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MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE
ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogotá D.C. 16 de febrero de 2009
MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE
ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
Trabajo de grado
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGO AGRICOLA Y VETERINARIO.
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL.
NOTA DE ADVERTENCIA:
Artículo 23 de la resolución No.13 julio de 1946.
“la universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no tengas ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellos el anhelo de
buscar la verdad y la justicia”.
MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE
ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
APROBADO
_
________________________
Dra. Margarita Chaves Clavijo
Bacterióloga MSc
Directora.
______________________
Dr. Fredy Gamboa
Bacteriólogo Ph. D.
Jurado.
______________________
Dra. Mery Santaella
Bacteriòloga
Jurado.
MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE
ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL
APROBADO
__________________________
Ingrid Schuler.
Bióloga Ph. D.
Decana Académica.
______________________
Janeth Arias
Bacterióloga M.Sc-M. Ed
Directora de carrera
AGRADECIMIENTOS
Especialmente a nuestros padres, hermanas y amigos que apoyaron nuestro
trabajo a través de nuestra carrera.
A la Dra. Margarita Chaves Clavijo por su paciencia, dedicación y apoyo por
todo el largo proceso de finalización de nuestra carrera y por hacernos
excelentes personas y alcanzar la meta de ser excelentes profesionales.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION…………………………………………………….. 1
2. OBJETIVOS…………………………………………………………... 4
2.1 Objetivo General……………………………………………………... 4
2.2 Objetivos específicos………………………………………………… 4
3. MARCO TEORICO………………………………………………….. 5
3.1 MICROBIOLOGIA DE LA CAVIDAD ORAL…………………… 5
3.1.1 Adquisición de la flora microbiológica oral…………………… 6
3.2 LA PULPA DENTAL……………………………………………….. 7
3.2.1 Funciones de la pulpa…………………………………………...7
3.2.2 Exposición de la pulpa………………………………………….. 9
3.2.3 Filtraciones marginales de las restauraciones…………………... 10
3.2.4 Contigüidad……………………………………………………... 10
3.3 VIAS DE ACCESO DE LOS MICROORGANISMOS A LA PULPA.11
3.3.1 Acceso mediante túbulos dentinarios……………………………. 11
3.3.2 Acceso Vía Periodontal…………………………………………..14
3.3.3 Vía Hematógena………………………………………………….15
3.3.4 Papel de los microorganismos en la patología pulpar…………...16
3.4
EL MEDIO ENDODONTICO……………………………………..18
3.4.1 Requerimientos para un patógeno endodóntico…………………19
3.4.2 Fisicoquímicos………………………………………………….. 20
3.4.3 Factores de Adhesión, Agregación y Coagregación……………..21
3.4.4 Nutricionales……………………………………………………. 22
3.4.5 Protectores del huésped…………………………………………..22
3.4.6 Antagónicos intermicrobianos………………………………….. 22
3.4.7 Modelos de relación microbiana……………………………….. 22
3.4.8 Actividad enzimática bacteriana………………………………... 25
3.5
MICROORGANISMOS MAS FRECUENTES ASOCIADOS A LAS
LESIONES PULPARES…………………………………………...26
3.5.1 Fusobacteriumnucleatum………………………………………...26
3.5.2 Porphyromonas gingivalis………………………………………..27
3.5.3 Prevotella spp…………………………………………………….29
3.5.4 Peptostreptococcus spp…………………………………………..30
3.5.5 Streptococcus mutans………………………………………….....31
3.5.6 Enterococcus spp…………………………………………………33
3.5.7 Candida albicans……………………………………………….....34
3.5.8 Filifactor alocis……………………………………………………35
3.6 MICROORGANISMOS POCO FRECUENTES EN LESIONES
PULPARES……………………………………………………………….37
3.7 MEDIOS DE CULTIVO……………………………………………..40
3.7.1 Análisis Microbiológico…………………………………………..42
3.8 TÉCNICAS MOLECULARES………………………………………45
3.8.1 Reacción de Hibridación………………………………………….48
3.8.2 Tipos de Hibridación……………………………………………...50
3.8.3 Amplificación de Ácidos Nucleícos……………………………....51
3.8.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)……………………52
3.8.4.1 Detección del Producto Amplificado…………………… 53
3.8.4.2 Modificaciones de la PCR………………………………..54
3.8.5 NASBA…………………………………………………………54
3.8.6 ADN Ramificado……………………………………………….55
3.8.7 Técnicas Moleculares Aplicadas a Taxonomías Microbianas…..56
3.8.7.1 Contenido G+C…………………………………………...56
3.8.7.2 Hibridación ADN-ADN…………………………………..56
3.8.7.3 Patrones de enzimas de Restricción……………………….57
3.8.7.3.1 Polimorfismos de la Longitud de lo Fragmentos
De Restricción (RFLP)…………………………...57
3.8.7.3.2 Electroforesis en Gel del Campo Pulsátil (PFGE).58
3.8.8 Secuenciación de Ácidos Nucleícos…………………………….58
3.8.9 Técnicas ARNr16S……………………………………………...59
4. ANALISIS BIBLIOGRAGICO DE ESTUDIOS REALIZADOS…...63
5. CONCLUSIONES…………………………………………………….82
6. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………...83
7. ANEXOS………………………………………………………………96
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales géneros y especies de microbiota oral………37
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Microfotografía al Microscopio Electrónico de Barrido mostrando.
Candida spp……………………………………………………………..71
INDICES DE ANEXOS
ANEXO 1. Fusobacterium nucleatum………………………………………... 96
ANEXO 2. Porphyromonas gingivalis……………………………………….. 96
ANEXO 3. Prevotella intermedia…………………………………………….. 97
ANEXO 4. Peptostreptococcus spp………………………………………….. 97
ANEXO 5. Streptococcus mutans…………………………………………….. 98
ANEXO 6. Enterococcus faecalis…………………………………………….. 98
ANEXO 7. Candida albicans………………………………………………….. 99
ANEXO 8. Microorganismos referentes en el estudio bibliográfico……… 100
ANEXO 9. Tipos de Medios de Cultivo………………………………………. 101
ANEXO 10. Tecnica Reaccion en Cadena de Polimerasa (PCR)………..112
1. INTRODUCCION
La pulpa es un tejido blando de origen mesenquimatoso con células
especializadas, los odontoblastos, que se colocan periféricamente en
contacto directo con la matriz dentinal. La íntima relación
entre los
odontoblastos y la dentina es una de las razones por la que la dentina y la
pulpa deben considerarse como una entidad funcional, a veces denominada
complejo dentino pulpar. (Cohen, 2006).
La pulpa constituye un sistema microcirculatorio cuyos componentes
vasculares más grandes son las arteriolas y las vénulas. Ninguna arteria o
vénula sale o entra de la pulpa. El tejido pulpar está protegido en su parte
externa por el esmalte y la dentina y la dentina a nivel coronal, a nivel
radicular por la dentina y cemento. Cuando algún agente externo genera una
lesión a estos tejidos puede comprometer la integridad de la pulpa y
ocasionar cambios inflamatorios o degenerativos a nivel de este tejido que
puede variar en magnitud y severidad (Rodríguez et al 2008)
Según Bascones et al (1995) y Brau et al. (1995) la caries dental es la razón
fundamental por la que la pulpa se ve afectada por procesos infecciosos,
aunque también se pueden producir colonizaciones bacterianas a través de
los márgenes de obturación o por fracturas dentarias, así mismo, los
procesos periodontales pueden ser el camino por el que lleguen bacterias a
la pulpa. Otras causas que motivan una afectación pulpar pueden ser
iatrogénicas, y en concreto la manipulación dental con instrumental rotatorio
sin la adecuada refrigeración o la aplicación de fármacos cavitarios o
materiales de restauración, que son procedimientos que, por la frecuencia de
su empleo, se encuentran entre las causas más frecuentas de patología
pulpar.
La pulpitis hace referencia a un estado inflamatorio de la pulpa que puede ser
agudo o crónico y en distintas formas evolutivas según criterios clínicos o
histopatológicos (Regezi et al, 2000)
La gran variedad anatómica y tisular existente en la cavidad oral, entre otros
factores, hace posible la convivencia de diferentes ecosistemas microbianos,
cada uno con características metabólicas y nutricionales específicas y todos
ellos conviviendo dentro de un delicado equilibrio ecológico (Gutiérrez, et al
2004)
Ahora bien como comenta Rodríguez et al, (2008) ante el hallazgo de
muerte pulpar y posterior daño a tejidos del periápice se cuestiona el origen
de estos mismos a partir de factores iatrogénicos bacterianos o químicos, por
tanto ellos determinaron cuales son los microorganismos que se hallan en
estos dientes y pudiendo establecer su procedencia. Por esto mismo es de
vital importancia y de conocimiento, saber que son propios de la enfermedad
pulpar microorganismos que se ven vinculados en la etiología tales como:
Fusobacterium,
Prevotella,
Porphyromonas,
Treponema,
Actinomyces,
Streptococcus, Peptostreptococcus y muchos otros.
La naturaleza polimicrobiana de las infecciones en la cavidad oral, permite
que se produzcan fenómenos de simbiosis y de sinergia bacteriana. Hasta el
inicio de la pulpitis, las bacterias implicadas serán principalmente aerobias;
sin embargo su proliferación originará condiciones de anaerobiosis y la
necrosis vasculonerviosa pulpar, creándose así condiciones favorables para
el crecimiento de bacterias anaerobias facultativas y, posteriormente, de
anaerobias estrictas principales responsables de los procesos infecciosos
(Gutiérrez, et al 2004).
El número de bacterias que colonizan la pulpa o el periápice es directamente
proporcional a la magnitud de la puerta de entrada de las mismas. Cuanto
más importante sea la invasión bacteriana, en poco intervalo de tiempo,
mayor será la respuesta inflamatoria reactiva. Sin embargo, más que el
número, tiene mayor relevancia la capacidad que tengan las bacterias de
multiplicarse (Canalda-Brau, 2006); Por tanto las bacterias pueden utilizar
diversas puertas de entrada hacia la cavidad pulpar. En función de su
magnitud y proximidad, la patología se instaura rápidamente o de forma
prolongada.
Así desde que se demostró que la invasión microbiana de la pulpa casi
siempre cursaba con una respuesta inflamatoria pulpar, se han abierto
numerosas líneas de investigación dirigidas a identificar los ecosistemas
bacterianos de la cavidad pulpar.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general:
Realizar una revisión bibliográfica del tema: “Microbiología en
lesiones
pulpares”, y las metodologías aplicadas para la identificación de estos
microorganismos relacionados en esta patología.
2.2 Objetivos específicos:
•
Revisar las especies de microorganismos más frecuentes en lesiones
pulpares.
•
Describir las características microbiológicas y ecológicas de los
microorganismos presentes en lesiones pulpares.
•
Analizar las técnicas utilizadas en la determinación de la flora
microbiológica de las lesiones pulpares.
3. MARCO TEORICO
3.1 MICROBIOLOGIA DE LA CAVIDAD ORAL
La cavidad oral se compone de un conjunto de tejidos, asociados a
numerosos microorganismos constituyendo ecosistemas, con modificación
constante. Según la composición de la microbiota y los tejidos se dividen en
saliva, superficie epitelial del surco crevicular, superficie dental del surco
crevicular, dorso de la lengua y epitelio bucal. Cuando este sistema ecológico
esta en equilibrio se denomina eubiosis, y cuando se altera dicho equilibrio
se conoce como disbiosis, correspondiendo a una boca enferma a partir de la
cual puedan iniciarse procesos que desencadenen la destrucción del diente y
o sus tejidos de soporte. (Fraile, 2003).
En la cavidad oral
se pueden aislar más de 500 especies de
microorganismos; la mayoría corresponde a la microbiota transitoria o de
paso, quedando como microbiota residente o habitual unas 20 especies y
predominado entre ellas la microbiota Gram positiva, principalmente los
estreptococos del grupo viridans componiendo el 90% de la microbiota oral.
El resto de microorganismos presentes se distribuyen entre cocos Gram
negativos como Neisseria; bacilos Gram positivos anaerobios ramificados
como Actinomyces, bacilos Gram positivos como
Lactobacillus
y
Bifidobacterium; bacilos Gram negativos anaerobios como Bacteroides,
Prevotella, Fusobacterium etc. Aunque en menor proporción, podemos
encontrar en la cavidad oral normal espiroquetas, comensales y hongos
como Candida albicans. (Fraile, 2003). (Tabla 1)
3.1.1 Adquisición de la flora microbiológica oral.
La flora bacteriana se instala en la cavidad oral en forma progresiva desde el
nacimiento. El niño nace con una cavidad oral estéril
y la primera
contaminación se produce en el parto por las bacterias de la flora vaginal.
Los siguientes microorganismos que colonizan son los que se encuentran en
el ambiente en estado libre o que se trasmiten al niño por personas más
cercanas a él. A los tres meses de vida aun se pueden encontrar
Streptococcus en el 95% de la población. Con la erupción de los primeros
dientes aparecen también nuevos hábitats para la colonización, como el
esmalte dental y el surco gingival. Esto permite la aparición de nuevas
bacterias como Fusobacterium, Actinomyces y Veillonella. En esta etapa los
anticuerpos maternos ya han desaparecido del suero del niño y este empieza
a
crear
sus
propias
defensas
inmunológicas,
constituidas
por
inmunoglobulinas séricas IgA secretadas en la saliva. Cuando se produce la
erupción de dientes permanentes, el período de recambio se acompaña de
fenómenos inflamatorios, que permite que se favorezca la colonización de
bacterias potencialmente patógenas. La conformación de la flora oral
definitiva se concreta desde la adolescencia, en donde los cambios
hormonales permiten el crecimiento de la mayoría de Bacteroides. La
prevalencia
de
Prevotella
intermedia
y
Treponema
denticola
es
especialmente elevada, pero la prevalencia de A. actinomycetemcomitans y
Porphyromonas gingivalis, se mantienen bajas. La totalidad de factores
habitacionales del ecosistema oral se establecen completamente en la edad
adulta y comprende una amplia diversidad de microorganismos. (Liébana,
1997).
3.2 PULPA DENTAL
La pulpa dental es el tejido blando localizado en el centro del diente; forma,
soporta y está rodeado por dentina. En general, se considera a la pulpa como
un tejido blando laxo especializado. La pulpa dental alberga un gran número
de elementos titulares, incluido los nervios, el tejido vascular, fibras de tejido
conectivo, sustancia fundamental, líquido intersticial, los odontoblastos, los
fibroblastos y otros componentes celulares menores. (Walton, 1996).
La función primaria de la pulpa es formativa, debido a que de ahí surgen los
odontoblastos que forman la dentina. En el desarrollo temprano del diente,
los odontoblastos también interactúan con las células del epitelio dental para
formar esmalte. Después de la formación dental la pulpa proporciona varias
funciones secundarias relacionadas con la sensibilidad, hidratación y defensa
del diente. (Walton, 1996).
3.2.1 Funciones de la pulpa
Durante toda su vida la pulpa lleva a cabo cinco funciones:
•
Inducción:
La pulpa participa en la inducción y el desarrollo de odontoblastos y dentina,
que cuando se forman inducen a la formación de esmalte. Estos procesos
tienen actividades interdependientes, de tal manera que los ameloblastos
influyen en la diferenciación de odontoblastos, y los odontoblastos y la
dentina en formación de esmalte. Esta interacción epitelial mesenquimatosa
es la esencia de la formación dental. (Walton, 1996).
•
Formación
Los odontoblastos forman dentina; estas células altamente especializadas
participan en la formación de dentina de tres maneras: a) al sintetizar y
secretar matriz orgánica; 2) al transportar de manera inicial componentes
inorgánicos a la matriz de nueva formación. 3) al crear un ambiente que
permita la mineralización de la matriz. Durante el desarrollo temprano del
diente, la dentogènesis primaria por lo general es un proceso rápido después
de completar la maduración dental, la formación de dentina continúa de una
forma mucho más lenta y en un patrón menos simétrico. (Walton, 1996).
•
Nutrición
Por medio de los túbulos dentinarios, la pulpa suministra nutrientes que son
esenciales para la formación de dentina e hidratación. (Walton, 1996).
•
Defensa
Los odontoblastos forman dentina en respuesta a la lesión, en particular
cuando el grosor original de la dentina está afectado por caries, desgaste,
traumatismo o procedimiento de restauración. Los odontoblastos (o sus
células de reemplazo) también tienen la capacidad de formar dentina en
sitios donde se perdió la continuidad (exposición pulpar), por medio de la
diferenciación de nuevos odontoblastos
o células parecidas a los
odontoblastos en el sitio de exposición. Sin embargo, la cantidad de dentina
producida en respuesta a la lesión no es la misma que se produce de manera
fisiológica ni proporciona el mismo grado de protección al tejido pulpar
subyacente. (Walton, 1996).
La pulpa también tiene la capacidad de producir una respuesta inflamatoria e
inmunológica en un intento por neutralizar o eliminar la invasión de la dentina
por microorganismos causantes de caries y sus productos. (Walton, 1996).
•
Sensibilidad
A través del sistema nervioso la pulpa trasmite las sensaciones mediadas por
el esmalte o dentina a los centros nerviosos más altos, estos estímulos se
expresan a nivel clínico como dolor, aunque estudios fisiológicos y
psicofisiológicos indican que la pulpa también siente temperatura y tacto.
También trasmite sensaciones de dolor profundo causado por enfermedad,
principalmente de tipo inflamatorio. (Walton, 1996)
3.2.2 Exposición de la pulpa
La exposición pulpar directa, sea de origen traumático, como la fractura
coronaria o iatrogénica causada por procedimientos operatorios, rompe la
barrera física impuesta por las estructuras dentarias, poniendo la pulpa en
contacto con el ambiente séptico de la cavidad oral (Estrela, 2005)
Debido a la exposición de la pulpa a la flora oral, ésta y su dentina
circundante
Pueden dar asilo a las bacterias y a sus productos derivados. Dependiendo
de la virulencia de las bacterias, la resistencia del huésped, la cantidad de
flujo sanguíneo y el grado de drenaje, el tejido pulpar puede permanecer
inflamado durante un largo periodo de tiempo o necrotizarse rápidamente.
Tras la necrosis pulpar, todo el sistema de canal radicular se infecta con
distintas especies de bacterias, las cuales pueden extenderse desde este
sistema hacia el ligamento periodontal a través del foramen apical o de los
canales laterales. La presencia de bacterias en el sistema del canal radicular
suele dar a lugar al desarrollo de lesiones perirradiculares y, en ocasiones
laterales. (Cohen, 1999)
Si la pulpa queda expuesta, como ocurre por ejemplo en la caries esta queda
expuesta a toda flora oral. Los estreptococos alfa-hemolíticos, los
Enterococos spp. Y Lactobacilos spp. Son los que se encuentran con más
frecuencia. A medida que aumenta el espesor de la pulpa necrótica, se
establece un mayor número de especies anaeróbicas obligadas, entre las
cuales se incluyen los cocos anaeróbicos Gram positivos y los bacilos Gram
negativos, que son favorecidos por la baja concentración de oxigeno
existente en las zonas necróticas de la pulpa (Cohen, 2002)
3.2.3 Filtraciones marginales de las restauraciones
Se producen a través de la interface existente entre el material de
restauración y el diente. Errores en la técnica operatoria, como adaptaciones
inadecuada en los márgenes de la corona a la línea de terminación del
tallado, errores en el manejo de los materiales de obturación, o la fatiga o
alteraciones de los mismos que se produce con el paso del tiempo, pueden
dar lugar a discrepancias significativas en el material de restauración y la
estructura dentaria restaurada. (Liébana, 2002).
3.2.4 Contigüidad
La infección de la pulpa dental puede acontecer a consecuencia de procesos
infecciosos adyacentes, las alteraciones óseas como la osteítis y la
osteomielitis y la presencia de quistes en áreas apicales en el propio diente
conducen con frecuencia a la necrosis pulpar. (Liébana, 2002).
Independientemente de las vías de entrada, una vez que han penetrado en el
tejido pulpar, las bacterias colonizan, se multiplican y contaminan todo el
sistema radicular. Dependiendo del nivel de la concentración de oxigeno y de
la presencia o ausencia de los nutrientes esenciales en el sistema radicular,
existen grupos específicos de bacterias que sobreviven y forman la flora de
los canales radiculares infectados. (Adriaens, 1988)
Las bacterias anaerobias producen ácidos grasos de cadena corta, como el
ácido propiónico, butírico e isobutírico. Estos son factores de virulencia que
afectan la quimiotaxis de los neutrófilos y la fagocitosis.
Estas bacterias
están en un estado dinámico influido por la interacción entre las bacterias y el
hospedero. Aunque esta microbiota es menos compleja que la microbiota
subgingival, se produce una serie de relaciones ecológicas interbacterianas.
(Walton, 1996).
3.3 VÍAS DE ACCESO DE LOS MICROORGANISMOS A LA PULPA
DENTAL
El acceso de microorganismos a la estructura pulpar se puede dar
básicamente por el acceso vía túbulos dentinarios y a través de vías
periodontal y hematógenas.
3.3.1 Acceso mediante túbulos dentinarios
Como consecuencia de la pérdida del esmalte o del cemento, los túbulos
dentinales están expuestos a las bacterias presentes en la cavidad oral. Los
túbulos dentinales se extienden desde la pulpa hasta las uniones esmalte
dentina y cemento dentina. Debido al tamaño y el número de túbulos en la
dentina, los microorganismos pueden penetrar, multiplicarse e invadir los
numerosos túbulos expuestos. La lentitud de la invasión de la dentina viable
por las bacterias pueden deberse a la presencia de factores de resistencia
naturales en la dentina y tejido pulpar. (Liébana, 2002).
Hoshino et.al (1992) utilizaron procedimientos anaeróbicos para comprobar la
rápida invasión bacteriana de las pulpas dentales no expuestas, las cuales se
cubrían con dentina clínicamente sana por debajo de las lesiones producidas
por caries. Seis de cada nueve dientes sufrían invasión bacteriana, siendo
los organismos predominantes los anaerobios obligados.
La presencia de bacterias, de sus productos derivados y de otros irritantes en
los túbulos dentinales suelen generar respuestas inflamatorias en el tejido
pulpar. La inflamación de la pulpa también puede producirse cuando los
túbulos dentinales transportan sustancias irritantes desde las caries
incipientes a la pulpa o cuando los túbulos contienen y permiten el paso de
los microorganismos existentes bajo los materiales dentales de restauración
o cerca de las bolsas periodontales. (Cohen, 2006).
La eliminación del cemento durante el tratamiento periodontal puede exponer
numerosos túbulos dentinales a la flora oral, lo que en ocasiones permite que
los microorganismos penetren el tejido pulpar. La producción de un barrillo
dentinario durante la manipulación de la raíz, así como los iones de calcio y
fósforo de la saliva, pueden retardar la invasión de los túbulos dentinales por
los microorganismos orales. (Cohen, 2006).
Sen et al. (1995) definen el barrillo dentinario como una capa de material
amorfo, irregular y granular, compuesta por dentina, restos de tejido pulpar y
procesos odontoblásticos y, en ocasiones, por bacterias. Cuando los canales
radiculares se instrumentan durante el tratamiento endodóntico, siempre se
forma esa capa en las paredes del canal.
La mayoría de autores opinan que las bacterias productoras de ácido
invaden los túbulos y desmineralizan las paredes. Las especies proteolíticas,
que actúan sobre la matriz orgánica, la cual es denudada en los túbulos
dentinales ensanchados, los ácidos, metabolitos y productos tóxicos se
difunden más rápidamente que las bacterias, con lo cual los odontoblastos
resultan afectados y, posiblemente, destruidos. Si las bacterias pueden ser
eliminadas en su avance, es posible conseguir la curación. La caries dental
es la causa más común de las lesiones pulpares, y muchas reacciones de la
pulpa pueden ser infecciones prolongadas de los túbulos dentinales, que se
originan desde el fondo de la cavidad y las paredes como consecuencia de la
filtración de materiales de relleno. Si no se tratan, las bacterias acaban por
afectar el tejido pulpar y dan lugar a la inflamación. El número de bacterias
aumenta, los leucocitos neutrófilos polimorfonucleares se infiltran y se forma
un absceso, provocando la muerte del tejido pulpar. (Cohen, 2006)
A partir de la expansión de la lesión cariosa en sentido centrípeto o durante
intervenciones odontológicas, los microorganismos pueden utilizar esta vía
para llegar a la pulpa; es la vía más comúnmente utilizada, siendo la lesión
de caries la fuente más frecuente de infección (Estrela, 2005) además
Dahlen-Moller (1991) y Siqueira (1997) a partir de sus estudios llegaron a la
conclusión
que esa invasión solamente ocurre cuando el grosor de la
dentina alcance como máximo 0.2 mm entre los limites cariosos y pulpar, y
que es garantizada gradualmente por el proceso de división celular,
favorecida, a veces, por el efecto mecánico de la masticación.
3.3.2 Acceso Vía Periodontal
Muchas veces tenemos una injuria y/o compromiso pulpar en dientes con
ausencia de caries (coronas íntegras) y con presencia de restauraciones. Las
piezas dentarias comprometidas periodontalmente, suelen sufrir una invasión
microbiana proveniente de microorganismos presentes en las bolsas
periodontales y que tiene acceso a la pulpa mediante los conductos laterales,
conductos accesorios y a través del delta apical, (De Lorenzo 2004., Liébana,
1997).
Existen múltiples anastomosis entre vasos sanguíneos y linfáticos de la pulpa
y del periodonto, lo que facilita el pasaje de los microorganismos. (Liébana
1997).
Adriaens et al. (1988) examinaron la presencia de bacterias en la dentina de
dientes con complicaciones periodontales y las comparó con la dentina de
dientes sanos, encontrando más microorganismos en la dentina y pulpa de
los dientes con compromiso periodontal. La eliminación del cemento durante
un tratamiento periodontal puede exponer numerosos túmulos dentinarios a
la flora oral, permitiendo que los microorganismos penetren hasta la pulpa.
Estrela et al. (2005) y a partir de estudios realizados por Dahlen-Moller
(1991) comentan que esa vía puede ser facilitada a los microorganismos,
por ejemplo, durante la realización de una profilaxis dentaria, y a
consecuencia de una luxación y, más significativamente, a partir de la
migración de la inserción epitelial durante el establecimiento de una bolsa
periodontal. En relación con esa vía, es pertinente considerar que la
capacidad de locomoción de ciertos microorganismos periodontopatógenos,
como Wolinella y Selenomonas, les garantiza las condiciones ecológicas
para llegar hasta la pulpa y eventualmente colonizarlas.
Existe una relación causa-efecto entre la infección del canal radicular,
lesiones perirradiculares o laterales y la penetración de las bacterias en la
dirección opuesta (hacia la pulpa). Teóricamente, los canales laterales
limpios y el foramen apical adyacente a las bolsas periodontales deberían
proporcionar el acceso a los microorganismos orales al sistema del canal
radicular. Cuando se infecta la pulpa a través del foramen apical, un requisito
previo parece ser siempre la existencia de un mal estado de la pulpa para
que se produzca la infección. Grossman (1967) aplico Serratia marcescens
sobre la encía labial de dientes de perros y monos, y los traumatizo con una
pesa metálica. Al encontrar este microorganismo en el tejido pulpar, llego a la
conclusión de que el ligamento periodontal proporcionaba una vía para el
paso de estos organismos hacia el tejido pulpar. (Cohen, 1999)
3.3.3 Vía Hematógena
La infección vía hematógena es rara. Esta vía de infección está dada por el
fenómeno de la anacoresis, que se define como la atracción positiva de los
microorganismos presentes en la circulación sanguínea hacia los tejidos
inflamados o necróticos durante una bacteremia. Se considera así pues, que
para que se dé una instalación de bacterias circulantes en el torrente
sanguíneo, generalmente se requiere una inflamación o necrosis previa de la
pulpa. La detección de microorganismos que no pertenecen a la microbiota
normal de la cavidad oral, nos sugiere una infección por esta vía. Otra
manera de que la pulpa se infecte es la presencia de un foco infeccioso
adyacente. (Adriaens, 1988)
Cuando la pulpa se infecta a través de cualquiera de los mecanismos
explicados, el mal estado de ésta es prerrequisito para que se produzca
dicha infección. Cuando tienen lugar infecciones retrógradas, generalmente
están involucradas pocas especies bacterianas. (Liébana, 2002).
En los casos de necrosis asépticas (que se puede producir por la supresión
de la irrigación sanguínea) motivada por un traumatismo, el tejido necrótico
se mantendrá libre de bacterias hasta su posterior infección, la cual se puede
dar por cualquiera de las vías antes ya expuestas. (Adriaens, 1988)
3.3.4 Papel de los microorganismos en la patología pulpar
Ha sido reconocido ampliamente que los microorganismos juegan un papel
fundamental en el desarrollo y mantenimiento de las patologías pulpares y
periapicales. Normalmente la pulpa dental es un tejido estéril y está
principalmente involucrada en la producción de dentina y en la sensibilidad
del diente. (Kettering J, 1999).
Cualquier lesión de la pulpa puede desencadenar una respuesta inflamatoria
de la misma. Si bien los irritantes pueden ser de naturaleza física, térmica o
química, los microorganismos son considerados el principal agente
etiológico. Las patologías pulpares y periapicales suelen ser un resultado
directo o indirecto de la presencia de bacterias y otros microorganismos en el
medio bucal. (Dahlen et al. 2000).
Dado que los microorganismos desempeñan un papel primordial en la
patogénesis de las lesiones pulpares y perirradiculares es preciso manejar
los fundamentos de la microbiología endodóntica para entender el papel que
desempeñan en estas afecciones, las vías de difusión de la infección pulpar y
periapical, las respuestas de los tejidos ante estos agresores y los métodos
utilizados para controlar y erradicar las infecciones del sistema de conductos
radiculares. (Love et al. 2002).
La pulpa y la dentina forman un complejo funcional el cual es protegido tanto
por sustancias exógenas de la cavidad bucal como por estructuras dentarias
(el esmalte y el cemento). Cuando el complejo dentino-pulpar es infectado,
los tejidos reaccionan en contra de los microorganismos invasores a fin de
erradicarlos. La capacidad de este complejo de realizar esta función no ha
sido subestimada, ya que los tejidos están dotados con procesos
inmunocompetentes. Sin embargo, en términos clínicos, si la infección no es
erradicada a través de esos procesos naturales o procedimientos
operatorios, los microorganismos invaden el complejo dentino-pulpar
venciendo las defensas y causando la enfermedad pulpar, e infectando la
cámara pulpar y el sistema de conductos radiculares. (Love et al. 2002).
El sistema de conductos radiculares está en abierta comunicación con los
tejidos periapicales (ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar) por las
vías del foramen apical, conductos laterales y accesorios. Los metabolitos y
productos tóxicos son producidos principalmente por las bacterias presentes
dentro del sistema de conductos radiculares y se difunden a los tejidos
periapicales desencadenando la respuesta inflamatoria (periodontitis apical),
la cual se caracteriza por resorción del hueso alveolar. La enfermedad
periapical inducida por microorganismos por lo general comienza como una
inflamación de tipo crónico y se manifiesta histopatológicamente como un
granuloma. (Love et al. 2002).
La invasión de los túbulos dentinarios por microorganismos ocurre cuando la
dentina está expuesta al medio bucal. Esto puede ocasionarse por lesiones
de caries, procedimientos restauradores o periodontales, fisuras de esmalte o
dentina, o traumatismo dental. (Peters et al. 1995).
El avance de las
bacterias del proceso carioso traerá como consecuencia la infección de la
pulpa dental y del sistema de conductos radiculares y el consecuente
desarrollo de lesión perirradicular. Sin embargo, las bacterias asociadas a la
caries dental difieren de las asociadas a la infección pulpar. (Love et al. 2002)
3.4 EL MEDIO ENDODÓNTICO
El medio endodóntico es un sistema complejo y dinámico. Complejo, púes
tenemos el conducto radicular, con sus características particulares en cuanto
a forma y a distribución (conductos amplios, atrésicos, curvos, rectos,
bifurcados, conductos accesorios, conductos laterales, deltas apicales)
conforman una red amplia de “microambientes” de difícil acceso y que
favorecen (por contener tejido necrótico como fuente de nutrientes) el
crecimiento de microorganismos. Dinámico, pues los microorganismos
implicados en una lesión inicial de la pulpa no serán los mismos que se
encuentren en una necrosis pulpar, en la que se forma un ecosistema
radicalmente diferente. En este medio ambiente particular, que es el
endodóntico, cobra importancia el concepto de sucesión microbiana
(Liébana, 1997).
La sucesión microbiana es el proceso mediante el cual se produce una
variación o un cambio de microorganismos condicionado por alteraciones en
el hábitat. Es lógico, por tanto, esperar un cambio en cuanto a la composición
de la flora bacteriana, pues se produce una alteración radical del medio
ambiente endodóntico. De pulpas recientemente infectadas, son aisladas
mayores proporciones de bacterias Gram positivas, anaerobias facultativas y
sacarolíticas, tales como Lactobacillus y Actinomyces spp. (Liébana, 1997).
Con la evolución del proceso infeccioso, estas bacterias van consumiendo
gradualmente el oxígeno presente en el medio y las condiciones en el interior
del conducto se van paulatinamente alterando, favoreciendo el desarrollo de
bacterias anaerobios estrictos, siendo la mayoría de éstas Gram negativas y
proteolíticas. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996).
La particularidad de estas bacterias, tales como: Prevotella, Porphyromonas
y Fusobacterium, es su ubicación inicial en el periápice, región de la cual
pueden obtener fácilmente el exudado rico en contenido proteico y en donde
las condiciones de anaerobiosis son las más propicias. Con el desarrollo de
la necrosis, éste exudado pasa a todo el canal, aportando el contenido
proteico y permitiendo el predominio de estas bacterias a lo largo de todo el
sistema endodóntico. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996). Toda infección
endodóntica es de carácter polimicrobiana. (Brook et al. 1996).
Los anaerobios no son encontrados en cultivos puros porque su naturaleza
sinérgica requiere de nutrientes específicos para su crecimiento, los mismos
que son aportados por otro tipo de microorganismos. (Sundqvist, 1992).
3.4.1 REQUERIMIENTOS PARA UN PATÓGENO ENDODONTICO
Para que un microorganismo logre su objetivo deben darse ciertos
requerimientos:
•
Los
microorganismos
suficientes
•
deben
estar
presentes
en
cantidades
para iniciar y mantener una lesión periapical
Poseer factores de patogenicidad, que puedan expresarse durante el
proceso infeccioso
•
Deben localizarse espacialmente en el canal radicular para que sus
factores de patogenicidad alcancen los tejidos periapicales
•
El canal radicular debe permitir la supervivencia y crecimiento de los
microorganismos.
•
Las relaciones antagónicas entre los microorganismos no deben
darse o presentarse en baja proporción.
•
El huésped debe defenderse, inhibiendo la diseminación de la
infección, éste proceso puede resultar en daño del tejido periapical.
(Siqueira et al. 2002).
Los microorganismos que componen la microflora oral, coexisten en
ecosistemas primarios que están regulados por una serie de factores
conocidos como determinantes ecológicos que son de cinco tipos: (Liébana,
1997).
•
Fisicoquímicos
•
De adhesión, agregación y coagregación
•
Nutricionales
•
Protectores del huésped
•
Antagónicos interbacterianos
3.4.2 Fisicoquímicos:
a) Humedad
Las bacterias dependen de ella para el intercambio de nutrientes, para las
reacciones metabólicas y para la eliminación de productos inhibidores de
desecho. (Liébana, 1997).
b) pH
En la cavidad oral en condiciones normales oscila entre 6.7 y 7.5, pero
constantemente esta sometido a variaciones que afectan el metabolismo
bacteriano. (Liébana, 1997).
c) Temperatura
La temperatura oral está próxima a los 37º C pero tiende a variar
transitoriamente por la ingesta de alimentos calientes o fríos por lo que se
eliminan microorganismos de forma transitoria. (Liébana 1997).
d) Potencial de óxido-reducción
El hábitat de los gérmenes anaerobios tiene una baja tensión de oxígeno y
un potencial de óxido reducción disminuido, resultado de la actividad
metabólica de los microorganismos que consumen oxígeno mediante su
respiración. (Liébana 1997).
3.4.3 Factores de Adhesión, Agregación y Coagregación
a) Adhesión
Es la interrelación que se da entre los microorganismos y el huésped,
lo que permite la colonización de los tejidos.
b) Agregación y Coagregación
Unión entre bacterias de la misma o diferente especie
respectivamente que les permite acumularse y formar colonias.
(Liébana 1997).
Entre las especies mas comunes en los canales radiculares necróticos, se
encuentra, Fusobacterium nucleatum, el cual muestra una alta habilidad para
coagregarse in vitro con la mayoría de las bacterias orales (Sundqvist G.
1992).
3.4.4 Nutricionales
La microbiota oral obtiene sus nutrientes de tres fuentes distintas: de los
tejidos
o secreciones
del
huésped (fuentes
endógenas),
de
otros
microorganismos (fuentes interbacterianas) y de la dieta alimentaría (fuentes
exógenas). (Liébana, 1997)
3.4.5 Protectores del huésped
Son todos aquellos factores que limitan por parte del huésped el ingreso
penetración y colonización bacteriana tales como: Integridad de mucosas y
del tejido dental, masticación, deglución, tejidos linfoides, y la saliva por su
acción mecánica, química e inmunitaria. (Liébana, 1997).
3.4.6 Antagónicos intermicrobianos
A nivel microbiano se dan relaciones entre especies bacterianas que
determinan la supervivencia de unas y la eliminación de otras lo cual llega a
establecer un tipo de microflora determinado. (Liébana, 1997).
3.4.7 Modelos de relación microbiana
Un ecosistema oral, constituye una comunidad microbiana que habita en la
cavidad oral, y como comunidad existen relaciones entre las diferentes
especies allí presentes. Las relaciones que se dan entre las bacterias,
tienden a dividirse en relaciones positivas, neutras y negativas. (Liébana,
1997).
a) Relaciones positivas
Son relaciones en que dos microorganismos obtienen ventaja de la
asociación. Entre las relaciones positivas destaca el mutualismo o simbiosis.
(Liébana, 1997).
b) Relaciones neutras
En esta relación, ninguna de las especies se ve afectada, se puede obtener
ventaja de una de ellas pero sin perjudicar a la otra. Entre ellas el
comensalismo, en la que se destaca la presencia de anfibiontes, los cuales
son microorganismos que mantienen una relación comensal con otro, pero
que en determinadas condiciones , como por ejemplo una disminución en la
capacidad de defensa del hospedador, pueden llegar a establecer una
relación de parasitismo.(Liébana,1997).
c) Relaciones negativas
Se dan cuando uno de los microorganismos se ve perjudicado por la relación
con otro microorganismo. La principal relación negativa es la antibiosis o
antagonismo que se da cuando un microorganismo impide el crecimiento de
otro, obteniéndose de esta forma una ventaja ecológica ya que se disminuye
la competencia. Esto se da por la producción de bacteriocinas que son
sustancias inhibitorias del crecimiento de otras bacterias, entre las que se
pueden citar las mutacinas que son bacteriocinas producidas por algunas
cepas de Streptococcus mutans orales. (Liébana, 1997).
La depredación es otro tipo de relación negativa en que uno de los
microorganismos mata al otro y se alimenta de él. Otra relación negativa es
el parasitismo en que una de las especies vive en o sobre la otra obteniendo
beneficio del hospedador a costa del perjuicio de éste.
Un ejemplo de
relación negativa es la que se da cuando determinadas especies de
estreptococos orales que producen peróxido de hidrógeno, ejercen una
acción tóxica sobre otras bacterias que carecen de sistemas detoxicantes.
(Liébana,1997).
Los lactobacilos y los estreptococos son importantes productores de
bacteriocinas, que juegan un papel muy importante en la ecología de la
microflora de la mucosa oral. Esta producción de bacteriocinas puede inhibir
el acceso de bacterias exógenas a la cavidad oral y al tracto respiratorio.
(Sundqvist G. 1992).
De esta forma se ha observado que, las interacciones microbianas tanto
positivas como negativas, pueden regular significativamente la presencia de
diferentes especies microbianas en un mismo nicho (Sundqvist G. 1992).
Se han reportado varias asociaciones bacterianas en conductos radiculares
de
dientes
necróticos,
entre
ellos:
Fusobacterium
nucleatum
con
Peptostreptococcus micros, Selenomonas sputigena, Campylobacter rectus y
Porphyromonas
endodontalis.
Prevotella
intermedia
es
afín
a
Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus anaerobius y Eubacterium
spp; mientras que se ha observado que Porphyromonas endodontalis inhibe
el crecimiento de Prevotella intermedia. (Sundqvist G. 1992).
Algunas combinaciones de bacterias resultan más potentes que otras, por
ejemplo, la unión entre Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium y
Peptostreptococcus, incrementan el grado de destrucción periapical.
Experimentalmente la inducción de infecciones radiculares en monos
utilizando únicamente Enterococcus faecalis, indujo una modesta destrucción
periapical en comparación con la combinación entre Enterococcu faecalis,
Streptococcus milleri y ctinomyces bovis, que demostró ser mas agresiva.
(Liébana, 1997).
3.4.8 Actividad Enzimática Bacteriana.
Hoy en día se asume que la microbiota endodóntica está representada,
principalmente, por microorganismos Gram negativos, los cuales viven, se
multiplican y eventualmente mueren en el conducto radicular infectado,
liberando en este proceso endotoxinas. La actividad endotóxica está
fuertemente relacionada con la presencia y el número de bacterias Gram
negativas en el canal radicular (Pajari et al. 1993) éstas en un determinado
momento, pueden superar el foramen apical e iniciar una lesión a ese nivel.
(Dalby, 2000).
Las endotoxinas contenidas en la pared celular de las bacterias Gram
negativas son las sustancias responsables de los mecanismos inflamatorios
que se desencadenan a nivel pulpar. Son liberadas al medio después de la
desintegración de la bacteria, lo que produce diversos efectos biológicos,
como fiebre o estimulación de la actividad linfocítica. (Dalby, 2000).
Las endotoxinas están presentes en altas concentraciones en conductos
radiculares de dientes con necrosis pulpar sintomática y son antígenos no
específicos que pueden desencadenar reacciones inflamatorias específicas e
inespecíficas, donde intervendrán células fagocitarias de defensa (linfocitos,
macrófagos y neutrófilos), las cuales liberarán diferentes sustancias químicas
que actuarán como potenciadores, mediadores o inhibidores de la patología
pulpar y periapical. (Jawetz et al.1999).
Algunos microorganismos anaerobios producen enzimas extracelulares como
colagenasas y proteasas que al parecer estimulan la invasión bacteriana de
los tejidos. (Dalby, 2000).
3.5 MICROORGANISMOS MÁS FRECUENTES ASOCIADOS A LAS
LESIONES PULPARES.
3.5.1 Fusobacterium nucleatum:
Son bacterias pleomorfas que aparecen con formas muy variables: en huso,
globulosas, redondeadas, finas, etc. Son moderadamente sacarolíticas,
aunque sintetizan material de reserva intracelular a expensas de polímeros
de glucosa. Sus fuentes nutricionales y energéticas mas importantes
provienen del catabolismo de péptidos y aminoácidos, elaborando como
producto metabólico final especialmente acido butírico. A diferencia de otros
bacilos
Gram negativos
anaerobios estrictos son resistentes al verde
brillante. Puede aislarse como hábitat primario en la cavidad oral y además
aislarse del intestino, vías respiratorias aunque se encuentra por lo general
en el surco gingival. (ANEXO 1) (Liébana 2002).
Aun así, in vivo, los factores de virulencia
de F. nucleatum no están
claramente definidos, su poder patógeno se relaciona con la endotoxina,
leucotoxina, compuestos solubles que inhiben la quimiotaxis de los
neutrófilos, fosfatasas, etc. Si parece importante su capacidad
de
coagregarse con otras bacterias favoreciendo los procesos de colonización y
formación de placas. También se sabe que los ácidos grasos de cadena
corta (especialmente el ácido butírico) y el amoniaco obtenido a partir de
aminoácidos (p. ej. cisteína o metionina) pueden comportarse como tóxicos
tisulares, igualmente, producen dos compuestos
malolientes que están
implicados en la halitosis (SH, metilmercaptano). (Liébana, 2002)
3.5.2 Porphyromonas gingivalis:
Comprende bacterias asacarolíticas, es decir que no metabolizan los hidratos
de carbono ni por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (glucólisis) ni por la
ruta pentosa de fosfatos, debido a que carecen de enzimas como la glucosa6-fosfato deshidrogenasa y gluconato-6-fosfato-deshidrogenasa.
Emplean
compuestos nitrogenados como fuentes energéticas, no se desarrollan en
presencia de bilis al 20%. Este microorganismo se encuentra en el surco
gingival, de forma especial cuando hay lesiones periodontales avanzadas;
mas raramente puede detectarse, quizás a modo de reservorio, en el dorso
de la lengua, amígdalas y saliva. No se le considera como parte integrante de
la microbiota oral normal sino como un patógeno exógeno ausente en
individuos sanos. Se le relaciona con multitud de procesos patológicos:
gingivitis,
pulpitis,
abscesos
periodontales
y
periapicales.
Para
su
aislamiento, los medios de cultivo deben incluir vitamina K y de forma
especial, por su dependencia del hierro, hemina o sangre, habitualmente a
de carnero lacada, esto es, congelada y descongelada para que, al romperse
la membrana de los hematíes, se liberen mejor los nutrientes. Para hacer los
medios selectivos se añaden antibióticos no activos sobre P. gingivalis; es el
caso de kanamicina, tobramicina, acido nalidíxico, colistina o bacitracina
(medio preconizado por Hunt). Las colonias, claramente diferenciadas,
aparecen tras una incubación de al menos 48 horas a 36 +/- 1 °C; muestran
la típica pigmentación marrón oscura o negra y no fluorescente bajo una luz
ultravioleta. Las características in vitro para su identificación, son aparte de
las del género, la producción de indol a partir del triptófano y el hecho de
poseer una enzima proteolítica semejante a la tripsina que hidroliza un
sustrato incoloro, la Benzoil.D-L- arginina-B –naftilamida (BANA) dando
origen a un compuesto coloreado (B-naftilamida). (Liébana, 2002).
Sus factores de virulencia:
Capsula: es de naturaleza polisacárida que aparte de permitir la subdivisión
de la especie en seis serotipos, tiene una acción antifagocitaria por su efecto
antiopsónico.
Membrana externa: tiene gran interés fisiopatológico por poseer proteínas
que se comportan como adhesinas que participan en fenómenos de adhesión
y coagregacion bacteriana y, por tanto, en la colonización de células
epiteliales y fibroblastos y en la formación y mantenimiento de la placa
subgingival. Con respecto a esto ultimo cabe destacar los procesos
coagregativos de P. gingivalis con Fusobacterium nucleatum y Actinomyces
naeslundii. (Liébana, 2002).
La endotoxina asociada al lipopolisacárido (LPS) cuya actividad endotóxica,
con respecto a otras bacterias Gram negativas, no parece muy importante.
Formar vesículas superficiales que se liberan con facilidad del resto del soma
celular; dichas vesículas atraviesan barreras impermeables a la célula
completa y transportan, de esta forma, factores de virulencia que serian
trasladados a distancia. (Liébana, 2002).
Fimbrias: como las proteínas de la membrana externa y con sus mismas
consecuencias, se comportan como adhesinas e intervienen en fenómenos
de coagregacion y adhesión a superficies epiteliales y dentales, en este caso
con la mediación de la saliva. (Liébana, 2002).
Proteasas: P. gingivalis produce una amplia gama de enzimas proteolíticas;
algunas se asocian a la membrana externa y otras se liberan al exterior o son
transportadas a distancia por las vesículas superficiales. El efecto destructivo
de estas enzimas se extiende también a elementos del sistema inmunitario,
permitiendo la evasión bacteriana de la respuesta del hospedador. Se
comprende que estas proteasas, al comportarse como agresinas e
impedinas, desempeñan un papel importante en el surco gingival para
producir periodontitis. (Liébana, 2002).
Otros compuestos proteicos: es el caso de la superóxido dismutasa, que
permite a P. gingivalis resistir la acción oxidante de los radicales superoxido
generados en el interior
de los leucocitos polimorfonucleares. Otras
exoenzimas que también contribuyen al daño tisular como hialuronidasa,
fosfatasa alcalina; y una exotoxina del tipo epiteliotoxina de gran importancia
en el proceso penetrante de los tejidos. (Liébana, 2002).
Metabolitos tóxicos tisulares: son ácidos grasos de cadena corta, amoniaco,
compuestos
azufrados
volátiles,
metilmercaptano,
que
aumenta
la
permeabilidad de la mucosa oral. (Liébana, 2002).
Moléculas antibacterianas: muchos de los metabolitos citados ejercen un
efecto competitivo con otras bacterias; a ellos hay que añadir la producción
de bacteriocinas por parte de algunas cepas de P. gingivalis. Todas estas
moléculas están implicadas en las amplias interrelaciones que las bacterias
establecen en la cavidad oral. (ANEXO 2) (Liébana, 2002).
3.5.3 Prevotella spp.
Comprende bacterias moderadamente sacarolíticas por la vía Embdem
Meyerhof Parnas pero no metabolizan los glúcidos por la vía de las pentosas
fosfato ya que carecen de las enzimas glucosa-6 –fosfato deshidrogenasa y
gluconato-6 –fosfato- deshidrogenasa. No se desarrolla en presencia de bilis
al 20%. Son resistentes a la vancomicina.
Especies pigmentadas:
P. melaninogenica, P. intermedia, P. nigrescens, P. corporis, P. loescheii, P.
pallens, P. denticola (algunas de cuyas cepas no son pigmentadas). Se les
relaciona con mayor o menor grado con multitud de procesos, como
infecciones pulpares, absceso periapical, alveolitis, etc. En la mayoría de los
casos su patogenicidad no es muy bien conocida, de forma que participarían
en estos procesos unidas a otras bacterias de carácter sinérgico. Con
respecto a las enfermedades periodontales la mas implicada son P.
intermedia y P. nigrescens cuyas colonias al contrario de P. gingivalis, emiten
fluorescencia; la primera especie esta presente en el surco gingival en una
de cada dos personas con buena salud periodontal y su prevalencia pasa a
tres de cada cuatro sujetos con problemas de gingivitis o periodontitis; por
ello resulta difícil atribuirle un papel claro como periodontopatogena; con
respecto a P. nigrescens se aísla aun con mayor frecuencia en individuos
sanos. P. intermedia, P. melaninogenica, P. loescheii se han descrito fimbrias
como adhesinas y residuos proteicos y glucoproteicos superficiales, pueden
actuar como receptores de otras adhesinas. También se ha comprobado la
capacidad para degradar inmunoglobulinas, su acción toxica sobre los
fibroblastos y su actividad fibronolítica. La boca es un reservorio habitual para
estas bacterias. Especies no pigmentadas (Koneman. 1999).
Son P. buccae, P. buccalis, P. oris, P. oulorum, P. veroralis y P.
zoogleoformas, P tanerae y P. enoeca. La mayoría de ellas tienen como
hábitat primario el surco gingival, algunas especies son más abundantes en
las enfermedades periodontales aunque su grado patógeno real se
desconoce. (ANEXO 3) (Liébana, 2002).
3.5.4 Peptostreptococcus spp:
Son
cocos
de cadenas cortas o emparejados Gram positivos, no
formadores de esporas, anaerobios su factor de virulencia está en la enzima
de la colagenasa y betalactamasa. Se aíslan frecuentemente en procesos
infecciosos supurados que tienen carácter mixto y polimicrobiano: en el
cerebro y los senos, pleuropulmonares, peritoneales, etc. También se
detectan con el mismo carácter con lesiones de caries de dentina, formas
avanzadas de periodontitis, abscesos de origen dental, conductos radiculares
infectados, etc. Ante una identificación preliminar de cocos Gram positivos
anaerobios, la sensibilidad mediante la técnica de disco-placa a polianetol
sulfonato sódico (SPS) indica la identificación de Peptostreptococcus
anaerobius y así la fácil diferenciación de este último por su morfología
microscópica (tamaño) y porque se identifica muy bien con los micrométodos
que detectan enzimas preformados, un cromatograma abigarrado, incluyendo
hasta ácido isocaproico en los productos finales del metabolismo.
Únicamente en el caso de P. anaerobius la cromatografía separa un género y
una especie concreta, en el resto, y según los últimos cambios taxonómicos,
los productos finales del metabolismo son los mismos para los distintos
géneros. Aquí se da la paradoja de que con los caracteres fenotípicos
usualmente estudiados, hay que llegar al diagnóstico de especie para poder
llegar al género adecuado. Cuando esto no sea posible, quizás sea bueno
conocer en que grupo se está. (ANEXO 4) (Alcalá et al, 2004).
3.5.5 Streptococcus mutans
Se aísla en el 70.90% de la población no desdentada y resistente a la caries
(portadores). En individuos con caries activa o especialmente predispuestos
su cantidad aumenta significativamente. Se considera el microorganismo
cariogeno por excelencia. Por su especial capacidad de colonizar superficies
duras se aísla en la cavidad oral, sobre todo a partir de placa
supragingivales, radiculares y saliva, en cuyo caso su origen es secundario a
la localización en las placas. Igualmente su papel es importante en las
endocarditis subagudas, representando entre el 7.14% de todas las
originadas por los estreptococos. (ANEXO 5) (Liébana, 2002).
Sus colonias en agar sangre son α y γ hemolíticas y excepcionalmente βhemolíticas. En su estructura antigénica hay que destacar que poseen los
polisacáridos parietales c, e y f, y,
proteínas asociadas a la mureina
conocidas como antígenos I y II estas proteínas u otras similares participan
en procesos adhesivos: a) como adhesinas interactuando con receptores de
la película adquirida, tales como proteínas ricas en prolina. b) como
glucosiltransferasas y receptoras de glucano en fenómenos agregativos y
coagregativos entre bacterias que colonizan los dientes. (Liébana, 2002).
Los factores de virulencia a destacar son:
a) Síntesis de polisacáridos intracelulares.
b) Síntesis de polisacáridos extracelulares de tipo glucano insolubles y
solubles y fructanos
c) Movilización de polisacáridos intracelulares por glucógeno fosforilasa y
extracelulares solubles por dextranasas y fructanasas.
d) Poder acidogeno, acidofilo y acidurico, inicio de crecimiento a pH 5 y
corto efecto post-pH.
e) Importante capacidad adhesiva por las proteínas parietales, que
facilitan su adhesión en superficies duras en ausencia de glucanos,
agregativa y coagregativa, a través de glucanos y proteínas receptoras
de glucanos.
f) Producción de bacteriocinas con actividad sobre otras bacterias Gram
positivas que podrían tener una significación ecológica, aunque no
esta demostrada in vivo su importancia como factor selectivo de la
microbiota. (Liébana, 2002).
3.5.6 Enterococcus spp
Pertenecen a este genero numerosas especies, la mas frecuente en
patología humana es Enterococcus faecalis, seguida de Enterococcus
faecium. Se asocian en parejas y cadenas cortas; en cultivo son muy
parecidas a los estreptococos. Pertenecen al serogrupo D pero fueron
separadas de los estreptococos por carácter quimiogénico. Sus factores de
virulencia no son muy bien conocidos. Su hábitat es el intestino. Producen
una gran variedad de procesos infecciones extraorales que plantean un
problema particular de tratamiento antibiótico. Por su metabolismo anaerobio
son intrínsecamente resistentes a los aminoglucósidos que, sin embargo
pueden penetrar si se unen a otros compuestos que inhiben la síntesis del
peptidoglucano al ingresar en el interior de las bacterias, pero aun así no
serán útiles si las cepas muestran altos niveles de resistencia por la
producción de enzimas inactivantes; por otra parte, las cefalosporinas no son
eficaces por la baja afinidad de sus PBP a las misma. (Koneman, 1999).
Enterococcus faecalis: Coco anaerobio facultativo Gram positivo que habita
el tracto gastrointestinal y genitourinario femenino. La mayoría de sus cepas
son homofermentativas, no producen gas, no poseen enzimas citocrómicas y
se obtiene ácido láctico por fermentación de la glucosa. En su pared celular
poseen antígenos del grupo D y un acido lipoteicoico intracelular asociado a
la membrana citoplasmática. Puede crecer en temperaturas entre 10o y 450 C.
Es un microorganismo oportunista, causa infecciones nosocomiales en
diferentes grados de compromiso. Crece con facilidad en medios difíciles con
poca cantidad de oxigeno y nutrientes y forma biopeliculas entre si o con
microorganismos de otras especies. Otro factor que favorece su crecimiento,
es el potencial de oxido reducción elevado. (ANEXO 6) (Liébana, 2002).
Se asocia fuertemente a casos de fracaso de tratamientos de conductos,
aunque eventualmente, se ha visto en presencia de lesiones primarias de
origen pulpar. Enterococcus faecalis se puede encontrar asociado a
Streptococcus, Lactobacillus y otras bacterias facultativas así como bacterias
anaerobias lo que puede crear una flora mixta aun más virulenta. (Liebana
2002).
3.5.7 Candida albicans:
Las especies Candida crecen como células de levaduras típicas de 4-6 µm
redondas u ovaladas con gemación en la mayoría de las condiciones y en
casi todas las temperaturas, crecen en condiciones de anaerobiosis en
medios de cultivo a pH con rango entre 2,5 y 7,5 y la temperatura oscila entre
20o y 38o, el crecimiento de colonias se puede detectar entre 48 y 72 horas
después de la siembra. (Liébana, 2002).
Los microorganismos del genero Candida son oportunistas se encuentran
como comensal en la cavidad bucal, intestino, vagina, secreción bronquial y
piel
del
hombre.
macroscópicamente:
Las
color
colonias
crema
de
esta
cerosa,
especie
húmedas,
se
observan
redondas.
Y
microscópicamente son blastosporas redondas u ovales. (Liébana, 2002).
Candida albicans a lo largo de la historia ha sido causante de diferentes
enfermedades en humanos, las cuales generalmente se produce por tres
mecanismos: por invasión de cepas colonizantes del tracto gastrointestinal o
la piel; como consecuencia de transmisión vertical en el neonato o en raras
ocasiones por trasmisión horizontal además esta especie puede llegar a
producir infección cuando el hospedero tiene algún factor predisponente y de
esta manera ocasionar un grupo de manifestaciones clínicas que pueden
presentarse en la zona cutánea, mucocutánea o de formas sistemáticas
(Castrillon. et al. 2005). C. albicans tiene varios atributos de virulencia para
colonizar el hospedero y ocasionar daños de forma directa al activar, resistir
o desviar los mecanismos de defensa del mismo. Estos atributos que
contribuyen a la patogénesis de C. albicans incluye la morfogénesis
(transición entre las células levaduras unicelulares y las formas de
crecimiento filamentosas), las enzimas secretadas aspartil proteasas (SAP) y
fosfolipasas
y
las
biomoléculas
de
reconocimiento
del
hospedero
(adhesinas), que le permiten iniciar el proceso de formación de biopeliculas.
Así mismo, el cambio de fenotipo se acompaña por alteraciones en la
expresión de antígenos, morfología colonial afinidades de C. albicans a los
tejidos. (Castrillon et al 2005)
Candida albicans es un microorganismo muy versátil, por su capacidad para
sobrevivir como comensal en varios sitios anatómicamente distintos como la
piel, intestino, cavidad vaginal y oral. En el esputo expectorado y en la vejiga
urinaria de los pacientes con catéteres a permanencia; ya que en promedio
del 25 al 30% de los individuos son portadores de C. albicans en estas
cavidades. Además de el reservorio endógeno (cavidades naturales del
hombre), también se puede adquirir de fuentes exógenas y se aíslan de
superficies ambientales. (ANEXO 7) (Bonardello et al. 1999).
3.5.8 Filifactor alocis:
Es un bacilo, no esporulado, anaeróbico obligado, Gram negativo,
las
células miden de 0.4-0.7 µm de ancho por 1.5-7.0 µm de largo. Tienen forma
cónica redondeada. Algunas cepas han demostrado algún tipo de movilidad
esto sin observar flagelo alguno. Las colonias en agar sangre son pequeñas
puntiformes
con 1.0 mm de diámetro. Son circulares, convexos, lisas,
translucidas a transparentes, brillantes y no hemolíticos. (Siqueira-Rocas,
2003). Los principales productos metabólicos
en caldo de glucosa son
pequeños a moderadas cantidades de butirato y acetato. Con abundante H2
que puede ser detectado como halos alrededor, estos es, cuando hay
suficiente crecimiento. Las cepas de estas especies muestran un mínimo
crecimiento y no reaccionan a pruebas bioquímicas y es muy utilizado para
la diferenciación de otras especies de Fusobacterium a partir de determinar
las proteínas celular solubles por electroforesis y por el contenido de G+C de
ADN. El principal hábitat de F. alocis aparecen en el surco gingival y estudios
ha demostrado que está envuelta en la patogénesis de la periodontitis.
Debido al escaso crecimiento que tiene este microorganismo y los métodos
de identificación bioquímica no son suficientes y lo hace más difícil detectar y
relacionar con enfermedades endodónticas. Su detección se hace más
eficiente con métodos moleculares como el PCR. (Tabla 1) (Siqueira-Rocas,
2003).
Principales Géneros y Especies de la Microbiota Oral.
Tabla 1. Principales géneros y especies de microbiota oral. (Aguilar 2004)
3.6
MICROORGANISMOS
POCO
FRECUENTES
EN
LESIONES
PULPARES
Se han realizado estudios que revelan la presencia de otros microorganismos
poco comunes entre ellos se encuentra
Coxiella burnetii
y según
Abuodharam et al (2002), además de su detección pudo corroborar la teoría
de la colonización de la pulpa dental a partir de la invasión del torrente
sanguíneo en ausencia de inflamación (anacoresis) Bajo este reporte se
pudo sustentar con resultados que por primera vez la colonización por C.
burnetii en la pulpa dental por vía sanguínea es un hecho. Su trabajo fue
desarrollado en inicio con la inoculación intraperitoneal en conejillos de indias
y posteriormente con la técnica de amplificación
PCR y secuenciación
directa, C. burnetii fue recuperada hasta en un 50 % de los animales.
Dialister pneumosintes es un bacilo no fermentativo, anaeróbico, Gram
negativo, que crece en agar sangre formando colonias pequeñas, circulares,
transparentes, lisas, y brillantes. Se ha recuperado de la profundidad de la
cavidad periodontal y se ha relacionado la enfermedad periodontal con el
microorganismo, Doan, et al (2000), hace referencia a la identificación por la
técnica de PCR a partir de la muestra periodontal.
Cabe destacar que
previamente al realizar pruebas bioquímicas no hay consistencia para la
identificación de Dialister Pneumosintes
además que no es
frecuente
encontrar tal microorganismo en la placa subgingival ya que es muy poco lo
reportado.
Por esto Doan y colaboradores dieron a conocer una
identificación definitiva de D. pneumosintes
como un organismo que se
encuentra en muestras de placa subgingival, así como desarrollar un método
de detección PCR para D. pneumonsintes y comparar la eficacia entre los
métodos de detección entre medios de cultivo y PCR.
Otro tipo de microorganismo rara vez encontrado en lesiones pulpares es
Yersinia pestis en un plano histórico Drancourt et al (1998) identificaron
ADN de Yersinia pestis en pulpa dental de hace 400 años lo que evidencia su
presencia y esto gracias a la durabilidad de la pulpa dental así como también
mantenerse una esterilidad natural en ella. Cabe mencionar
que fueron
recolectadas las muestras de dos esqueletos del siglo 16 que se suponen
que murieron por la “plaga dental” de la época. El uso de PCR para la
extracción de ADN antiguo e incorporación de primers específicos para el
gen humano beta-globina demostró la ausencia de inhibidores. La
incorporación de primers específicos para Y. pestis rpoB (el gen codificante
de la subunidad-beta para la ARN polimerasa) y asociado a la virulencia (gen
codificante para la activación del plasminógeno) con esto se logro obtener
una indistinguible secuencia de nucleótidos para su identificación de la
bacteria. También dedujeron los autores que a partir de la pulpa dental
promete ser un blanco atractivo
para determinar la etiología de
enfermedades septicémicas ancestrales. (Drancourt et al.1998).
Otros
microorganismos
Mogibacterium
ssp,
son:
Bifidobacterium
Lachospiraceae
spp,
ssp,
Lactobacillus
spp,
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Megasphaera spp, Leptotricia buccalis, Selemonas
sputigena, Serratia mercescens, Gemella spp, Tannerella forsythensis.
(ANEXO 8)
3.7 Medios de cultivo
Son preparados que intentan reproducir artificialmente las condiciones del
hábitat natural de los agentes bacterianos. Sus componentes deben cubrir
todas las necesidades nutricionales de las bacterias que se van a estudiar y
deben incorporarse en una mezcla justa y equilibrada. (Liébana, 2002)
Clasificación de los medios de cultivo se hace en función de su contenido, de
su estado y de su utilidad, según Liébana (2002)
1. Según su contenido.
a.) Definidos o sintéticos: Se conoce perfectamente la composición
química, ya que se elaboran añadiendo productos
puros
e
individualizados.
b.) No sintéticos o empíricos: No se conoce la composición exacta; se
prepara con extractos de carne, de levadura, peptonas etc. su empleo
se basa en la experiencia y son los medios más utilizados (ej., agar
cerebro corazón o agar Mueller Hilton)
2. Según su estado.
a.) Líquidos: Son llamados caldos (ej., caldo tioglicolato, caldo cerebro
corazón) los constituyentes están disueltos en el agua sin sustancias
solidificantes. Se utilizan sobre todo para inocular muestras o cuando
se cultiva un único microorganismo, para obtener una masa
microbiana u observar las características de crecimiento.
b.) Semisólidos: Contienen agar en escasa proporción (menos del 1%) se
utilizan como medios para analizar alguna característica especial de
las bacteria, como por ejemplo la movilidad o la capacidad oxidativa
fermentativa. También se emplean como medios de transporte de
muestras clínicas (ej., medio Stuart)
c.) Sólidos: Se obtienen agregando agar al medio liquido en una cantidad
suficiente para que solidifiquen, según su utilización, se distribuyen en
tubos o platos de petri, se utilizan principalmente para pruebas de
identificación bioquímica (ej., bilis esculina agar)
3. Según su utilización:
a.) Básicos o comunes: Son aptos para las bacterias no exigentes y
contienen los nutrientes mínimos para el desarrollo.
b.) Enriquecidos: Son medios básicos que se suplementan con sustancias
muy nutritivas para bacterias exigentes, como la sangre, el suero, etc.
c.) Selectivos: Estos medios permiten el crecimiento de algunas bacterias
e inhiben el de otras se utilizan en casos que interese recuperar
ciertos tipos de microorganismos y se desee impedir el crecimiento de
otros.
d.) Diferenciales:
Estos
medios
llevan
incorporados
determinadas
sustancias que pondrán de manifiesto visualmente la presencia de
alguna característica bioquímica de la bacteria.
Cada microorganismo requiere una variedad de condiciones especiales para
su crecimiento. Para conseguir su desarrollo, es fundamental otorgarle tanto
condiciones físico-químicas óptimas como un medio de cultivo que contenga
los nutrientes necesarios para su multiplicación. (ANEXO 9) (Liébana 2002).
3.7.1 Análisis Microbiológico
Reconociendo la evidencia de la participación de los microorganismos en el
establecimiento y manutención de los procesos en el conducto radicular y en
la región periapical, el análisis microbiológico como recurso de la
determinación del efecto terapéutico no se constituye en técnica de rutina en
las clínicas de endodoncia y en instituciones académicas (Siqueira, 1997).
Los procedimientos microbiológicos, relativos a la recolección, transporte,
siembra e incubación, con el objeto de
preservar y
microorganismos anaerobios presenta poca practicidad,
propagar los
son costosos y
consumidores de tiempo; las técnicas genéticas presentan restricciones a
nivel de la practica y evaluaciones clínicas; el resultado negativo puede
expresar falta de sensibilidad de la técnica; el uso de eficientes sustancias
antimicrobianas durante el tratamiento químico-mecánico y en la medicación
intracanal optimizan el control microbiano. Aun con aquellas limitaciones,
actualmente el
análisis microbiológico con base en
el cultivo de
microorganismos oriundos del conducto radicular parece constituirse en
recursos de laboratorio valioso en el contexto de la técnica endodóntica.
(Estrela 2005).
En la investigación, su importancia es significativa una vez que permite el
estudio de la etiopatogenia del proceso; soporta la evaluación de la
efectividad antimicrobiana de sustancias usadas en el tratamiento; y por
consiguiente, contribuye para el perfeccionamiento de la técnica endodóntica.
Finalmente el análisis microbiológico de los conductos radiculares es útil en
la evaluación y acompañamiento de los casos recidivantes, porque permite,
por
ejemplo,
el
aislamiento
de
microorganismos
de
los
géneros
Enterococcus, Actinomyces y Propionibacterium (originalmente Arachnia)
(Molander et al. 1998),
facilitando su identificación y posteriormente
permitiendo la determinación de su perfil de sensibilidad a antibióticos y/o
quimioterápicos (Molander et al. 1998).
El protocolo para el ensayo microbiológico de naturaleza cultivable, concluido
el tratamiento químico-mecánico, consisten lo siguiente:
a. Adición de la solución de muestreo, haciendo movimientos de
introducción y retirada con la ayuda de una lima.
b. Repetición del procedimiento
c. Retirada del material adherido a las paredes del conducto con
lima endodóntica y, en la secuencia, su corte en el segmento
activo, con subsiguiente inmersión del mismo en medio de
transporte
d. Homogenización de la mezcla y transferencia del segmento de
la lima para el medio de cultivo correspondiente y/o repique de
la suspensión microbiana
e. Incubación
f. Lectura e interpretación de los resultados.
Es importante
destacar que lo referido anteriormente debe ser realizado
integralmente en condiciones asépticas, evitando que
microorganismos
contaminantes interfieran en el resultado. De la misma manera, el uso de
sustancias neutralizantes del agente antimicrobiano utilizado durante el
tratamiento provoque resultados falsos negativos. (Estrela 2005).
Los medios de transporte tienen por finalidad la preservación de los
microorganismos, eventualmente generados en el material clínico, desde su
recolección hasta el adecuado procesamiento en laboratorio. Por su
composición y características esos medios tienen acción stática, impidiendo,
de ese modo, que ocurran alteraciones en la proporción original de los
microorganismos, así como condiciones capaces de proteger la microbiota
endodóntica de los efectos tóxicos del oxigeno molecular; el uso de esos
medios actualmente constituyen un recurso universal a medida que los
microorganismos conservan su viabilidad en los mismos. Entre los medios de
transporte comúnmente recomendados, se encuentran: Medio de Transporte
Reducido (RTF), Medio III Microbiostatico de Viabilidad y Mantenimiento
(VMGA III) y el Caldo Tioglicolato (THM). (Siqueira, 1997).
La etapa correspondiente al cultivo exige la utilización de medios de cultivos
líquidos, semisólidos y/o sólidos, dependiendo del propósito del estudio. Esos
medios deben ser ricos en sustancias nutritivas, de modo que soporten el
crecimiento y multiplicación de la gama variada de microorganismos
endodónticos, abarcando aquellos con gran capacidad de síntesis y también
aquellos exigentes de sustancias nutritivas más complejas. Las sustancias
enriquecedoras son hemina y vitamina K, complementariamente, en medio
sólido, debe ser adicionada sangre desfibrinada de carnero. (Siqueira, 1997).
Entre los medios líquidos, se destacan el Caldo Tripticasa Soya (TSB) y
Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI). En el caso de utilizarse medios
semisólidos, la selección recae en el Caldo Tioglicolato (THM), ya que
presenta excelente desempeño como medio de transporte y como medio de
cultivo para los microorganismos oriundos de conductos radiculares
infectados (Carlsson et al, 1980). El medio sólido mas utilizado parece ser el
Agar Brucella
que, enriquecido con algunas sustancias, soporta el
aislamiento de los principales microorganismos de las lesiones pulpares.
(Estrela, 2005).
La incubación del material debe priorizar los microorganismos anaerobios,
considerando que la presencia de microorganismos aerobios estrictos es
fugaz o inexistente. La incubación debe ser realizada
en anaerobiosis,
alcanzada por medio físico (vacuo e insuflación con una mezcla con el 80%
de N2 el 10% H2 y el 10% de CO2) o medio químico (sistema Gazpak o
Anaerobac). El tiempo de incubación varía entre 3, 6 y 14 días. (Molander et
al, 1998).
En el medio líquido o semisólido, la lectura tiene como referencia la
presencia o ausencia de turbidez del mismo, indicativa, o no, del crecimiento
y multiplicación de microorganismos. El medio sólido va a permitir el
aislamiento de microorganismos, la determinación de su capacidad
hemolítica,
la
obtención
de
cultivo
puro
y
subsecuentemente,
su
caracterización morfológica, fisiológica y/o genética y, cuando es necesario,
el análisis de sensibilidad a antimicrobianos. (Siqueira, 1997).
3.8 TÉCNICAS MOLECULARES
La introducción de técnicas para la manipulación del ADN in vitro ha tenido
un enorme impacto en el progreso de cada una de las áreas de la
investigación biológica.
El primer reporte de la aplicación de la genética
molecular en estreptococos se obtuvo alrededor de 1980, y en la actualidad
se cuenta con más de 40 genes del Streptococcus mutans que han sido
clonados y secuenciados. (Liébana, 1997 )
Recientemente, la metodología molecular de identificación microbiana
(reacción de la cadena de polimerasa (PCR), sondas genómicas de ADN y
técnicas de hibridación molecular ADN-ADN) han permitido, por un lado,
obtener muestras positivas casi en un 100 % de los casos de identificación
de
especies bacterianas que, hasta el momento, no habían sido
relacionadas con la patología periapical. (Canalda-Brau, 2006)
En los últimos años se han implementado nuevas técnicas de identificación
microbiana de base molecular, como por ejemplo, la reacción de cadena
polimerasa (PCR). Estos métodos han demostrado una ventaja considerable
para la identificación de microorganismos y ya han sido aplicados para
analizar la flora endodóntica (Chaves, 2005) sin embargo, uno de los
problemas mas resaltantes que acarrea la aplicación de dichas técnicas
moleculares en la microbiología endodóntica es que muchos de los
microorganismos que son identificados por medio de estos métodos no
pueden ser cultivados en condiciones normales de laboratorio. Esta
condición puede ser explicada debido a que luego de la extracción del ADN
cromosómico y del ADN no cromosómico, los microorganismos sujetos a
dichas extracciones ya no pueden ser reproducidos. Chaves señala además
que con tal carencia de reproducibilidad en medios de cultivos, las
características patógenas de dichos microorganismos "no cultivables" no
podrían ser analizadas in vitro; y así no poder validar la implicancia de dichas
técnicas de identificación como, por ejemplo, en infecciones resistentes en el
tratamiento de conductos donde es mas importante poder reproducir los
microorganismos que crecen y sobreviven en el conducto radicular a que
solamente identificarlos molecularmente partiendo de un extracto de
ADN. Otro factor negativo para la aplicación de técnicas moleculares es la
falta de protocolo cuidadoso para la recolección de muestra de ADN.
(Chaves, 2005).
Aunque para demostrar el potencial y el futuro que aun mantiene una técnica
molecular se puede señalar a Fouad et al (2000), quienes a partir de un
estudio de PCR en los canales radiculares de una pulpa necrótica, revelaron
la presencia de un microorganismo relacionado al genero Olsenella el cual no
ha sido previamente descrito dentro de las infecciones endodónticas. (Fouad
et al. 2002).
Rolph et al. (2001),
utilizaron
la técnica de reacción de hibridación
fundamentada en el apareamiento de dos cadenas sencillas de ácidos
nucleicos que sean complementarias entre si para formar un hibrido, para
realizar un estudio de identificación de microorganismos situados en canales
radiculares y demostrar que las técnicas moleculares pueden detectar la
presencia de bacterias vinculadas a las infecciones endodónticas cuando las
técnicas de cultivo dan un resultado negativo, y además puede ser usado en
la identificación de un amplio rango de bacterias relacionadas a la infección
endodóntica así estas no sean cultivables.
A partir de estos métodos de laboratorio, se han detectado, en orden de
frecuencia las bacterias mas prevalentes en la periodontitis apicales tales
como Treponema denticola (68%) Porphyromonas endodontalis (61%)
Tannerella forsythia (58%). (Canalda-Brau, 2006)
También las técnicas moleculares aplicadas a la taxonomía son de
indiscutible importancia dado que por estos métodos se puede basar en
características fenotípicas y genotípicas de los organismos, un ejemplo claro
de ello hace Saito et al (2006) al lograr la identificación de nuevos filotipos
asociados con infecciones endodónticas y sugerir que aun esta por revelar
una porción de taxas sin caracterizar.
Las técnicas de biología molecular han revolucionado el campo del
diagnostico microbiológico, ya que constituyen la alternativa de mayor utilidad
para
la
caracterización
de
ciertos
microorganismos
que
presentan
dificultades para su detección mediante los métodos convencionales. Gracias
a su relativa sencillez y gran sensibilidad, son de especial ayuda en múltiples
situaciones que requieran su identificación.
Extracción de ácidos nucleicos: Existen diversos métodos de extracción y
el procedimiento elegido depende del tipo de muestra, la cantidad de
microorganismos presente y la naturaleza del ácido nucleico. Por ejemplo, si
se trata de una colonia microbiana puede ser suficiente una extracción con
calor o con detergentes; la proteasa K es útil en diversas muestras que
contengan células o detritos celulares: la extracción mediante fenolcloroformo es la técnica de referencia, pero requiere muchos pasos y entraña
el riesgo de contaminación de la muestra. Actualmente, existen equipos
comerciales de extracción que combinan la acción de agentes químicos
(p.ej., tiocianato de guanidina), enzimáticos (p.ej., proteasa K)
solventes
orgánicos (p.ej., alcohol o acetona) y medios físicos (p. ej., partículas de
sílice o filtración por membranas); estos métodos están al alcance de la
mayoría de los laboratorios y tienen las ventajas de su gran sensibilidad y
relativa sencillez. Una vez extraída la diana, se puede proceder a la
detección de los ácidos nucleicos propiamente dicha. (Liébana, 2002)
3.8.1 Reacción de hibridación
Descripción: Consiste en el apareamiento de dos cadenas sencillas de
ácidos
nucleicos
(ADN-ADN,
ARN-ARN
o
ADN-ARN)
que
sean
complementarias entre sí para formar un hibrido. En ella, se conoce la
composición de una de las moléculas de acido nucleico y se asocia con un
sistema que posteriormente ponga de manifiesto su presencia: enzimas,
antígenos, moléculas fluorescentes o radioisótopos. (Liébana, 2002).
Fundamento
y
procedimiento:
Se
basa
en
la
capacidad
de
desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleidos. Cuando una
molécula de ADN de doble cadena se somete a un choque térmico
(elevación de la temperatura por encima de 90 °C) o a un choque de pH
(soda concentrada), los puentes de hidrogeno que mantienen su estructura
se
desnaturalizan
(se
rompen),
separándose
las
dos
cadenas
complementarias entre si; si se restablecen las condiciones iníciales de
temperatura (temperatura ambiente) o de pH (neutro) las dos hebras de ADN
son capaces de volver a unirse para formar la doble cadena mediante el
proceso que se conoce como renaturalización. Estas dos propiedades son
inherentes a los ácidos nucleicos y en ellas se basa la reacción de
hibridación. Para llevar a cabo esta reacción lo primero que se hace es
desnaturalizar la diana, que previamente se habrá extraído; tras la
desnaturalización, se introduce en el medio de reacción la sonda (segmento
de ADN) y en vez de restablecer las condiciones iníciales de temperatura,
tomando una temperatura de hibridación superior al ambiente, entre 35 y 65
°C. Esta depende directamente de la composición de la cadena de ADN de la
sonda y es la necesaria para que el proceso de renaturalización tenga lugar
entre la sonda y su cadena complementaria, es decir, para que tenga lugar la
hibridación. Y una vez formado, el hibrido se detecta siguiendo el formato de
revelado inmunológico que determina el sistema de marcaje empleado en la
sonda (enzimas, radioisótopos, fluorocromos o incluso antígenos). (Liébana,
2002).
3.8.2 TIPOS DE HIBRIDACION
Los
más
utilizados
son:
hibridación
en
microplaca
(formato
de
enzimoinmunoanálisis) o en solución (el acido nucleico y la sonda se
encuentra en solución, lo que acelera el proceso de hibridación). (Liébana,
2002).
Enzimoinmunoanálisis: se basa en la capacidad en que tienen Ag y Ac de
adherirse a una superficie inerte como el poliestireno sin perder sus
propiedades
y en la posibilidad de marcar una inmunoglobulina con una
enzima. (Liébana, 2002).
Dot blot: consiste en desnaturalizar el acido nucleico diana y luego fijarlo por
calor o luz UV en una membrana de nylon; posteriormente se añade la
sonda, lo que permite la detección cualitativa de un agente infeccioso en una
muestra. (Liébana, 2002).
Southern y Northern blot: el primero permite determinar el tamaño del
fragmento de ADN que hibrida con la sonda; el ADN se digiere previamente
con enzimas de restricción y se separan por tamaño los fragmentos
resultantes mediante electroforesis; estos se transfieren por la acción de un
tampón de gran fuerza iónica a una membrana de soporte como nylon o
nitrocelulosa y posteriormente se sigue como en el Dot blot. La técnica es
compleja y larga y requiere gran cantidad de muestra, lo cual limita su
aplicación. El Northern blot es una variación de Southern blot utilizando ARN
en lugar de ADN. (Liébana, 2002).
Hibridación in situ: se utiliza para la detección directa en tejidos, ya que se
realiza en el contexto morfológico del tejido infectado, confirmando, en su
caso, que el microorganismo está implicado en el proceso infeccioso.
(Liébana, 2002).
3.8.3 Amplificación de ácidos nucleicos
Las técnicas de hibridación pueden carecer de la suficiente sensibilidad
cuando el microorganismo buscado se encuentra en escasa cantidad en la
muestra. Para esto se recurre a
métodos químicos o enzimáticos para
aumentar específicamente la cantidad de una secuencia de ácido nucleico
del microorganismo. (Liébana, 2002).
Se puede describir dos grandes grupos de técnicas en función de lo que se
amplifica:
Amplifica la diana: el primero que comprende la mayoría de los métodos
existentes, entre estos están la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
que es la más extendida y la Amplificación basada en la secuencia de ácidos
nucleicos (NASBA) aunque además existen otras como la
reacción en
cadena de ligasa (LCR)
Amplifica la señal: obtenida tras producirse el hibrido, entre los que hay que
destacar el método conocido como ADN ramificado. (Liébana, 2002).
3.8.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Componentes:
ADN diana: es el ADN que se desea amplificar; también se llama ADN
molde. Su cantidad y calidad son factores determinantes de la eficacia de la
reacción.
Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP): aportan las bases que componen el
ADN (dATP, dTTP, dGTP) y debe encontrarse en cantidades iguales.
Cebadores: también se conocen como primers o iniciadores; son
oligonucleótidos
(secuencia
de
ADN
de
15-20
bases
de
longitud
complementarias de los extremos 3´ de cada una de las cadenas de ADN
diana). (Liébana, 2002).
Taq polimerasa: ADN polimerasa obtenida de la bacteria termófila Thermus
aquaticus, que tiene una temperatura máxima de actuación de 72-90°C y es
estable a las temperaturas de la reacción. Su función consiste en alargar la
cadena de ADN hibridada con el cebador mediante la incorporación de los
dNTP. (Liébana, 2002).
Cloruro de magnesio: Influye en la hibridación de los cebadores con el ADN
diana y en la actividad de la Taq polimerasa. (Liébana, 2002).
Tapón de hibridación: asegura la fuerza iónica y el pH óptimos de la
reacción enzimática.
Reacción:
Consta de 3 etapas que se repiten cíclicamente, entre 25 y 40 veces,
dependiendo del protocolo:
- Desnaturalización del ADN: Temperatura de 90-95°C, se separan las dos
hebras de ADN, quedando disponibles para hibridar con los cebadores.
- Hibridación del ADN con los cebadores: se produce a una temperatura que
oscila entre 35-65°C, dependiendo de la composición de los cebadores.
(Liébana, 2002).
- Extensión o polimerización de la cadena de ADN: La Taq actúa alargando el
nuevo hibrido formado a una temperatura de 72°C a partir del extremo 3´ del
cebador, incorporando los dNTP complementarios del molde de ADN diana.
El producto de este primer ciclo sirve como diana para el siguiente ya que se
somete a unA nueva desnaturalización y a las etapas sucesivas. (ANEXO 10)
(Liébana, 2002).
3.8.4.1 Detección del producto amplificado:
Una vez finalizada la PCR, se recurre a detectar la presencia del producto
amplificado (amplicon), para ello se realiza la electroforesis y si se requiere
mayor sensibilidad. Como se conoce el tamaño del fragmento amplificado,
delimitado por la zona en la que se hibridan los cebadores, la electroforesis
es un método sencillo y útil en la detección, sobre todo en aquellos casos
donde la cantidad es elevada. Se realiza en gel de agarosa o poliacrilamida
y posteriormente se aplica una tinción con bromuro de etidio, que fluórese
con mayor intensidad en presencia de ADN de doble cadena. Para confirmar
que se trata del fragmento de ADN
buscado, es conveniente realizar la
electroforesis usando como control un marcador de peso molecular para
verificar el tamaño correcto del amplificado. (Liébana, 2002).
3.8.4.2 Modificaciones de la PCR
- RT PCR: si el acido nucleico diana es ARN, tras la extracción este se debe
convertir en ADN complementario (ADNc) ya que la Taq polimerasa es
especifica de ADN. Se utiliza la enzima retrotranscriptasa, para transcribir
el ARN a ADN monocatenario y luego la Taq polimerasa lo convierte en ADN
bicatenario. (Liébana, 2002).
- Nested-PCR: se trata de dos reacciones de PCR consecutivas y se utiliza
para aumentar la sensibilidad de la amplificación; en una primera reacción se
emplean cebadores externos y en la segunda cebadores internos que
amplifican un fragmento interno al amplificado en la primera PCR. Así se
logra aumentar la sensibilidad de la reacción. (Liébana, 2002).
-
Múltiple
PCR:
Permite
la
identificación
de
múltiples
fragmentos
pertenecientes a un mismo gen o a distintos genes. Para ello, se utilizan
tantas parejas de cebadores como productos se desee amplificar. (Liébana,
2002).
- PCR in situ: el tejido se pone en contacto con la mezcla de reacción en
termocicladores
adaptados,
los cebadores están marcados con algún
sistema indicador y luego se revela directamente el producto amplificado.
(Liébana, 2002).
3.8.5 NASBA
Se trata de un método de amplificación de la diana, aunque a diferencia de
la PCR es una reacción que tiene lugar a una sola temperatura (isotérmica)
por lo que no es necesario emplear un termociclador, además la diana para
este método es ARN. (Liébana, 2002).
Para conseguir la amplificación del ARN se utiliza una estrategia enzimática y
no es necesaria la desnaturalización, ya que la diana se encuentra en forma
de cadena sencilla. Se utiliza una cascada de reacciones a través de tres
enzimas, una retrotranscriptasa (que es una ADN polimerasa que puede
utilizar como molde una molécula de ARN, aunque también es capaz de
copiar a partir de ADN. Una ARNasa H (degradadora de ARN, pero solo
cuando éste está hibridado con ADN). Y una T7 ARN polimerasa (que
sintetiza entre 10 y 100 copias de ARN a partir de una doble cadena de
ADN). (Liébana, 2002).
3.8.6 ADN ramificado
Esta técnica amplifica la señal y no la diana. La señal que se amplifica es la
obtenida tras la hibridación de tres tipos de sondas: de captura, de anclaje,
de marcaje.
Una vez liberada, la diana se inmoviliza gracias a su hibridación con las
sondas de captura que se hallan fijadas sobre la superficie de una
microplaca. Posterior a esta primera reacción de hibridación, se recurre a la
incorporación a este hibrido de una segunda sonda de anclaje produciéndose
una segunda reacción de hibridación. Las sondas de anclaje son moléculas
de ADN capaces de hibridarse con la diana y tienen la peculiaridad de
disponer de un verdadero esqueleto que soporta a su vez múltiples brazos o
ramificaciones de ADN. Y por último se da la tercera reacción de hibridación
con la inclusión de una sonda de marcaje, y esta tercera reacción consiste en
la unión de numerosas sondas de marcaje a los múltiples lugares de unión.
Después de añadir el sustrato después de esta tercera hibridación, la señal
obtenida se habrá amplificado y esto se debe a que utilizando esta cascada
de reacciones de hibridación se consigue incorporar mayor cantidad de
moléculas marcadoras que es, en esencia, de lo que depende la intensidad
de la señal producida. (Liébana, 2002).
3.8.7 TECNICAS MOLECULARES APLICADAS A TAXONOMIA
MICROBIANA
3.8.7.1 CONTENIDO G+C:
Corresponde al número de bases de guanina + citosina en relación con el
número
total: adenina (A)
timina (T). guanina (G) y citosina (C). El
porcentaje de G+C es constante dentro de una especie y dentro de un mismo
género las variaciones de dicho contenido son generalmente menores del
10%. Sin embargo aunque dos microorganismos tengan un contenido G+C
similar no se puede suponer que las secuencias sean iguales; por ello, esta
característica debe ser analizada con otros datos complementarios. (Liébana,
2002).
3.8.7.2 HIBRIDACION ADN-ADN:
Se utiliza hibridación como término que indica una comparación de
similitudes existentes entre el ADN de dos microorganismos. El ADN de
ambos microorganismos se desnaturaliza por calor y se ponen en contacto
en presencia de un tampón de hibridación.
Si las cadenas son
complementarias, si poseen el mismo ADN, se formarán híbridos estables de
ADN bicatenario a una temperatura 25°C inferior a la que se disoció el ADN.
Si las cadenas no son complementarias, seguirán entonces como ADN de
simple cadena. (Liébana, 2002).
Además se utiliza esta técnica para estudiar el grado de homología entre dos
bacterias. Prácticamente se desnaturaliza el ADN de una de las dos
bacterias a estudiar y las cadenas sencillas de ADN se fijan en una cadena
de nitrocelulosa; se añade entonces el ADN de otro microorganismo marcado
con radioisótopos y se incuba a temperatura de hibridación. Después se lava
la membrana para eliminar el ADN marcado y no unido, se determina la
radiactividad ligada a la membrana, que es proporcional a la cantidad de
ADN hibridado, y por tanto, a la semejanza entre ambos microorganismos. La
homología se utiliza para le definición de especie. (Liébana, 2002).
3.8.7.3 PATRONES DE ENZIMAS DE RESTRICCION
Su fundamento radica en la utilización de una enzima de restricción (ER),
endonucleasa que corta el ADN en un sitio de reconocimiento
específico,
generalmente compuesto de cuatro a seis pares de bases. Estas enzimas
van leyendo la cadena de ADN hasta encontrar la secuencia que reconocen
y, si está presente lo rompen originando lo que se conoce como fragmentos
de restricción. Basándose en los patrones de dichos fragmentos se establece
la homología o diferencia entre las cepas de los microorganismos que se
quieran comparar. (Liébana, 2002).
3.8.7.3.1 POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE
RESTRICCION (RFLP)
El análisis de los sitios de restricción del ADN
compara el número y el
tamaño de fragmentos producidos por la acción sobre este con una (ER).
Debido a la gran especificidad de estas enzimas, la digestión completa del
ADN proporciona un orden reproducible de fragmentos, que pueden
separarse por medio de electroforesis y es conocido como fingerprinting. En
esencia se trata de la huella dactilar de cada microorganismo. El análisis de
RFLP puede realizarse sobre ADN genómico. También se puede efectuar
sobre el producto amplificado de ADN por PCR, método denominado PCRRFLP; en este caso aumenta considerablemente la sensibilidad del método.
(Liébana, 2002).
Cuando el análisis de los RLFP se hace sobre RNA ribosómico (ARNr)
entonces la técnica recibe el nombre de ribotipificación. El ARNr bacteriano
contiene regiones conservadas en todas las procariotas y otras regiones
variables, lo que permite comparar el grado de diferenciación entre dos o
más cepas bacterianas. (Liébana, 2002).
3.8.7.3.2 ELECTROFORESIS EN GEL DEL CAMPO PULSATIL (PFGE)
En ocasiones, las ER cortan un gran porcentaje del genoma microbiano en
fragmentos tan grandes de ADN que la electroforesis convencional es
incapaz de separarlos. En este caso se utiliza la PFGE, que consigue
separar
estos fragmentos utilizando cambios en el sentido de la
electroforesis por acción de una corriente que regularmente invierte su
polaridad. De esta forma se obtiene un electroferograma y para identificar un
microorganismo, este se compara con el de otros conocidos. (Liébana,
2002).
3.8.8 SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS:
Es la mejor manera de comparar las secuencias de ADN o ARN de dos
microorganismos. Es el método de referencia, ya que proporciona la
composición exacta del acido nucleico. Para la identificación bacteriana se
elige secuenciar ARNr de las subunidades ribosómicos 30s y 50s y para el
estudio del ARNr, se debe realizar un RT-PCR para transformarlo en ADN.
(Liébana, 2002).
3.8.9 TECNICA ARNr16S
La comparación de las secuencias del ARNr16S ha facilitado enormemente
la identificación de bacterias, incluyendo microorganismos no cultivables, y la
elucidación de sus relaciones naturales. Consecuentemente, estas pueden
ser utilizadas para determinar relaciones taxonómicas entre especies que
presentan poca interrelación en su ADN. (Herrera, 2001)
Inicialmente
realizaron
estudios
de
secuenciación
del
ARNr16S.
Posteriormente, los estudios se extendieron al ARNr23S. Las secuencias
nucleotídicas constantes del ARNr16S presentan la ventaja de proporcionar
un sitio de iniciación adecuada para la elongación de los cebadores y así
aplicar de forma más fácil la técnica de secuenciación (Herrera, 2001).
El
análisis
del
ARNr16S
parece
ser
el
más
adecuado
con
los
microorganismos, ya que contiene aproximadamente a 1550 pb frente a los
75-120 del ARNr5S, por lo que pequeñas diferencias en los nucleótidos del
ARNr5S afectan mucho mas al resultado final que en el caso del ARNr16S
(Herrera, 2001).
Además de su utilidad en los estudios taxonómicos, la secuenciación del
ARNr se ha aplicado en identificación bacteriana. Mediante el análisis de las
secuencias parciales del ARNr16S es posible encontrar patrones de
secuencias
específicos
para
grupos,
especies
o
incluso
serotipos
bacterianos. Para la identificación de los microorganismos a ese nivel, se han
desarrollado pequeñas sondas específicas de la región variable del
ARNr16S. Las diferencias en las regiones conservativas proporcionan así
mismo secuencias para el diagnostico de grupos de organismos relacionados
y
pueden
ser
usados
como
dianas
para
sondas
especificas
de
oligonucleótidos. Sondas específicas de ARNr16S y 23S han sido aplicadas
para establecer diferentes grupos y especies, así como la identificación de
bacterias (Herrera, 2001).
La hibridación con sondas específicas permite la identificación rápida de un
gran número de aislados, al mismo tiempo que posibilita la detección directa
de microorganismos concretos en las muestras, usando un extracto de
ácidos nucleicos como diana. La sensibilidad de las pruebas puede ser
aumentada in vitro aplicando a la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). A partir de un pequeño fragmento de ADN, es posible
amplificar una secuencia diana hasta unos cuantos microgramos, los cuales
pueden ser secuenciados directamente o pueden ser utilizados como diana
de una sonda especifica. El uso combinado de sondas universales y
específicas
permite
también
estimar
la
fracción
de
determinados
microorganismos dentro de un conjunto. Por último se puede realizar
estimaciones de unidades formadoras de colonias utilizando métodos de
hibridación de colonias in situ (FISH) (Herrera, 2001).
En cuanto a la metodología de este análisis, el ARNr16S es secuenciado
utilizando
una
modificación
de
la
técnica
de
Sanger
(1977)
de
dideoxinucleótidos, en la que conocidos primers complementarios a las
regiones conservadas del ARNR16S, son elongados utilizando una
transcriptasa inversa. Las pequeñas cadenas de ADN producidas pueden ser
amplificadas mediante la PCR o por clonación, y después secuenciadas
mediante un proceso automatizado por
electroforesis en geles de
poliacrilamida (Herrera, 2001).
Anteriormente, la metodología utilizada para estudiar estas secuencias,
recaían en el aislamiento exitoso del ARNr, seguido de la secuencia directa
utilizando transcriptasa inversa. Actualmente, estas secuencias pueden ser
clonadas y detectadas por hibridación, con genes que codifican para sondas
de ARNr (ADNr) de un organismo diferente. La utilización del PCR, permite
amplificar específicamente la región a secuenciar, utilizando una corta
selección de primers. Estas secuencias amplificadas específicamente,
pueden ser clonadas para secuenciarse por métodos convencionales
(Herrera, 2001).
Se usan dos estrategias a la hora de aislar genes de ARNr del total de los
ácidos nucleicos. Una aproximación es clonar fragmentos al azar de ADN
del medio ambiente y analizar aquellos que contienen genes de ARNr. Como
la cantidad de ADN clonado que contiene genes de ARNr es pequeña, el
segundo paso, casi obligado, es la utilización de la PCR para amplificar este
ARNr. Como el
ARNr está altamente conservado en la naturaleza los
investigadores usan primers universales para los tres dominios de
organismos (eucariota, bacterias, arqueobacterias), desde todos los puntos
parece aconsejable el uso de la PCR pues se necesita amplificar el ARNr
que antes solo formaba una pequeña parte del total (Herrera, 2001).
La manera más rápida de obtener los constituyentes de los ecosistemas
microbianos es pues mediante el uso de la PCR. En principio la PCR
realizada con estos primers amplifica los genes de ARN de todos los tipos de
organismos presentes en un ambiente. Los tipos individuales de genes en la
mezcla son separados en principio por clonación y posteriormente son
secuenciados (Herrera, 2001).
Existen bases de datos como el Ribosomal Database Project, el GenbanK y
el laboratorio europeo de biología molecular (EMBL), las cuales contienen
miles de secuencias de ARNr, perteneciente a una gran cantidad de
microorganismos. Estas bases de datos pueden consultarse libremente, para
realizar una comparación estadística de las secuencias obtenidas de un
aislamiento, contra las que ya están publicadas, y así poder elaborar
dendrogramas, en los que se indique la posición del nuevo microorganismo
recién identificado (Herrera, 2001).
Aplicación
La secuencia del ARNr es el método de elección para determinar relaciones
taxonómicas altas (arriba del nivel de género) debido a que la molécula de
ARNr16S contiene regiones altamente variables es usualmente posible el
encontrar regiones de 20 a 30 bases que son completamente exclusivas de
una solo especie de bacterias (Herrera, 2001).
La caracterización filogenética de los organismos es más que un ejercicio de
taxonomía, puesto que las relaciones evolutivas están establecidas en una
forma creíble y cuantitativa. Se espera que los organismos cercanamente
relacionados sean similares en sus propiedades bioquímicas generales; por
el contrario, la diversidad en las secuencias de ARNr indica diferencias
bioquímicas potenciales (Herrera, 2001).
4. ANALISIS BIBLIOGRAFICO DE ESTUDIOS REALIZADOS
En 1894, Miller (Miller W, 1894) fué el primero en demostrar la invasión
bacteriana de los túbulos dentinarios tanto de dentina cariada como no
cariada así como en tejido pulpar necrótico, reportando que esta microflora
tubular consistía en cocos y bacilos.
Luego de este argumento se desarrollaron múltiples investigaciones sobre la
microbiota de los conductos radiculares las cuales reportaron la presencia de
numerosas especies bacterianas. Dependiendo del medio de cultivo y las
técnicas utilizadas para la identificación bacteriana, los tipos y el número de
organismos aislados variaban significativamente.
Cuando Kakehashi et al. (1965), proporcionaron evidencia experimental y
establecieron claramente el papel fundamental de las bacterias
en la
enfermedad pulpar y periapical. Señaló el efecto de los microorganismos
sobre el tejido pulpar y demostró la aparición de enfermedad pulpar y
periapical en pulpas dentales de molares de ratas quirúrgicamente expuestas
sólo cuando existían bacterias en la cavidad bucal. En ratas gnotobioticas
(libres de microorganismos) las pulpas expuestas permanecieron sanas e
iniciaron la reparación formando un puente dentinario a nivel de la exposición
pulpar.
En las primeras investigaciones se reportó una pequeña incidencia de
bacterias anaerobias en infecciones primarias, (Hedman et al.1951, Melville
et al.1967, Nair et al. 1990, Winkler et al.1972) mientras que en estudios
posteriores se informó de una prevalencia del 90% de estas bacterias en
conductos radiculares infectados. (Baumgartner et al.1999, Fabricius et al.
1982 Hancock et al. 2001).
Estos resultados son confirmados posteriormente por Korzen et al (1974)
quienes analizaron los efectos de la microbiota bucal normal y de la infección
por Streptococcus mutans en la pulpa y los tejidos periapicales de ratas
comunes y gnotobioticas. En dicho trabajo, los autores concluyen que la
severidad de la inflamación pulpar y periapical estaba directamente
relacionada con la cantidad de microorganismos existentes en el sistema de
conductos radiculares y con el tiempo de permanencia de los mismos dentro
del sistema, así como comprobaron que el grado de inflamación es de mayor
intensidad en infecciones mixtas que en infecciones producidas por
microorganismos pertenecientes a una sola especie.
Hasta principios de 1970, la mayoría de los estudios microbiológicos
señalaban
fundamentalmente
la
presencia
de
bacterias
anaerobias
facultativas en el sistema de conductos radiculares infectados. Sin embargo,
con el advenimiento de las nuevas tecnologías en el aislamiento de bacterias
anaerobias y el progreso en el conocimiento del papel fundamental de estos
microorganismos
en
diversas
patologías
humanas,
han
cambiado
sustancialmente la bacteriología médica y bucal.
Los estudios de Sundqvist, et al (1976), cambian diametralmente los
conceptos hasta los momentos establecidos en la microbiología endodóntica.
La presencia de un alto porcentaje de anaerobios estrictos reportados en su
investigación, demostraron la necesidad de emplear medios de cultivo
adecuado y técnico para la identificación de microorganismos anaerobios en
beneficio del avance en el conocimiento de la microbiología del sistema de
conductos radiculares.
Las pulpas necróticas presentan una flora polimicrobiana caracterizada por
una amplia variedad de combinaciones de bacterias, un promedio de 4-7
especies por conducto, predominantemente anaerobias y en igual proporción
de bacterias Gram positivas y Gram negativas. (Baumgartner et al.1999,
Hancock et al. 2001, Peters et al. 2002, Sundqvist et al. 1989). Demostró
que sólo podían ser detectados signos de reacción inflamatoria en los tejidos
periapicales de dientes que presentaran infección bacteriana dentro del
sistema de conductos radiculares. Este autor realizó un estudio en 32 dientes
unirradiculares con historia previa de traumatismo, los cuales presentaban
pulpas necróticas y su corona clínica intacta. Diecinueve de estos dientes
presentaban imagen radiolúcida; en 18 de estos dientes se encontró la
presencia de microorganismos. Por otra parte, no se encontraron
microorganismos en aquellos dientes traumatizados sin área periapical.
Sumado a estos hallazgos, sus resultados sugieren también, una asociación
entre la sintomatología y combinaciones específicas de bacterias.
Un 90% de las especies aisladas por Sundqvist (Sundqvist 1976) fueron
anaerobias; éstas comprenden un grupo de especies restringido, si se
compara con la totalidad de la microbiota de la cavidad bucal.
Como se mencionó anteriormente, los estudios de Sundqvist, en 1976,
marcan pauta en la tipificación de microorganismos anaerobios estrictos y
anaerobios facultativos involucrados en las lesiones pulpares y periapicales,
con la introducción de las técnicas de anaerobiosis
Fabricius, et al (1982) desvitalizaron mecánicamente pulpas de monos, las
expusieron al medio bucal durante una semana y posteriormente las sellaron
durante 3, 6 y 35 meses. Los análisis bacteriológicos de estos períodos de
observación
mostraron
que
el
85-98%
24
observaron
que
los
microorganismos
hallados
con mayor
frecuencia fueron Bacteroides
(Prevotella y Porphyromonas) y bacilos anaerobios Gram positivos, también
se aislaron pequeñas cantidades de bacterias anaerobias facultativas.
Sundqvist et al (1989) evaluaron la microbiota de conductos radiculares
infectados y más específicamente la prevalencia de Bacteroides pigmentados
de negro, actualmente tipificados como Porphyromonas y Prevotella. En una
muestra de 72 conductos se identificaron 173 cepas microbianas. Se
identificaron estos microorganismos en un 30% de los conductos radiculares.
Las especies más frecuentemente encontradas fueron Fusobacterium
nucleatum,
Bacteroides
intermedius,
Peptostreptococcus
anaerobius,
Eubacterium lentum y E. alactolyticum.
Los bacilos anaerobios pigmentados de negro (Porphyromonas spp. y
Prevotella spp.) han sido implicados con mucha frecuencia en la etiología de
las patologías pulpares y perirradiculares. Es probable que la actividad
proteolítica de estas bacterias sea un factor de virulencia altamente
significativo
debido
a
que
las
proteinasas
producidas
por
estos
microorganismos tienen efectos sobre las proteínas plasmáticas envueltas en
los procesos de defensa. (Sundqvist et al. 1989).
Siqueira et al (2003), estudiaron el género Porphyromonas que incluye doce
especies pigmentadas y una no pigmentada. De las cuatro especies aisladas
en seres humanos, sólo P. endodontalis y P. gingivalis han sido aisladas
consistentemente en infecciones endodónticas, y se ha determinado que
juegan un papel importante en la etiología de las diferentes formas de
lesiones perirradiculares incluyendo los abscesos perirradiculares agudos.
Las bacterias pigmentadas de negro están siempre asociadas con otras
bacterias, confirmando las relaciones sinérgicas entre las bacterias
encontradas
en
infecciones
polimicrobianas,
especialmente
con
microorganismos Gram positivos. Estas bacterias poseen requerimientos
nutricionales muy específicos los cuales son aportados por bacterias
específicas tales como Peptostreptococcus micros, Eubacterium spp. y
Campylobacter rectus. (Sundqvist, 1994).
Sundqvist, et al (1992), investigó las relaciones comensales o antagónicas
entre los microorganismos en los conductos radiculares de dientes con
periodontitis apical. Se tomaron muestras de 65 conductos radiculares
humanos infectados y se analizaron según especies, frecuencia de aparición
y proporción de la flora aislada total. Las especies más frecuentes fueron
Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros,
Peptostreptococcus anaerobius, Eubacterium alactolyticum, Eubacterium
lentum y Wolinella recta. Las asociaciones positivas más evidentes fueron
encontradas entre F. nucleatum y P. micros, Porphyromonas endodontalis,
Selenomona sputigena y Wolinella recta. También se evidenció una
asociación positiva entre Prevotella intermedia y Peptostreptococcus micros,
Peptostreptococcus anaerobius y Eubacterium. Los resultados de este
estudio son consistentes con el concepto de que existe un ambiente especial
y selectivo dentro del sistema de conductos radiculares, esto se debe, en
parte, a la naturaleza de cooperación y antagonismo de las relaciones entre
las bacterias.
Gomes et al (1994), realizaron un estudio con el propósito de determinar si
algún grupo de bacterias estaba relacionada con dolor, inflamación o con
cualquier otro síntoma endodóntico. De 30 canales radiculares examinados
se aislaron un total de 57 especies bacterianas, de las cuales, el 60% fueron
anaerobios estrictos. Fusobacterium nucleatum fue aislado y relacionado a
todos los casos clínicos examinados pero no se determinó una asociación
significativa con otros géneros bacterianos.
Debelian et al. (1995), realizaron un estudio para determinar la presencia de
bacterias en los conductos radiculares posterior a la instrumentación de
piezas dentarias con diagnóstico de necrosis pulpar asociada a lesión
periapical aguda. De un total de 26 piezas dentarias evaluadas, se determinó
que todos los canales contenían microorganismos, en su mayor parte
anaerobios estrictos, hallándose a Fusobacterium nucleatum en el 53% de
los casos.
Pocos estudios han reportado la presencia de hongos en infecciones
primarias endodónticas. Sen et al. (1995) evidenciaron hongos en las
paredes de los conductos radiculares en dientes infectados. En cuatro de las
muestras se presentaron en forma de levaduras y en una se presentaron en
forma de hifas. El estudio realizado con Microscopía Electrónica (SEM) para
investigar la topografía de la flora microbiana de los canales radiculares y
observar el grado de penetración bacteriana en los túbulos dentinales de las
raíces infectadas Sin embargo, Pardi et al (2001).
Han señalado que la
presencia de hongos en conductos radiculares es básicamente poco
frecuente (10%) y podría estar asociado a la presencia de estos
microorganismos en saliva.
Brook (1996) confirmó la hipótesis en la cual las infecciones del sistema
endodóntico eran causadas principalmente por anaerobios estrictos. Para el
desarrollo de este estudio se analizó el contenido de secreción purulenta de
cinco abscesos periapicales en el maxilar superior, todos ellos asociados a
cuadros de sinusitis. En todos los casos, los autores encontraron anaerobios
de
los
géneros
Peptostreptococcus.
Prevotella,
Porphyromonas,
Fusobacterium
y
En 1996, (Gomes et al.1996) investigaron la sensibilidad de la microflora
endodóntica a los procedimientos biomecánicos del tratamiento de
conductos. Para ello, fueron evaluados 42 conductos radiculares tomándose
muestras en todos los casos antes de la limpieza y conformación y, entre
siete y diez días posteriores a dicho procedimiento. En las primeras
muestras, fueron aisladas 51 especies bacterianas diferentes. Posterior a la
terapia endodóntica el micro-ambiente cambia de diversas formas. El
principal efecto puede ser el cambio en la anaerobiosis. En este estudio se
determinó un significativo descenso entre las especies anaerobias de la
primera y segunda evaluación. En la segunda evaluación, se detectaron
microorganismos tales como Enterococcus faecalis, Propionibacterium
acnes,
Veillonella parvula,
Streptococcus
parasanguis,
Streptococcus
gordonii, Streptococcus intermedius, entre otros. Se observaron especies
individuales de un mismo grupo presentándose en un mismo caso entre la
muestra 1 y 2, por ejemplo, Streptococcus intermedius, así como especies
que disminuyen y otras que aumentan entre la primera y segunda muestra.
Molander et al (1998) evaluaron el estado de la microbiota intrarradicular de
100 casos de periodontitis apical crónica persistente. Todos los dientes
presentaron tratamiento de conducto con no menos de cuatro años
postoperatorios. El tamaño de las lesiones fue establecido radiográficamente
y fue de 2 mm en 14 casos, entre 3 y 5 mm en 56 casos y 5 mm en 30 casos.
Los conductos fueron desobturados con instrumental rotatorio y manual,
mientras en 21 casos se incluyó el uso de cloroformo como solvente. Las
muestras fueron sembradas en agar Brucella para la incubación aerobia y en
medio semi-líquido (HCMG-Sula) con el método de combustión de Hidrógeno
para la incubación anaerobia. Molander et al (1998) Los resultados
demostraron la presencia de microbiota dentro del conducto en 68 de los 100
casos estudiados, detectando 117 especies microbianas. En la mayoría de
los conductos, fueron aisladas de 1-2 especies (85%) con predominio de
anaerobios facultativos Gram positivos (69%). El microorganismo detectada
con mayor frecuencia fue Enterococcus spp., en 32 dientes. En 20 de los
casos el crecimiento fue muy abundante. También fueron aisladas en
cantidades importantes Lactobacillus spp., Escherichia coli, Streptococcus
spp., Staphylococcus spp. Fusobacterium spp., Prevotella spp. y Candida
albicans. En conclusión aseguran que las bacterias anaerobias facultativas
son menos sensibles a la actividad antimicrobiana que los anaerobios
estrictos y, por lo tanto, es de esperarse que persistan más frecuentemente
en
conductos
radiculares
después
de
un
tratamiento
endodóntico
inadecuado. Cuando los microorganismos anaerobios facultativos han estado
en una fase latente con baja actividad metabólica por un período de tiempo,
los cambios en las condiciones nutricionales desencadenan su crecimiento.
(Molander et al.1998)
Siqueira et al. (1998) estudiaron la patogenicidad de bacterias anaerobias
estrictas
y
facultativas
comúnmente
encontradas
en
infecciones
endodónticas usando ratones como modelo. La capacidad de inducir
abscesos fue evaluado siete días después de inyectarles de manera
subcutánea la bacteria en cultivo puro y en combinación con Prevotella
intermedia o Prevotella nigrescens; como resultado se obtuvo que ninguna
de las 50 muestras bacterianas estudiadas fueron patógenas en cultivo puro.
Una diferencia, aunque no estadísticamente significativa, fue detectada entre
muestras de cultivo puro y muestras en combinación. Se detectó un aparente
sinergismo cuando se asoció Porphyromonas gingivalis con Prevotella
intermedia o Prevotella nigrescens.
Bogen et al. (1999) estudiaron la frecuencia de P. endodontalis, P. gingivalis,
P. intermedia y P. nigrescens en 20 lesiones periapicales cerradas asociadas
a cuadros endodónticos sintomáticos y asintomáticos. La identificación de las
especies bacterianas fue realizada por medio de la técnica de la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR). Los resultados obtenidos revelaron que P.
endodontalis no estuvo presente en ninguna lesión periapical. P. gingivalis
fue identificada en una lesión periapical y estuvo relacionada con un cuadro
de dolor moderado. P. endodontalis, P. intermedia o P. nigrescens no fueron
identificadas en ninguna de las lesiones estudiadas por lo que el autor
concluyó que éstos microorganismos al parecer eran infrecuentes en este
tipo de infecciones.
Waltimo et al. (1997) realizaron un importante estudio sobre la presencia de
hongos en 967 casos de periodontitis apical crónica persistente. De los
hongos aislados en este estudio el 80% fue representado por la especie
Candida albicans. Así mismo, fueron identificadas Candida glabrata, Candida
guilliermondii, Candida incopiscua y Geotrichum candidum. Un total de 48
cepas de hongos fueron aisladas en 47 muestras (7%) de las cuales seis
fueron infecciones producidas por un solo microorganismo (Candida
albicans).
Figura 1. Microfotografía al Microscopio Electrónico de
Barrido mostrando Candida spp. En las fibras (Waltimo et
al 1999)
Así mismo, evidenciaron crecimiento microbiano en 692 casos (72%). En los
casos de infecciones mixtas demostró la presencia de Streptococcus spp., P.
micros y F. nucleatum. Todas las especies de Candida evaluadas en este
estudio, presentaron alta resistencia a solución saturada de hidróxido de
calcio. Se requirió de 16 horas de incubación para eliminar el 99,9% de las
unidades de colonias formadas. (Waltimo et al 1999).
Así también Waltimo et al (1999) realizaron un estudio enfocado a evaluar la
sensibilidad de Candida spp. Con hidróxido de calcio, medicación de amplio
uso en endodoncia, dado su alto grado de alcalinidad. También ha sido
probada, la sensibilidad de Candida spp, a ciertas soluciones desinfectantes,
tales como yoduro de potasio, acetato de clorhexidina, hipoclorito de sodio e
hidróxido de calcio. Los resultados señalan una mayor efectividad de los tres
primeros agentes antimicrobianos sobre Candida spp, en comparación con el
hidróxido de calcio. Sin embargo, apuntan los autores, que el uso combinado
de estos desinfectantes, puede proveer una preparación antimicrobiana de
amplio espectro con efectos a largo plazo.
Kuriyama-Karasawa, (2000) estudiaron la microflora bacteriana asociada a
infecciones orofaciales odontológicas. Las muestras fueron tomadas de 163
pacientes que presentaban infecciones dentoalveolares, periodontitis y
pericoronaritis. Aisló un total de 664 especies bacterianas, 200 de las cuales
fueron aerobias. Los géneros bacterianos más frecuentemente aislados
fueron:
Peptostreptococcus,
Gemella,
Prevotella,
Porphyromonas
y
Fusobacterium.
Dalby
(2000) evaluó la sensibilidad antibiótica de las bacterias más
prevalentes en abscesos dentoalveolares agudos en 30 muestras de
secreción purulenta, las cuales fueron cultivadas en condiciones aerobias y
anaerobias. Se identificaron 56 cepas bacterianas, de las cuales, el 62.5%
correspondió a anaerobios estrictos; siendo los microorganismos más
prevalentes Streptococcus (35%), Peptostreptococcus (25%), Fusobacterium
(12.5%) y Porphyromonas (9%).
Arroyo (2000) evaluó 30 muestras intraorales de pacientes atendidos en el
Centro Médico Naval con el diagnóstico de absceso dentoalveolar agudo,
realizando la identificación microbiológica mediante el sistema Microscan. De
un total de 56 especies bacterianas, el 62.5% estuvo representada por
bacterias anaerobias estrictas y el 35.7% por bacterias anaerobias
facultativas. Las especies bacterianas de mayor prevalencia fueron:
Peptostreptococcus saccharolyticus y Streptococcus mitis, con 18% y 14%
respectivamente. Asimismo, determinó que la infección de tipo mixto fue la
más frecuente (73%), pudiendo aislar de 1 a 4 microorganismos por muestra.
Lana et al. (2001) analizaron 31 canales radiculares con diagnóstico de
necrosis pulpar, antes y después de su manipulación o preparación
biomecánica. Los géneros aislados que presentaron mayor frecuencia
fueron: Prevotella, Fusobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium
y Peptostreptococcus en bacterias, y Candida y Saccharomyces en
levaduras. El total de microorganismos anaerobios estrictos aislados fue de
54 especies. El 82% de los canales evaluados mostraron infección
polimicrobiana. Las bacterias anaerobias estrictas fueron recuperadas en el
80% de los casos; las bacterias anaerobias facultativas en el 51% y las
especies microaerófilas en un 18.5% de los casos. Fueron determinadas
además fuertes asociaciones positivas, particularmente entre Clostridium con
Prevotella y Peptostreptococcus con Fusobacterium.
Otro
microorganismo
últimamente
reportado,
Bacteroides
forsythus,
recientemente reclasificado como Tannerella forsythensis, es un bacilo
anaerobio estricto Gram negativo, pleomórfico, el cual fue identificado en un
52% del total de casos estudiados en pulpa necrótica. En los casos
asintomáticos se presentó en un 59,1%, un 40% en periodontitis apical aguda
y un 50% en abscesos periapicales agudos. Estos resultados sugieren una
asociación de este microorganismo con la patogénesis de diferentes formas
de patología perirradicular. (Rocas 2001).
Un importante estudio, realizado por Love et al. (2001) permitió comprobar
que la virulencia de E. faecalis se relaciona con su capacidad para invadir
los túbulos dentinarios y permanecer viable dentro de los mismos,
adhiriéndose al colágeno tipo I presente en el suero humano. Fue
comprobado igualmente por el autor, que para otros microorganismos, tales
como S. gordonii y S. mutans, el suero humano actúa inhibiendo su
capacidad de invadir la dentina, no así sobre E. faecalis donde se mantuvo la
invasión aún cuando fue reducida escasamente.
Lima et al. (2001)
evaluaron in vitro la sensibilidad de biopelículas de
Enterococcus faecalis a ciertas medicaciones antimicrobianas tales como
clorhexidina (CHX) 2%, clindamicina y metronidazol. Concluyeron en esta
investigación que la combinación de metronidazol con clindamicina reduce
significativamente las biopelículas formadas de un día, mientras la
clorhexidina fue el único medicamento capaz de eliminar las biopelículas de
1-3 días de formación.
Portenier et al. (2001) evaluaron
los efectos de elementos tales como
dentina, matriz de dentina tratada con ácido etilendiamino tetraacético
(EDTA) o ácido cítrico, colágeno tipo I y células muertas (E. faecalis) sobre la
inactivación de la actividad antimicrobiana de yoduro de potasio y digluconato
de clorhexidina contra E. faecalis. La matriz de dentina y las células muertas
fueron los inhibidores más potentes de la clorhexidina, mientras que la
dentina tratada mostró una muy leve inhibición. El yoduro de potasio mostró
ser inhibido por todos los componentes evaluados excepto EDTA y ácido
cítrico. Los autores concluyen que los diversos componentes de la dentina
son responsables de patrones divergentes de inhibición de la actividad
antimicrobiana de estas dos sustancias, así como el tratamiento químico de
la dentina, previos a la medicación, puede alterar el efecto antimicrobiano de
las sustancias. En la búsqueda de alternativas de tratamiento para la
eliminación efectiva de E. faecalis, ha sido evaluada la acción de diversas
soluciones antisépticas, medicaciones e inclusive materiales de obturación
sobre el microorganismo.
Siqueira et al. (2002) califican las infecciones endodónticas como mixtas y
semi-específicas con predominio de bacterias anaerobias estrictas. La
característica de semi-específica de estas infecciones es dada por la
correlación entre algunos grupos bacterianos y algunas formas de
enfermedad periapical. Cuando se realizan cultivos de conductos radiculares
infectados, parece frecuente la aparición de ciertas especies asociadas. Esto
indica que existen interrelaciones entre ciertas bacterias, comensales o
antagonistas.
Fouad et al. (2002) en un estudio bajo técnicas de hibridación de ADN
demostraron la alta frecuencia de Fusobacterium nucleatum, así como de
otros patógenos (Peptostreptococcus micros, Streptococcus spp. y Prevotella
nigrescens) sobre otros microorganismos involucrados en infecciones
primarias.
Por su parte, Peters et al. (2002) investigaron las combinaciones bacterianas
presentes en infecciones primarias con lesiones perirradiculares. Las
especies más frecuentemente encontradas fueron Prevotella intermedia,
Peptostreptococcus micros y Actinomyces odontolyticus. También se
reportaron asociaciones positivas entre P. intermedia y P. micros, entre P.
intermedia y Prevotella oralis, A. odontolyticus y P. micros, Bifidobacterium
spp. y Veillonella spp. Estos resultados indican que los patógenos
endodónticos no se presentan aleatoriamente y pueden estar asociados en
combinaciones específicas. Reportaron que las especies predominantes en
58 dientes con pulpas necróticas y periodontitis apical crónica fueron
Prevotella
intermedia,
Peptostreptococcus
micros
y
Actinomyces
odontolyticus. Estos resultados son comparables con los obtenidos por otros
estudios realizados bajo condiciones similares.
Por su parte, Evans et al. (2002) estudiaron los mecanismos involucrados en
la resistencia de E. faecalis al hidróxido de calcio. Este estudio confirmó la
supervivencia del microorganismo a dicho medicamento a un pH de 11,1.
Una respuesta adaptativa en un pH alcalino y una síntesis de proteínas
inducidas por la tensión superficial parecen jugar un papel menor en la
persistencia de E. faecalis. Sin embargo, el hallazgo de una bomba de
protones con capacidad de acidificar el citoplasma fue un factor crítico en la
supervivencia de esta bacteria en altos niveles de pH. Así mismo se
concluyó, que el hipoclorito de sodio (NaOCl) es efectivo para la eliminación
del microorganismo, según los hallazgos de estos investigadores.
Jacinto et al. (2003), compararon hallazgos microbiológicos de dientes con
necrosis pulpar asintomático (29 casos) con dientes con el mismo
diagnóstico
y
que
presentaban sintomatología clínica. Los
canales
radiculares de dientes con sintomatología presentaron mayor porcentaje de
anaerobios estrictos y mayor número de especies bacterianas por canal en
relación a los dientes asintomáticos. Los más comúnmente aislados fueron:
Fusobacterium
necrophorum,
Peptostreptococcus
prevotti,
Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum y Prevotella. El 39%
del total de especies aisladas estuvo constituida por bacterias Gram
negativas y fueron relacionadas con la sintomatología. Hay una relación
estadísticamente significativa al generarse inflamación cuando esta presente
Fusobacterium nucleatum, mientras que el dolor a la percusión fue
relacionado a Bifidobacterium y Actinomyces.
En un estudio Siqueira (2003) demostró en conductos radiculares infectados,
la presencia de una especie no descrita anteriormente, Filifactor alocis. Este
microorganismo, detectado bajo técnicas de identificación PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa), fue aislado en el 46% de las muestras estudiadas.
Esta frecuencia relativamente alta de detección de Filifactor alocis asociada a
infecciones endodónticas, implica la posibilidad de estar involucrada en la
patogénesis y mantenimiento de las lesiones perirradiculares. Debido a su
alta prevalencia y su relación con otras patologías bucales, particularmente
con periodontitis marginal, es una especie potencial para formar parte del
restringido grupo de patógenos endodónticos.
Por su parte
Tang
et al (2003) realizaron la detección directa de
Actinomyces spp en canales radiculares infectados en una población china.
Y explican que la poca sensibilidad dada por las técnicas de identificación
fenotípica ha obstaculizado la diferenciación taxonómica de los Actinomyces;
ellos lograron desarrollar un método de identificación más sensible y
especifico por medio de la técnica de hibridación
DNA-oligonucleótido
basada en PCR. Se sustentó bajo el estudio de 32 muestras (dientes) de
pacientes chinos y con lo cual se logro amplificar el ADN ribosomal 16S de
las bacterias y posteriormente marcaje con dioxigenina
para la posterior
hibridación y detección. Concluyeron de manera asertiva con un 31.3% la
presencia de A. odontolyticus en los canales radiculares infectados y
confirmar de manera secundaria que A. naeslundii cobra presencia en
dientes traumatizados.
Gomes et al (2004) estudiaron la microbiota de conductos radiculares con
infección primaria. Sesenta conductos radiculares, 41 con infección primaria
y 19 con infección secundaria arrojaron 56 especies y un máximo de 10
especies por conducto. Un 70% lo constituyeron especies anaerobias
estrictas o microaerofílicas. Las especies más frecuentemente aisladas
fueron: Peptostreptococcus micros (35%), Fusobacterium necrophorum
(23.3%), Fusobacterium nucleatum (11.7%), Prevotella intermedia (16.7%),
Porphyromonas gingivalis (6.7%) y Porphyromonas endodontalis (5%). La
microflora aislada de las infecciones primarias con periodontitis apical fue de
carácter mixto, comprendiendo bacterias Gram negativas y Gram positivas,
principalmente microorganismos anaerobios y conteniendo al menos tres
especies por conducto.
Fouad et al, (2004) hacen que la técnica molecular tenga un papel
prominente o importante en el estudio clínico y mas en estudios críticos como
aquel expuesto en la detección molecular de especies de Enterococus en
canales radiculares con terapia de resistencia a infecciones endodónticas,
dado el estudio en pacientes diabéticos, determino la presencia dominante
en estos pacientes de Enterococcus faecalis, con la técnica de amplificación
por PCR y posterior secuenciación e identificación filogenética.
Siquiera Jr. et al. (2005), realizaron un estudio en dientes con diagnóstico de
necrosis pulpar asintomáticos y con lesión periapical, comparando la
prevalencia de patógenos endodónticos en muestras de infecciones
primarias tomadas de pacientes en diferentes localizaciones geográficas
(Brasil y Corea del Sur) para lo cual utilizó la técnica de PCR. Como
resultado obtuvo que la especies prevalentes detectadas en Brasil fueron
Porphyromonas endodontalis (79%), Treponema denticola (79%) y Dialister
pneumosistes (76%), mientras que las especies encontradas en Corea
fueron Fusobacterium nucleatum (38%), Tannarella forsythia (26%) y
Treponema malthophilum (24%). Concluyendo que la prevalencia de algunas
especies en infecciones endodónticas pueden ser significativamente
diferentes de una localización geográfica a otra.
Mientras Chu et al. (2005) compararon en su estudio los microorganismos
cultivables de canales radiculares que presentaban radiolucencia apical con
exposición pulpar (grupo A) y sin exposición pulpar (grupo B), tomando 45 y
43 muestras bacterianas respectivamente, las mismas que fueron cultivadas
en condiciones aerobias y anaerobias. Del grupo A se aislaron un total de
211 microorganismos, agrupados en 28 géneros y 55 especies y del grupo B
185 microorganismos, agrupados en 28 géneros y 54 especies. Concluyeron
que no hubo diferencias significativas entre la prevalencia de Actinomyces,
Peptostreptococcus y Campylobacter entre ambos grupos. El género
Prevotella fue más común en ambos grupos y Fusobacterium nucleatum fue
más común en el grupo B.
Sakamoto et al (2006) utilizaron la técnica de análisis de restricción de
polimorfismos de ARNr 16s en bibliotecas de genes clonados, investigando la
diversidad de microbiota asociada con infecciones endodónticas sintomáticas
y asintomáticas y comparándola con la estructura de la comunidad
bacteriana de las dos condiciones clínicas. Las muestras fueron tomadas de
infecciones endodónticas asintomáticas asociadas a
lesiones crónicas
periradiculares. La infección sintomática fue diagnosticada por abscesos
agudos. Los genes ARNr 16s aislados de muestras clínicas se utilizaron para
construir las bibliotecas y se realizaron
análisis de secuencias de 186
clones, los cuales revelaron 42 tipos de microorganismos; 23 (55%) fueron
filotipos, de los cuales siete son exclusivas de infecciones endodónticas. La
mayoría de los microorganismos detectados
fueron: Fusobacterium
nucleatum, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus spp, Prevotella
spp, Dialister spp, Mogibacterium spp, Lachnospiraceae oral, Filifactor alocis,
Megasphaera spp, Veillonella spp, Veillonella párvula, Dialister spp. Algunos
microorganismos se detectaron solamente en muestras sintomáticas como
Prevotella intermedia, Dialister Pneumosintes. En general, el número medio
de fragmentos de restricción en muestras sintomáticas fue significativamente
mayor que en muestras asintomáticas.
Sassone et al (2007) evaluaron la composición de la microbiota de las
infecciones primarias endodónticas en 111 casos seleccionados de un solo
diente con pulpa necrótica. Se recogieron muestras de las canales de la raíz
usando papel estéril de dos puntos a 1 mm por debajo del foramen apical.
En cada muestra se aislaron 40 especies diferentes de bacterias. Se
determinaron utilizando técnicas como sondas de ADN e hibridación ADNADN.
El promedio de número de especies por muestra fue de 22. Las
especies
mas
frecuentes
fueron:
Enterococcus
faecalis
(89,3%),
Campylobacter gracilis (89,3%), Leptotrichia buccalis (89,3%), Neisseria
mucosa
(87,5%),
nucleatum
spp
Prevotella
Vincentii
melaninogenica
(85,7%),
(86,6%),
Eubacterium
Fusobacterium
saburreum
(75,9%),
Streptococcus anginosus (75%), y Veillonella parvula (74,1%).
Rodríguez et al (2008) determinaron la presencia de microorganismos en el
tejido pulpar y así mismo clarifica las causas de su muerte y su posterior
daño a los tejidos periodontales. Selecciono 23 dientes y en 20 fue posible
encontrar crecimiento microbiano, se encontró bacterias anaerobias estrictas,
microorganismos
entéricos
y
levaduras.
Fusobacterium
spp
fue
el
microorganismo mas encontrado con 25%, seguido de Eubacterium spp en
15%, Peptostreptococcus spp., 10%; Campylobacter spp., 10%; bacilos
entéricos Gram negativos, 10%; Porphyromonas gingivalis, 10%; Prevotella
intermedia, 5%; Eikenellia corrodens, 5%; Dialister pneumosintes, 5%; y
levaduras en 5%. No hubo evidencias de crecimiento de Actinobacillus
actinomycetemcomitans,
Tannerella
forsythensis
ni
estreptococo
β
hemolítico. Los resultados en el presente estudio concluyeron claramente la
presencia de microorganismos en lesiones apicales cerradas de origen
endodóntico. De igual forma se evidenció que gran parte de los
microorganismos encontrados son considerados periodontopatógenos lo que
puede igualmente sugerir manejo compartido entre tratamiento endodóntico,
periodontal y farmacológico.
5 CONCLUSIONES
Desde que se demostró que la invasión microbiana de la pulpa, ocasiona
una respuesta inflamatoria se han abierto numerosas líneas de investigación
dirigidas a identificar los ecosistemas bacterianos en la pulpa.
En el estudio bibliográfico realizado, se encontró
gran variedad de
microorganismos relacionados con esta patología y los géneros mas
reportados fueron Fusobacterium spp, Peptostreptococcus spp, Prevotella
spp, Streptococcus spp, Porphyromonas spp.
Por otra parte se han encontrado otros microorganismos poco frecuentes
relacionados con lesiones pulpares como: Olsenella spp, Coxiella burnetii,
Dialister pneumosintes, Mogibacterium ssp, Megasphaera spp, Leptotrichia
buccalis, Selenomonas sputigena, Serratia marcescens, Gemella spp,
Tannerella forsythensis.
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BIBLIOGRAFIA ELECTRONICA
www.genomenewsnetwork.org/articles/03_02/fuso...
www.flickr.com/photos/ajc1/2425524326/
http://kato-dental.net
www.wikipedia.org/wiki/Peptostreptococcus
www.ronaldschulte.nl/Preparaten%20Tandplaque%...
http.commons.wikimedia.org/wiki/File:Enterococcus_...
www.doctorfungus.org
7. ANEXOS
ANEXO 1. Fusobacterium nucleatum
Fuente: www.genomenewsnetwork.org/articles/03_02/fuso...
ANEXO 2. Porphyromonas gingivalis
Fuente: www.flickr.com/photos/ajc1/2425524326/
ANEXO 3 Prevotella intermedia
Fuente: http://kato-dental.net
ANEXO 4. Peptostreptococcus spp
Fuente:www.wikipedia.org/wiki/Peptostreptococcus
ANEXO 5 Streptococcus mutans
Fuente:www.ronaldschulte.nl/Preparaten%20Tandplaque%...
ANEXO 6. Enterococcus faecalis
Fuente: http.commons.wikimedia.org/wiki/File:Enterococcus_...
ANEXO 7. Candida albicans en Agar Corn Meal
Fuente: www.doctorfungus.org
ANEXO 8.
MICROORAGNISMOS REFERENTES EN EL ESTUDIO BIBLIOGRAFICO
Figura 2. Microorganismos más frecuentes en el presente estudio
ANEXO 9
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR SANGRE
Para la preparación de placas de agar sangre y de agar sangre cocida
destinadas al aislamiento y cultivo de diversos microorganismos, sobre todo
patógenos exigentes y su determinación.
Sin adición de sangre, es adecuado, por ejemplo, para la realización de
hemocultivos (UPDYKE 1970) y como base para la preparación de diversos
medios de cultivo especiales.
El medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de APHA para el
análisis de alimentos (1984). (Oxoid 2006).
• Forma de actuación
Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de crecimiento a
todos los microorganismos presentes. El valor del pH de 6.8, es
especialmente favorable para la conservación de los eritrocitos y para La
formación de los halos hemolíticos claros (NORTON 1932). Para la
determinación de las formas de hemolisis es adecuado añadir sangre de
oveja, recién obtenida, desfibrinada. Por calentamiento, después de la
adición de sangre, se obtiene el Agar sangre cocida (agar chocolate) que es
un medio nutritivo excelente. (Oxoid, 2006).
En realidad, cuando se utiliza como medio basal de cultivo, sin adición de
sangre, se recomienda ajustar su pH entre 7.2 y 7.4, pues la mayoría de las
bacterias forman colonias más precozmente y crecen con mayor exuberancia
en un medio ligeramente básico. (Oxoid 2006).
Según TARSHIS y FRISH (1951), para el aislamiento de bacterias
tuberculosas a partir de esputos, es recomendable una adición de 1% de
glicerina y 25% de sangre humana, lo que hace más fácilmente reconocible
el crecimiento de colonias micobacterias, incluso en el caso de cantidades
mínimas de estos gérmenes. Según HOSTY y col. (1953), resulta ya
suficiente la adición de 0.1% de glicerina y 2.5 de sangre humana, junto con
100 U.I /ml de penicilina. Según SONDAG y col. (1977), BLACK y VAN
BUSKIRK (1973), la adición de 5 mg/ml de gentamicina (por ejemplo, 0.1 ml
gentamicina en solución), al agar sangre, posibilita el crecimiento selectivo
De Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus, así como Bacteroides,
Clostridium y levaduras. MISHRA y col. (1987) recomiendan un agar
Ampicilina Sangre de oveja (ASBA 30) para el cultivo selectivo de
Aeromonas. (Oxoid 2006).
• Composición (g/litro)
Sustrato nutritivo (extracto de corazón y peptonas) 20.0
Cloruro sódico 5.0
Agar agar
Aditivo: sangre 50-80 ml
• Preparación
Disolver 40 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min a 121°C), dejar enfriar a
45-50 °C, incorporar 5 a 8 % de sangre desfibrinada y verter en placas
pH: 6.8 +/- 0.2
El medio de cultivo preparado es, antes de la adición de la sangre, claro y
amarillo parduzco y posteriormente a la adición de la sangre del color de la
misma y no hemolizado.
• Empleo e interpretación
Sembrar las placas en superficie. Incubación: bajo condiciones casi siempre
de 24 a 48 horas a 37°C. (Oxoid 2006).
AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS
Para el cultivo de microorganismos anaerobios, incluso muy exigentes y de
crecimiento lento, a partir de material clínico e investigación. (Merck 1994).
• Forma de actuación.
Este medio de cultivo no selectivo, rico en nutrientes, garantiza tanto el
cultivo de microorganismos anaerobios exigentes como de aerobios y
microaerófilos. Favorece asimismo la formación del pigmento típico en el
caso de Bacteroides.
• Composición:
Peptona de caseína 15.0
Peptona de harina de soja 5.0
Extracto de levadura 5.0
Cloruro sódico 5.0
L-cisteína 0.5
Hemina 0.005
Agar-agar 13.5
Aditivos:
Vitamina K (phytomenadion) 0.01
Sangre de carnero desfibrinada 50 ml.
• Preparación:
Disolver 44g/litro, añadir 1 ml de solución de vitamina K y esterilizar en
autoclave (15min a 121°C ) tras enfriamiento a 45-50°C, añadir mezclando,
50 ml de sangre de carnero estéril y verter en placas. pH 7.4 +/- 0.1
El medio de cultivo preparado es, antes de la adición de la sangre, claro y
ligeramente
parduzco y posteriormente del color de la misma y no
hemolizada
Preparación de la solución de vitamina K: disolver 1g de vitamina k en 99 ml
de etanol absoluto. (Merck 1994).
• Empleo e interpretación:
Sembrar las placas en superficie. Incubación: en condiciones optimas de 24
a 48 horas 37 °C.
Determinación de la formación de pigmento y del tipo de colonias y de
hemolisis. (Merck 1994).
AGAR BILIS ESCULINA
Para la investigación preliminar de Enterococos (grupo serológico D), de
acuerdo con la formulación propuesta por SWAN (1954), así como por
FACKLAM y MOODY (1970).
• Forma de acción
La hidrólisis de la Esculina y la tolerancia a la bilis considerada como
características fidedignas y constantes de Enterococos (Oxoid, 2006).
En tanto que los Enterococos que toleran la presencia de bilis, pueden
multiplicarse sin impedimento, numerosas bacterias acompañantes resultan
notablemente inhibidas en su crecimiento por las sales biliares. Los
Enterococos hidrolizan al glucósido Esculina convirtiéndolo en glucosa y
esculetina. (Oxoid 2006).
Esta ultima sustancia, con iones hierro (III) forma un complejo de color verde
oliva hasta negro. Añadiendo suero de caballo al medio de cultivo puede
optimizarse el crecimiento de Enterococos. (Oxoid 2006).
• Composición (g/litro)
Extracto de carne 3.0
Peptona de carne 5.0
Bilis de buey 40.0
Esculina 1.0
Citrato férrico 0.5
Agar agar.
Adición de gentamicina
• Preparación
Disolver 64 g/ litro y esterilizar en autoclave. No recalentar! Tras enfriamiento
a 45-50°C añadir eventualmente, 5% de suero y mezclar. Verter en placas.
pH:6.6+/- 0.2
Las placas preparadas son claras y de color pardo azulado.
• Empleo e interpretación
Sembrar por sedimentación sutil el material a investigar. Incubación hasta 3
días a 37°C.
En presencia de Enterococos, se produce por lo general ya al cabo de las
primeras 24 horas una coloración oscura del medio alrededor de las colonias
en crecimiento. Cuando estas son numerosas y llegar a confluir, el
oscurecimiento producido puede llegar a afectar a la totalidad del medio de
cultivo de la placa. (Oxoid 2006).
Si al cabo de 3 días de incubación no se ha producido oscurecimiento alguno
del medio de cultivo, se acepta que el material sembrado no tenía
Enterococcus. (Oxoid 2006).
AGAR SABOURAUD
Para el cultivo de mohos y levaduras a partir, sobre todo, de materiales de
envasado y embalajes, así como para el ensayo de sustancias antimicóticas.
Este
medio
de
cultivo
corresponde
por
su
composición
a
las
recomendaciones del Instituto d Tecnología de Alimentos y de envasado de
la Universidad Tecnológica de Múnich (1974).
• Composición (g/litro)
Peptona de caseína 5.0
Peptona de carne 5.0
D (+) glucosa 10.0
Maltosa 10.0
Agar agar.
• Preparación
Disolver 45 g/litro y esterilizar en autoclave (15 min a 121°C). ¡no
sobrecalentar¡
pH 5.4 +/- 0.1
Las placas con medio de cultivo son claras y de color amarillento
• Empleo e interpretación
Sembrar el medio de cultivo. Incubación hasta 5 días a 25°C. (Oxoid 2006).
AGAR PAPA DEXTROSA
Es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de
muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosméticos.
Puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento
bacteriano. Este medio es recomendado para realizar recuento colonial.
También puede ser utilizado para promover el crecimiento de hongos y
levaduras de importancia clínica. La base del medio es altamente nutritiva y
permite la esporulación y la producción de pigmentos de algunos
dermatofitos. Alguno procedimientos señalan bajar el pH del medio a 3.5 +/0.1 con acido tartárico al 10% para inhibir el crecimiento bacteriano.
La infusión de papa promueve el crecimiento abundante de hongos y
levaduras y el agar es adicionado como agente solidificante. (Merck 1994).
• Composición (g/litro)
Infusión de papa 200.0
Dextrosa 20.0
Agar agar
pH 5.6 +/- 0.2
• Preparación
Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con
agitación suave hasta completa disolución y hervir durante 1 minuto.
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121°C, enfriar a una temperatura entre
45-50°C y vaciar en placas de petri. (Merck 1994).
• Interpretación
Las levaduras se observan como colonias de color crema o blanco. Los
hongos crecen como colonias difusas y de varios colores. (Merck 1994).
AGAR TSBV
Utilizado como medio selectivo apropiado pata el aislamiento de
A. actinomycetemcomitans en el laboratorio.
• Composición (g/litro)
Agar tripticasa soya 40.0
Extracto de levadura 1.0
Bacitracina 75 mg
Vancomicina 5 mg
Suero de caballo estéril 0.1%
Se homogenizo la solución hirviéndola a 100°C, se esterilizó en el autoclave
de vapor, se atempero a 50°C y se le añadieron los antibióticos y el suero.
(Merck 1994).
CALDO Y MEDIO DE CULTIVO TIOGLICOLATO
Para el cultivo y aislamiento de Anaerobios estrictos y facultativos, de
gérmenes microaerofilicos y para ensayos de esterilidad. (Oxoid 2006).
Por su composición ambos medios de cultivo corresponden a las
recomendaciones de la United States Pharmacopoeia XXI (1980), a la
European Pharmacopoeia II (1985) y a la APHA (1984). Corresponden
además a las prescripciones analíticas apartado 35 de la LMBG para la
investigación de alimentos. (Oxoid 2006).
• Forma de acción
Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteína, proporcionan una
anaerobiosis suficiente, incluso para Anaerobios exigentes. Debido a sus
grupos sulfhidrilos, se activan las compuestos de arsénico, mercurio y de
otros metales pesados. (Oxoid 2006).
Los medios con tioglicolato son adecuados, por lo tanto, para la investigación
de materiales que contengan metales pesados o conservantes en cuya
composición participen dichos metales pesados. La elevada viscosidad del
medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxigeno. El
eventual aumento del contenido de oxigeno se pone en manifiesto por un
viraje a rojo del indicador redox Rezarsurina sódica. (Oxoid 2006).
• Composición
Peptona de caseína 15.0
Extracto de levadura 5.5
L (+) cisteína 0.5
Cloruro sódico 2.5
Tioglicolato sódico 0.5
Rezarsurina sódica (ausente en caldo) 0.001
Agar agar (ausente en caldo)
• Preparación
Disolver 29 g/litro (para el caldo tioglicolato), o bien 30 g litro (para el medio
de cultivo tioglicolato), distribuir en tubos y esterilizar en autoclave (15 min a
121°C)
pH 7.1 +/- 0.2
Los medios de cultivo preparados son claro de color amarillento.
A ser posible, estos medios de cultivo deben usarse recién preparados. En
medio de cultivo tioglicolato ya no puede utilizarse cuando los tubos
presenten coloración rosa debida a la penetración de oxigeno, en mas del
tercio superior de la altura del medio y cuando dicha coloración no quede
eliminada por ebullición (una sola vez). (Oxoid 2006).
• Empleo e interpretación
El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de
cultivo. A continuación, puede superponerse una capa de aprox. 1 cm de
altura de parafina liquida estéril o de agar agua.
Incubación: varios días a temperatura optima.
Los gérmenes anaerobios crecen en la parte inferior del tubo de cultivo.
(Oxoid 2006).
AGAR CEREBRO- CORAZON (BHI)
Para el cultivo de diversos microorganismos patógenos exigentes. Estos
medios de cultivo corresponden a las recomendaciones de los Standard
methods for the examination of wáter and wastewater (1975). El caldo de
cerebro-corazón corresponde a la norma DIN 10163 para el análisis de
carnes y a las prescripciones según apartado 35 de la LMBG para el análisis
de alimentos. (Merck 1994).
• Composición (g/litro)
Substrato alimenticio (extracto cerebro, extracto de corazón y peptona) 27.5
D (+) glucosa 2.0
Cloruro sódico 5.0
Hidrogenofosfato disódico 2.5
Agar-agar 15
• Preparación.
Disolver 52g/litro (agar cerebro-corazón) y esterilizar en autoclave (15min a
121 °C) pH: 7.4+/- 0.2. El medio es ligeramente parduzco, presenta
opalescencia. (Merck 1994).
• Formas de actuación
El agar cerebro corazón, aparte de su aplicación en el terreno bacteriológico,
es adecuado también para el cultivo de hongos patógenos. El crecimiento de
la flora bacteriana de acompañamiento puede inhibirse notablemente por
adición de 20 UI de penicilina y 40 ug de estreptomicina por ml de medio de
cultivo. (Merck 1994).
Este medio de cultivo es menos
adecuado para el estudio de formas
hemolíticas (tras adición de sangre) debido a su contenido de glucosa.
(Merck 1994).
ANEXO 10:
TECNICA DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un n
número de veces:
1. Separación de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando
la
temperatura, la cual rompe los enlaces de hidrógeno que mantiene unidos a
las cadenas de ADN.
2. Adición de cadenas cortas de polinucleótidos, denominados cebadores,
que
Se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del
fragmento de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5’ ---3’ y
otro a la cadena 3’—5’.
3. Disminución de la temperatura para permitir que los cebadores hibridasen
con las cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de
bases.
4. Adición de la ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos (ATP, GTP, TTP,
CTP) y demás cofactores, para que tenga lugar la síntesis de la cadena
complementaria.
5. Repetición de las etapas 1 a 4. Este proceso se caracteriza por ser
exponencial. En cada ciclo se duplica la región de ADN ubicada entre los
cebadores. Este procedimiento se realiza en un equipo denominado
termociclador, que permite regular las diferentes temperaturas que se
requieren para cada uno de los pasos. A continuación se enumeran ejemplos
de agentes microbianos subclasificados en bacterias, virus y protozoario, que
han sido identificados mediante PCR.
Grafico tegnica de PCR.
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema12.pdf
.