Download herpesvirosis del salmón masou (salmón japonés)

NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista
del capítulo 1.2.3 del Código de animales acuáticos.
Este capítulo no ha sido actualizado desde 2003.
CAPÍTULO 2.1.3.
HERPESVIROSIS DEL SALMÓN MASOU
(SALMÓN JAPONÉS)
RESUMEN
La enfermedad del virus Oncorhynchus masou es una condición oncogénica y ulcerante de la piel que se
da en los salmónidos de Japón, y probablemente en los ríos costeros del este de Asia en los que habita el
salmón del Pacífico. El virus Oncorhynchus masou (OMV), que es el virus causal, es también conocido
como virus del tumor de Yamame (YTV), virus Nerka de Towada Lake, prefectura de Akita y Amori
(NeVTA), virus del tumor del salmón coho (CSTV), virus Oncorhynchus kisutch (OKV),
herpesvirus del salmón coho (CSHV), virus del riñón de la trucha arco iris (RKV), o herpesvirus de la
trucha arco iris (RHV). Para una revisión reciente y más detallada de la enfermedad, véanse las
referencias 4, 12 y 13.
Las especies de peces susceptibles a OMV incluyen: salmón sockeye (Oncorhynchus nerka), salmón
masou) (O. masou), salmón chum (O. keta), salmón coho (O. kisutch) y trucha arco iris (O. mykiss)
(6).
Desde el punto de vista clínico, la infección inicial por OMV (conocida taxonómicamente como herpesvirus
2 de los salmónidos; SalHV-2) aparece como una infección sistémica y con frecuencia letal que se asocia
con edema y hemorragias. La multiplicación del virus en las células endoteliales de los capilares sanguíneos,
los tejidos hematopoyéticos y los hepatocitos acompañan a los signos clínicos (7, 11). Cuatro meses después
del primer cuadro clínico, un número variable de peces supervivientes exhiben un epitelioma que ocurre
principalmente en torno a la boca (mandíbulas superior e inferior) y, en menor medida, en la aleta
caudal, el opérculo y la superficie corporal. Esas neoplasias pueden persistir hasta un año después de la
infección. En el caso del salmón coho, sobre todo los peces infectados de un año muestran úlceras en la piel,
manchas blancas en el hígado y tejidos neoplásticos en torno a la boca o en la superficie corporal. En la
trucha arco iris, los peces enfermos apenas muestran síntomas externos, aunque algunos peces muestran
lesiones ulcerosas en la piel. Internamente, se observan hemorragia intestinal y manchas blancas en el
hígado (5, 15, 16).
Siguiendo la fase de septicemia de la infección por OMV, se produce una respuesta inmune que provoca la
síntesis de anticuerpos neutralizantes contra OMV. Con frecuencia se produce un estado de portador que
lleva a diseminar el virus mediante los productos sexuales en el momento del desove.
Según los estudios antigénicos realizados con antisueros de conejo policlonales neutralizantes, OMV difiere
del herpesvirus 1 de los salmónidos (SalHV-1), que está presente en la parte occidental de EE.UU. y es
poco patogénico (3, 9, 12).
Los reservorios de OMV son los peces clínicamente infectados y los portadores inaparentes entre grupos de
peces de cultivo, domesticados o silvestres. El virus infeccioso se disemina por las heces, orina, productos
sexuales y probablemente el moco de la piel, mientras que el riñón, el bazo, el hígado y los tumores son los
sitios en los que más abunda el virus en el curso de la infección manifiesta. La transmisión del OMV es
horizontal y posiblemente “asociada a la superficie de los huevos”. La transmisión horizontal puede ser
directa o vectorial, siendo el agua el principal factor abiótico. Los vectores animados y los objetos
inanimados también intervienen en la transmisión del OMV. La desinfección de los huevos
inmediatamente después de la fertilización y en la fase en que aparecen los ojos es efectiva para prevenir la
infección por OMV. No se halló la enfermedad debida al OMV en alevines procedentes de huevos
desinfectados que habían sido incubados y eclosionados en agua libre del virus (14).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.3. — Herpesvirosis del salmón masou
Los salmónidos constituyen las únicas especies de pez receptivas a la infección por OMV; el orden de las
especies, de más a menos receptivas, es el siguiente: salmón sockeye, salmón chum, salmón masou, salmón
coho y trucha arco iris. La edad del pez es crítica y los alevines de un mes de edad son los más sensibles a
la infección vírica (6). El principal factor medioambiental favorecedor del la infección por OMV es el agua
a temperatura baja (inferior a 14°C) (10).
Los procedimientos de análisis del OMV se basan en el aislamiento directo del virus en cultivo celular y el
co-cultivo de tejidos neoplásicos con líneas celulares de salmónidos (8). Las pruebas confirmatorias consisten
en la identificación inmunológica mediante pruebas de neutralización o inmunofluorescencia, y en la
detección de los genes específicos del virus mediante reacción en cadena de la polimerasa.
Los métodos de control actuales se basan en la realización de prácticas de higiene y prevención en el manejo
durante la cría de salmónidos. Las medidas esenciales para disminuir la contaminación con OMV en un
lugar concreto de acuicultura son la desinfección exhaustiva de los huevos fertilizados y la incubación de
esos huevos, la crianza de crías y alevines en instalaciones que estén completamente separadas de las que
alojan a los portadores del virus y libres de contacto con objetos inanimados. (14).
PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO
El análisis y el diagnóstico de la herpesvirosis del salmón masou (HSJ) se basa en métodos directos, que
consisten en el aislamiento del virus Oncorhynchus masou (OMV) en cultivo celular seguido de la
identificación inmunológica (enfoque convencional),o la demostración inmunológica del antígeno de
OMV en tejidos de peces infectados (2, 5).
Debido al insuficiente conocimiento de las respuestas serológicas de los peces a las infecciones víricas, la
detección de anticuerpos de peces contra los virus no se ha considerado hasta ahora como un método de
diagnóstico válido para valorar el estado infectivo de las poblaciones de peces. Sin embargo, en un futuro
próximo podrían validarse algunas técnicas serológicas para el diagnóstico de ciertas infecciones víricas de
los peces, convirtiendo el uso de la serología con peces en aceptable para fines de diagnóstico.
El material de peces infectados apropiado para el examen virológico es:
•
Peces con afección clínica: alevín entero (longitud del cuerpo ≤4 cm), vísceras que incluyan el riñón
(4 cm ≤ longitud del cuerpo ≤6 cm) o, con peces de tamaño mayor, lesiones ulcerosas de la piel o
tejidos neoplásicos, y riñón, bazo, hígado y encéfalo.
•
Peces asintomáticos (aparentemente sanos): riñón, bazo y encéfalo (peces de cualquier tamaño) y/o
fluido ovárico de los reproductores durante el desove.
Procedimientos de muestreo: véase el capítulo I.1, sección B.
1. MÉTODO ESTÁNDAR DE ANÁLISIS DEL OMV
1.1. Aislamiento del OMV en cultivo celular
Línea celular que se debe usar: RTG-2 o CHSE-214
a) Inoculación de monocapas de células
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i)
Se hace una dilución decimal adicional de 1/10 de los sobrenadantes del homogeneizado
de órganos y se transfiere un volumen apropiado de cada una de las dos diluciones a
monocapas celulares de 24 horas. Se inocula al menos 2 cm2 de monocapa celular
escurrida con 100 µl de cada dilución.
ii)
Dejar que se adsorba durante 0,5−1 hora a 10−15°C y, sin retirar el inóculo, se añade
medio de cultivo celular tamponado a pH 7,6 y suplementados con 2% de suero fetal
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Capítulo 2.1.3. — Herpesvirosis del salmón masou
bovino (FCS) (1 ml/pocillo para placas de cultivo celular de 24-pocillos), y se incuba a
10−15°C.
b) Control de la incubación
i)
Se sigue el curso de la infección en controles positivos y otros cultivos celulares
inoculados mediante examen microscópico diario a 40–100 aumentos durante 14 días. Se
recomienda el uso de microscopía de contraste de fases.
ii)
Se mantiene el pH del medio de cultivo celular entre 7,3 y 7,6 durante la incubación. Eso
se puede lograr mediante la adición al medio de cultivo celular inoculado de tampón
bicarbonato estéril (para frascos de cultivo celular con cierre hermético) o solución
tamponada Tris (para placas de cultivo celular) o, lo que es mejor, utilizando medio
tamponado con HEPES (HEPES = ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfónico).
iii) Si aparece efecto citopático (ECP) en los cultivos celulares inoculados con las diluciones
de los sobrenadantes del homogeneizado analizado, deben aplicarse de inmediato los
procedimientos de identificación (véase la sección 1.2 más adelante).
Si se está aplicando un programa de vigilancia /control, es posible que tenga que suspenderse el
estatus sanitario aprobado de la unidad de producción y/o la zona (si ésta se aprobó con
anterioridad) en la que se obtuvo la muestra positiva al virus. Se mantendrá la suspensión del
estatus aprobado hasta que se demuestre que el virus en cuestión no es el OMV.
iv) Si no se desarrolla efecto citopático en los cultivos inoculados (a pesar de la progresión
normal del ECP en los controles de virus), deben subcultivarse durante 7 días más los
cultivos inoculados. Si los controles de virus no desarrollan ECP, debe repetirse el
proceso con células frescas susceptibles y nuevos lotes de muestras.
c) Procedimientos de subcultivo
i)
Se recogen alícuotas de medio de cultivo celular de todas las monocapas inoculadas con
diluciones de cada sobrenadante de los homogeneizados de órganos.
ii)
Si es preciso, se repite la prueba de neutralización con el virus de la necrosis pancreática
infecciosa (IPNV) y/o el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV) como se
describió previamente (véase el capítulo I.1, sección B.3.3), con dilución del sobrenadante
aludido anteriormente (1/1 a 1/100).
iii) Se inoculan las monocapas celulares como se describió en la sección 1.1.a
iv) Se incuba y controla como se describió en la sección 1.1.b
v)
Si no se produce ECP, la prueba puede declararse negativa.
d) Aislamiento del OMV a partir de cultivos de células neoplásicas
i)
Se cogen tejidos neoplásicos, se desinfectan con yodóforo, 50 partes por millón durante
20 minutos, y se lava tres veces con solución salina equilibrada de Hanks.
ii)
Se dejan los tejidos toda la noche en 0,25% de tripsina en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) a 5°C. Luego, se siembran 3,5 × 105 células neoplásicas/ml en un frasco de
cultivo de tejido y se incuba con medio de cultivo que contenga 20% de suero fetal
bovino (FBS).
iii) Se recoge el cultivo de células neoplásicas primarias y se cultiva junto con células RTG-2
o CHSE-214.
iv) Se incuba y se observa como se describió en la sección 1.1.b
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.3. — Herpesvirosis del salmón masou
1.2. Identificación del OMV
a) Prueba de neutralización
i)
Se recoge el medio de cultivo de las monocapas celulares que muestren ECP y se
centrifuga a 2.000 g durante 15 minutos a 4°C para eliminar los restos celulares.
ii)
Se diluye el medio que contiene el virus de 10−2 a 10−4.
iii) Se mezclan alícuotas (por ejemplo 200 µl) de cada dilución de virus con volúmenes
iguales de una solución de anticuerpos específicos para OMV, y, de forma similar se
tratan las alícuotas de cada dilución de virus con medio de cultivo celular.
(La solución de anticuerpos neutralizantes [NAb] debe tener un título de reducción del
50% de placas de al menos 2.000.)
iv) De forma paralela, deben realizarse otras pruebas de neutralización contra:
• una cepa del virus homólogo (prueba de neutralización positiva)
• una cepa del virus heterólogo (prueba de neutralización negativa).
v)
Si es preciso, se puede realizar una prueba de neutralización similar utilizando anticuerpos
contra IPNV, para asegurarse de que ningún contaminante con IPNV ha pasado
desapercibido en la primera prueba contra el IPNV.
vi) Se incuban todas las mezclas a 15°C durante 1 hora.
vii) Se transfieren alícuotas de cada una de las mezclas anteriores a monocapas celulares (se
inoculan dos cultivos celulares por dilución) y se deja que se adsorba durante 0,5−1 horas
a 15°C; para este propósito son suficientes placas de cultivo de 24 o 12 pocillos, usándose
50-µl de inóculo.
viii) Una vez se ha completado la adsorción, se añade a cada pocillo medio de cultivo celular
suplementado con 2% de FCS y tamponado a pH 7.4−7,6 y se incuba a 10−15°C.
ix) Comprobar si en los cultivos celulares se inicia CPE y leer los resultados tan pronto como
aquél ocurra en los controles no neutralizados (protegiendo las monocapas celulares en
los controles de neutralización positivos). Se registran los resultados bien después de un
examen microscópico (preferiblemente de contraste de fases) o después de desechar el
medio de cultivo celular y teñir las monocapas celulares con una solución al 1% de cristal
violeta en etanol al 20%.
x)
El virus ensayado se identifica como OMV cuando se evita o se retarda
considerablemente el ECP en los cultivos celulares a los que se les había administrado la
suspensión de virus tratada con un anticuerpo específico contra OMV, mientras que el
ECP es evidente en todos los demás cultivos celulares.
xi) En ausencia de cualquier neutralización por NAb contra OMV, es obligatorio realizar una
prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) con la muestra sospechosa.
b) Prueba de inmunofluorescencia indirecta
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i)
Se preparan monocapas de células en pocillos de 2 cm2 de placas de plástico para cultivo
celular o en cubres a fin de obtener en torno al 80% de confluencia, lo que se consigue
normalmente antes de 4 horas de incubación a 22°C (se siembran seis monocapas
celulares por cada aislamiento del virus a identificar, más dos para controles positivos y
dos para controles negativos). El contenido en FCS del medio de cultivo celular puede
reducirse al 2–4%. Si se han de identificar muchos aislamientos de virus, se recomienda
encarecidamente la utilización de placas de Terasaki.
ii)
Cuando las monocapas de células estén listas para la infección, i.e., el mismo día o al día
siguiente de la siembra, se inoculan las suspensiones del virus a identificar realizando
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.3. — Herpesvirosis del salmón masou
diluciones decimales seriadas directamente en los pocillos de cultivo celular o en los
frascos de cultivo.
iii) Se diluyen las suspensiones control del OMV de forma similar, a fin de obtener un título
vírico de en torno a 5.000–10.000 unidades formadoras de placas (UFP/ml en el medio
de cultivo celular.
iv) Se incuba a 15°C durante 48 horas.
v)
Se elimina el medio de cultivo celular, se lava una vez con 0,01 M de PBS, pH 7,2, luego
tres veces con acetona fría (mantenida a –20°C) para el caso de los cubres, o una mezcla
de acetona al 30%/etanol al 70%, también a –20°C, para pocillos de plástico.
vi) Se deja que actúe el fijador durante 15 minutos. Es adecuado un volumen de de 0,5 ml
para 2 cm2 de monocapa celular.
vii) Se deja que las monocapas celulares se sequen al aire durante al menos 30 minutos y se
procesa de inmediato o se congela a –20°C.
viii) Se prepara una solución de anticuerpo o suero purificado contra OMV en 0,01 M de PBS,
pH 7,2, que contenga 0,05% de Tween 80 (PBST), a la dilución apropiada (que se ha
establecido previamente o ha sido proporcionada por el proveedor del reactivo).
ix) Se rehidratan las monocapas celulares mediante cuatro pasos de lavado con solución
PBST, y se elimina ese tampón completamente después del último lavado.
x)
Se tratan las monocapas celulares con una solución de anticuerpo durante 1 hora a 37°C
en una cámara sin permitir que haya evaporación. El volumen de solución a usar es
0,25 ml/pocillo de 2 cm2.
xi) Se lava cuatro veces con PBST como antes.
xii) Se tratan las monocapas celulares durante 1 hora a 37°C con una solución de anticuerpo
conjugado con isotianato de fluoresceína (FITC) contra la inmunoglobulina usada en la
primera capa y preparada de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Estos
anticuerpos FITC son casi siempre anticuerpos de conejo o de cabra.
xiii) Se lava cuatro veces con PBST.
xiv) Se examinan de inmediato las monocapas tratadas en placas de plástico, o se montan los
cubres utilizando solución salina de glicerol a pH 8,5 antes de la observación
microscópica.
xv) Se examina bajo luz UV incidente utilizando un microscopio con lente ocular de ×10 y
lentes objetivos de ×20–40, con aberturas numéricas >0,65 y >1,3, respectivamente.
Antes de cualquier otra observación se comprueba que los controles positivos y negativos
dan los resultados esperados.
c) Enzimoinmunoensayo
i)
Se recubren los pocillos de las microplacas diseñadas para enzimoinmunoensayos
(ELISA) con diluciones adecuadas de anticuerpo monoclonal o inmunoglobulina (Ig)
purificada específica para OMV, en 0,01 M de PBS, pH 7,2 (200 µl/pocillo).
ii)
Se incuba toda la noche a 4°C.
iii) Se lava cuatro veces con 0,01 M de PBS que contenga 0,05% de Tween 20 (PBST).
iv) Se bloquea con leche desnatada (5% en PBST) u otra solución bloqueadora durante
1 hora a 37°C (200 µl/pocillo).
v)
Se lava cuatro veces con PBST.
vi) Se añade 2% de Tritón X-100 a la suspensión del virus a identificar.
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Capítulo 2.1.3. — Herpesvirosis del salmón masou
vii) Se distribuyen 100 µl/pocillo de una dilución del virus a identificar en dos o cuatro pasos
y del virus control OMV, y se deja que reaccione con el anticuerpo recubierto contra
OMV durante 1 hora a 20°C.
viii) Se lava cuatro veces con PBST.
ix) Se añade a los pocillos anticuerpo policlonal biotilinado contra OMV.
x)
Se incuba durante 1 hora a 37°C.
xi) Se lava cuatro veces con PBST.
xii) Se añade peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina a los pocillos que contienen
el anticuerpo conjugado con biotina, y se incuba durante 1 hora a 20°C.
xiii) Se lava cuatro veces con PBST.
xiv) Se añaden el sustrato y el cromógeno. Se detiene el desarrollo de la prueba cuando
reaccionen los controles positivos, y se analizan los resultados.
d) Reacción en cadena de la polimerasa
i)
Se extrae el ácido nucleico de las células infectadas con cepas de OMV y SalHV-1 usando
la Matriz InstGene (Biorad).
ii)
Se precipitan los tejidos infectados con el virus o las células de cultivo infectadas
mediante centrifugación a 19.000 g (14.800 rpm) durante 15 minutos.
iii) Se lava el precipitado dos veces con 1 ml de PBS y se mezcla con 200 μl de resina
quelante (Sigma).
iv) Se incuba la mezcla a 56°C durante 20 minutos en un baño de agua, se agita en un vórtex,
y luego se coloca en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos.
v)
Se agitan las mezclas en un vórtex y se centrifugan a 8.200 g (10.000 rpm) durante
90 segundos.
vi) Se somete el sobrenadante a la PCR.
vii) El cebador directo (F10) es 5’-GTA-CCG-AAA-CTC-CCG-AGT-C-3’, y el cebador
inverso (R5) es 5’-AAC-TTG-AAC-TAC-TCC-GGG-G-3’.
viii) Se incuban los ejemplares, los juegos de cebadores y las mezclas de reacción para
30 ciclos en un termociclador automático (GeneAmp PCR 9700, Applied Biosystems),
consistiendo cada ciclo en una desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, hibridación
a 56°C durante 30 segundos y extensión a 72°C durante 30 segundos.
ix) Se analiza el tamaño y la pureza del producto amplificado mediante electroforesis (100 V
durante 30 minutos) en gel de agarosa al 2% y se tiñe con bromuro de etidio.
x)
Mediante una prueba de PCR en la que se utilizaron esos conjuntos de cebadores se
amplificó un segmento ADN de 439 pb procedente de cepas de OMV aisladas de salmón
masou (salmón japonés), salmón coho (salmón plateado) y trucha arco iris, y de hígado,
riñón, cerebro y tejidos nerviosos, y un segmento de ADN de 800 pb procedente de
SalHV-1. El SalHV-1 y el SalHV-2 pueden distinguirse por el perfil en gel de agarosa de
ese ADN amplificado (1).
2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE OMV
2.1. Aislamiento del virus e identificación subsiguiente
Como en las secciones 1.1 y 1.2.
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Capítulo 2.1.3. — Herpesvirosis del salmón masou
2.2. Prueba de inmunofluorescencia indirecta
a) El método de la prueba de inmunofluorescencia indirecta
i)
Se sangra el pez a fondo.
ii)
Se hacen frotis de riñón sobre portas de vidrio limpios o en el fondo de los pocillos de
una placa de cultivo celular de plástico.
iii) Guardar los trozos de riñón (como se indicó en la sección B.3.1 del capítulo I.1) junto
con los demás órganos necesarios para el aislamiento del virus en caso de que se necesite
más adelante.
iv) Dejar que el frotis se seque al aire durante minutos.
v)
Se fija con acetona o etanol /acetona y se seca como se indicó en la sección 1.2.b, pasos
(v–vii).
vi) Se rehidratan los preparados anteriores (véase la sección 1.2.b, paso [ix]) y se bloquean
con 5% de leche desnatada o con 1% de sero-albúmina bovina (ASB), en PBST durante
30 minutos a 37°C.
vii) Se lava cuatro veces con PBST.
viii) Se tratan los frotis con la solución de anticuerpo contra OMV y se lava como se indicó en
la sección 1.2.b.
ix) Se bloquea y se lava como se describió previamente en los pasos (vi) y (vii).
x)
Se revela la reacción con un anticuerpo específico conjugado con FITC, se lava y se
observa como se indicó en la sección 1.2.b, pasos (xii–xv).
Si la prueba es negativa, se procesan las muestras de órganos guardadas a 4°C tal como se
describió en la sección 1.1.
2.3. Enzimoinmunoensayo
a) Procesamiento de las microplacas
Como se describió en la sección 1.2.c del presente capítulo hasta el paso (iv) (inclusive).
b) Procedimiento de muestreo
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1:
B.1. para la selección de ejemplares de peces
B.2. para la selección de los materiales de muestra.
c) Procesamiento de las muestras de órganos
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1:
B.3.1. para el transporte
B.3.2. para la extracción de virus y la obtención de homogeneizados de órganos.
d) Procedimiento del enzimoinmunoensayo
i)
Separar una alícuota de 1/4 de cada homogeneizado por si se precisa un aislamiento
adicional del virus en cultivo celular.
ii)
Se trata el resto del homogeneizado con 2% Tritón X-100, como en la sección 1.2.c, paso
(vi), y 2 mM de fenil metil sulfonil fluoruro; se mezcla con suavidad.
iii) Se completan los otros pasos del procedimiento como se describió en la sección 1.2.c.
Se la prueba es negativa, se procesan las muestras de órganos almacenadas a 4°C para el
aislamiento del virus en cultivo celular como se describió en la sección 1.1.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.3. — Herpesvirosis del salmón masou
2.4. Método de la reacción en cadena de la polimerasa
a) Extracción de ADN
Como se describió en la sección 1.2.d del presente capítulo hasta el paso (v) (inclusive).
b) Conjunto de cebadores y condición de la PCR
Tal como se describió en la sección 1.2.d del presente capítulo, los pasos (vi–viii). En una
prueba PCR en la que se utilizaron estos conjuntos de cebadores se amplificó un segmento de
ADN de 439 pares de bases proveniente de OMV. El SalHV-1 y el SalHV-2 pueden
distinguirse por el perfil en gel de agarosa de ese ADN amplificado (1).
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*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para el herpesvirus del salmón masou (salmón japonés)
(véase el cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web
de la OIE : www.oie.int).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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