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Manual de técnicas bacteriológicas
generales
Código: M-CCBA-LB-09
Revisión: 01
Fecha de emisión: 19/04/10
Página: 1 de 23
CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS
NIVEL DE SECCIÓN Y/O
REVISIÓN
PÁGINA
01
1
DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y
MEJORA
FECHA DE
MODIFICACIÓN
Actualización de las firmas
Octubre 2012
02
03
04
05
Elaboró
Revisó
Aprobó
QFB Ana María Sofía Rejón Magaña
Responsable del laboratorio
Coordinador de la Unidad de
Diagnóstico
Coordinador de la Unidad de
Diagnóstico
1.-OBJETIVO
Describir las técnicas básicas generales para el análisis y aislamiento de muestras
biológicas de origen animal.
2.- ALCANCE
Aplica a todo el personal del laboratorio de bacteriología.
3.- POLITICAS
Todo el personal debe:
 Seguir los lineamientos que se señalan en este manual.
 Preparar las muestras de acuerdo a las técnicas generales descritas en este manual
2
INDICE
Introducción …………………………………………………………...…………………
5
Cristal violeta …………………………………………………………..………………..
5
Lugol ……………………………………………………………………...………………
5
Alcohol acetona …………………………………………………………...…………….
5
Safranina …………………………………………………………………….…………..
6
Colorante wayson ……………………………………………………………………….
6
Azul de metileno alcalino (Tinción de Hansen) ………………………………….…..
6
Solución acuosa de safranina ………………………………………………………....
6
Azul de Metileno Alcalino Loeffler …………………………………………………….
7
Fucsina Fenicada (Tinción de Ziehl -Neelsen) ………………………………….…...
7
Alcohol Acido (Tinción de Ziehl-Neelsen) ………………………..………………......
7
Verde Malaquita al 5 % (Tinción de esporas) ………………………………………..
8
Safranina al 5 % (Tinción de espora) …………………………………………………
8
Sulfato de cobre al 20 % (Tinción de cápsula) ……………………………………....
8
Fucsina básica (Tinción de cápsula) ……………………………………………….…
8
Fucsina fenicada (Tinción de Campylobacter)al 0.8 % ………………………..……
8
Preparación de soluciones …………………………………………………………….
9
Introducción …………………………………………………………………………...…
9
Indicador de rojo de metilo ………………………………...…………………………..
9
Soluciones, empleadas para la prueba (Reducción de nitratos) ………….............
9
Reactivo de kovac ……………………………………………………………………....
10
3
Reactivos empleados para la prueba de Voges Proskauer ..................................
10
Hidróxido de potasio (KOH) 40 % agente oxidante ………………………………....
10
Peróxido de hidrógeno al 30% ……………………………………………………...…
11
Solución salina fisiológica 0.85 % ………………………………………………….....
11
Estandar sulfato de bario (para ANTIBIOGRAMAS) ………………………………..
11
Preparación de HCl 0.1 N ……………………………………………………………...
11
Solución Verde Brillante al 0.1 % (Salmonella) ……………………………………...
12
Solución buffer fosfatos para alimentos (PBS) …………………………………..….
12
Agua peptonada concentrada para salmonella en aves (APC) ……………………
12
Agua peptonada diluida para salmonella en carne molida …………………………
12
Buffer fosfatos para salmonella en aves …………………………………………..…
12
Preparación de lugol para tetrathionate ………………………………………………
13
Preparación del hipurato de sodio al 1 % …………………………………………….
13
Solución de fosfatos para mantener remojados los electrodos ……………………
13
Solución buffer diluyente para bacteriológico de alimentos ………………………..
13
Soluciones para ajustar pH de muestras ………………………………………….…
14
Referencias ……………………………………………………………………………...
15
4
DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO
El diagnóstico microbiológico es el conjunto de procedimientos y técnicas
complementarias empleadas para establecer la etiología del agente responsable de
una enfermedad infecciosa. El material utilizado para llevarlo a cabo en el laboratorio
de bav¿cteriología es el siguiente.
ASAS DE PLATINO, HISOPOS, PALILLOS
MEDIOS DE CULTIVO
MICROSCOPIO
LAMINILLAS Y CUBREOBJETOS
MECHERO BUNSEN
El diagnóstico bacteriológico en la actualidad cuenta con 3 aspectos básicos
para su realización: Demostración, aislamiento e identificación.
5
DEMOSTRACION
Tiene por objeto la visualización del agente patógeno o su efecto en el material
biológico; tejidos, secreciones, exudados, trasudados, contenido estomacal, intestinal,
etc.
VENTAJAS
1. Se obtienen resultados inmediatos
2. Requerimientos mínimos de equipo, tiempo, técnicas de laboratorio, espacio de
trabajo, material, etc.
3. Puede ser el único método de diagnóstico viable, como en el caso de que los
organismos involucrados no puedan ser cultivados in vitro (M. leprae) o poseer
características de cultivo especiales (Nutrientes: vitaminas, factores de
crecimiento, etc.)
4. Nos puede orientar tentativamente a un diagnóstico y tratamiento rápido.
5. En el caso de enfermedades relacionadas con producción de toxinas potentes, la
demostración de estas es de mayor importancia que el aislamiento del
microorganismo por ejemplo: Clostridium perfringens.
6. Nos puede dar una idea de la cantidad de gérmenes relacionados en el proceso
de infección, forma, tamaño y disposición.
7. Permite la observación de algunas reacciones tisulares y elementos que
intervienen en el proceso de infección (ejemplo: fagocitosis, tipo de leucocitos
asociados en el proceso, fibrina, destrucción o degeneración celular, etc.).
8. Nos muestra sus características de tinción.
LIMITACIONES
1. Se requiere de grandes cantidades de microorganismos para la obtención de
resultados positivos. Se calcula aproximadamente por cada bacteria que se
observa al microscopio con el objetivo de inmersión, existen aproximadamente
106 bacterias por mililitro de fluido o sustancia.
2. En la mayoría de los casos no proporciona respuesta de la acción de toxinas,
anticuerpos, etc. Relacionados con el procesos “in vivo”. Respuestas más
específicas se pueden obtener con el uso de anticuerpos marcados
(Fluoresceína, ferritina, enzimas, etc.).
6
AISLAMIENTO
La etapa de aislamiento consiste en el transporte y cambio de los
microorganismos del medio natural donde se encuentran a un medio artificial (medio de
cultivo y animal de experimentación), para su propagación en cultivo puro.
VENTAJAS
a) Es la forma más convincente del diagnóstico etiológico de las enfermedades
infecciosas.
b) Prerrequisito indispensable para la identificación de los agentes microbianos
salvo algunas excepciones.
c) Requisito para una determinación correcta de la sensibilidad a los diferentes
antibióticos y sulfas.
DESVENTAJAS
a) Requiere de tiempo, equipo, conocimiento y experiencia.
b) Puede ser peligroso para el personal de laboratorio.
c) En algunas ocasiones se puede llegar al diagnóstico con técnicas menos
laboriosas como el examen clínico, clínico patológico, examinación directa, etc.
Esterilización a la flama
Previo a la realización del aislamiento bacteriano, la muestra biológica es
preparada para su inoculación, con el objetivo de recuperar las bacterias, las técnicas
de preparación de la muestra varía según el tipo de muestra, en el caso de los tejidos,
la esterilización a la flama es importante, para una optima obtención de
microorganismos.
A partir de una muestra de tejido siempre se procede de la siguiente manera:
1.
Se calienta a la flama (se mantienen remojados en alcohol una
espátula, una tijera y pinzas) la espátula sin que quede al rojo vivo y se pasa
sobre la superficie del tejido afectado.
2.
Con la ayuda de una tijera y pinzas esterilizadas a la flama se corta
un cuadrante del tejido de aproximadamente 1 cm cuadrado, la parte interna del
7
tejido se pasa sobre el medio de cultivo adecuado y luego se aplica la técnica de
siembra en estrías para el aislamiento puro del cultivo.
NOTA: En el caso de otro tipo de muestras utilizadas para el aislamiento bacteriano
consultar M-CCBA-LB-01 Y M-CCBA-LB-02.
Aislamiento puro de un cultivo bacteriano
El aislamiento bacteriano tiene como principal objetivo la obtención del
microorganismo problema, en un cultivo puro, para su posterior identificación.
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones
adecuadas, ocurre un incremento muy marcado en el número de células en un período
muy corto. En algunas especies se alcanza la población máxima en 24 hrs. en cambio,
en otras se necesita un período más prolongado para alcanzar el máximo desarrollo.
La técnica más común para obtener un cultivo puro es el método llamado
sembrado en estrías. Con este método se obtienen colonias aisladas a partir de una
sola célula dando lugar a una colonia bacteriana.
La siembra se realiza en cajas de petri con Agar y básicamente consiste en el
desprendimiento de las bacterias del asa de platino, las cuales caen espaciadas
individualmente sobre el medio de cultivo. El sembrado en estrías puede realizarse de
varias formas dependiendo del número de microorganismos que se espera,
desarrollen. La manera en cómo se realiza es la siguiente:
a) Dividir la caja de petri imaginariamente en cuatro cuadrantes.
b) Inocular en el primer cuadrante con la muestra realizando estrías
muy juntas. Figura 1.
c) Esterilizar el asa y continuar con estrías muy juntas en el segundo
cuadrante partiendo de las primeras estrías (no se vuelve a tomar de la
muestra).
d) Continuar de la misma forma esterilizando el asa entre cada
cuadrante hasta que la placa entera se ha sembrado. Figura 2.
e) Asegurarse de que haya contacto entre las estrías de cada
cuadrante.
f)
Incubar a 37°C. por 24 hrs.
8
Después de incubarlas, estas células individuales se dividen repetidamente
hasta formar una masa visible sobre el Agar, las cuales se originaron a partir de una
sola célula dando lugar a una colonia bacteriana.
Figura 1.
Figura 2.
9
Morfologia de las colonias bacterianas
La utilidad diagnóstica en el estudio de la morfología de las colonias es de gran
importancia porque con ello puede iniciarse una identificación preliminar de los
microorganismos aislados. Las características morfológicas son muy variadas mismas
que son constantes para cada especie de bacteria en idénticas condiciones de cultivo.
Estas características pueden modificarse cuando factores como: humedad relativa,
medio de cultivo y temperatura son diferentes. La descripción de las colonias deben
realizarse cuando estas se encuentran separadas unas de otras en el medio de cultivo,
tomando en cuenta: Tamaño, color, etc.
Color: Hay especies bacterianas capaces de sintetizar pigmentos muy diversos
los cuales son detectados fácilmente debido al color característico que imparten a las
colonias o por la difusión de dichos pigmentos en el medio de cultivo. Figura 3.
Borde: Enteras, onduladas, lobuladas erizadas, filamentosas.
Opacidad: Translúcidas, opacas, brillantes.
Elevación: Umbilicadas, difusas, planas, convexas.
Estructura interna: Mucoides, granulares, filamentosas.
Superficie: Lisas, rugosas.
Figura 3. Aspectos más comunes de las diversas colonias aisladas sobre medio sólido.
Otro dato útil en la identificación preliminar de colonias es la producción de
hemolisinas. En el medio de cultivo de Agar sangre la producción de hemolisinas
conduce a la formación de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de la colonia. En la
hemólisis beta se observa un halo transparente y en la hemólisis alfa un halo verdoso.
En el caldo sangre la producción de hemolisinas es detectada por la coloración
rojiza que toma el caldo al liberarse la hemoglobina de los eritrocitos.
10
IDENTIFICACION
La identificación del agente patógeno tiene como objeto confirmar su identidad
por medio de diferentes sustratos y esto depende de:
a) Conocimiento de la especie animal, signos clínicos de la enfermedad y/o tipo de
lesiones patológicas.
b) Examen y tinción de frotis hechos directamente de la muestra.
c) El crecimiento y características coloniales de la bacteria patógena sobre los
medios de cultivo.
d) Condiciones atmosféricas necesitadas para desarrollarse.
e) Bioquímicas del cultivo puro del patógeno para confirmar su identidad.
Identificación primaria de las bacterias:
De un cultivo puro realizar las siguientes pruebas:
1.- Tinción de Gram del cultivo para establecer:
a) Si son cocos o bacilos
b) SI son Gram positivos o Gram negativos.
2.- Crecimiento o ausencia de crecimiento sobre Agar Mc Conkey.
3.- Prueba de la catalasa.
4.- Prueba de la oxidasa.
5.- Motilidad
6.- Oxidación – Fermentación en medio de Hugh y Leifson.
Pruebas bioquimicas secundarias para la identificación de las bacterias
hasta especie:
a)
b)
c)
d)
Estas pruebas pueden ser agrupadas en las siguientes categorías:
Medios comerciales preparados en tubos.
Medios convencionales para pruebas bioquímicas en tubos.
Micrométodos disponibles comercialmente en pequeñas cámaras.
Sistemas microbiológicos automatizados.
11
Algunas de ellas son:

Fermentación de carbohidratos

Utilización de citrato, Hidrólisis de la Urea, descarboxilación de
aminoácidos.

Licuefacción de la gelatina.

Prueba de Voges – Proskauer.

Rojo de metilo.

Producción de ácido sulfhídrico, indol y motilidad (SIM)

TSI.

Leche tornasolada.

LIA
12
TÉCNICAS DE TINCIÓN BÁSICAS PARA EL
DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO
Elaboración de frotis fijo
Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un
microscopio óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar la visibilidad,
acentuar las características morfológicas y conservarlos para su estudio en el futuro.
Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo más
posible a las células vivas. LA FIJACION es el proceso por el cual se conservan y fijan
en su posición las estructuras internas y externas de las células de los
microorganismos. Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular y endurece
las estructuras celulares, de manera que no cambien durante la tinción ni la
observación.
Existen dos clases de fijación fundamentales diferentes:
1. Fijar con calor frotis bacterianos calentando suavemente con una llama una
película de bacterias secadas previamente al aire. Este método conserva
adecuadamente la morfología general, pero no las estructuras internas de la
célula.
2. La fijación química para proteger la subestructura fina y la morfología de
microorganismos delicados de mayor tamaño, en esta clase de fijación se
utilizan fijadores químicos que penetran a las células y reaccionan con
componentes celulares, normalmente proteínas y lípidos, para inactivarlos y
convertirlos en insolubles e inmóviles
La realización de un frotis fijo consiste en depositar sobre una laminilla una capa
delgada de bacterias mismas que quedarán adheridas a la laminilla por medio de calor.
Utilizar el marcador, y dibujar dos círculos sobre la superficie de la laminilla. En
cada uno de ellos hacer un frotis diferente, por lo que estos deberán quedar
adecuadamente identificados.
Figura 4.
13
En el primer círculo colocar una pequeña gota de agua destilada. A continuación
tomar una pequeña asada del cultivo de S. aureus en medio sólido y con movimientos
giratorios, hacer una suspensión muy ligera extendiéndola en toda el área del círculo.
Figura 5.
Figura 6.
En el segundo círculo colocar la asada del cultivo de E. coli en medio sólido
extenderla de la misma manera como se hizo en el primer círculo. Dejar secar los frotis
a temperatura ambiente.
Figura 7.
Fijar los frotis al calor pasándolos rápidamente por la flama del mechero. Es
importante que la laminilla no se caliente demasiado ya que se pueden modificar las
características morfológicas y tintoriales.
Figura 8.
14
TINCIÓN DE GRAM
Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente con tinción simple esto
es, utilizando sólo un colorante, o con tinción diferencial utilizando dos colorantes. Los
métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes según sus
propiedades de tinción.
La tinción de Gram desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884 es
el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método
diferencial porque divide a las bacterias en dos clases, Gramnegativas y grampositivas
de acuerdo a los componentes predominantes de su pared celular, y permite así mismo
la observación microscópica de la morfología, el tamaño y la agrupación.
El proceso de la tinción se debe en algunos casos a reacciones de intercambio
iónico entre compuestos del colorante y otros elementos activos de la superficie o el
interior de la célula. La causa de que unas bacterias se coloreen de púrpura y otras no,
parece deberse a diferencias en estructura química superficial.
Las paredes celulares tanto de bacterias grampositivas y de Gramnegativas
poseen una capa basal de peptidoglucano responsable de la rigidez característica de la
pared, el peptidoglucano no se tiñe por sí mismo; más bien, parece que actúa como
barrera de permeabilidad para evitar la pérdida del cristal violeta. Las bacterias
grampositivas están constituidas propiamente por ácidos teicoicos que son importantes
por su especialidad antigénica. En la tinción de Gram se tiñen de color violeta.
En las bacterias Gramnegativas existe una membrana externa cuya constitución
química es de fosfolípidos y proteínas pero que poseen un alto contenido de
lipopolisacáridos, se tiñen de color rosado. La técnica de la tinción de Gram se realiza
de la siguiente manera:
1.- Preparar frotis fijos del cultivo y del sarro dental(utilizando un palillo raspa un
poco de tu sarro dental)
2.- Cubrir el frotis con la solución de cristal violeta (colorante primario), una o dos
gotas son suficientes para cubrir el área del frotis. Dejar actuar por un minuto.
Figura 6
Figura 9.
15
3.- Lavar con agua corriente de la llave. Sacudir la laminilla para eliminar las
gotas gruesas de agua. Figura 7
Figura 10.
4.- Aplicar la solución de lugol (mordente) y dejar actuar durante un minuto, lavar
con agua corriente de la llave.
Figura 11.
Figura 12
5.- Sacudir la laminilla y aplicar el alcohol acetona (agente decolorante) durante
3 a 5 segundos y lavar nuevamente con agua corriente.
Figura 13.
Figura 14.
6.- Sacudir el frotis, agregar la fucsina básica (colorante de contraste) y dejar
actuar durante medio minuto. Figura 12
16
Figura 15.
7.- Lavar con agua corriente (Figura 13), secar el frotis a temperatura ambiente
(Figura 14) y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100X.)
Figura 17.
Figura 16.
INTERPRETACION
Grampositivas: Se tiñen de color violeta. Figura 17.
Gramnegativas: Se tiñen de color rosado. Figura 18.
Figura 17.
Figura 18.
17
TINCIÓN DE ESPORAS
Diversas bacterias grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva,
de resistencia, denominada endospora (espora).
Las endosporas se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas de
varios géneros: Bacillus y Clostridium(bacilos), Sporosarcina(cocos), entre otros.
Las esporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse tanto
intracelularmente, como liberadas de la bacteria (célula vegetativa). Por su localización
dentro de la célula pueden estar situadas centralmente, cerca de un extremo
(subterminal) o claramente terminales, presentan además variación en su tamaño.
Estas estructuras son extraordinariamente resistentes a situaciones ambientales
estresantes, como calor, radiación ultravioleta, desinfectantes químicos y desecación.
Estas características son de utilidad taxonómica para la identificación de algunas
especies de los géneros, capaces de esporular.
Las endosporas se pueden examinar con los microscopios óptico y electrónico.
Como las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, a menudo se han
observado como áreas incoloras en bacterias tratadas con azul de metileno y otros
colorantes; se han utilizado tinciones especiales para esporas con el fin de poder verlas
mejor.
En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen como
cuerpos refringentes sin teñir, para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer y Fulton, en
la que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del verde de malaquita
(colorante primario) y una vez que este ha penetrado, al lavar la preparación y agregar
safranina (colorante de contraste), las células vegetativas se tiñen de rojo y la espora
permanece teñida de color verde. La técnica de la tinción de esporas se realiza de la
siguiente manera:
1.- Preparar un frotis a partir de los cultivos de Bacillus Spp. y fijarlo a la flama.
2.- Cubrir el frotis con verde malaquita (colorante primario), déjelo que reaccione
por un minuto y luego caliente la preparación hasta que el colorante empiece a
vaporizarse, continúe haciéndolo por un minuto.
3.- Lavar el frotis con agua de la llave durante medio minuto.
4.- Cubrir el frotis con solución de safranina (colorante de contraste) y dejar
reaccionar por medio minuto.
5.- Lavar con agua de la llave y secar al aire.
6.- Examinar la preparación con el objetivo de inmersión (100X).
18
INTERPRETACIÓN
Espora: Se tiñe de color verde.
Célula vegetativa (resto de la célula): Se tiñe de color rosado.
Espora
libre
Espora
19
TINCIÓN DE CAPSULA
La estructura más externa de algunas células bacterianas es la cápsula, que es
una substancia gelatinosa no bien definida, que forma una capa que envuelve a la
célula, la cual es sintetizada por la membrana citoplasmática y excretada al exterior a
través de los poros de la pared celular.
La cápsula tiene compuestos como los polisacáridos, pero se encuentran
también otras muchas clases de substancias características de cada una de ellas de
las especies determinadas.
La presencia de la cápsula aumenta la capacidad de virulencia en algunas
bacterias, y al contrario, la pérdida de la cápsula puede derivarse la pérdida de la
misma.
Las cápsulas bacterianas no pueden observarse en los frotis teñidos por las
técnicas usuales, ya que estas son incapaces de retener el colorante, y no todas las
especies de bacterias producen cápsulas fácilmente observables.
El mejor método para observarlas es el de utilizar una tinción negativa, en este
método puede utilizarse tinta china. En este caso no son los organismos los que se
tiñen, sino la superficie de vidrio sobre la que estos se encuentran. Así, se puede
observar claramente la forma o contorno del organismo contra el fondo obscuro.
La cápsula se observa como un halo incoloro alrededor de los microorganismos
gracias al contraste proporcionado por la coloración negra tanto del espacio intercelular
como de las células microbianas. La técnica de la tinción de cápsula se realiza de la
siguiente manera:
1.- Utilizando el asa de platino tomar una colonia del cultivo de Klebsiella spp. y
suspender homogéneamente en una gota de solución salina sobre el portaobjeto.
2.- A esta suspensión diluida, agregue tinta china, y luego mézclela con la
suspensión de bacterias.
3.- Con cuidado coloque el cubreobjetos sobre la preparación y observar al
microscopio con el objetivo de inmersión.
20
INTERPRETACIÓN
Las partículas de tinta china se verán dotadas de movimiento Browniano muy
rápido, las bacterias de formas pálidas y las cápsulas como un halo alrededor del
organismo.
Cápsula
21
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23