiculares y observar el grado de penetración bacteriana en los túbulos dentinales de las raíces infectadas Sin embargo, Pardi et al (2001). Han señalado que la presencia de hongos en conductos radiculares es básicamente poco frecuente (10%) y podría estar asociado a la presencia de estos microorganismos en saliva. Brook (1996) confirmó la hipótesis en la cual las infecciones del sistema endodóntico eran causadas principalmente por anaerobios estrictos. Para el desarrollo de este estudio se analizó el contenido de secreción purulenta de cinco abscesos periapicales en el maxilar superior, todos ellos asociados a cuadros de sinusitis. En todos los casos, los autores encontraron anaerobios de los géneros Peptostreptococcus. Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium y En 1996, (Gomes et al.1996) investigaron la sensibilidad de la microflora endodóntica a los procedimientos biomecánicos del tratamiento de conductos. Para ello, fueron evaluados 42 conductos radiculares tomándose muestras en todos los casos antes de la limpieza y conformación y, entre siete y diez días posteriores a dicho procedimiento. En las primeras muestras, fueron aisladas 51 especies bacterianas diferentes. Posterior a la terapia endodóntica el micro-ambiente cambia de diversas formas. El principal efecto puede ser el cambio en la anaerobiosis. En este estudio se determinó un significativo descenso entre las especies anaerobias de la primera y segunda evaluación. En la segunda evaluación, se detectaron microorganismos tales como Enterococcus faecalis, Propionibacterium acnes, Veillonella parvula, Streptococcus parasanguis, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, entre otros. Se observaron especies individuales de un mismo grupo presentándose en un mismo caso entre la muestra 1 y 2, por ejemplo, Streptococcus intermedius, así como especies que disminuyen y otras que aumentan entre la primera y segunda muestra. Molander et al (1998) evaluaron el estado de la microbiota intrarradicular de 100 casos de periodontitis apical crónica persistente. Todos los dientes presentaron tratamiento de conducto con no menos de cuatro años postoperatorios. El tamaño de las lesiones fue establecido radiográficamente y fue de 2 mm en 14 casos, entre 3 y 5 mm en 56 casos y 5 mm en 30 casos. Los conductos fueron desobturados con instrumental rotatorio y manual, mientras en 21 casos se incluyó el uso de cloroformo como solvente. Las muestras fueron sembradas en agar Brucella para la incubación aerobia y en medio semi-líquido (HCMG-Sula) con el método de combustión de Hidrógeno para la incubación anaerobia. Molander et al (1998) Los resultados demostraron la presencia de microbiota dentro del conducto en 68 de los 100 casos estudiados, detectando 117 especies microbianas. En la mayoría de los conductos, fueron aisladas de 1-2 especies (85%) con predominio de anaerobios facultativos Gram positivos (69%). El microorganismo detectada con mayor frecuencia fue Enterococcus spp., en 32 dientes. En 20 de los casos el crecimiento fue muy abundante. También fueron aisladas en cantidades importantes Lactobacillus spp., Escherichia coli, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Fusobacterium spp., Prevotella spp. y Candida albicans. En conclusión aseguran que las bacterias anaerobias facultativas son menos sensibles a la actividad antimicrobiana que los anaerobios estrictos y, por lo tanto, es de esperarse que persistan más frecuentemente en conductos radiculares después de un tratamiento endodóntico inadecuado. Cuando los microorganismos anaerobios facultativos han estado en una fase latente con baja actividad metabólica por un período de tiempo, los cambios en las condiciones nutricionales desencadenan su crecimiento. (Molander et al.1998) Siqueira et al. (1998) estudiaron la patogenicidad de bacterias anaerobias estrictas y facultativas comúnmente encontradas en infecciones endodónticas usando ratones como modelo. La capacidad de inducir abscesos fue evaluado siete días después de inyectarles de manera subcutánea la bacteria en cultivo puro y en combinación con Prevotella intermedia o Prevotella nigrescens; como resultado se obtuvo que ninguna de las 50 muestras bacterianas estudiadas fueron patógenas en cultivo puro. Una diferencia, aunque no estadísticamente significativa, fue detectada entre muestras de cultivo puro y muestras en combinación. Se detectó un aparente sinergismo cuando se asoció Porphyromonas gingivalis con Prevotella intermedia o Prevotella nigrescens. Bogen et al. (1999) estudiaron la frecuencia de P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia y P. nigrescens en 20 lesiones periapicales cerradas asociadas a cuadros endodónticos sintomáticos y asintomáticos. La identificación de las especies bacterianas fue realizada por medio de la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Los resultados obtenidos revelaron que P. endodontalis no estuvo presente en ninguna lesión periapical. P. gingivalis fue identificada en una lesión periapical y estuvo relacionada con un cuadro de dolor moderado. P. endodontalis, P. intermedia o P. nigrescens no fueron identificadas en ninguna de las lesiones estudiadas por lo que el autor concluyó que éstos microorganismos al parecer eran infrecuentes en este tipo de infecciones. Waltimo et al. (1997) realizaron un importante estudio sobre la presencia de hongos en 967 casos de periodontitis apical crónica persistente. De los hongos aislados en este estudio el 80% fue representado por la especie Candida albicans. Así mismo, fueron identificadas Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida incopiscua y Geotrichum candidum. Un total de 48 cepas de hongos fueron aisladas en 47 muestras (7%) de las cuales seis fueron infecciones producidas por un solo microorganismo (Candida albicans). Figura 1. Microfotografía al Microscopio Electrónico de Barrido mostrando Candida spp. En las fibras (Waltimo et al 1999) Así mismo, evidenciaron crecimiento microbiano en 692 casos (72%). En los casos de infecciones mixtas demostró la presencia de Streptococcus spp., P. micros y F. nucleatum. Todas las especies de Candida evaluadas en este estudio, presentaron alta resistencia a solución saturada de hidróxido de calcio. Se requirió de 16 horas de incubación para eliminar el 99,9% de las unidades de colonias formadas. (Waltimo et al 1999). Así también Waltimo et al (1999) realizaron un estudio enfocado a evaluar la sensibilidad de Candida spp. Con hidróxido de calcio, medicación de amplio uso en endodoncia, dado su alto grado de alcalinidad. También ha sido probada, la sensibilidad de Candida spp, a ciertas soluciones desinfectantes, tales como yoduro de potasio, acetato de clorhexidina, hipoclorito de sodio e hidróxido de calcio. Los resultados señalan una mayor efectividad de los tres primeros agentes antimicrobianos sobre Candida spp, en comparación con el hidróxido de calcio. Sin embargo, apuntan los autores, que el uso combinado de estos desinfectantes, puede proveer una preparación antimicrobiana de amplio espectro con efectos a largo plazo. Kuriyama-Karasawa, (2000) estudiaron la microflora bacteriana asociada a infecciones orofaciales odontológicas. Las muestras fueron tomadas de 163 pacientes que presentaban infecciones dentoalveolares, periodontitis y pericoronaritis. Aisló un total de 664 especies bacterianas, 200 de las cuales fueron aerobias. Los géneros bacterianos más frecuentemente aislados fueron: Peptostreptococcus, Gemella, Prevotella, Porphyromonas y Fusobacterium. Dalby (2000) evaluó la sensibilidad antibiótica de las bacterias más prevalentes en abscesos dentoalveolares agudos en 30 muestras de secreción purulenta, las cuales fueron cultivadas en condiciones aerobias y anaerobias. Se identificaron 56 cepas bacterianas, de las cuales, el 62.5% correspondió a anaerobios estrictos; siendo los microorganismos más prevalentes Streptococcus (35%), Peptostreptococcus (25%), Fusobacterium (12.5%) y Porphyromonas (9%). Arroyo (2000) evaluó 30 muestras intraorales de pacientes atendidos en el Centro Médico Naval con el diagnóstico de absceso dentoalveolar agudo, realizando la identificación microbiológica mediante el sistema Microscan. De un total de 56 especies bacterianas, el 62.5% estuvo representada por bacterias anaerobias estrictas y el 35.7% por bacterias anaerobias facultativas. Las especies bacterianas de mayor prevalencia fueron: Peptostreptococcus saccharolyticus y Streptococcus mitis, con 18% y 14% respectivamente. Asimismo, determinó que la infección de tipo mixto fue la más frecuente (73%), pudiendo aislar de 1 a 4 microorganismos por muestra. Lana et al. (2001) analizaron 31 canales radiculares con diagnóstico de necrosis pulpar, antes y después de su manipulación o preparación biomecánica. Los géneros aislados que presentaron mayor frecuencia fueron: Prevotella, Fusobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium y Peptostreptococcus en bacterias, y Candida y Saccharomyces en levaduras. El total de microorganismos anaerobios estrictos aislados fue de 54 especies. El 82% de los canales evaluados mostraron infección polimicrobiana. Las bacterias anaerobias estrictas fueron recuperadas en el 80% de los casos; las bacterias anaerobias facultativas en el 51% y las especies microaerófilas en un 18.5% de los casos. Fueron determinadas además fuertes asociaciones positivas, particularmente entre Clostridium con Prevotella y Peptostreptococcus con Fusobacterium. Otro microorganismo últimamente reportado, Bacteroides forsythus, recientemente reclasificado como Tannerella forsythensis, es un bacilo anaerobio estricto Gram negativo, pleomórfico, el cual fue identificado en un 52% del total de casos estudiados en pulpa necrótica. En los casos asintomáticos se presentó en un 59,1%, un 40% en periodontitis apical aguda y un 50% en abscesos periapicales agudos. Estos resultados sugieren una asociación de este microorganismo con la patogénesis de diferentes formas de patología perirradicular. (Rocas 2001). Un importante estudio, realizado por Love et al. (2001) permitió comprobar que la virulencia de E. faecalis se relaciona con su capacidad para invadir los túbulos dentinarios y permanecer viable dentro de los mismos, adhiriéndose al colágeno tipo I presente en el suero humano. Fue comprobado igualmente por el autor, que para otros microorganismos, tales como S. gordonii y S. mutans, el suero humano actúa inhibiendo su capacidad de invadir la dentina, no así sobre E. faecalis donde se mantuvo la invasión aún cuando fue reducida escasamente. Lima et al. (2001) evaluaron in vitro la sensibilidad de biopelículas de Enterococcus faecalis a ciertas medicaciones antimicrobianas tales como clorhexidina (CHX) 2%, clindamicina y metronidazol. Concluyeron en esta investigación que la combinación de metronidazol con clindamicina reduce significativamente las biopelículas formadas de un día, mientras la clorhexidina fue el único medicamento capaz de eliminar las biopelículas de 1-3 días de formación. Portenier et al. (2001) evaluaron los efectos de elementos tales como dentina, matriz de dentina tratada con ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) o ácido cítrico, colágeno tipo I y células muertas (E. faecalis) sobre la inactivación de la actividad antimicrobiana de yoduro de potasio y digluconato de clorhexidina contra E. faecalis. La matriz de dentina y las células muertas fueron los inhibidores más potentes de la clorhexidina, mientras que la dentina tratada mostró una muy leve inhibición. El yoduro de potasio mostró ser inhibido por todos los componentes evaluados excepto EDTA y ácido cítrico. Los autores concluyen que los diversos componentes de la dentina son responsables de patrones divergentes de inhibición de la actividad antimicrobiana de estas dos sustancias, así como el tratamiento químico de la dentina, previos a la medicación, puede alterar el efecto antimicrobiano de las sustancias. En la búsqueda de alternativas de tratamiento para la eliminación efectiva de E. faecalis, ha sido evaluada la acción de diversas soluciones antisépticas, medicaciones e inclusive materiales de obturación sobre el microorganismo. Siqueira et al. (2002) califican las infecciones endodónticas como mixtas y semi-específicas con predominio de bacterias anaerobias estrictas. La característica de semi-específica de estas infecciones es dada por la correlación entre algunos grupos bacterianos y algunas formas de enfermedad periapical. Cuando se realizan cultivos de conductos radiculares infectados, parece frecuente la aparición de ciertas especies asociadas. Esto indica que existen interrelaciones entre ciertas bacterias, comensales o antagonistas. Fouad et al. (2002) en un estudio bajo técnicas de hibridación de ADN demostraron la alta frecuencia de Fusobacterium nucleatum, así como de otros patógenos (Peptostreptococcus micros, Streptococcus spp. y Prevotella nigrescens) sobre otros microorganismos involucrados en infecciones primarias. Por su parte, Peters et al. (2002) investigaron las combinaciones bacterianas presentes en infecciones primarias con lesiones perirradiculares. Las especies más frecuentemente encontradas fueron Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros y Actinomyces odontolyticus. También se reportaron asociaciones positivas entre P. intermedia y P. micros, entre P. intermedia y Prevotella oralis, A. odontolyticus y P. micros, Bifidobacterium spp. y Veillonella spp. Estos resultados indican que los patógenos endodónticos no se presentan aleatoriamente y pueden estar asociados en combinaciones específicas. Reportaron que las especies predominantes en 58 dientes con pulpas necróticas y periodontitis apical crónica fueron Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros y Actinomyces odontolyticus. Estos resultados son comparables con los obtenidos por otros estudios realizados bajo condiciones similares. Por su parte, Evans et al. (2002) estudiaron los mecanismos involucrados en la resistencia de E. faecalis al hidróxido de calcio. Este estudio confirmó la supervivencia del microorganismo a dicho medicamento a un pH de 11,1. Una respuesta adaptativa en un pH alcalino y una síntesis de proteínas inducidas por la tensión superficial parecen jugar un papel menor en la persistencia de E. faecalis. Sin embargo, el hallazgo de una bomba de protones con capacidad de acidificar el citoplasma fue un factor crítico en la supervivencia de esta bacteria en altos niveles de pH. Así mismo se concluyó, que el hipoclorito de sodio (NaOCl) es efectivo para la eliminación del microorganismo, según los hallazgos de estos investigadores. Jacinto et al. (2003), compararon hallazgos microbiológicos de dientes con necrosis pulpar asintomático (29 casos) con dientes con el mismo diagnóstico y que presentaban sintomatología clínica. Los canales radiculares de dientes con sintomatología presentaron mayor porcentaje de anaerobios estrictos y mayor número de especies bacterianas por canal en relación a los dientes asintomáticos. Los más comúnmente aislados fueron: Fusobacterium necrophorum, Peptostreptococcus prevotti, Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum y Prevotella. El 39% del total de especies aisladas estuvo constituida por bacterias Gram negativas y fueron relacionadas con la sintomatología. Hay una relación estadísticamente significativa al generarse inflamación cuando esta presente Fusobacterium nucleatum, mientras que el dolor a la percusión fue relacionado a Bifidobacterium y Actinomyces. En un estudio Siqueira (2003) demostró en conductos radiculares infectados, la presencia de una especie no descrita anteriormente, Filifactor alocis. Este microorganismo, detectado bajo técnicas de identificación PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), fue aislado en el 46% de las muestras estudiadas. Esta frecuencia relativamente alta de detección de Filifactor alocis asociada a infecciones endodónticas, implica la posibilidad de estar involucrada en la patogénesis y mantenimiento de las lesiones perirradiculares. Debido a su alta prevalencia y su relación con otras patologías bucales, particularmente con periodontitis marginal, es una especie potencial para formar parte del restringido grupo de patógenos endodónticos. Por su parte Tang et al (2003) realizaron la detección directa de Actinomyces spp en canales radiculares infectados en una población china. Y explican que la poca sensibilidad dada por las técnicas de identificación fenotípica ha obstaculizado la diferenciación taxonómica de los Actinomyces; ellos lograron desarrollar un método de identificación más sensible y especifico por medio de la técnica de hibridación DNA-oligonucleótido basada en PCR. Se sustentó bajo el estudio de 32 muestras (dientes) de pacientes chinos y con lo cual se logro amplificar el ADN ribosomal 16S de las bacterias y posteriormente marcaje con dioxigenina para la posterior hibridación y detección. Concluyeron de manera asertiva con un 31.3% la presencia de A. odontolyticus en los canales radiculares infectados y confirmar de manera secundaria que A. naeslundii cobra presencia en dientes traumatizados. Gomes et al (2004) estudiaron la microbiota de conductos radiculares con infección primaria. Sesenta conductos radiculares, 41 con infección primaria y 19 con infección secundaria arrojaron 56 especies y un máximo de 10 especies por conducto. Un 70% lo constituyeron especies anaerobias estrictas o microaerofílicas. Las especies más frecuentemente aisladas fueron: Peptostreptococcus micros (35%), Fusobacterium necrophorum (23.3%), Fusobacterium nucleatum (11.7%), Prevotella intermedia (16.7%), Porphyromonas gingivalis (6.7%) y Porphyromonas endodontalis (5%). La microflora aislada de las infecciones primarias con periodontitis apical fue de carácter mixto, comprendiendo bacterias Gram negativas y Gram positivas, principalmente microorganismos anaerobios y conteniendo al menos tres especies por conducto. Fouad et al, (2004) hacen que la técnica molecular tenga un papel prominente o importante en el estudio clínico y mas en estudios críticos como aquel expuesto en la detección molecular de especies de Enterococus en canales radiculares con terapia de resistencia a infecciones endodónticas, dado el estudio en pacientes diabéticos, determino la presencia dominante en estos pacientes de Enterococcus faecalis, con la técnica de amplificación por PCR y posterior secuenciación e identificación filogenética. Siquiera Jr. et al. (2005), realizaron un estudio en dientes con diagnóstico de necrosis pulpar asintomáticos y con lesión periapical, comparando la prevalencia de patógenos endodónticos en muestras de infecciones primarias tomadas de pacientes en diferentes localizaciones geográficas (Brasil y Corea del Sur) para lo cual utilizó la técnica de PCR. Como resultado obtuvo que la especies prevalentes detectadas en Brasil fueron Porphyromonas endodontalis (79%), Treponema denticola (79%) y Dialister pneumosistes (76%), mientras que las especies encontradas en Corea fueron Fusobacterium nucleatum (38%), Tannarella forsythia (26%) y Treponema malthophilum (24%). Concluyendo que la prevalencia de algunas especies en infecciones endodónticas pueden ser significativamente diferentes de una localización geográfica a otra. Mientras Chu et al. (2005) compararon en su estudio los microorganismos cultivables de canales radiculares que presentaban radiolucencia apical con exposición pulpar (grupo A) y sin exposición pulpar (grupo B), tomando 45 y 43 muestras bacterianas respectivamente, las mismas que fueron cultivadas en condiciones aerobias y anaerobias. Del grupo A se aislaron un total de 211 microorganismos, agrupados en 28 géneros y 55 especies y del grupo B 185 microorganismos, agrupados en 28 géneros y 54 especies. Concluyeron que no hubo diferencias significativas entre la prevalencia de Actinomyces, Peptostreptococcus y Campylobacter entre ambos grupos. El género Prevotella fue más común en ambos grupos y Fusobacterium nucleatum fue más común en el grupo B. Sakamoto et al (2006) utilizaron la técnica de análisis de restricción de polimorfismos de ARNr 16s en bibliotecas de genes clonados, investigando la diversidad de microbiota asociada con infecciones endodónticas sintomáticas y asintomáticas y comparándola con la estructura de la comunidad bacteriana de las dos condiciones clínicas. Las muestras fueron tomadas de infecciones endodónticas asintomáticas asociadas a lesiones crónicas periradiculares. La infección sintomática fue diagnosticada por abscesos agudos. Los genes ARNr 16s aislados de muestras clínicas se utilizaron para construir las bibliotecas y se realizaron análisis de secuencias de 186 clones, los cuales revelaron 42 tipos de microorganismos; 23 (55%) fueron filotipos, de los cuales siete son exclusivas de infecciones endodónticas. La mayoría de los microorganismos detectados fueron: Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus spp, Prevotella spp, Dialister spp, Mogibacterium spp, Lachnospiraceae oral, Filifactor alocis, Megasphaera spp, Veillonella spp, Veillonella párvula, Dialister spp. Algunos microorganismos se detectaron solamente en muestras sintomáticas como Prevotella intermedia, Dialister Pneumosintes. En general, el número medio de fragmentos de restricción en muestras sintomáticas fue significativamente mayor que en muestras asintomáticas. Sassone et al (2007) evaluaron la composición de la microbiota de las infecciones primarias endodónticas en 111 casos seleccionados de un solo diente con pulpa necrótica. Se recogieron muestras de las canales de la raíz usando papel estéril de dos puntos a 1 mm por debajo del foramen apical. En cada muestra se aislaron 40 especies diferentes de bacterias. Se determinaron utilizando técnicas como sondas de ADN e hibridación ADNADN. El promedio de número de especies por muestra fue de 22. Las especies mas frecuentes fueron: Enterococcus faecalis (89,3%), Campylobacter gracilis (89,3%), Leptotrichia buccalis (89,3%), Neisseria mucosa (87,5%), nucleatum spp Prevotella Vincentii melaninogenica (85,7%), (86,6%), Eubacterium Fusobacterium saburreum (75,9%), Streptococcus anginosus (75%), y Veillonella parvula (74,1%). Rodríguez et al (2008) determinaron la presencia de microorganismos en el tejido pulpar y así mismo clarifica las causas de su muerte y su posterior daño a los tejidos periodontales. Selecciono 23 dientes y en 20 fue posible encontrar crecimiento microbiano, se encontró bacterias anaerobias estrictas, microorganismos entéricos y levaduras. Fusobacterium spp fue el microorganismo mas encontrado con 25%, seguido de Eubacterium spp en 15%, Peptostreptococcus spp., 10%; Campylobacter spp., 10%; bacilos entéricos Gram negativos, 10%; Porphyromonas gingivalis, 10%; Prevotella intermedia, 5%; Eikenellia corrodens, 5%; Dialister pneumosintes, 5%; y levaduras en 5%. No hubo evidencias de crecimiento de Actinobacillus actinomycetemcomitans, Tannerella forsythensis ni estreptococo β hemolítico. Los resultados en el presente estudio concluyeron claramente la presencia de microorganismos en lesiones apicales cerradas de origen endodóntico. De igual forma se evidenció que gran parte de los microorganismos encontrados son considerados periodontopatógenos lo que puede igualmente sugerir manejo compartido entre tratamiento endodóntico, periodontal y farmacológico. 5 CONCLUSIONES Desde que se demostró que la invasión microbiana de la pulpa, ocasiona una respuesta inflamatoria se han abierto numerosas líneas de investigación dirigidas a identificar los ecosistemas bacterianos en la pulpa. En el estudio bibliográfico realizado, se encontró gran variedad de microorganismos relacionados con esta patología y los géneros mas reportados fueron Fusobacterium spp, Peptostreptococcus spp, Prevotella spp, Streptococcus spp, Porphyromonas spp. Por otra parte se han encontrado otros microorganismos poco frecuentes relacionados con lesiones pulpares como: Olsenella spp, Coxiella burnetii, Dialister pneumosintes, Mogibacterium ssp, Megasphaera spp, Leptotrichia buccalis, Selenomonas sputigena, Serratia marcescens, Gemella spp, Tannerella forsythensis. 6. BIBLIOGRAFIA 1) Aboudharam, G; Lascola, B; Raoult D; Drancourt M. 2000. Detection of Coxiella burnetii DNA in dental pulp during experimental bacteremia. Microb pathog. Apr; 28 (4): 249-254. 2) Adriaens P.; Boever J.A., Loeche W.J. 1988. Bacterial Invasion in root cementum and radicular dentin of periodontal diseases teeth in humans. Journal Of periodontology. 59:222. 3) Aguilar. T. 2004. 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Microorganismos más frecuentes en el presente estudio ANEXO 9 MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE Para la preparación de placas de agar sangre y de agar sangre cocida destinadas al aislamiento y cultivo de diversos microorganismos, sobre todo patógenos exigentes y su determinación. Sin adición de sangre, es adecuado, por ejemplo, para la realización de hemocultivos (UPDYKE 1970) y como base para la preparación de diversos medios de cultivo especiales. El medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de APHA para el análisis de alimentos (1984). (Oxoid 2006). • Forma de actuación Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de crecimiento a todos los microorganismos presentes. El valor del pH de 6.8, es especialmente favorable para la conservación de los eritrocitos y para La formación de los halos hemolíticos claros (NORTON 1932). Para la determinación de las formas de hemolisis es adecuado añadir sangre de oveja, recién obtenida, desfibrinada. Por calentamiento, después de la adición de sangre, se obtiene el Agar sangre cocida (agar chocolate) que es un medio nutritivo excelente. (Oxoid, 2006). En realidad, cuando se utiliza como medio basal de cultivo, sin adición de sangre, se recomienda ajustar su pH entre 7.2 y 7.4, pues la mayoría de las bacterias forman colonias más precozmente y crecen con mayor exuberancia en un medio ligeramente básico. (Oxoid 2006). Según TARSHIS y FRISH (1951), para el aislamiento de bacterias tuberculosas a partir de esputos, es recomendable una adición de 1% de glicerina y 25% de sangre humana, lo que hace más fácilmente reconocible el crecimiento de colonias micobacterias, incluso en el caso de cantidades mínimas de estos gérmenes. Según HOSTY y col. (1953), resulta ya suficiente la adición de 0.1% de glicerina y 2.5 de sangre humana, junto con 100 U.I /ml de penicilina. Según SONDAG y col. (1977), BLACK y VAN BUSKIRK (1973), la adición de 5 mg/ml de gentamicina (por ejemplo, 0.1 ml gentamicina en solución), al agar sangre, posibilita el crecimiento selectivo De Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus, así como Bacteroides, Clostridium y levaduras. MISHRA y col. (1987) recomiendan un agar Ampicilina Sangre de oveja (ASBA 30) para el cultivo selectivo de Aeromonas. (Oxoid 2006). • Composición (g/litro) Sustrato nutritivo (extracto de corazón y peptonas) 20.0 Cloruro sódico 5.0 Agar agar Aditivo: sangre 50-80 ml • Preparación Disolver 40 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min a 121°C), dejar enfriar a 45-50 °C, incorporar 5 a 8 % de sangre desfibrinada y verter en placas pH: 6.8 +/- 0.2 El medio de cultivo preparado es, antes de la adición de la sangre, claro y amarillo parduzco y posteriormente a la adición de la sangre del color de la misma y no hemolizado. • Empleo e interpretación Sembrar las placas en superficie. Incubación: bajo condiciones casi siempre de 24 a 48 horas a 37°C. (Oxoid 2006). AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS Para el cultivo de microorganismos anaerobios, incluso muy exigentes y de crecimiento lento, a partir de material clínico e investigación. (Merck 1994). • Forma de actuación. Este medio de cultivo no selectivo, rico en nutrientes, garantiza tanto el cultivo de microorganismos anaerobios exigentes como de aerobios y microaerófilos. Favorece asimismo la formación del pigmento típico en el caso de Bacteroides. • Composición: Peptona de caseína 15.0 Peptona de harina de soja 5.0 Extracto de levadura 5.0 Cloruro sódico 5.0 L-cisteína 0.5 Hemina 0.005 Agar-agar 13.5 Aditivos: Vitamina K (phytomenadion) 0.01 Sangre de carnero desfibrinada 50 ml. • Preparación: Disolver 44g/litro, añadir 1 ml de solución de vitamina K y esterilizar en autoclave (15min a 121°C ) tras enfriamiento a 45-50°C, añadir mezclando, 50 ml de sangre de carnero estéril y verter en placas. pH 7.4 +/- 0.1 El medio de cultivo preparado es, antes de la adición de la sangre, claro y ligeramente parduzco y posteriormente del color de la misma y no hemolizada Preparación de la solución de vitamina K: disolver 1g de vitamina k en 99 ml de etanol absoluto. (Merck 1994). • Empleo e interpretación: Sembrar las placas en superficie. Incubación: en condiciones optimas de 24 a 48 horas 37 °C. Determinación de la formación de pigmento y del tipo de colonias y de hemolisis. (Merck 1994). AGAR BILIS ESCULINA Para la investigación preliminar de Enterococos (grupo serológico D), de acuerdo con la formulación propuesta por SWAN (1954), así como por FACKLAM y MOODY (1970). • Forma de acción La hidrólisis de la Esculina y la tolerancia a la bilis considerada como características fidedignas y constantes de Enterococos (Oxoid, 2006). En tanto que los Enterococos que toleran la presencia de bilis, pueden multiplicarse sin impedimento, numerosas bacterias acompañantes resultan notablemente inhibidas en su crecimiento por las sales biliares. Los Enterococos hidrolizan al glucósido Esculina convirtiéndolo en glucosa y esculetina. (Oxoid 2006). Esta ultima sustancia, con iones hierro (III) forma un complejo de color verde oliva hasta negro. Añadiendo suero de caballo al medio de cultivo puede optimizarse el crecimiento de Enterococos. (Oxoid 2006). • Composición (g/litro) Extracto de carne 3.0 Peptona de carne 5.0 Bilis de buey 40.0 Esculina 1.0 Citrato férrico 0.5 Agar agar. Adición de gentamicina • Preparación Disolver 64 g/ litro y esterilizar en autoclave. No recalentar! Tras enfriamiento a 45-50°C añadir eventualmente, 5% de suero y mezclar. Verter en placas. pH:6.6+/- 0.2 Las placas preparadas son claras y de color pardo azulado. • Empleo e interpretación Sembrar por sedimentación sutil el material a investigar. Incubación hasta 3 días a 37°C. En presencia de Enterococos, se produce por lo general ya al cabo de las primeras 24 horas una coloración oscura del medio alrededor de las colonias en crecimiento. Cuando estas son numerosas y llegar a confluir, el oscurecimiento producido puede llegar a afectar a la totalidad del medio de cultivo de la placa. (Oxoid 2006). Si al cabo de 3 días de incubación no se ha producido oscurecimiento alguno del medio de cultivo, se acepta que el material sembrado no tenía Enterococcus. (Oxoid 2006). AGAR SABOURAUD Para el cultivo de mohos y levaduras a partir, sobre todo, de materiales de envasado y embalajes, así como para el ensayo de sustancias antimicóticas. Este medio de cultivo corresponde por su composición a las recomendaciones del Instituto d Tecnología de Alimentos y de envasado de la Universidad Tecnológica de Múnich (1974). • Composición (g/litro) Peptona de caseína 5.0 Peptona de carne 5.0 D (+) glucosa 10.0 Maltosa 10.0 Agar agar. • Preparación Disolver 45 g/litro y esterilizar en autoclave (15 min a 121°C). ¡no sobrecalentar¡ pH 5.4 +/- 0.1 Las placas con medio de cultivo son claras y de color amarillento • Empleo e interpretación Sembrar el medio de cultivo. Incubación hasta 5 días a 25°C. (Oxoid 2006). AGAR PAPA DEXTROSA Es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosméticos. Puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este medio es recomendado para realizar recuento colonial. También puede ser utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clínica. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulación y la producción de pigmentos de algunos dermatofitos. Alguno procedimientos señalan bajar el pH del medio a 3.5 +/0.1 con acido tartárico al 10% para inhibir el crecimiento bacteriano. La infusión de papa promueve el crecimiento abundante de hongos y levaduras y el agar es adicionado como agente solidificante. (Merck 1994). • Composición (g/litro) Infusión de papa 200.0 Dextrosa 20.0 Agar agar pH 5.6 +/- 0.2 • Preparación Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta completa disolución y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121°C, enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de petri. (Merck 1994). • Interpretación Las levaduras se observan como colonias de color crema o blanco. Los hongos crecen como colonias difusas y de varios colores. (Merck 1994). AGAR TSBV Utilizado como medio selectivo apropiado pata el aislamiento de A. actinomycetemcomitans en el laboratorio. • Composición (g/litro) Agar tripticasa soya 40.0 Extracto de levadura 1.0 Bacitracina 75 mg Vancomicina 5 mg Suero de caballo estéril 0.1% Se homogenizo la solución hirviéndola a 100°C, se esterilizó en el autoclave de vapor, se atempero a 50°C y se le añadieron los antibióticos y el suero. (Merck 1994). CALDO Y MEDIO DE CULTIVO TIOGLICOLATO Para el cultivo y aislamiento de Anaerobios estrictos y facultativos, de gérmenes microaerofilicos y para ensayos de esterilidad. (Oxoid 2006). Por su composición ambos medios de cultivo corresponden a las recomendaciones de la United States Pharmacopoeia XXI (1980), a la European Pharmacopoeia II (1985) y a la APHA (1984). Corresponden además a las prescripciones analíticas apartado 35 de la LMBG para la investigación de alimentos. (Oxoid 2006). • Forma de acción Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteína, proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para Anaerobios exigentes. Debido a sus grupos sulfhidrilos, se activan las compuestos de arsénico, mercurio y de otros metales pesados. (Oxoid 2006). Los medios con tioglicolato son adecuados, por lo tanto, para la investigación de materiales que contengan metales pesados o conservantes en cuya composición participen dichos metales pesados. La elevada viscosidad del medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxigeno. El eventual aumento del contenido de oxigeno se pone en manifiesto por un viraje a rojo del indicador redox Rezarsurina sódica. (Oxoid 2006). • Composición Peptona de caseína 15.0 Extracto de levadura 5.5 L (+) cisteína 0.5 Cloruro sódico 2.5 Tioglicolato sódico 0.5 Rezarsurina sódica (ausente en caldo) 0.001 Agar agar (ausente en caldo) • Preparación Disolver 29 g/litro (para el caldo tioglicolato), o bien 30 g litro (para el medio de cultivo tioglicolato), distribuir en tubos y esterilizar en autoclave (15 min a 121°C) pH 7.1 +/- 0.2 Los medios de cultivo preparados son claro de color amarillento. A ser posible, estos medios de cultivo deben usarse recién preparados. En medio de cultivo tioglicolato ya no puede utilizarse cuando los tubos presenten coloración rosa debida a la penetración de oxigeno, en mas del tercio superior de la altura del medio y cuando dicha coloración no quede eliminada por ebullición (una sola vez). (Oxoid 2006). • Empleo e interpretación El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de cultivo. A continuación, puede superponerse una capa de aprox. 1 cm de altura de parafina liquida estéril o de agar agua. Incubación: varios días a temperatura optima. Los gérmenes anaerobios crecen en la parte inferior del tubo de cultivo. (Oxoid 2006). AGAR CEREBRO- CORAZON (BHI) Para el cultivo de diversos microorganismos patógenos exigentes. Estos medios de cultivo corresponden a las recomendaciones de los Standard methods for the examination of wáter and wastewater (1975). El caldo de cerebro-corazón corresponde a la norma DIN 10163 para el análisis de carnes y a las prescripciones según apartado 35 de la LMBG para el análisis de alimentos. (Merck 1994). • Composición (g/litro) Substrato alimenticio (extracto cerebro, extracto de corazón y peptona) 27.5 D (+) glucosa 2.0 Cloruro sódico 5.0 Hidrogenofosfato disódico 2.5 Agar-agar 15 • Preparación. Disolver 52g/litro (agar cerebro-corazón) y esterilizar en autoclave (15min a 121 °C) pH: 7.4+/- 0.2. El medio es ligeramente parduzco, presenta opalescencia. (Merck 1994). • Formas de actuación El agar cerebro corazón, aparte de su aplicación en el terreno bacteriológico, es adecuado también para el cultivo de hongos patógenos. El crecimiento de la flora bacteriana de acompañamiento puede inhibirse notablemente por adición de 20 UI de penicilina y 40 ug de estreptomicina por ml de medio de cultivo. (Merck 1994). Este medio de cultivo es menos adecuado para el estudio de formas hemolíticas (tras adición de sangre) debido a su contenido de glucosa. (Merck 1994). ANEXO 10: TECNICA DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un n número de veces: 1. Separación de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura, la cual rompe los enlaces de hidrógeno que mantiene unidos a las cadenas de ADN. 2. Adición de cadenas cortas de polinucleótidos, denominados cebadores, que Se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5’ ---3’ y otro a la cadena 3’—5’. 3. Disminución de la temperatura para permitir que los cebadores hibridasen con las cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de bases. 4. Adición de la ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos (ATP, GTP, TTP, CTP) y demás cofactores, para que tenga lugar la síntesis de la cadena complementaria. 5. Repetición de las etapas 1 a 4. Este proceso se caracteriza por ser exponencial. En cada ciclo se duplica la región de ADN ubicada entre los cebadores. Este procedimiento se realiza en un equipo denominado termociclador, que permite regular las diferentes temperaturas que se requieren para cada uno de los pasos. A continuación se enumeran ejemplos de agentes microbianos subclasificados en bacterias, virus y protozoario, que han sido identificados mediante PCR. Grafico tegnica de PCR. Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema12.pdf .