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Manual de técnicas bacteriológicas generales Código: M-CCBA-LB-09 Revisión: 01 Fecha de emisión: 19/04/10 Página: 1 de 23 CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS NIVEL DE SECCIÓN Y/O REVISIÓN PÁGINA 01 1 DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y MEJORA FECHA DE MODIFICACIÓN Actualización de las firmas Octubre 2012 02 03 04 05 Elaboró Revisó Aprobó QFB Ana María Sofía Rejón Magaña Responsable del laboratorio Coordinador de la Unidad de Diagnóstico Coordinador de la Unidad de Diagnóstico 1.-OBJETIVO Describir las técnicas básicas generales para el análisis y aislamiento de muestras biológicas de origen animal. 2.- ALCANCE Aplica a todo el personal del laboratorio de bacteriología. 3.- POLITICAS Todo el personal debe: Seguir los lineamientos que se señalan en este manual. Preparar las muestras de acuerdo a las técnicas generales descritas en este manual 2 INDICE Introducción …………………………………………………………...………………… 5 Cristal violeta …………………………………………………………..……………….. 5 Lugol ……………………………………………………………………...……………… 5 Alcohol acetona …………………………………………………………...……………. 5 Safranina …………………………………………………………………….………….. 6 Colorante wayson ………………………………………………………………………. 6 Azul de metileno alcalino (Tinción de Hansen) ………………………………….….. 6 Solución acuosa de safranina ……………………………………………………….... 6 Azul de Metileno Alcalino Loeffler ……………………………………………………. 7 Fucsina Fenicada (Tinción de Ziehl -Neelsen) ………………………………….…... 7 Alcohol Acido (Tinción de Ziehl-Neelsen) ………………………..………………...... 7 Verde Malaquita al 5 % (Tinción de esporas) ……………………………………….. 8 Safranina al 5 % (Tinción de espora) ………………………………………………… 8 Sulfato de cobre al 20 % (Tinción de cápsula) …………………………………….... 8 Fucsina básica (Tinción de cápsula) ……………………………………………….… 8 Fucsina fenicada (Tinción de Campylobacter)al 0.8 % ………………………..…… 8 Preparación de soluciones ……………………………………………………………. 9 Introducción …………………………………………………………………………...… 9 Indicador de rojo de metilo ………………………………...………………………….. 9 Soluciones, empleadas para la prueba (Reducción de nitratos) …………............. 9 Reactivo de kovac …………………………………………………………………….... 10 3 Reactivos empleados para la prueba de Voges Proskauer .................................. 10 Hidróxido de potasio (KOH) 40 % agente oxidante ……………………………….... 10 Peróxido de hidrógeno al 30% ……………………………………………………...… 11 Solución salina fisiológica 0.85 % …………………………………………………..... 11 Estandar sulfato de bario (para ANTIBIOGRAMAS) ……………………………….. 11 Preparación de HCl 0.1 N ……………………………………………………………... 11 Solución Verde Brillante al 0.1 % (Salmonella) ……………………………………... 12 Solución buffer fosfatos para alimentos (PBS) …………………………………..…. 12 Agua peptonada concentrada para salmonella en aves (APC) …………………… 12 Agua peptonada diluida para salmonella en carne molida ………………………… 12 Buffer fosfatos para salmonella en aves …………………………………………..… 12 Preparación de lugol para tetrathionate ……………………………………………… 13 Preparación del hipurato de sodio al 1 % ……………………………………………. 13 Solución de fosfatos para mantener remojados los electrodos …………………… 13 Solución buffer diluyente para bacteriológico de alimentos ……………………….. 13 Soluciones para ajustar pH de muestras ………………………………………….… 14 Referencias ……………………………………………………………………………... 15 4 DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO El diagnóstico microbiológico es el conjunto de procedimientos y técnicas complementarias empleadas para establecer la etiología del agente responsable de una enfermedad infecciosa. El material utilizado para llevarlo a cabo en el laboratorio de bav¿cteriología es el siguiente. ASAS DE PLATINO, HISOPOS, PALILLOS MEDIOS DE CULTIVO MICROSCOPIO LAMINILLAS Y CUBREOBJETOS MECHERO BUNSEN El diagnóstico bacteriológico en la actualidad cuenta con 3 aspectos básicos para su realización: Demostración, aislamiento e identificación. 5 DEMOSTRACION Tiene por objeto la visualización del agente patógeno o su efecto en el material biológico; tejidos, secreciones, exudados, trasudados, contenido estomacal, intestinal, etc. VENTAJAS 1. Se obtienen resultados inmediatos 2. Requerimientos mínimos de equipo, tiempo, técnicas de laboratorio, espacio de trabajo, material, etc. 3. Puede ser el único método de diagnóstico viable, como en el caso de que los organismos involucrados no puedan ser cultivados in vitro (M. leprae) o poseer características de cultivo especiales (Nutrientes: vitaminas, factores de crecimiento, etc.) 4. Nos puede orientar tentativamente a un diagnóstico y tratamiento rápido. 5. En el caso de enfermedades relacionadas con producción de toxinas potentes, la demostración de estas es de mayor importancia que el aislamiento del microorganismo por ejemplo: Clostridium perfringens. 6. Nos puede dar una idea de la cantidad de gérmenes relacionados en el proceso de infección, forma, tamaño y disposición. 7. Permite la observación de algunas reacciones tisulares y elementos que intervienen en el proceso de infección (ejemplo: fagocitosis, tipo de leucocitos asociados en el proceso, fibrina, destrucción o degeneración celular, etc.). 8. Nos muestra sus características de tinción. LIMITACIONES 1. Se requiere de grandes cantidades de microorganismos para la obtención de resultados positivos. Se calcula aproximadamente por cada bacteria que se observa al microscopio con el objetivo de inmersión, existen aproximadamente 106 bacterias por mililitro de fluido o sustancia. 2. En la mayoría de los casos no proporciona respuesta de la acción de toxinas, anticuerpos, etc. Relacionados con el procesos “in vivo”. Respuestas más específicas se pueden obtener con el uso de anticuerpos marcados (Fluoresceína, ferritina, enzimas, etc.). 6 AISLAMIENTO La etapa de aislamiento consiste en el transporte y cambio de los microorganismos del medio natural donde se encuentran a un medio artificial (medio de cultivo y animal de experimentación), para su propagación en cultivo puro. VENTAJAS a) Es la forma más convincente del diagnóstico etiológico de las enfermedades infecciosas. b) Prerrequisito indispensable para la identificación de los agentes microbianos salvo algunas excepciones. c) Requisito para una determinación correcta de la sensibilidad a los diferentes antibióticos y sulfas. DESVENTAJAS a) Requiere de tiempo, equipo, conocimiento y experiencia. b) Puede ser peligroso para el personal de laboratorio. c) En algunas ocasiones se puede llegar al diagnóstico con técnicas menos laboriosas como el examen clínico, clínico patológico, examinación directa, etc. Esterilización a la flama Previo a la realización del aislamiento bacteriano, la muestra biológica es preparada para su inoculación, con el objetivo de recuperar las bacterias, las técnicas de preparación de la muestra varía según el tipo de muestra, en el caso de los tejidos, la esterilización a la flama es importante, para una optima obtención de microorganismos. A partir de una muestra de tejido siempre se procede de la siguiente manera: 1. Se calienta a la flama (se mantienen remojados en alcohol una espátula, una tijera y pinzas) la espátula sin que quede al rojo vivo y se pasa sobre la superficie del tejido afectado. 2. Con la ayuda de una tijera y pinzas esterilizadas a la flama se corta un cuadrante del tejido de aproximadamente 1 cm cuadrado, la parte interna del 7 tejido se pasa sobre el medio de cultivo adecuado y luego se aplica la técnica de siembra en estrías para el aislamiento puro del cultivo. NOTA: En el caso de otro tipo de muestras utilizadas para el aislamiento bacteriano consultar M-CCBA-LB-01 Y M-CCBA-LB-02. Aislamiento puro de un cultivo bacteriano El aislamiento bacteriano tiene como principal objetivo la obtención del microorganismo problema, en un cultivo puro, para su posterior identificación. Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un incremento muy marcado en el número de células en un período muy corto. En algunas especies se alcanza la población máxima en 24 hrs. en cambio, en otras se necesita un período más prolongado para alcanzar el máximo desarrollo. La técnica más común para obtener un cultivo puro es el método llamado sembrado en estrías. Con este método se obtienen colonias aisladas a partir de una sola célula dando lugar a una colonia bacteriana. La siembra se realiza en cajas de petri con Agar y básicamente consiste en el desprendimiento de las bacterias del asa de platino, las cuales caen espaciadas individualmente sobre el medio de cultivo. El sembrado en estrías puede realizarse de varias formas dependiendo del número de microorganismos que se espera, desarrollen. La manera en cómo se realiza es la siguiente: a) Dividir la caja de petri imaginariamente en cuatro cuadrantes. b) Inocular en el primer cuadrante con la muestra realizando estrías muy juntas. Figura 1. c) Esterilizar el asa y continuar con estrías muy juntas en el segundo cuadrante partiendo de las primeras estrías (no se vuelve a tomar de la muestra). d) Continuar de la misma forma esterilizando el asa entre cada cuadrante hasta que la placa entera se ha sembrado. Figura 2. e) Asegurarse de que haya contacto entre las estrías de cada cuadrante. f) Incubar a 37°C. por 24 hrs. 8 Después de incubarlas, estas células individuales se dividen repetidamente hasta formar una masa visible sobre el Agar, las cuales se originaron a partir de una sola célula dando lugar a una colonia bacteriana. Figura 1. Figura 2. 9 Morfologia de las colonias bacterianas La utilidad diagnóstica en el estudio de la morfología de las colonias es de gran importancia porque con ello puede iniciarse una identificación preliminar de los microorganismos aislados. Las características morfológicas son muy variadas mismas que son constantes para cada especie de bacteria en idénticas condiciones de cultivo. Estas características pueden modificarse cuando factores como: humedad relativa, medio de cultivo y temperatura son diferentes. La descripción de las colonias deben realizarse cuando estas se encuentran separadas unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta: Tamaño, color, etc. Color: Hay especies bacterianas capaces de sintetizar pigmentos muy diversos los cuales son detectados fácilmente debido al color característico que imparten a las colonias o por la difusión de dichos pigmentos en el medio de cultivo. Figura 3. Borde: Enteras, onduladas, lobuladas erizadas, filamentosas. Opacidad: Translúcidas, opacas, brillantes. Elevación: Umbilicadas, difusas, planas, convexas. Estructura interna: Mucoides, granulares, filamentosas. Superficie: Lisas, rugosas. Figura 3. Aspectos más comunes de las diversas colonias aisladas sobre medio sólido. Otro dato útil en la identificación preliminar de colonias es la producción de hemolisinas. En el medio de cultivo de Agar sangre la producción de hemolisinas conduce a la formación de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de la colonia. En la hemólisis beta se observa un halo transparente y en la hemólisis alfa un halo verdoso. En el caldo sangre la producción de hemolisinas es detectada por la coloración rojiza que toma el caldo al liberarse la hemoglobina de los eritrocitos. 10 IDENTIFICACION La identificación del agente patógeno tiene como objeto confirmar su identidad por medio de diferentes sustratos y esto depende de: a) Conocimiento de la especie animal, signos clínicos de la enfermedad y/o tipo de lesiones patológicas. b) Examen y tinción de frotis hechos directamente de la muestra. c) El crecimiento y características coloniales de la bacteria patógena sobre los medios de cultivo. d) Condiciones atmosféricas necesitadas para desarrollarse. e) Bioquímicas del cultivo puro del patógeno para confirmar su identidad. Identificación primaria de las bacterias: De un cultivo puro realizar las siguientes pruebas: 1.- Tinción de Gram del cultivo para establecer: a) Si son cocos o bacilos b) SI son Gram positivos o Gram negativos. 2.- Crecimiento o ausencia de crecimiento sobre Agar Mc Conkey. 3.- Prueba de la catalasa. 4.- Prueba de la oxidasa. 5.- Motilidad 6.- Oxidación – Fermentación en medio de Hugh y Leifson. Pruebas bioquimicas secundarias para la identificación de las bacterias hasta especie: a) b) c) d) Estas pruebas pueden ser agrupadas en las siguientes categorías: Medios comerciales preparados en tubos. Medios convencionales para pruebas bioquímicas en tubos. Micrométodos disponibles comercialmente en pequeñas cámaras. Sistemas microbiológicos automatizados. 11 Algunas de ellas son: Fermentación de carbohidratos Utilización de citrato, Hidrólisis de la Urea, descarboxilación de aminoácidos. Licuefacción de la gelatina. Prueba de Voges – Proskauer. Rojo de metilo. Producción de ácido sulfhídrico, indol y motilidad (SIM) TSI. Leche tornasolada. LIA 12 TÉCNICAS DE TINCIÓN BÁSICAS PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO Elaboración de frotis fijo Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un microscopio óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar la visibilidad, acentuar las características morfológicas y conservarlos para su estudio en el futuro. Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo más posible a las células vivas. LA FIJACION es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posición las estructuras internas y externas de las células de los microorganismos. Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular y endurece las estructuras celulares, de manera que no cambien durante la tinción ni la observación. Existen dos clases de fijación fundamentales diferentes: 1. Fijar con calor frotis bacterianos calentando suavemente con una llama una película de bacterias secadas previamente al aire. Este método conserva adecuadamente la morfología general, pero no las estructuras internas de la célula. 2. La fijación química para proteger la subestructura fina y la morfología de microorganismos delicados de mayor tamaño, en esta clase de fijación se utilizan fijadores químicos que penetran a las células y reaccionan con componentes celulares, normalmente proteínas y lípidos, para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmóviles La realización de un frotis fijo consiste en depositar sobre una laminilla una capa delgada de bacterias mismas que quedarán adheridas a la laminilla por medio de calor. Utilizar el marcador, y dibujar dos círculos sobre la superficie de la laminilla. En cada uno de ellos hacer un frotis diferente, por lo que estos deberán quedar adecuadamente identificados. Figura 4. 13 En el primer círculo colocar una pequeña gota de agua destilada. A continuación tomar una pequeña asada del cultivo de S. aureus en medio sólido y con movimientos giratorios, hacer una suspensión muy ligera extendiéndola en toda el área del círculo. Figura 5. Figura 6. En el segundo círculo colocar la asada del cultivo de E. coli en medio sólido extenderla de la misma manera como se hizo en el primer círculo. Dejar secar los frotis a temperatura ambiente. Figura 7. Fijar los frotis al calor pasándolos rápidamente por la flama del mechero. Es importante que la laminilla no se caliente demasiado ya que se pueden modificar las características morfológicas y tintoriales. Figura 8. 14 TINCIÓN DE GRAM Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente con tinción simple esto es, utilizando sólo un colorante, o con tinción diferencial utilizando dos colorantes. Los métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción. La tinción de Gram desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884 es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método diferencial porque divide a las bacterias en dos clases, Gramnegativas y grampositivas de acuerdo a los componentes predominantes de su pared celular, y permite así mismo la observación microscópica de la morfología, el tamaño y la agrupación. El proceso de la tinción se debe en algunos casos a reacciones de intercambio iónico entre compuestos del colorante y otros elementos activos de la superficie o el interior de la célula. La causa de que unas bacterias se coloreen de púrpura y otras no, parece deberse a diferencias en estructura química superficial. Las paredes celulares tanto de bacterias grampositivas y de Gramnegativas poseen una capa basal de peptidoglucano responsable de la rigidez característica de la pared, el peptidoglucano no se tiñe por sí mismo; más bien, parece que actúa como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida del cristal violeta. Las bacterias grampositivas están constituidas propiamente por ácidos teicoicos que son importantes por su especialidad antigénica. En la tinción de Gram se tiñen de color violeta. En las bacterias Gramnegativas existe una membrana externa cuya constitución química es de fosfolípidos y proteínas pero que poseen un alto contenido de lipopolisacáridos, se tiñen de color rosado. La técnica de la tinción de Gram se realiza de la siguiente manera: 1.- Preparar frotis fijos del cultivo y del sarro dental(utilizando un palillo raspa un poco de tu sarro dental) 2.- Cubrir el frotis con la solución de cristal violeta (colorante primario), una o dos gotas son suficientes para cubrir el área del frotis. Dejar actuar por un minuto. Figura 6 Figura 9. 15 3.- Lavar con agua corriente de la llave. Sacudir la laminilla para eliminar las gotas gruesas de agua. Figura 7 Figura 10. 4.- Aplicar la solución de lugol (mordente) y dejar actuar durante un minuto, lavar con agua corriente de la llave. Figura 11. Figura 12 5.- Sacudir la laminilla y aplicar el alcohol acetona (agente decolorante) durante 3 a 5 segundos y lavar nuevamente con agua corriente. Figura 13. Figura 14. 6.- Sacudir el frotis, agregar la fucsina básica (colorante de contraste) y dejar actuar durante medio minuto. Figura 12 16 Figura 15. 7.- Lavar con agua corriente (Figura 13), secar el frotis a temperatura ambiente (Figura 14) y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100X.) Figura 17. Figura 16. INTERPRETACION Grampositivas: Se tiñen de color violeta. Figura 17. Gramnegativas: Se tiñen de color rosado. Figura 18. Figura 17. Figura 18. 17 TINCIÓN DE ESPORAS Diversas bacterias grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva, de resistencia, denominada endospora (espora). Las endosporas se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas de varios géneros: Bacillus y Clostridium(bacilos), Sporosarcina(cocos), entre otros. Las esporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse tanto intracelularmente, como liberadas de la bacteria (célula vegetativa). Por su localización dentro de la célula pueden estar situadas centralmente, cerca de un extremo (subterminal) o claramente terminales, presentan además variación en su tamaño. Estas estructuras son extraordinariamente resistentes a situaciones ambientales estresantes, como calor, radiación ultravioleta, desinfectantes químicos y desecación. Estas características son de utilidad taxonómica para la identificación de algunas especies de los géneros, capaces de esporular. Las endosporas se pueden examinar con los microscopios óptico y electrónico. Como las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, a menudo se han observado como áreas incoloras en bacterias tratadas con azul de metileno y otros colorantes; se han utilizado tinciones especiales para esporas con el fin de poder verlas mejor. En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen como cuerpos refringentes sin teñir, para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer y Fulton, en la que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del verde de malaquita (colorante primario) y una vez que este ha penetrado, al lavar la preparación y agregar safranina (colorante de contraste), las células vegetativas se tiñen de rojo y la espora permanece teñida de color verde. La técnica de la tinción de esporas se realiza de la siguiente manera: 1.- Preparar un frotis a partir de los cultivos de Bacillus Spp. y fijarlo a la flama. 2.- Cubrir el frotis con verde malaquita (colorante primario), déjelo que reaccione por un minuto y luego caliente la preparación hasta que el colorante empiece a vaporizarse, continúe haciéndolo por un minuto. 3.- Lavar el frotis con agua de la llave durante medio minuto. 4.- Cubrir el frotis con solución de safranina (colorante de contraste) y dejar reaccionar por medio minuto. 5.- Lavar con agua de la llave y secar al aire. 6.- Examinar la preparación con el objetivo de inmersión (100X). 18 INTERPRETACIÓN Espora: Se tiñe de color verde. Célula vegetativa (resto de la célula): Se tiñe de color rosado. Espora libre Espora 19 TINCIÓN DE CAPSULA La estructura más externa de algunas células bacterianas es la cápsula, que es una substancia gelatinosa no bien definida, que forma una capa que envuelve a la célula, la cual es sintetizada por la membrana citoplasmática y excretada al exterior a través de los poros de la pared celular. La cápsula tiene compuestos como los polisacáridos, pero se encuentran también otras muchas clases de substancias características de cada una de ellas de las especies determinadas. La presencia de la cápsula aumenta la capacidad de virulencia en algunas bacterias, y al contrario, la pérdida de la cápsula puede derivarse la pérdida de la misma. Las cápsulas bacterianas no pueden observarse en los frotis teñidos por las técnicas usuales, ya que estas son incapaces de retener el colorante, y no todas las especies de bacterias producen cápsulas fácilmente observables. El mejor método para observarlas es el de utilizar una tinción negativa, en este método puede utilizarse tinta china. En este caso no son los organismos los que se tiñen, sino la superficie de vidrio sobre la que estos se encuentran. Así, se puede observar claramente la forma o contorno del organismo contra el fondo obscuro. La cápsula se observa como un halo incoloro alrededor de los microorganismos gracias al contraste proporcionado por la coloración negra tanto del espacio intercelular como de las células microbianas. La técnica de la tinción de cápsula se realiza de la siguiente manera: 1.- Utilizando el asa de platino tomar una colonia del cultivo de Klebsiella spp. y suspender homogéneamente en una gota de solución salina sobre el portaobjeto. 2.- A esta suspensión diluida, agregue tinta china, y luego mézclela con la suspensión de bacterias. 3.- Con cuidado coloque el cubreobjetos sobre la preparación y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. 20 INTERPRETACIÓN Las partículas de tinta china se verán dotadas de movimiento Browniano muy rápido, las bacterias de formas pálidas y las cápsulas como un halo alrededor del organismo. Cápsula 21 REFERENCIAS Alvarez M.C.I., Mendoza E.S.E.(1994). Manual básico de bacteriología. Facultad de Estudios Superiores Cuatlitlán. UNAM. Carmona O., Gomez M.J., Montes T. Marcano C. Marino F.(1997). Microbiología Médica , de Divo. 5º.Edición. McGraw-Hill Interamericana. BRADSHAW J.L.(1973). Microbiología de Laboratorio. Primera edición Editorial El Manual Moderno. México D.F. . Branson D.(1974). Métodos en Bacteriología Clínica. Manual de Test y Procedimientos. Primera edición. Editorial Médica Panamericana S.A. Buenos Aires Argentina. Burdon K., Williams R.P.(1978). Microbiología. 4a.Edición. Publicaciones Culturales S.A. México D.F. Carter G.R.(1979). Diagnostic Procedure in Veterinary Bacteriology and Mycology. Third Edition. Charles C. Thomas Publisher. Illinois U.S.A. Carter G.R.(1985). Bacteriología y Micología Veterinaria; Aspectos esenciales. Editorial El Manual Moderno S.A. México D.F.. Cowan S.T., Steel K.J.(1974). Manual para la Identificación de Bacterias de Importancia Médica. Segunda Edición. Cia. Editorial Continental, S.A. de C.V., México. Cowan S.T., Steel K.J. (1993). Manual para la Identificación de Bacterias de Importancia Médica. Third Edition. Cambridge. University Press. Cottral G.E. (1986). Manual de Métodos estandarizados en Microbiología Veterinaria. Primera Edición en Español. Edición Científica. La Prensa Médica Mexicana S.A. México D.F. Cruz J.G.,Sainz M. J. E., Segura R.P.(1994). Manual de bacteriología clínica. Fac. de Estudios Superiores Cuatitlán. UNAM. Faddin J.F.(1980). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Médica. Segunda Edición. Editorial Médica Panamericana S.A. Argentina. Galas, M (2001).Manual de Procedimientos para la Determinación de Sensibilidad a los Antimicrobianos. Curso Internacional de Entrenamiento sobre vigilancia de Salmonella y Resistencia Antimicrobiana en Patógenos Transmitidos por Alimentos. Pag. 28. 22 Jang, S.S., Biberstein, E.L. and Hirsh, D.C.(1986). A Diagnostic Manual of Veterinary Clinical Bacteriology and Mycology. Microbiological Diagnostic Laboratory at the Veterinary Medical Teaching Hospital, University of California, Davis. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. (1984). Manual of Veterinary Investigation. Laboratory Techniques. Vol. 1 Third Edition. London: Her Majestyc' s Stationery Office. Pérez M.J.A., Vázquez M.J.R., Rodríguez S.Ma.C., Miranda M.R.E., Romo G.A.L., Nader G.E.(1983). Procedimientos de Laboratorio para Bacteriología y Micología Veterinarias. Departamento de Bacteriología y Micología FMVZ. UNAM. México Quin P.J., Carter M.E., Markey B. Carter G.R.(1994).Clinical Veterinary Microbiology. Wolfe Publishing. Thatcher F.S., Black, D.S.(1972). Análisis Microbiológico de los Alimentos. Editorial Acribia Zaragoza. Madrid España. Zaidi M, Zamora E. (2001). Manual de procedimientos para el Aislamiento e identificación de Salmonella de Humanos y animales. Curso Internacional de Entrenamiento sobre Vigilancia de Salmonella y Resistencia Antimicrobiana En Patógenos Transmitidos por Alimentos.Mérida,Yucatàn,Mèxico del 2 al 12 de julio de 2001. 23