Download Análisis genético y molecular de PEP1, un gen implicado en la

Departamento de Biología Aplicada
División de Genética
Análisis genético y molecular de PEP1,
un gen implicado en la morfogénesis del fruto de
Arabidopsis thaliana
Juan José Ripoll Samper.
Sant Joan d’Alacant, 2004
Análisis genético y molecular de PEP1,
un gen implicado en la morfogénesis del fruto
de Arabidopsis thaliana
Trabajo realizado por el Licenciado Juan José Ripoll Samper, en la División de Genética
del Departamento de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández de Elche,
para optar al Grado de Doctor.
Sant Joan d’Alacant, 31 de Mayo de 2004.
Departamento de Biología Aplicada
Universidad Miguel Hernández – Campus de Sant Joan d’Alacant
ANTONIO VERA TORNEL, Profesor Titular de Genética de la Universidad Miguel
Hernández de Elche,
CERTIFICA
que el Licenciado D. Juan José Ripoll Samper ha realizado bajo su dirección y supervisión la
Tesis Doctoral que con el título Análisis genético y molecular de PEP1, un gen implicado en
la morfogénesis del fruto de Arabidopsis thaliana presenta para optar al Grado de Doctor. El
trabajo reflejado en la presente memoria se ha desarrollado íntegramente en la División de
Genética de la Universidad Miguel Hernández de Elche.
Y para que así conste y surta a los efectos oportunos, firmo el presente certificado en Sant
Joan d’Alacant a 3 de Junio de 2004
Fdo.: Dr. Antonio Vera Tornel
Universidad Miguel Hernández, Campus de Sant Joan, Ctra. Alicante-Valencia Km. 87, 03550 San Juan, Alicante. Spain
Tel: 34 96 591 9542 – Fax: 34 96 591 9568 – e-mail: [email protected] – URL: http://biolapli.umh.es
Departamento de Biología Aplicada
Universidad Miguel Hernández – Campus de Elche
Prof. Dr. D. José Luis Micol Molina, Catedrático de Universidad y director del Departamento
de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández de Elche,
INFORMA
Que la Tesis Doctoral titulada Análisis genético y molecular de PEP1, un gen implicado en la
morfogénesis del fruto de Arabidopsis thaliana ha sido realizada por el licenciado D. Juan
José Ripoll Samper, bajo la inmediata dirección y supervisión del Prof. D. Antonio Vera
Tornel, y que el Departamento de Biología Aplicada ha dado su conformidad para que sea
presentada ante la comisión de doctorado.
Elche, a 3 de Junio de 2004
Fdo.: José Luis Micol Molina
Universidad Miguel Hernández, Campus de Elche, Edificio Vinalopó, Avenida del Ferrocarril s/n, 03202 Elche, Alicante. Spain
Tel: 34 96 665 8504 – Fax: 34 96 665 8511 – e-mail: [email protected] – URL: http://biolapli.umh.es
A mis padres
A mis hermanos
A Elena
Esto no es el final. Ni tampoco es el principio del final.
Pero quizás sea, el final del principio.
W. Churcill
Todas las cosas fingidas caen como flores marchitas,
porque ninguna simulación puede durar largo tiempo.
Cicerón
La ignorancia afirma o niega rotundamente;
la ciencia duda.
Voltaire
La ciencia es la medida de todas las cosas,
de lo que es, que es, y de lo que no es, que no es.
W. Sellars
AGRADECIMIENTOS
No siempre se presenta una oportunidad como ésta para dar las gracias a todas
las personas que, de una forma u otra, te ayudan a conseguir un determinado objetivo.
En primer lugar, quiero agradecerle a Antonio Vera Tornel el permitir mi iniciación,
con esta Tesis, en este proceloso mundo de la Ciencia. Le agradezco también su
inestimable ayuda, su preocupación, sus consejos, su apoyo, su confianza, que estuviera
ahí cuando lo he necesitado y que me creyera capaz de culminar este trabajo. Y cómo no,
por aguantar mi carácter. Gracias Antonio (Amunt València !!!).
A Antonio Martínez Laborda, por el seguimiento tan de cerca de mi Tesis, por su
comprensión y su grandísimo e inestimable apoyo, particularmente en los momentos
difíciles, por sus sabios consejos, por su confianza tanto dentro como fuera del
laboratorio, por su labor como Tutor durante los cursos de doctorado y por “darme caña”
en las discusiones científicas. Tampoco me olvido de esas trufas con las que a veces nos
sorprende.
A los “Antonios”, globalmente, por su amistad y por preocuparse tanto y tanto por
la gente del laboratorio. Por tirar de todos hacia delante, aunque en algunos momentos ha
sido difícil. Por esos ratos tan divertidos que hacen olvidar los malos. Son dos de las
personas que más mella han dejado en mí.
A José Luis Micol, por el gran apoyo y confianza que me ha dado durante todo
este tiempo y el interés mostrado sobre nuestro trabajo, por su encomiable labor como
director del Departamento, lo que ha facilitado muchas situaciones durante esta travesía.
Y desde luego, por la utilización de su equipamiento siempre que ha sido necesario.
Quisiera destacar la gran labor previa realizada en su grupo por parte de María Rosa
Ponce; Genoveva Berná, José Serrano, Víctor Quesada, Pedro Robles, Héctor Candela y
José Manuel Pérez, plasmada en sus respectivas Tesis, y cuya lectura ha supuesto una
inestimable ayuda.
A Cristina Ferrándiz, por su gran ayuda y valiosos consejos, científicos y
personales todo el tiempo que residió en nuestro laboratorio. Deseo agradecerle su
confianza, amistad y ánimo en todo momento.
A mis compañeros de laboratorio Isabel y Hugo, a los que les tengo mucho aprecio
y de los que siempre se aprende alguna cosa. Por ofrecerme su amistad, confianza y sus
ánimos durante esta última etapa de escritura. A veces, pienso que paso más tiempo a lo
largo del día con ellos que conmigo mismo.
A Ade y Asun, por su continua predisposición para preparar cualquier cosa que
pudiera necesitar. Por esos momentos tan divertidos que hemos pasado juntos. Gracias
por estar ahí tanto dentro como fuera del laboratorio.
A María Rosa Ponce, a Héctor Candela, Víctor Quesada y Pedro Robles (los tres
veteranos), a Pedro Piqueras, José Manuel Pérez, Santi, José María y Sara por los
momentos agradables compartidos cuando residían en este campus y por su ayuda
siempre que ha sido necesaria.
Tampoco puedo olvidar a Susana Gerber y José Manuel Serrano, que inicialmente
me ayudaron con los reactivos, medios de cultivo, placas, etc. Además, quiero
agradecerles el interés que han mostrado por saber en todo momento cómo iban las
cosas.
Dar las gracias a Amparo Albiñana, por librar mil y una guerras con los “papeleos”
y encontrar siempre una solución a cualquier problema burocrático surgido en todo este
tiempo.
A Luis Vicente López Llorca y Jesús Salinas por su interés y apoyo moral, por
mediar en la utilización del microscopio electrónico de barrido de la Universidad de
Alicante.
A Verónica y Andrés, por encontrar siempre un hueco para poder ver las muestras
en el microscopio electrónico de barrido.
A Joaquín Rueda por permitirnos la utilización de su microtomo.
Al laboratorio de Manolo Criado, por ser “un pozo sin fondo” de infinitas enzimas
de restricción. Y a Luismi Valor, por ser un buen compañero y vecino, por su interés en la
marcha de mi Tesis. Por esas cenas de becarios de risas y cachondeo.
A Flavia (por las sesiones de apoyo y “les xarraetes” del pasillo), a Claudia Vieira
(por conseguirme cualquier artículo que le pidiera y demás información, por animarme), a
Susana Frasés (por allanarme un poco el camino con algunos papeleos), y a la gente de
la asociación Joves Investigadors y Precarios.
A mis compañeros y amigos Ana y Juan Carlos, Rosana y Luis, Belén, Nuria, Pilar,
Edu, Sonia, Nino, Eric, Paco Olaya y M. Carmen, Santi, J. Antonio y Penélope, Marcos y
Bea, J. Ángel, Miguel y Pepa, Pepe y Jorge por entender mi “enclaustramiento” durante
los últimos tiempos.
A la familia Barceló y Payá-Signes, por la ayuda y apoyo prestados en este tiempo.
A mis padres, por su cariño y cuidado, por respetar y entender mis decisiones en
todo momento, por el gran esfuerzo realizado en procurarme una buena educación. En
definitiva, por estar ahí a mi lado. A mis dos hermanos Ros Mary y Rubén, por aguantar
mis manías y nervios durante todo este tiempo. A Julia, por sus ánimos.
A la familia ilicitana, Amparo y los dos Vicentes, por el cuidado y apoyo moral que
en todo momento me han prestado.
A Elena, por ser como es y acompañarme durante este largo viaje. Por su cariño y
apoyo en los momentos duros, por sus ánimos y comprensión en esta última etapa. Por
aguantar como una campeona.
Por último, agradecer al Ministerio de Ciencia y Tecnología la concesión de una
beca FPI con la que he podido sobrevivir (aunque existan personas que piensen que es
un chollo) durante mi periodo de “becario-precario” entre los años 1999 y 2003.
ÍNDICE DE MATERIAS
Índices I
ÍNDICE DE MATERIAS
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
I.- INTRODUCCIÓN
1
I.1.- CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE EL DESARROLLO
2
I.1.1.- Sinopsis, orígenes y evolución de la Biología del desarrollo
2
I.2.- CARACTERÍSTICAS DEL DESARROLLO VEGETAL
4
I.2.1.- Características diferenciales del desarrollo en plantas
4
I.3.- UTILIZACIÓN DE SISTEMAS MODELO EN BIOLOGÍA
6
I.4.- Arabidopsis thaliana COMO SISTEMA MODELO EN EL
ESTUDIO DEL DESARROLLO VEGETAL
I.4.1.- Características de Arabidopsis thaliana como sistema modelo
6
9
I.4.2.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana
10
I.4.3.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana
11
I.4.4.- El genoma de Arabidopsis thaliana
13
I.4.5.- Generación, obtención y caracterización de mutantes
en Arabidopsis thaliana
I.4.5.1.- Mutágenos utilizados en Arabidopsis thaliana
17
17
I.4.5.1.1.- Mutágenos físicos y químicos
17
I.4.5.1.2.- El T-DNA como mutágeno insercional
17
I.5.- DESARROLLO DE Arabidopsis thaliana
20
I.5.1.- Embriogénesis en Arabidopsis thaliana
20
I.5.2.- Desarrollo a partir del meristemo apical del tallo
20
I.5.2.1.- Mantenimiento de la población de células totipotentes
en el meristemo
24
Índices II
I.5.2.2.- Diferenciación de las células meristemáticas en los
primordios de los órganos laterales
27
I.5.3.- Transición de la etapa vegetativa a la reproductiva. Inducción floral
29
I.5.4.- Desarrollo floral
30
I.5.4.1.- El meristemo floral
30
I.5.4.2.- Genes de identidad de los órganos florales. Modelo ABC
32
I.5.4.2.1.- Redefinición del modelo. Genes de la clase E
I.5.5.- Desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana
34
35
I.5.5.1.- Estructura del fruto en Arabidopsis thaliana
36
I.5.5.2.- Estadios de desarrollo del gineceo y del fruto de Arabidopsis thaliana
39
I.5.5.3.- Genes implicados en el desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana
41
I.5.5.3.1.- AG, un gen clave en la especificación de los carpelos
41
I.5.5.3.1.1.- Nuevos miembros de la ruta de AG. Genes HUA y HEN
42
I.5.5.3.2.- FRUITFULL, un gen que determina la identidad de la valva
43
I.5.5.3.3.- Los genes SHATTERPROOF1 y SHATTERPROOF2 están implicados
en la dehiscencia del fruto
45
I.5.5.3.4.- Papel de INDEHISCENT (IND) y ALCATRAZ (ALC)
en el desarrollo del fruto
I.5.5.3.5.- REPLUMLESS (RPL) especifica la región del replum
46
47
I.5.5.3.6.- SPATULA (SPT) actúa independientemente de AG
en la diferenciación de tejidos del fruto
47
I.5.5.3.7.- La función de CRABS CLAW (CRC) en la
diferenciación de los carpelos
48
I.5.5.3.8.- Los genes TOUSLED (TSL), STYLISH1 (STY1) y STYLISH2 (STY2)
están implicados en la formación de tejidos apicales del gineceo
49
I.5.5.3.9.- ETTIN (ETT) está relacionado con la regionalización del gineceo
50
I.5.5.3.10.- Los genes CLV y el número de carpelos en el gineceo
51
I.5.5.3.11.- La familia de genes ERECTA (ER) en el desarrollo del gineceo
51
Índices III
II.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
53
III.- MATERIALES Y MÉTODOS
57
III.1.- ORGANISMOS UTILIZADOS
58
III.1.1.- Estirpes de Arabidopsis thaliana
58
III.1.1.1.- Estirpes silvestres
58
III.1.1.2.- Estirpes mutantes
58
III.1.1.2.1.- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes,
mutaciones, fenotipos e individuos aislados durante el escrutinio
de una colección de mutantes
59
III.1.1.2.2.- Procedencia de los mutantes
60
III.1.2.- Estirpes de Escherichia coli
61
III.1.3.- Estirpes de Agrobacterium tumefaciens
61
III.2.- VECTORES. PLÁSMIDOS Y CONSTRUCCIONES
61
III.3.- OLIGONUCLEÓTIDOS EMPLEADOS COMO CEBADORES
65
III.4.- MEDIOS DE CULTIVO, DISOLUCIONES Y TAMPONES
67
III.4.1.- Medios de cultivo
III.4.1.1- Medios de cultivo para Arabidopsis thaliana
III.4.1.1.1.- Medios de cultivo líquido (Medio mínimo ATM)
III.4.1.1.2.- Medios de cultivo sólido (Medio GM)
III.4.1.2.- Medios de cultivo para microorganismos
67
67
67
67
68
III.4.1.2.1.- Medios de cultivo líquido
68
III.4.1.2.2.- Medios de cultivo sólido
68
III.4.1.2.3.- Medios de cultivo con antibióticos
68
III.4.2.- Disoluciones y tampones
69
III.4.2.1.- Disoluciones de uso común
69
III.4.2.2.- Disoluciones para el aislamiento de DNA genómico
69
III.4.2.3.- Disoluciones empleadas en el aislamiento de DNA plasmídico
69
III.4.2.4.- Disoluciones para el aislamiento de RNA
69
III.4.2.4.1.- Disoluciones para el aislamiento de mRNA (poliA+)
69
Índices IV
III.4.2.4.2.- Disoluciones para el aislamiento de RNA total
70
III.4.2.5.- Disoluciones utilizadas en electroforesis
70
III.4.2.6.- Disoluciones para el análisis Southern
70
III.4.2.7.- Disoluciones empleadas en la identificación de clones bacterianos
mediante hibridación
III.4.2.8.- Disoluciones utilizadas en la hibridación in situ de tejidos
70
71
III.4.2.9.- Disolución para infiltración de plantas
con Agrobacterium tumefaciens
71
III.4.2.10.- Solución de esterilización de semillas de Arabidopsis thaliana
71
III.4.2.11.- Sustrato para cultivo de Arabidopsis thaliana en maceta
72
III.5.- CONDICIONES Y MÉTODOS DE CULTIVO
III.5.1.- Condiciones y métodos de cultivo para Arabidopsis thaliana
72
72
III.5.1.1.- Cultivos en placas de Petri
72
III.5.1.2.- Cultivos en maceta
72
III.5.1.3.- Realización de cruzamientos
73
III.5.2.- Condiciones y métodos de cultivo para Escherichia coli y
Agrobacterium tumefaciens
73
III.6.- ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS
MORFOLÓGICAS E HISTOLÓGICAS
74
III.6.1.- Fotografía a bajo aumento
74
III.6.2.- Microscopía óptica
74
III.6.2.1.- Inclusión en resina JB4
74
III.6.2.2.- Inclusión en parafina
75
III.6.3.- Microscopía electrónica de barrido (SEM)
76
III.6.4.- Microscopía electrónica de barrido de baja temperatura (LTSEM)
76
III.7.- AISLAMIENTO Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
77
III.7.1.- Preparaciones de DNA genómico de Arabidopsis thaliana
77
III.7.2.- Obtención de RNA de Arabidopsis thaliana
77
III.7.2.1.- Obtención de mRNA (poliA+)
77
III.7.2.2.- Obtención de RNA total
78
III.7.3.- Obtención de DNA plasmídico
78
Índices V
III.7.4.- Tratamiento de DNA con enzimas de restricción
78
III.7.5.- Reacciones de ligación de DNA
79
III.7.6.- Transformación bacteriana
79
III.7.6.1.- Transformación por choque térmico
79
III.7.6.2.- Electroporación
79
III.7.7.- Técnicas electroforéticas
III.7.7.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
79
79
III.7.7.1.1.- Condiciones no desnaturalizantes
79
III.7.7.1.2.- Condiciones desnaturalizantes
80
III.7.7.2.- Electroforesis en geles de agarosa
III.7.7.2.1.- Condiciones no desnaturalizantes
III.7.8.- Recuperación de DNA a partir de geles de agarosa
80
80
80
III.7.9.- Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
80
III.7.9.1.- PCR convencional
80
III.7.9.2.- PCR de asimetría térmica entrelazada o TAIL-PCR
81
III.7.9.3.- PCR inversa (IPCR)
83
III.7.9.4.- Retrotranscripción y PCR (RT-PCR)
83
III.7.10.- Secuenciación de DNA
84
III.7.11.- Análisis y tratamiento informático de las secuencias de
ácidos nucleicos y proteínas
III.8.- TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN MOLECULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS
84
85
III.8.1.- Transferencia de DNA a membranas para análisis
por hibridación Southern
85
III.8.1.1.- Obtención de la sonda marcada
85
III.8.1.2.- Transferencia e inmovilización del DNA
85
III.8.1.3.- Tratamiento de prehibridación, hibridación con la sonda y
lavado de la membrana
III.8.1.4.- Detección quimioluminiscente
III.8.2.- Identificación de clones bacterianos mediante hibridación en colonia
III.8.2.1.-Obtención de sonda
85
85
86
86
Índices VI
III.8.2.2.- Transferencia del DNA a una membrana de nailon
86
III.8.2.3.- Tratamiento de la membrana e hibridación
87
III.8.2.4.- Lavado de la membrana
87
III.8.2.5.- Detección colorimétrica de la señal
87
III.8.3.- RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR)
87
III.8.4.- Análisis de la expresión mediante hibridación in situ en tejidos vegetales
89
III.8.4.1.- Obtención y marcaje con digoxigenina de la sonda de RNA
88
III.8.4.2.- Cuantificación de la sonda
88
III.8.4.3.- Obtención y procesamiento histológico de las muestras
89
III.8.4.4.- Prehibridación e hibridación de la sonda
89
III.8.4.5.- Lavados e inmunodetección colorimétrica de la señal
90
III.9.- TRANSFORMACIÓN DE Arabidopsis thaliana
90
III.9.1.- Transformación con clones de sobreexpresión
91
III.9.2.- Transformación con clones genómicos
91
III.9.3.- Infiltración con Agrobacterium tumefaciens
91
III.9.4.- Selección de transformantes
92
III.10.- CARTOGRAFÍA GÉNICA MEDIANTE ANÁLISIS DE LIGAMIENTO A
MARCADORES SSLP
III.11.- GENOTIPADO MOLECULAR DE ESTIRPES DE Arabidopsis thaliana
92
92
III.11.1.- Genotipado molecular de los alelos pep1
92
III.11.2.- Genotipado molecular de otras estirpes mutantes utilizadas
93
III.12.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE χ2
94
IV.- RESULTADOS
95
IV.1.- ESCRUTINIO Y AISLAMIENTO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana
AFECTADOS EN LA MORFOLOGÍA DEL FRUTO
96
IV.1.1.- Escrutinio de una colección de inserciones de T-DNA
96
IV.1.2.- Aislamiento y estudio preliminar de mutantes
97
IV.2.- CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA LÍNEA SJF20-15.
LA MUTACIÓN pepper1-1
100
Índices VII
IV.2.1. Análisis macroscópico
100
IV.2.2.- Estudio morfológico de los frutos pep1-1 mediante microscopía
electrónica de barrido (SEM)
105
IV.2.2.1.- Estudio comparativo de la ontogenia de los pistilos silvestres
y de pep1-1
108
IV.2.3.- Análisis histológico de las silicuas de pep1-1
110
IV.2.4.- Introgresión de pep1-1 en otros fondos silvestres
112
IV.3.- CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL MUTANTE pep1-1
115
IV.3.1.- Determinación del número de copias de T-DNA en el mutante
115
IV.3.2.- Clonación de las regiones genómicas adyacentes a la inserción
116
IV.3.3.- Ligamiento de pep1-1 a marcadores moleculares de tipo SSLP
119
IV.3.4.- Estudio de la fertilidad en heterocigotos pep1-1
119
IV.3.5.- pep1-1 es una mutación compleja que puede afectar a diversas
funciones génicas
120
IV.4.- ESTUDIO DE GENES POTENCIALMENTE AFECTADOS
POR LA TRANSLOCACIÓN
121
IV.4.1.- Estudio fenotípico de líneas de inserción correspondientes a genes
potencialmente afectados por la translocación de pep1-1.
Nuevos alelos de pep1
122
IV.4.2.- Análisis de complementación entre pep1-1 y líneas de inserción
procedentes de las colecciones de dominio público
IV.5.- ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN At4g26000 (PEP1)
126
127
IV.5.1.- Estructura del gen PEP1
127
IV.5.2.- PEP1 es una proteína con dominios KH
130
IV.6.- LOCALIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN LOS ALELOS DE pep1
IV.6.1.- Expresión de PEP1 en los alelos mutantes
134
134
IV.7.- OBTENCIÓN DE CONSTRUCCIONES Y GENERACIÓN DE
PLANTAS TRANGÉNICAS
IV.7.1.- Generación de las contrucciones
135
136
IV.7.1.1.- Construcción genómica de PEP1
136
IV.7.1.2.- Construcción de sobreexpresión 35S::PEP1
136
Índices VIII
IV.7.2.- Transferencia de transgenes y selección de transformantes
138
IV.7.3.- Fenotipo de las plantas transgénicas
138
IV.7.3.1.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon genómico
138
IV.7.3.2.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon de sobreexpresión
139
IV.8.- ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN PEP1
140
IV.8.1.- Detección del transcrito de PEP1 en distintos órganos de la planta
mediante RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR)
140
IV.8.2.- Localización del mRNA de PEP1 mediante hibridación in situ
141
IV.9.- ANÁLISIS DE LAS INTERACCIONES GENÉTICAS DE PEP1
141
IV.9.1.- Dobles y triples mutantes con hua1, hua2 y hua enhancer2 (hen2)
142
IV.9.2.- Doble mutante con fruitfull (ful)
142
IV.9.3.- Doble mutante con flowering locus k (flk)
143
IV.9.4.- Dobles mutantes con los genes de la ruta de los CLAVATA
146
IV.9.4.1.- Interacciones con clavata3 (clv3)
146
IV.9.4.2.- Interacciones con clavata2 (clv2)
148
IV.9.4.3.- Interacciones con clavata1 (clv1)
150
IV.9.5.- Doble mutante con wuschel (wus)
V.- DISCUSIÓN
152
154
V.1.- ESCRUTINIO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana AFECTADOS
EN EL DESARROLLO DEL FRUTO EN UNA COLECCIÓN
ESPAÑOLA DE INSERCIONES DE T-DNA
155
V.2.- EL MUTANTE pep1-1 ES PORTADOR DE UNA TRANSLOCACIÓN
RECÍPROCA Y PRESENTA ALTERACIONES EN LA MORFOLOGÍA
DEL FRUTO
156
V.3.- NUEVOS ALELOS DE pep1
157
V.4.- RESCATE FENOTÍPICO DE pep1
159
V.5.- PAPEL DE LAS PROTEÍNAS CON DOMINIOS KH
EN EL DESARROLLO
V.6.- INTERACCIONES DE pep1 CON OTROS MUTANTES
161
163
Índices IX
V.6.1.- Interacciones con ful, hua1, hua2 y hen2
163
V.6.2.- Interacciones con flk
164
V.6.3.- Interacciones con los genes clv
165
V.7.- PEP1, UN PRESUNTO REGULADOR POSTRANSCRIPCIONAL
INVOLUCRADO EN LA ONTOGENIA DEL PISTILO Y EN
OTROS PROCESOS DEL DESARROLLO DE Arabidopsis thaliana
166
VI.- CONCLUSIONES
169
VII.- BIBLIOGRAFÍA
172
VIII.- GLOSARIO
196
Índices X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura I.1.- Distribución geográfica de Arabidopsis thaliana en el mundo
8
Figura I.2.- Número de artículos científicos sobre Arabidopsis thaliana publicados
9
Figura I.3.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana
11
Figura I.4.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana
12
Figura I.5.- Esquema cronológico de la progresión de los principales eventos durante el
desarrollo de Arabidopsis thaliana
Figura I.6.- Representación esquemática de los cromosomas de Arabidopsis thaliana
13
14
Figura I.7.- Clasificación funcional de los genes predichos
en Arabidopsis thaliana
15
Figura. I.8.- Representación esquemática de la infección por
Agrobacterium tumafaciens
18
Figura I.9.- Embrión maduro poco antes de la germinación
20
Figura I.10.- Arquitectura de una dicotiledónea adulta
21
Figura I.11.- Estructura del meristemo apical del tallo en Arabidopsis thaliana
23
Figura I.12.- Fenotipo de los mutantes clv y wus
25
Figura I.13.- Cascada de señalización de la ruta CLAVATA
26
Figura I.14.- Organogénesis desde el meristemo apical
28
Figura I.15.- Meristemos de inflorescencia y floral en Arabidopsis thaliana
30
Figura I.16.- Interacciones génicas en el meristemo floral
31
Figura I.17.- Modelo ABC
33
Figura I.18.- Revisión del Modelo ABC
35
Figura I.19.- Morfología del fruto de Arabidopis thaliana
36
Figura I.20.- Células de la superficie de la valva y del replum en
los frutos de Arabidopis thaliana
37
Figura I.21.- Dehiscencia de los frutos
38
Figura I.22.- Sección tranversal de un fruto en antesis
39
Figura I.23.- Estadios de desarrollo del fruto tras la fertilización
41
Índices XI
Figura I.24.- Fenotipos de los mutantes involucrados en la ruta de AG
43
Figura I.25.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ful-1
44
Figura I.26.- Fenotipo del doble mutante shp1shp2
45
Figura I.27.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ind y alc
46
Figura I.28.- Fenotipo en el fruto del mutante rpl
47
Figura I.29.- Fenotipo de los mutantes crc y spt
48
Figura I.30.- Fenotipo de los frutos en los mutantes tsl, sty1 y sty2
49
Figura I.31.- Fenotipo de los frutos en los mutantes ett
50
Figura I.32.- Aparición de valvas extra en los frutos de los mutantes clv
51
Figura I. 33.- Fenotipo en el fruto generado por la mutación er
52
Figura III.1.- Plámidos pGEM-3Zf(+) y pGEM-T
62
Figura III.2.- Esquema de la estructura de los T-DNA que se han empleado
en la obtención de las tres colecciones de mutagénesis insercional
empleadas en la elaboración de este trabajo
63
Figura III.3.- Vectores para la transformación de Arabidopsis thaliana
64
Figura III.4.- Cuantificación simultánea de distintas ribosondas
89
Figura IV.1- Frutos de individuos aislados durante el escrutinio
97
Figura IV.2.- Fenotipo de pep1-1
101
Figura IV.3.- Recuento del número de valvas en pep1-1
102
Figura IV.4.- Representación del recuento del número de sépalos, pétalos y
estambres en individuos pep1-1 y WS-2
103
Figura IV.5.- Flor del silvestre y pep1-1
103
Figura IV.6.- Tallos fasciados y alteraciones en las inflorescencias de pep1-1
104
Figura IV.7. Comparación entre la disposición de órganos en el silvestre y
en el mutante pep1-1
104
Figura IV.8.- Rosetas de Ws-2 y pep1
105
Figura IV.9.- Microscopía electrónica de barrido de los frutos de pep1-1
106
Índices XII
Figura IV.10.- Asimetría en la disposición de las valvas en pep1-1
107
Figura IV.11.- Observación de las semillas en Ws-2 y pep1-1
107
Figura IV.12.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas silvestre Ws-2
108
Figura IV.13.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas pep1-1
109
Figura IV.14.- Histología de frutos de 5 dpa silvestres (Ws-2)
y mutantes pep1-1
111
Figura IV.15.- Fruto pep1-1 con dos repla fusionados
112
Figura IV.16.- Introgresión de pep1-1 en Col-0
114
Figura IV.17.- Introgresión de pep1-1 en Ler
115
Figura IV.18.- Detección del T-DNA en pep1-1 mediante hibridación Southern
116
Figura IV.19.- Esquema de la posición relativa, respecto al T-DNA pGKB5,
de los cebadores utilizados en TAIL-PCR e IPCR
117
Figura IV.20.- Estructura esquemática de los cromosomas IV y V
de Arabidopsis thaliana
118
Figura IV.21.- Esquema hipotético de la estructura de los T-DNA
en los cromosomas derivados en pep1-1
118
Figura IV.22.- Localización de los marcadores SSLP utilizados en pep1-1
119
Figura IV.23.- Semiesterilidad en los heterocigotos pep1-1
120
Figura IV.24.- Fenotipo de los alelos pep1-2 y pep1-3
123
Figura IV.25.- Alteraciones en el patrón de filotaxia en los alelos pep1
124
Figura IV.26.- Diferencias en la roseta basal de plantas de 14 días Col-0 y pep1-2
125
Figura IV-27.- Análisis de la expresión, mediante RT-PCR, de At4g26000 (PEP1)
y ACT2 en plantas pep1-1 y su ancestro silvestre Ws-2
126
Figura IV.28- Fenotipo de los frutos en los transheterocigotos
pep1-1/pep1-2
127
Figura IV.29.- Secuencia y estructura del gen PEP1
128
Figura IV.30.- Estructura esquemática de la proteína PEP1
130
Figura IV.31.- Alineamiento de las secuencias peptídicas de PEP1, FLK
y sus respectivos ortólogos en arroz
132
Figura IV.32.- Alineamiento estructural de PEP1, FLK
y sus respectivos ortólogos
133
Índices XIII
Figura IV.33.- Localización de las inserciones de los alelos pep1
en el gen PEP1
134
Figura IV.34.- Análisis de la expresión en los alelos pep1-2 y pep1-4
135
Figura IV.35.- Esquemas de las construcciones transgénicas
137
Figura IV.36.- Fenotipo de las plantas pep1-2 portadoras de
la construcción genómica
139
Figura IV.37.- Selección de transformantes resistentes a la kanamicina
(plantas Col-0 portadoras de la construcción para la
sobreexpresión de PEP1)
140
Figura IV.38.- Niveles de expresión de PEP1 en distintos órganos del silvestre
140
Figura IV.39.- Localización del mRNA de PEP1
141
Figura IV.40.- Fenotipo del doble mutante pep1-2 ful-1
143
Figura IV.41.- Interacción entre flk y pep1
144
Figura IV.42.- Fenotipo de los frutos en individuos FLK/flk-3 pep1-4
145
Figura IV.43.- Fenotipo de los dobles mutantes clv3-2 pep1-4
146
Figura IV. 44.- Frutos de individuos CLV3/clv3-2 pep1-4
147
Figura IV.45.- Ausencia de la mutación er en plantas clv3-2
148
Figura IV.46.- Interacciones entre clv2-1 y pep1-4
149
Figura IV.47.- Interacciones entre clv1-1 y pep1-4
150
Figura IV.48.- Interacción entre clv1-6 y pep1-2
152
Figura IV.48.- Interacción wus-1 pep1-1
153
Índices XIV
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I.1.- Rasgos generales de los genes y los tres genomas
de Arabidopsis thaliana
15
Tabla I.2.- Estadios de desarrollo floral asociados al desarrollo del gineceo
40
Tabla III.3.- Estirpes mutantes utilizadas
58
Tabla III.4.- Líneas de T-DNA de las colecciones de dominio público
60
Tabla III.3.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis
65
Tabla III.4.- Antibióticos utilizados
68
Tabla III.5.- Características y perfiles de las reacciones de TAIL-PCR
82
Tabla III.6.- Genotipado molecular de los alelos pep1
93
Tabla III.7.- Genotipado molecular de estirpes mutantes
93
Tabla III.8.- Valores del estadístico χ2 con distintos grados de libertad (GL)
94
Tabla IV.1.- Estudio de la heredabibilidad del fenotipo y de la resistencia a la
kanamicina en los individuos T4
Tabla IV.2.- Segregaciones fenotípicas de la progenie F2 de las líneas estudiadas
98
99
Tabla IV.3.- Análisis de las segregaciones de familias F3 en presencia
de kanamicina de los mutantes SJF8-6, SJF9-9 y SJF20-15
99
Tabla IV.4.- Segregación de la resistencia a la kanamicina en la progenie F3 del
mutante SJF5-3
100
Tabla IV.5.- Recuento del número de valvas en frutos pep1-1
101
Tabla IV.6.- Número de órganos florales en Ws-2 y pep1-1
102
Tabla IV.7.- Líneas de inserción analizadas y utilizadas en el ensayo de
complementación con el mutante pep1-1
Tabla IV.8.- Aparición de las hojas de la roseta en plantas Col-0 y pep1-2
121
124
Índices XV
Tabla IV.9.- Proteínas que presentan dominios KH en Arabidopsis thaliana
131
Tabla IV.10.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV3/clv3-2
PEP1 y CLV3/clv3-2 pep1-4
148
Tabla IV.11.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV2/clv2-1
PEP1 y CLV2/clv2-1 pep1-4
150
Tabla IV.12.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV1/clv1-1
PEP1 y CLV1/clv1-1 pep1-4
151
I.- INTRODUCCIÓN
Introducción 2
I.- INTRODUCCIÓN
I.1.- CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE EL DESARROLLO.
El desarrollo en los organismos multicelulares se puede considerar como uno de
los grandes éxitos de la evolución. A partir de una célula única, el cigoto, se construye un
individuo adulto compuesto por miles o incluso millones de células, que se organizan en el
espacio en grupos celulares, dando lugar a niveles de complejidad superiores (tejidos,
órganos, aparatos,...). En este proceso intervienen fenómenos de diferenciación
(generación de diversidad celular), morfogénesis (organización espacial de las células en
tejidos y órganos), crecimiento (aumento del tamaño de las estructuras y del organismo) y
reproducción (generación de gametos), siempre bajo un estricto control genético. A todo
este conjunto de procesos es a lo que se denomina desarrollo (Wolpert et al., 1998;
Atherly et al., 1999; Gilbert, 2000).
¿Cómo se diferencian las células tras las divisiones en el cigoto?, ¿cómo se
produce esa organización en distintos tejidos y órganos?, ¿qué elementos subyacen en la
formación de los patrones corporales? Estas son algunas de las preguntas a las que
intenta dar respuesta la Biología del desarrollo, cuyo objetivo es estudiar los cambios que
se producen a lo largo de las etapas que se suceden en la formación del individuo adulto
a partir del cigoto, desentrañando los mecanismos y procesos subyacentes (Fosket, 1994;
Browder et al., 1997; Mange y Mange, 1999; Gilbert, 2000; Griffith et al., 2002).
Además, conocer y comprender cómo se desarrollan los organismos contribuye sin
duda al avance del conocimiento básico, pero también se puede explotar en terrenos
aplicados, desde el sector agropecuario a las aplicaciones médicas. Este hecho comporta
la recopilación y el cotejo de la información obtenida a partir del análisis de un número
considerable de especies.
I.1.1.- Sinopsis, origen y evolución de la Biología del desarrollo.
Ya en la antigua Grecia, Hipócrates (Siglo V A. C.) intentó dar una explicación al
desarrollo de los seres vivos basándose en los principios de calor, humedad y
solidificación que imperaban en la época. Sin embargo, no fue hasta un siglo después
cuando Aristóteles inició los primeros estudios formales acerca de la estructuración de los
seres vivos. Estos análisis buscaban entender cómo se forman las distintas partes del
Introducción 3
embrión. Propuso la idea de la epigénesis, que postulaba que durante el desarrollo
aparecían nuevas estructuras progresivamente. Sus ideas fueron muy influyentes hasta
bien entrado el siglo XVII (Wolpert et al., 1998). A partir de este momento, la Biología del
desarrollo estuvo inmersa en una etapa meramente descriptiva, basada en estudios
anatómicos en diversas especies, que mediante su comparación intentaba dar una
explicación al desarrollo. Fue a finales del siglo XIX, cuando la Biología del desarrollo
sufrió una catarsis con el nacimiento de la “Mecánica del desarrollo”, lo que hoy
conocemos como Embriología experimental. Los experimentos llevados a cabo por los
embriólogos Wilhelm Roux y Hans Driesch incluían metodologías quirúrgicas y ensayos
químicos, revolucionando la estrategia experimental. A sus experimentos siguieron los
realizados por Hans Spemann, refinándose aún más las metodologías (Alberts, 1996;
Howell, 1998; Wolpert et al., 1998).
Sin duda, la incorporación de la Genética a la Biología del desarrollo cambió su
concepción. Descifrar parte del programa genético involucrado en los distintos fenómenos
del desarrollo era considerado casi imposible. No obstante, el gran impacto de la Genética
en los estudios sobre el desarrollo llevó a que se acuñara por primera vez el término de
Genética del desarrollo en 1963, durante la celebración del XI International Congress of
Genetics. Posteriormente, la aplicación de estrategias de mutagénesis de saturación
permitió la identificación por Nüsslein-Volhard y Wieschaus (1980) de un número
considerable de mutantes afectados en el desarrollo de Drosophila melanogaster, lo que
dio un espaldarazo definitivo a la Biología del desarrollo. A partir de entonces, los trabajos
genéticos para la comprensión del desarrollo se centraron en la búsqueda y estudio de
fenotipos aberrantes (Ferguson y Horvitz, 1985; Jürgens et al., 1991; Haffter et al., 1996;
Haffter y Nüsslein-Volhard, 1996) que posibilitaran la identificación de los genes
afectados, responsables últimos de la elaboración de los distintos programas del
desarrollo que finalmente darán lugar al individuo adulto (Wolpert et al., 1998; Davidson,
2001).
Sin duda, la concentración de esfuerzos sobre un número limitado de organismos
modelo ha contribuido a la rápida progresión de la Biología del desarrollo en los últimos
tiempos. Podemos destacar la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster, St. Johnston,
2002), el pez cebra (Danio rerio, Grunwald y Eisen, 2002), el nematodo Caenorhabditis
elegans (Jorgensen y Mango, 2002), el anfibio Xenopus laevis (Fukui y Asashima, 1994;
Vignali et al., 1994), el ratón (Mus musculus; Justice, 2000), el pollo (Gallus gallus; Brown
et al., 2003) o la escrufolariácea Antirrhinum majus (Schwarz-Sommer et al., 2003) y la
Introducción 4
crucífera Arabidopsis thaliana (Page y Grossniklaus, 2002) entre los vegetales. Pero
además, también reviste una importancia crucial la confluencia con el avance inusitado de
las técnicas moleculares, incrementando notablemente el potencial para la identificación
de genes involucrados en vías de desarrollo concretas (Howell, 1998).
I.2.- CARACTERÍSTICAS DEL DESARROLLO VEGETAL.
También la Biología Vegetal atraviesa un período de rápida evolución con el
advenimiento de nuevas tecnologías. El estudio de los fenómenos de desarrollo en
plantas, un terreno antaño limitado a la descripción de estructuras y a determinadas
pruebas bioquímicas (los denominados modelos reconstructivos), incluye hoy día la
utilización de herramientas genéticas y moleculares que permiten dilucidar los elementos
y procesos subyacentes (Prusinkiewicz, 2004). Históricamente, el análisis del desarrollo
vegetal ha recibido menor atención que el desarrollo animal. No obstante, varios de los
principios de la Biología del desarrollo moderna han sido establecidos gracias al análisis
del desarrollo en las plantas. Podemos citar los conceptos de homología, morfología y
equivalencia propuestos por Goethe en 1790, la identificación del núcleo y el protoplasma
por Robert Brown en 1835, la teoría celular y el descubrimiento del nucleolo por Schleiden
en 1839, la alternancia de generaciones (ciclo digenético) por Hofmeister (1851) o la
determinación de las fases de la mitosis en 1884 por Strasburger (citados en Meyerowitz,
1994a; Alberts et al., 1996; Paniagua et al. 1997).
Además de un mejor conocimiento de los mecanismos de desarrollo que son
propios de las plantas, el estudio de la Biología del desarrollo vegetal puede conducir a un
aumento de su producción y calidad, lo que presenta un indudable interés social y
económico (Meyerowitz y Pruitt, 1985).
I.2.1.- Características diferenciales del desarrollo de las plantas.
El análisis genético y molecular de los fenómenos de desarrollo en distintos
organismos pone de manifiesto cierto grado de conservación general de estrategias a lo
largo de la evolución. Algunas similitudes entre el desarrollo animal y el vegetal han
permitido aplicar ciertas teorías con carácter general (Davidson, 1994, Meyerowitz, 2001).
Pero existen profundas diferencias entre ambos que, generalmente, no son consideradas
en los trabajos centrados en el desarrollo animal.
Introducción 5
Las plantas son organismos sésiles, y de ello se deriva su gran capacidad de
adaptación al biotopo que les rodea. Esta característica influye en gran medida en su
modo de desarrollo, muy dependiente de las condiciones ambientales. Por ejemplo, la
temperatura y la duración relativa del día y la noche (fotoperiodo) determinan el momento
de la germinación y la floración, mientras que la gravedad y la posición de la fuente de luz
dictan la dirección del crecimiento de la planta. Esto se traduce en una gran variabilidad
de comportamientos entre las distintas especies (Lyndon, 1990; Fosket, 1994; Howell,
1998).
La existencia de cloroplastos en sus células, que las convierte en organismos
autótrofos, o de una pared celular rígida que mantiene su estructura, son algunas de las
características diferenciales. La presencia de esta pared celular impide que se produzcan
los movimientos y migraciones celulares propios del desarrollo animal. Por tanto, la
morfogénesis de las plantas queda supeditada a la existencia de diferenciación
dependiente de la posición y a un control de la división y la expansión celular (Meyerowitz,
1994a, 1994b; Wolpert et al., 1998; Westhoff et al. 1998). Pero este aislamiento celular
debido a la pared no es total. Existe una comunicación intercelular a través de puentes
citoplasmáticos denominados plasmodesmos (Robards y Lucas, 1990), que permiten el
intercambio de metabolitos y otras moléculas, pudiendo revestir gran importancia en los
procesos de desarrollo. Se ha descrito el movimiento de algunos factores de transcripción
codificados por los genes LEAFY (LFY, Sessions et al., 2000; Wu et al., 2003),
APETALA1 (AP1 Sessions et al., 2000; Wu et al, 2003), SHORTROOT (SHT, Nakajima et
al., 2001) en Arabidopsis thaliana, o Knotted1 en el maíz. (Lucas et al., 1995).
Las plantas presentan una estructura corporal simple, con alrededor de 40 tipos
celulares distintos. Este hecho contrasta, en gran medida, con la compleja organización
corporal que presentan los animales, donde podemos diferenciar entre alrededor de 100
tipos celulares distintos (Lyndon, 1990; Howell, 1998).
En los animales, muchos de los órganos del adulto se forman durante la
embriogénesis, por lo que se dice que el embrión es una copia reducida del individuo
adulto. Aquí difieren animales y plantas, ya que durante la embriogénesis vegetal sólo se
genera un rudimento del adulto que permitirá, en primera instancia, la subsistencia de la
plántula y, en etapas posteriores, se formarán los órganos a partir de los meristemos (del
griego merizein, dividir). A partir del meristemo apical o vegetativo (SAM, Shoot Apical
Meristem) se generarán las estructuras aéreas del individuo, siendo el meristemo
radicular (RAM, Root Apical Meristem) el responsable de la formación del sistema
Introducción 6
radicular. Por todo ello se define al desarrollo vegetal como básicamente postembrionario
(Lyndon et al., 1990; Fosket, 1994; Evans y Barton, 1997; Howell, 1998; Fletcher, 2002;
Bäurle y Laux, 2003; Carles y Fletcher, 2003).
Las células indiferenciadas de los meristemos tienen la capacidad de dividirse
continuamente para dar lugar a la formación de los distintos tejidos y órganos de la planta
adulta. Sin embargo, la totipotencia que caracteriza a estas células meristemáticas puede
presentarse en otros linajes celulares. Existe, por consiguiente, la necesidad de mantener
el estado diferenciado de la célula, a fin de evitar la desdiferenciación y el retorno a un
estado meristemático indeterminado. Esta situación subyace a la enorme plasticidad que
presenta el desarrollo vegetal (Taylor, 1997; Laux, 2003).
I.3.- UTILIZACIÓN DE SISTEMAS MODELO EN BIOLOGÍA.
Los organismos modelo son especies en cuyo estudio experimental convergen un
amplio número de equipos de investigación, con el fin de obtener conclusiones que
puedan ser generalizables a otras especies (Bolker, 1995). Reúnen características que
facilitan su mantenimiento y manipulación en el laboratorio y que, además, permiten la
obtención de resultados en un periodo de tiempo razonablemente breve. Estos
organismos presentan un ciclo de vida corto, pequeño tamaño, facilidad de propagación y
un bajo coste de mantenimiento en el laboratorio. También conviene que tanto su
morfología como su genoma sean relativamente simples, lo que facilita la interpretación
de los resultados obtenidos durante su estudio (Bolker, 1995). Anteriormente se han
citado diversos ejemplos que cumplen con todos o con buena parte de estos requisitos
(sección I.1.1).
I.4.- Arabidopsis thaliana COMO SISTEMA MODELO EN EL ESTUDIO DEL
DESARROLLO VEGETAL.
Hasta bien entrado el siglo XX, la mayoría de los estudios en plantas se realizaron
con especies de interés económico con el fin de mejorar sus cultivos. Estas especies
presentan inconvenientes ya que, en la mayoría de los casos, su genoma es de gran
tamaño y presentan un elevado grado de ploidía, lo que dificulta su análisis y
manipulación (Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). Una de las especies mejor
estudiadas ha sido el maíz (Zea mays). Pese a ello, se aleja de las características propias
Introducción 7
de un organismo modelo. La situación es similar en especies como el clavel (Dianthus
caryophyllus), el tomate (Lycopersicon esculentum), el guisante (Pisum sativum) o el
tabaco (Nicotiana tabacum).
Sólo a partir de mediados de la década de 1980 se generalizó la utilización de una
crucífera sin valor económico, Arabidopsis thaliana, en los trabajos de investigación sobre
el desarrollo vegetal. Aún reconociendo la importancia de Antirrhinum majus y otras
especies de gran tradición en su estudio, en la actualidad Arabidopsis thaliana se ha
convertido en la planta modelo por excelencia, considerada por muchos como la
“Drosophila vegetal” (Meyerowitz y Pruitt, 1985; Meyerowitz, 1987; Meyerowitz, 1989;
Bowman, 1994; Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002).
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Figura I.1.- Distribución geográfica de Arabidopsis thaliana en el mundo. Las regiones coloreadas
corresponden a zonas en las que se han aislado individuos (Rédei, 1970). Los puntos representan los lugares
en los que se han aislado los distintos accesos o ecotipos de esta crucífera. Tomado de Alonso-Blanco y
Koornneef (2000) con modificaciones.
Arabidopsis no difiere del resto de las plantas con flores en los aspectos básicos
de su biología, por lo que se espera que las conclusiones de sus estudios sean aplicables
al análisis de muchos aspectos estructurales y funcionales de otras especies vegetales
(Meyerowitz y Somerville, 1994). Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. es una angiosperma
dicotiledónea que pertenece a las Brasicáceas o Crucíferas, familia muy amplia en la que
encontramos aproximadamente 340 géneros y más de 3.300 especies (Al-Shehbaz, 1984;
citado en Hall et al., 2002). Algunos miembros con interés económico son las diversas
Introducción 8
formas de col (Brassica oleracea), el rábano (Raphanus sativus), el nabo (B. napus subsp.
rapifera), la colza (B. napus var. arvensis), las mostazas blanca y negra (Sinapis alba y B.
nigra, respectivamente) o plantas ornamentales como los alhelíes Erysimum cheiri y
Mathiola incana (Strasburger, 1994).
Aunque se ha sugerido que es originaria de Asia Central, resulta difícil conocer el
origen geográfico exacto de Arabidopsis thaliana, ya que, al igual que otras muchas
crucíferas, es una especie cosmopolita que se localiza, mayoritariamente, en regiones de
clima moderado (Figura I.1; Meyerowitz, 1989; Strasburger, 1994; Innan et al., 1997).
Muchas estirpes aisladas en localizaciones concretas recibieron la denominación
de ecotipos. La inadecuación de este término desde un punto de vista adaptativo ha dado
paso al de “acceso” (accessions), definido como “un genotipo particular de una especie
concreta, recolectado en una localización geográfica específica” (Alonso-Blanco y
Koornneef, 2000). No obstante, ambos términos coexisten en el uso corriente de la
comunidad científica dedicada a Arabidopsis thaliana.
Arabidopsis thaliana, fue descrita en el siglo XVI por Johannes Thal, quien la
denominó inicialmente Pilosella siliquosa. Ya en los años cuarenta del pasado siglo,
Friedrich Laibach publicó la primera colección de mutantes de Arabidopsis thaliana
inducidos por rayos X y constataba la posibilidad de utilizar esta especie en la
experimentación de laboratorio (Laibach, 1943; Reinholz, 1947a; Reinholz, 1947b citados
en Bowman, 1994; Page y Grossniklaus, 2002; Somerville y Koornneef, 2002). A
mediados de la década de los 60, comenzó a organizarse la comunidad científica que
trabajaba con esta crucífera, creando el denominado Arabidopsis Information Service
(AIS). Poco después (1965) se organizó el primer simposio sobre Arabidopsis thaliana
(http://www.arabidopsis.org/ais/1965/contents01S.html).
En la década de los 70, decayó su interés, en gran medida como consecuencia del
auge de otras especies (maíz, guisante, levaduras, bacterias, Drosophila melanogaster,
etc.). Sin embargo, los trabajos realizados por distintos grupos acerca de la respuesta a
las auxinas o sobre letalidad embrionaria, así como varias revisiones bibliográficas,
despertaron de nuevo el interés en Arabidopsis entre la comunidad científica (Meyerowitz,
2001; Page y Grossniklaus, 2002), como pone de manifiesto el notable incremento en los
últimos años del número de trabajos de investigación publicados sobre Arabidopsis
thaliana (Fig. I.2).
Número publicaciones por año
Introducción 9
Años
Figura I.2.- Número de artículos científicos publicados anualmente sobre Arabidopsis thaliana. Tomado, con
alguna modificación, de Somerville y Koornneef (2002).
I.4.1.- Características de Arabidopsis thaliana como sistema modelo.
Arabidopsis thaliana presenta unas características óptimas como organismo
modelo en Biología vegetal, entre las que destacan su capacidad de crecimiento bajo
condiciones controladas; su pequeño tamaño (unos 30 cm de altura y la posibilidad de
cultivar hasta 10.000 plantas /m2). Además, presenta un corto ciclo de vida de alrededor
de 6 semanas, permitiendo la obtención de hasta 8 generaciones al año en determinadas
condiciones de cultivo (25º C e iluminación continua). Se trata de una especie autógama y
muy prolífica, pudiendo conseguir hasta 10.000 semillas por planta sin necesidad de
intervención alguna. Las semillas pueden almacenarse varios años a temperatura
ambiente, con escasa pérdida de su viabilidad (Bowman 1994; Page y Grossniklaus,
2002).
Arabidopsis thaliana se puede mutagenizar con gran facilidad, mediante
mutágenos físicos (neutrones rápidos y rayos X), químicos (metanosulfonato de etilo,
EMS) o elementos de inserción (transposones y T-DNA de Agrobacterium tumefaciens).
En las últimas décadas, se han realizado numerosas mutagénesis sobre Arabidopsis
thaliana con el propósito de analizar diferentes procesos biológicos (Rédei, 1970; Rédei,
1975 citados en Meyerowitz, 2001; Estelle y Somerville, 1986; Meyerowitz, 1987; Bowman
et al., 1988; Meyerowitz, 1989; Griffing y Scholl, 1991; Koncz et al., 1992; Koornneef y
Stam, 1992; Rédei y Koncz, 1992; Berná et al., 1999; Quesada et al., 2000). Cabe
destacar la facilidad con la que se puede transformar Arabidopsis thaliana con el T-DNA
Introducción 10
de Agrobacterium tumefaciens (Krysan et al., 1999; Brunaud et al., 2002). Esto ha
permitido la generación de distintas colecciones de mutantes de inserción (Sessions et al.,
2002; Alonso et al., 2003; Jander et al., 2002).
El tamaño del genoma de Arabidopsis thaliana, uno de los más pequeños entre las
plantas superiores, presenta sólo 125 Mb (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000) con
poco DNA repetitivo, lo que facilita los estudios moleculares así como la clonación
posicional (Leutwiler et al., 1984; Pruitt y Meyerowitz, 1986; Meinke et al., 1998;
Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002).
Además, Arabidopsis cuenta con una ingente cantidad de herramientas genéticas
(líneas recombinantes endógamas, RI o Recombinant Inbred Lines; marcadores
fenotípicos, marcadores moleculares polimórficos, bancos de clones de cDNA, EST, etc.)
y bioinformáticas al servicio de la comunidad científica internacional. En la dirección del
TAIR (The Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org; Huala et al.,
2001) podemos encontrar actualizaciones periódicas de la información acerca de los
recursos de utilidad en el estudio de Arabidopsis (García-Hernández et al., 2002).
I.4.2.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana.
Arabidopsis thaliana presenta una morfología y anatomía similares a las de otras
angiospermas (Fig. I.3).
En la base de la planta encontramos la raíz, de la que surgen distintas
ramificaciones y la roseta, compuesta de hojas vegetativas a partir de la cual se desarrolla
el tallo principal y varios secundarios. Éstos, a su vez, pueden presentar ramificaciones
con una hoja caulinar en su base. El espacio comprendido entre un órgano y el siguiente
se denomina entrenudo.
En los extremos, tanto del tallo principal como de las ramificaciones, se desarrollan
inflorescencias con flores con una disposición en racimo. Los órganos en la flor se
disponen en cuatro verticilos concéntricos: 4 sépalos, 4 pétalos, 6 estambres (4 externos y
dos internos) que alojan al gametófito masculino y dos carpelos fusionados formando el
gineceo (Fig. I.3 C y B). El gineceo está formado por el ovario, en cuyo interior se alojan
los óvulos, y el estigma situado en la región apical, donde se desarrollan las papilas
estigmáticas. Separando a éste del ovario, encontramos el estilo (Fig. I.3 B y I.19;
Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999).
Introducción 11
A
B Estambres
Flor
Inflorescencia
Estigma
Carpelos
Silicua
Pétalos
Fitómero
Sépalos
Entrenudo
+
Nudo
Pedicelo
Diagrama floral de
Arabidopsis thaliana
Ramificación
Hoja caulinar
C
Pétalo
Tallo
principal
Sépalo
Hojas de la roseta
(vegetativas)
Estambre
Raíz
Carpelo
Figura I.3.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana. A) Dibujo de una planta adulta de Arabidopsis
thaliana de Somerville y Koornneef (2002) en el que se indican las distintas partes de la planta. B) Fotografía
de una flor de Arabidopsis thaliana (de unos 5 mm) en la que se indican los distintos órganos. C) Diagrama
floral en Arabidopsis thaliana. Barra de escala en B 1 mm.
I.4.3.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana.
Arabidopsis thaliana es una planta anual que presenta dos fases de crecimiento
bien diferenciadas, la fase vegetativa y la fase reproductiva (Fig. I.4). Al igual que otras
muchas angiospermas, presenta un ciclo de vida típico con alternancia de generaciones
haploides y diploides (gametofítica y esporofítica, respectivamente). Los estambres
constituyen los órganos reproductivos masculinos de la flor, y se componen del filamento
y la antera en la que se encuentran los granos de polen (gametófito masculino, haploide).
El gametófito femenino está formado por el óvulo, en el que se aloja la célula huevo y el
saco embrionario (Bowman, 1994; Meinke et al., 1998).
En el estadio de antesis (momento en el que se abren las flores) los granos de
polen de la antera se depositan en el estigma, quedando atrapados en las papilas
estigmáticas, y germinan generando el tubo polínico que atraviesa el estilo y la pared del
Introducción 12
ovario (septum) hasta alcanzar el óvulo. Se produce la fusión de los gametos dando lugar
al cigoto o embrión diploide, que junto con el tejido materno y el endospermo
extraembrionario, dará lugar a la semilla (Bowman, 1994; Meinke et al., 1998; Laux et al.,
2004).
Planta adulta
(esporófito)
Desarrollo de la semilla
Figura I.4.- Ciclo de vida de Arabidopsis thaliana. En esta figura se representan los distintos estadios de
desarrollo de esta crucífera. Se anotan algunos de los órganos que presenta la planta. En rojo, se indican
cada uno de los procesos que tienen lugar durante el ciclo vital de la planta. Dibujo tomado de Howell (1998)
con modificaciones.
Al culminar la embriogénesis, se observa en el embrión maduro un plano corporal
rudimentario, compuesto por las hojas embrionarias o cotiledones y los meristemos apical
y radicular (Laux et al., 2004). Tras la germinación, se produce una plántula compuesta
por la radícula, el hipocotilo y los cotiledones. A partir de aquí la planta entra en la fase
vegetativa. Ésta se divide en una etapa juvenil (temprana) donde, a partir del meristemo
apical, surgen las 4 primeras hojas con filotaxia decusada (pares de hojas enfrentadas), y
una etapa adulta (tardía) caracterizada por la producción de hojas que se disponen
Introducción 13
siguiendo un patrón filotáctico en espiral con unos entrenudos cortos entre dos hojas
sucesivas. A esta transición se asocian cambios morfológicos que reciben el nombre de
heteroblastia (Poethig, 1997; Candela et al., 1999; Berardini et al., 2001; Poethig, 2003).
Al final del desarrollo vegetativo, y tras la integración de señales exógenas (luz,
fotoperiodo, nutrientes, temperatura, etc.) y endógenas (hormonas, regulación génica), se
produce la transición floral, lo que marca el inicio de la fase reproductiva. El meristemo
apical se transforma en meristemo de inflorescencia, de donde surgen hojas caulinares y
meristemos florales siguiendo un patrón de filotaxia helicoidal. Tras la antesis se inicia un
nuevo ciclo (Bowman, 1994, Meinke et al., 1998; Boyes et al., 2001; Page y Grossniklaus,
2002).
Germinación
Producción de hojas vegetativas
Crecimiento de la roseta
Aparición de la inflorescencia (transición floral)
Floración
Maduración de la silicua (Fructificación)
0
10
20
30
40
50
50
70
Días
Figura I.5.- Esquema cronológico de la progresión de los principales eventos durante el desarrollo de
Arabidopsis thaliana. Esquema a partir de Boyes et al. (2001). Las plantas del acceso Col-0 fueron cultivadas
en condiciones de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (día largo).
I.4.4.- El genoma de Arabidopsis thaliana.
La práctica totalidad del genoma de Arabidopsis thaliana se encuentra
secuenciado salvo alguna región refractaria rica en repeticiones. Presenta un tamaño de
125 Mb estructurado en cinco cromosomas (Fig. I.6) y destaca la baja presencia de DNA
repetitivo, cercano al 10% (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000).
Su mapa genético comprende unos 600 cM, con una equivalencia de alrededor de
210 Kb/cM. Por otro lado, encontramos un bajo número de elementos móviles (un 10%)
dispersos por todo el genoma (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Hall et al., 2002).
Este hecho contrasta con lo observado en otras especies como el maíz, donde alcanzan
entre un 50 y un 80% del genoma (San Miguel et al., 1996), o un 45% en el caso del
genoma humano (The International Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
Introducción 14
El tamaño del genoma de Arabidopsis thaliana es relativamente pequeño. Se cifra
el tamaño del maíz en 2.500 Mb, y el del trigo en 16.000 Mb (Adam, 2000). La diferencia
de tamaño con el arroz no es tan notoria ya que su genoma posee 420 Mb (Oryza sativa
L. ssp. japonica; Goff et al, 2002) o 466 Mb (Oryza sativa L. ssp. Indica; Yu et al., 2002).
I
II
III
IV
V
MT
CLP
Figura I.6.- Representación esquemática de los cromosomas de Arabidopsis thaliana. De I a V se indican los
cromosomas nucleares. A la derecha el genoma de la mitocondria (MT) y el del cloroplasto (CLP). El círculo
rojo indica la posición del centrómero.
Al comparar el tamaño del genoma de Arabidopsis thaliana con otros organismos
no vegetales, observamos que se asemeja al de otros sistemas modelo, como Drosophila
melanogaster (180 Mb; Adams et al., 2000) o el nematodo Caenorhabditis elegans (97
Mb; The Caenorhabditis elegans Sequencing Consortium, 1998).
El número de presuntos genes en Arabidopsis thaliana es 25.498, acercándose a
las primeras estimaciones de 30.000 genes para la especie humana (International Human
Genome Sequencing Consortium, 2001) y muy superior a los 13.601 predichos para
Drosophila melanogaster (Adams et al., 2000) o los 19.099 para Caenorhabditis elegans
(The Caenorhabditis elegans Sequencing Consortium, 1998). Estas diferencias deben
basarse en reorganizaciones cromosómicas, duplicaciones locales de genes o
duplicaciones totales del genoma, acaecidas a lo largo de la evolución. De hecho, la
variedad de tipos proteicos es de sólo 11.601, muy similar a lo esperado en
Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster, cuyos proteomas oscilan entre 11.000
y 15.000 tipos distintos.
Introducción 15
Tabla I.1. Rasgos generales de los genes y los tres genomas de Arabidopsis thaliana.
Núcleo
Cloroplasto
Mitocondria
Tamaño del genoma
125 MB
154 Kb
367 Kb
Genomas por célula
2
560
26
Regiones duplicadas
60%
17%
10%
25.498
87
58
Variable pero sinténico
Conservado
Variable
4,5
1,2
6,25
1,9 Kb
900 pb
860 pb
Genes con intrones
79%
18,4%
12%
Genes/Pseudogenes
1/0,03
1/0
1/0,2-0,5
14%
0
4%
Número predicho de genes
Ordenamiento génico
Densidad génica (Kb/nº de genes)
Tamaño medio de la región
codificante
Transposones (% en el genoma)
Del total de genes predichos en el genoma de Arabidopsis thaliana, es posible
asignar una función al 69%, basándose en la similitud de secuencia que presentan con
respecto a otros genes de otros organismos, de los que un 9% han sido caracterizados
experimentalmente. Sin embargo, para un 30% no se ha podido clasificar su función (Fig.
I.7).
Transcripción
Metabolismo
Síntesis de DNA, crecimiento y
división celular
Senescencia, muerte celular
y defensa
Comunicación celular y
transducción de señales
Sin clasificar
Degradación proteica
Transporte intracelular
Biogénesis celular
Regulación del transporte
Energía
Síntesis proteica
Homeostasis iónica
Figura I.7.- Clasificación funcional de los genes predichos en Arabidopsis thaliana. Obsérvese en el diagrama
de sectores, el elevado porcentaje de genes cuya función aún no se ha podido determinar. Dibujo tomado de
The Arabidopsis Genome Initiative (2000) con modificaciones.
Introducción 16
El número de proteínas que son únicas en el genoma de Arabidopsis thaliana se
acerca al 35%. Por otro lado, la proporción de éstas que presentan más de 5 miembros es
muy superior (37,4%) a lo observado en Drosophila melanogaster (12,1%) o en
Caenorhabdidtis elegans (24%). El número de funciones, determinadas en relación a la
presencia o no de determinados dominios proteicos, presentan una proporción similar
entre Arabidopsis, Caenorhabditis y Drosophila, lo que pone de relieve la similitud en
determinados procesos entre los eucariotas, así como la ubicuidad de los tipos proteicos
implicados. Sin embargo, se debe tener en cuenta que 150 familias proteicas son únicas
(The Arabidopsis Genome inititive, 2000).
Otra de las conclusiones que se extrae del análisis del genoma es la abundancia
de proteínas implicadas en señalización, y aquéllas que presentan dominios implicados en
resistencia a enfermedades y reconocimiento de patógenos. Este resultado sugiere la
existencia de un mayor número de rutas de transducción de señales como consecuencia
de la respuesta al ambiente y a otros organismos, entre ellos los patógenos (The
Arabidopsis Genome Initiative, 2000).
Cabe destacar el elevado número de factores de transcripción que presenta
Arabidopsis thaliana, siendo dos veces mayor que en Drosophila melanogaster y tres que
en Caenorhabditis elegans. Estas proteínas muestran entre un 8 y un 23% de similitud
con otros factores de transcripción de otros eucariotas, existiendo 29 familias distintas, de
las que 16 parecen ser únicas de plantas (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). La
existencia de duplicaciones puede ser la causa de cierto grado de redundancia funcional.
Por ejemplo, Arabidopsis thaliana cuenta con 80 miembros del grupo de factores de
transcripción de tipo MADS. En el caso de la familia de factores SHATTERPROOF o
SEPALLATA es necesaria la ausencia de función de todos los miembros de cada familia
para la observación de un fenotipo mutante (Liljegren et al., 2000; Pelaz et al., 2000).
Arabidopsis thaliana también cuenta con un elevado número de genes que
codifican presuntas proteínas implicadas en el metabolismo del RNA (estabilización,
procesamiento, eliminación, transporte, ...), siendo mucho mayor que lo determinado para
Drosophila melanogaster o Caenorhabditis elegans (The Arabidopsis Genome Initiative,
2000). Es verosímil que también aquí desempeñe un importante papel la redundancia
funcional.
Introducción 17
I.4.5.- Generación, obtención y caracterización de mutantes en Arabidopsis thaliana.
I.4.5.1.- Mutágenos utilizados en Arabidopsis thaliana.
I.4.5.1.1.- Mutágenos físicos y químicos.
Los neutrones rápidos y los rayos X han sido los mutágenos físicos que con más
frecuencia se han utilizado en Arabidopsis thaliana (Meyerowitz, 2001). En ambos casos,
el tipo de mutaciones que producen son deleciones (alrededor de 1Kb en el caso de los
neutrones rápidos) y otro tipo de reorganizaciones cromosómicas (Shirley et al., 1992;
Bruggemann et al., 1996).
El mutágeno químico más utilizado en Arabidopsis thaliana es el agente alquilante
metanosulfonato de etilo (EMS). Éste induce mutaciones puntuales, preferentemente
transiciones de G por A (Weigel y Glazebrook, 2002). Debido a la efectividad del EMS,
pueden generarse varias mutaciones puntuales en cada individuo. Esto se traduce en una
elevada probabilidad de aislamiento de alelos mutantes para un determinado locus
durante el escrutinio. Sin embargo, la posible existencia de varias mutaciones
acompañantes a la mutación en el locus de interés requiere la eliminación de éstas
mediante retrocruzamiento con el ancestro silvestre (Wilhelmi y Preuss, 1996).
Generalmente, con estos mutágenos la clonación del gen afectado requiere
estrategias basadas en la cartografía y la clonación posicional mediante la utilización de
marcadores moleculares polimórficos (Weigel y Glazebrook, 2002). Gracias a la
secuenciación del genoma de Arabidopsis thaliana, el número de marcadores moleculares
se ha visto aumentado notablemente facilitando las tareas de cartografía (The Arabidopsis
Genome Initiative, 2000; http://www.arabidopsis.org/Cereon).
En la actualidad se está desarrollando una colección de mutantes derivados de
EMS, dentro del proyecto denominado ATP (Arabidopsis TILLING Project; Colbert et al.,
2001; Greene et al., 2003; Till et al., 2003) con el propósito de proporcionar series alélicas
de mutaciones puntuales en diversos loci mediante TILLING (Targeting-Induced Local
Lesions in Genomes).
I.4.5.1.2.- El T-DNA como mutágeno insercional.
En Arabidopsis thaliana se han desarrollado, principalmente, dos sistemas
insercionales como agentes mutagénicos. Uno de ellos es un sistema heterólogo basado
en transposones de maíz (Ralston et al., 1989; Bancroft et al., 1992; Aarts et al., 1993).
Tienen una elevada eficacia en Arabidopsis, permitiendo la generación de colecciones de
Introducción 18
genes señalizados y su clonación (Bancroft y Dean, 1993; Long et al., 1993; Sundaresan
et al., 1995; Kuromori et al., 2004).
A pesar de ello, el mutágeno insercional por excelencia en Arabidopsis thaliana es
el T-DNA (transfer DNA). Se trata de un pequeño segmento del plásmido inductor de
tumores Ti (Tumor inducer) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens que, tras la
infección de las plantas, se integra de forma estable en su genoma (Fig. I.8). Tras
diversos estudios, no se tiene un modelo completo de cómo el T-DNA finalmente se
integra en el genoma de la planta (Zupan et al., 2000; Tax y Vernon, 2001; Valentine,
2003). En la integración, es imprescindible la integridad de dos regiones, cada una en un
extremo del T-DNA a integrar, los bordes izquierdo o LB (Left Border) y derecho o RB
(Right Border; Bevan y Chilton, 1982; Zambryski et al., 1983; Gelvin, 2000).
Plásmido Ti
(200 Kb)
Agrobacterium
tumefaciens
Célula huésped infectada
T-DNA
Región Vir
Síntesis del
T-DNA por las
proteínasVir
Intermediario
monocatenario
del T-DNA
Opinas
metabolizadas
por
Agrobacterium
La
acetosiringona
activa a los
genes Vir
Integración
aleatoria del
T-DNA
en los
cromosomas
Tranporte
del T-DNA
al núcleo
de la célula
Transferencia
del T-DNA
Síntesis de Síntesis de Síntesis de
opinas citoquininas auxinas
Aumento en los
niveles de auxinas
y citoquininas en
las células
infectadas
Las células
dañadas
producen
acetosiringona
Molécula de acetosiringona
Figura. I.8.- Representación esquemática de la infección por Agrobacterium tumafaciens. Se indican las
etapas que tienen lugar durante la transferencia e integración del T-DNA del plásmido Ti en el genoma de la
célula huésped. Modificado a partir de Buchanan et al., 2000.
En los últimos años, se han generado distintas colecciones de mutantes de TDNA, localizando en cada una de las líneas la posición de la inserción. Este recurso
posibilita la rápida obtención de nuevos alelos para un determinado locus, y es de gran
Introducción 19
utilidad en estrategias de genética inversa (Sessions et al., 2002; Alonso et al., 2003;
Rosso et al., 2003; Strizhov et al., 2003).
El T-DNA presenta una serie de ventajas para su utilización como herramienta, no
sólo de mutagénesis, sino también en distintos procedimientos generales de Ingeniería
Genética (Valentine, 2003), como son la incorporación de marcadores de selección
(resistencia a antibióticos o herbicidas) y de genes testigo (Fosket, 1994). Otras
aplicaciones con gran interés son el rescate fenotípico de mutantes mediante la inserción
de una copia silvestre del gen afectado, o los estudios de sobreexpresión (Enhancer
traps, Activation tagging, Topping y Lindsey, 1997; Lindsey et al., 1998; Campisi et al.,
1999; Weigel et al., 2000). No obstante, su ventaja fundamental como mutágeno es la
posibilidad de aislar e identificar las regiones genómicas adyacentes a los puntos de
inserción, pudiendo clonar con relativa facilidad el gen afectado.
Sin embargo, y aún teniendo en cuenta estas ventajas, la utilización del T-DNA
presenta inconvenientes. El número medio de inserciones por planta mutagenizada es de
sólo 1,5. Consecuentemente, se requieren escrutinios de un mayor número de plantas.
Por otra parte, la transformación con Agrobacterium puede originar diversas mutaciones
cromosómicas, como inversiones (Laufs et al., 1999), duplicaciones, deleciones (Negruk
et al., 1996) o translocaciones cromosómicas (Tax y Vernon, 2001). La letalidad
embrionaria de muchos mutantes de T-DNA se debe a este tipo de aberraciones
cromosómicas (Castle et al., 1993).
Los métodos de infiltración con Agrobacterium tumefaciens han progresado
notablemente, trivializando procedimientos anteriormente tediosos. El sistema más
utilizado actualmente consiste en la inmersión de las inflorescencias de plantas adultas
(floral dip) en un cultivo de la bacteria con un surfactante (Bechtold et al., 1993; Clough y
Bent, 1998; Bent, 2000; Desfeux et al., 2000). Implica la exposición al mutágeno de
individuos que reciben la denominación de T1. Las plantas T2 son descendientes de la
autofecundación de los individuos T1. Los posibles efectos fenotípicos de las mutaciones
se pueden examinar en homocigosis en la generación T3 y siguientes. Con el propósito de
facilitar el escrutinio, las semillas descendientes de varios individuos T2 se reúnen en
distintos grupos parentales (pool).
Introducción 20
I.5.- DESARROLLO DE Arabidopsis thaliana.
I.5.1.- Embriogénesis en Arabidopsis thaliana.
La embriogénesis es el proceso por el cual el cigoto sufre transformaciones hasta
dar lugar al embrión. En las plantas, durante el desarrollo del embrión se genera un plano
corporal simple a lo largo del eje proximo-distal. En Arabidopsis thaliana, una vez
formado, podemos distinguir en el embrión el meristemo apical, que se localiza entre las
hojas embrionarias o cotiledones, el hipocotilo y la raíz, en cuyo extremo se sitúa el
meristemo radicular. Durante la formación de estas estructuras, se produce el desarrollo
de la epidermis, el crecimiento de la subepidermis y la formación de un haz vascular
principal a lo largo del embrión (Lyndon, 1990; Fosket, 1994; Howell, 1998).
Cotiledones
Meristemo
radicular
Meristemo
apical
Radícula
Hipocotilo
Figura I.9.- Embrión maduro poco antes de la germinación. Obsérvese ya la formación completa de los
cotiledones, la radícula y el meristemo apical.
El desarrollo del embrión se encuentra bajo un estricto control genético. Ya en
etapas muy tempranas, se activan distintos programas de transcripción relacionados con
la formación del patrón del embrión maduro (Lu et al., 1996; Weterings et al., 2001; Friml
et al., 2002; Haecker y Laux, 2001) y se han aislado numerosas mutaciones en genes
involucrados en este proceso que generan importantes alteraciones estructurales
(Jürgens et al., 1994).
I.5.2.- Desarrollo a partir del meristemo apical del tallo.
En las plantas superiores, el desarrollo postembrionario se caracteriza por la
formación reiterativa de primordios de órganos que se desarrollan a partir de los flancos
de pequeñas estructuras denominadas meristemos. Los meristemos apical y radicular
Introducción 21
definen el eje primario de crecimiento (apical-basal) de la planta. Los nuevos meristemos
generan los ejes secundarios de crecimiento de la planta (ramificaciones) en los flancos
del meristemo apical o en las axilas de las hojas (Bowman, 1994; Evans y Barton, 1997;
Howell, 1998; Carles y Fletcher, 2003; Laux et al., 2003; Fig. I.10).
A
Meristemo apical
del tallo
B
Meristemos
axilares
E
J
E
P
R
I
M
A
R
I
O
Meristemo
apical
Órgano
lateral
Nudo
Entrenudo
Meristemos
radiculares laterales
Meristemo
radicular
FITÓMERO
Meristemo axilar.
Primordio o M. Lateral
Figura I.10.- Arquitectura de una dicotiledónea adulta. A) Representación de la estructura de una planta
superior indicando el eje primario de crecimiento y la localización de los meristemos. B) Crecimiento modular
a partir del meristemo apical (Tomada con modificaciones de Carles y Fletcher, 2003).
Cada unidad repetida, recibe el nombre de fitómero (Evans y Grove, 1940, citado
en Howell, 1998; Fig. I.10), siendo el plastocrono el intervalo de tiempo que transcurre
desde la aparición de un órgano lateral al siguiente. Esta medida puede variar en función
de las condiciones de crecimiento (Sharman, 1942, citado en Howell, 1998). Se han
descrito mutantes en los que la progresión del desarrollo durante esta etapa se ve
alterada (mutantes heterocrónicos). Estas estirpes se caracterizan por un enlentecimiento
en la aparición y desarrollo de las hojas (Poethig, 2003). Algunos genes implicados en
este proceso son SQUINT (SQN; Berardini et al., 2001), PAUSED (PSD; Hunter et al.,
2003; Li y Chen, 2003) y HASTY (HST; Telfer y Poethig, 1998; Bollman et al., 2003) en
Introducción 22
Arabidopsis thaliana; PLASTOCHRON1 en arroz (Miyoshi et al., 2004) o TEOPOD2 en
maíz (Bassiri et al., 1992).
En todos los meristemos, localizamos una población de células indiferenciadas y
totipotentes que actúan como reservóreo celular manteniendo su capacidad de división
durante todo el ciclo de vida de la planta, lo que permite la formación de los distintos
órganos (Fig. I. 10 y 11; Evans y Barton, 1997; Barton, 1998; Lenhard y Laux, 1999;
Bowman y Eshed, 2000; Doerner, 2000; Laux, 2003).
En Arabidopsis thaliana, el meristemo apical se genera durante la embriogénesis
(estadio globular), localizándose entre los primordios de los cotiledones. En la planta
adulta consta de alrededor de 60 células que presentan una pared celular fina y un
citoplasma muy denso, dispuestas como un montículo protegido por las hojas en
desarrollo. Su tamaño aumenta a medida que se desarrolla el primordio del órgano lateral
y finaliza el plastocrono (Medford et al., 1992; Fosket, 1994; Evans y Barton, 1997;
Howell, 1998; Carles y Fletcher, 2003).
Superficialmente, el meristemo apical parece una estructura homogénea, sin
embargo presenta una clara organización interna. Inicialmente podemos distinguir una
región externa denominada túnica, y otra más interna, el corpus. La túnica se compone de
dos capas celulares de distinto origen clonal denominadas L1 (externa) y L2 (interna). El
plano de división celular en estas capas es perpendicular a la superficie del meristemo
(división anticlinal). Las células L1 pueden permanecer en esta capa o bien diferenciarse
a células epidérmicas. Las células de la capa L2 originarán el mesófilo y la línea germinal.
El corpus lo compone la capa L3. Las células de esta capa pasarán a formar parte del
tallo y la vasculatura de la planta (Fig. I.11 C). No existe un patrón fijo del mantenimiento
del linaje celular entre las capas del meristemo apical ya que, ocasionalmente, se
producen invasiones de una capa hacia otra sin generar ningún defecto en el desarrollo
(Furner y Pumfrey, 1992; Irish y Sussex, 1992; Brand et al., 2001; Fletcher, 2002). Se
trata de una muestra más de que la adquisición de destino de una célula vegetal depende
de su posición y no del linaje celular del que procede (Poethig, 1989; Irish, 1991).
Yuxtapuesta a esta estructuración, existe un segundo nivel de organización que
divide al meristemo en tres regiones con distinta función: la zona central (ZC), la región o
zona periférica (ZP) y la zona medular (ZM). La zona central se caracteriza por presentar
una baja tasa de división. En ella se localizan las células meristemáticas totipotentes que
actuarán a modo de reservóreo celular de la región periférica (Fig. I.11 B-D, Barton, 1998;
Clark, 2001; Fletcher y Meyerowitz, 2001; Fletcher, 2002; Carles y Fletcher, 2003).
Introducción 23
A medida que las células de la zona central se incorporan a la región periférica, se
inicia su diferenciación. Estas células pasarán a formar parte de los primordios de los
órganos laterales o bien de los entrenudos, encontrando en ambos casos células
descendientes de las capas L1, L2 y L3. Estas células serán reemplazadas por células
totipotentes de la región central (Fig. I.11 D; Laufs et al., 1998; Brand et al., 2001; Carles y
Fletcher, 2002). Los primordios de hojas y flores aparecen alrededor del meristemo apical,
generando el denominado patrón de filotaxia a lo largo del eje próximo-distal. En
Arabidopsis, se disponen de forma helicoidal con un ángulo de separación de 137,5º
(Mitchison, 1977; Steeves y Sussex, 1989, citados en Reinhardt et al., 2003; Micol y Hake,
2003).
B
A
Primordio o
meristemo floral
Primordio
o meristemo floral
ZC
ZP
ZP
TÚNICA
C
ZM
CORPUS
ML o PR
MA
ML o PR
D
ZC
ZP
ZC
ZP
ZM
ZP
ZM
Células totipotentes
Epidermis
ZP
L1
L2
L3
Subepidermis
Figura I.11.- Estructura del meristemo apical del tallo en Arabidopsis thaliana. A) Las diferentes capas
celulares del meristemo apical. B) Regiones histológicas en el meristemo apical. C) Superposición de ambas
regionalizaciones indicadas en un corte longitudinal del meristemo apical de Arabidopsis thaliana. D)
Localización de la población de células totipotentes en el meristemo. (MA: Meristemo apical; ML: Mersitemo
lateral; PR: Primordio; ZC: Zona central; ZM: Zona medular; ZP: Zona periférica). Tomado con modificaciones
de Howell, 1998 (A); Fletcher y Meyerowitz, 2000 (C y D); Carles y Fletcher, 2003 y Clark, 2001 (D).
El intercambio de señales que se produce entre las distintas regiones del
meristemo apical, así como entre éste y el órgano lateral en formación, desempeñan un
importante papel en el crecimiento modular continuo que se observa en la parte aérea de
la planta, así como en la homeostasis celular del meristemo apical, procesos en los que
Introducción 24
intervienen un número considerable de genes (Bowman y Eshed, 2000; Brand et al.,
2001; Clark, 2001; Fletcher, 2002; Baurle y Laux, 2003; Carles y Fletcher, 2003).
I.5.2.1.- Mantenimiento de la población de células totipotentes en el meristemo.
La diferenciación de las células totipotentes meristemáticas, así como la
delimitación de la región que ocupan éstas en el meristemo, parece estar mediada por la
ruta de transducción de señales en la que participan los genes CLAVATA: CLAVATA1
(CLV1), CLAVATA2 (CLV2) y CLAVATA3 (CLV3). Las mutaciones en cualquiera de estos
genes provocan la aparición de rasgos fenotípicos muy similares. Los mutantes clv
presentan un desequilibrio en la homeostasis celular del meristemo, apareciendo un
excedente de células indiferenciadas totipotentes, normales en su morfología y tamaño,
en la zona central (Fig. I.13 A-D y G; Clark, 2001; Carles y Fletcher, 2003; Laux et al.,
2003).
La actividad de los genes CLV no radica en el control de la tasa de división celular,
sino en la delimitación de la región de células indiferenciadas (totipotentes) de la zona
central del meristemo. La acumulación de células en los mutantes clv se traduce en un
aumento notable del meristemo apical. Estos mutantes presentan un incremento en el
número de órganos laterales, tallos fasciados y mayor número de órganos florales,
típicamente carpelos (Clark et al., 1993; Clark et al., 1995; Kayes y Clark., 1998; Fletcher
et al., 1999; Brand et al., 2000; Carles y Fletcher, 2003; Laux et al. 2003).
La clonación de los genes CLV ha permitido determinar que se trata de
componentes de una ruta de transducción de señales extracelulares. El producto del gen
CLV1 codifica un receptor con un dominio kinasa intracelular (RLK, receptor-like kinase) y
una región extracelular rica en leucina (LRR; leucine-rich repeat; Clark et al., 1997), al
igual que el de CLV2 (Kayes y Clark, 1998). Sin embargo, CLV2 no presenta el dominio
kinasa intracelular. Se forman complejos CLV1-CLV1 o CLV1-CLV2 (Jeong et al., 1999).
CLV3 codifica un pequeño polipéptido de 96 aa que es secretado al espacio intercelular
(Fletcher et al., 1999). El transcrito de CLV3 se localiza en las capas L2 y L3. De otro
lado, la expresión de CLV1 se detecta, mayoritariamente, en la capa L3 de la zona central
solapando con el dominio de CLV3 (Clark et al., 1997; Fletcher et al., 1999). Se ha
propuesto que CLV3 es el interruptor de la ruta. Su unión a CLV1, y en mayor medida al
heterodímero CLV1-CLV2 (complejo activo, Fig. I.13 D), activa la ruta de transducción
(Trotochaud et al., 2000; De Young y Clark, 2001; Rojo et al., 2002; Lenhard y Laux,
2003).
Introducción 25
A
B
C
E
G
H
D
F
Figura I.12.- Fenotipo de los mutantes clv y wus. Micrografías de barrido (SEM) de meristemos apicales
(indicado por la flecha) en individuos silvestre (A), clv1 (C) y wus (E). Secciones longitudinales de meristemos
apicales del silvestre (B), clv1 (D) y wus (F). El meristemo apical en los mutantes clv se ve incrementado en
tamaño, al contrario que en wus. G) Planta adulta clv3. Se indica con una flecha el tallo fasciado y
alteraciones en el patrón de filotaxia. H) Planta adulta de wus, observando su crecimiento característico “stop
and go”. fa: flat apex (meristemo plano). Imágenes modificadas a partir de Laux et al. 1996 (H); Clark, 2000
(A); Schoof et al. 2000 (E) y Carles y Fletcher 2003 (B, D y F).
La existencia de genes similares a los CLAVATA en otras especies, como el caso
de FASCIATED EAR2 en maíz (Taguchi-Shiobara et al., 2001), sugiere la conservación
de esta ruta entre las angiospermas.
El gen WUSCHEL (WUS) codifica un factor de transcripción con homeodominio y
está implicado en la iniciación y localización de la población de células meristemáticas
indiferenciadas en el meristemo apical desde etapas embrionarias. Sus mutantes
presentan un crecimiento típico denominado stop and go (Fig. I.12 E, F y H) debido a la
iniciación del meristemo apical y una degeneración prematura, generando una estructura
típica en la planta con la aparición de grupos de hojas y meristemos de forma
desorganizada (Laux et al., 1996; Mayer et al., 1998). La expresión de WUS se restringe a
la capa L3 en la zona central (Fig. I.11). Se ha propuesto que WUS estaría actuando
como un centro organizador (CO), induciendo la totipotencia de las células localizadas por
encima de su dominio de expresión (Mayer et al., 1998). Las mutaciones wus son
epistáticas sobre las clv, lo que sitúa a WUS aguas arriba de la ruta de transducción de
los genes CLAVATA (Laux et al., 1996; Schoof et al, 2000). WUS promueve la división
celular ya que la expresión ectópica genera el crecimiento y división celular en zonas
Introducción 26
adyacentes a células que expresan WUS. Estas células adquieren características
meristemáticas debido a la inducción de la expresión de CLV3 (Gallois et al., 2002;
Lenhard y Laux, 2003).
D
A
COMPLEJO
INACTIVO
COMPLEJO
ACTIVO
B
POL
mRNA CLV3
Señal activa CLV
Proteína CLV3
Expresión WUS
Movimiento CLV3
Solapameinto entre
el mRNA de CLV3
y señal activa de
CLV
Expresión CLV1
?
MAPKs
C
WUS
WUS
Figura I.13.- Cascada de señalización de la ruta CLAVATA. A) Se indican aquellas células que expresan
CLV1, CLV3 y WUS en el meristemo apical. B) Dominios de expresión de CLV1, CLV3 y WUS así como el
movimiento de CLV3 y las zonas donde se localiza el complejo CLV activo. C) Representación esquemática
del meristemo de un mutante clv en el que se observa una expansión en el dominio de expresión de WUS. D)
Cascada de señalización con los componentes descritos hasta el momento de la ruta CLAVATA. Figura
realizada a partir de Clark, 2001 (C); Cock et al., 2002 (D); Carles y Fletcher, 2003 (D); Lenhard y Laux, 2003
(B), con modificaciones.
En los mutantes clv, la disminución de la señal de la ruta CLV conlleva una
expansión del dominio de expresión de WUS. De otra parte, la sobreexpresión de WUS es
Introducción 27
suficiente para generar una fenocopia de alelos clv y la expresión ectópica de CLV3
fenocopia el fenotipo Wus en fondo silvestre (Fig. I.13 C; Brand et al., 2000).
Este conjunto de efectos se debe a un intercambio de señales entre las células
meristemáticas y el centro organizador que está mediada por CLV3 y WUS a través de un
bucle de retroalimentación (Fig. I.13 D).
Otros elementos también participan en la ruta de señalización de CLV. KAPP
(kinase associated protein phosphatase; Stone et al., 1994, 1998) y una GTPasa de la
subfamilia RHO (RAS homology gene family; Li et al., 1998; 2001) interaccionan
directamente con el complejo activo del receptor CLV1/CLV2. (Fig. I.13 D; Trotochaud et
al., 1999). El mutante shepherd (shd) presenta un fenotipo similar al de los alelos débiles
clv (Ishiguro et al., 2002). SHD codifica un ortólogo de la chaperona GRP94 de mamíferos
por lo que es posible que esté implicado en la correcta asociación del complejo CLV
activo o modulando el plegamiento de las proteínas CLV (Ishiguro et al., 2002).
El gen POLTERGEIST (POL), cuyas mutaciones suprimen el fenotipo de los
mutantes clv, codifica una subunidad de una fosfatasa de localización nuclear (PP2C;
protein phosphatase 2C) de expresión ubicua en la planta (Yu et al., 2003). El análisis
genético indica que POL actúa aguas abajo de los genes CLV (Fig. I.13 D) y coopera con
WUS, ya que los dobles mutantes wus pol presentan aditividad de fenotipos (Yu et al.,
2000).
Se han identificado otros elementos que regulan la organización celular del
meristemo apical. Dos de estos factores son los genes FASCIATED1 (FAS1) y
FASCIATED2 (FAS2), implicados en la regulación de los meristemos apical y radicular
(Lesyer y Furner, 1992; Kaya et al., 2000) a través de la remodelación de la cromatina,
permitiendo la correcta expresión de WUS, entre otros genes (Kaya et al., 2000).
I.5.2.2.- Diferenciación de las células meristemáticas en los primordios de los
órganos laterales.
Los genes KNOX (KNOTTED-like HOMEOBOX) tienen como función en el
meristemo regular la diferenciación de las células. El gen KNOTTED1 (KN1) de maíz, fue
el primer factor de transcripción con homeodominio identificado en las plantas. Su
sobreexpresión provoca la aparición de zonas con crecimiento indiferenciado en las hojas
(Hake y Freeling, 1985; Vollbrecht et al., 1991). Su órtólogo en Arabidopsis thaliana es
SHOOTMERISTEMLESS (STM). Sus mutaciones generan fallos en el establecimiento del
meristemo apical. Las plántulas stm presentan sólo dos cotiledones sin producción de
Introducción 28
órganos laterales (Barton et al., 1993; Endrizzi et al., 1996; Long et al., 1996). Este gen se
expresa en todo el meristemo, manteniendo en estado indiferenciado las células y
reprimiendo aquellas funciones que promueven la determinación. Su modo de actuación
es independiente de CLV y WUS, aunque su actividad, junto con WUS, es necesaria en el
mantenimiento de elevados niveles de expresión de CLV3 en el ápice del meristemo
(Clark et al., 1996; Gallois et al., 2002; Lenhard et al., 2002).
Otros genes de la familia KNOX, KNAT1 (KNOTTED-like from ARABIDOPSIS
THALIANA1), KNAT2 y KNAT6, también se expresan en el meristemo apical y actúan de
forma redundante con STM, oponiéndose a la diferenciación de las células necesaria para
formar parte de los primordios de los órganos laterales (Ori et al., 2000). STM reprime en
el meristemo a ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) y ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2),
implicados en la diferenciación de los órganos, y restringen su expresión al primordio (Fig.
I.15). Por contra, los genes AS1 y AS2 reprimen en el primordio a los genes KNAT,
impidiendo el retorno al estado indiferenciado (Byrne et al., 2002). El gen AS1 codifica un
factor de transcripción de tipo Myb (Byrne et al., 2000) y AS2 codifica un hipotético factor
de transcripción que contiene una cremallera de leucina (Iwakawa et al., 2002; Xu et al.,
2002).
Meristemo apical
PHAB + PNH
PHAB + PNH + AS1
YAB + AS1
PHAB + PNH +
YAB + AS1
P
AS1
YAB
STM
P
P
Giberelinas
PHAB
AS1
KNAT1
KNAT2
YAB
Figura I.14.- Organogénesis desde el meristemo apical. Se indican los dominios de expresión en distintos
colores señalando las interacciones que tienen lugar en el establecimiento de patrón en las células que
conformarán los primordios. P: primordios. AS1: ASYMMETRIC LEAVES 1; KNAT1: KNOTTED-like from
ARABIDOPSIS THALIANA1; KNAT2: KNOTTED-like from ARABIDOPSIS THALIANA2; PHAB: PHABULOSA;
PNH: PINHEAD; STM: SHOOTMERISTEMLESS; YAB: YABBY. Realizado a partir de Veit (2004).
AS2 pertenece a la familia de genes LOB, que codifican factores de transcripción
específicos de plantas (LATERAL ORGAN BOUNDARIES; Lin et al., 2003), también
implicados en el intercambio de señales entre el meristemo y el primordio de los órganos
Introducción 29
(Shuai et al., 2003) junto con PICKEL (PKL, Ogas et al., 1999). Otros elementos
importantes son los factores de transcripción con homeodominio y cremallera de leucina
de la clase III (HD-Zip III) PHABULOSA (PHB McConnell y Barton, 1998) y PHAVOLUTA
(PHV; McConnell et al., 2001) o los genes pertenecientes a las familias YABBY (Kumaran
et al., 2002) o KANADI (KAN; Kerstetter et al., 2001). Las fitohormonas giberelinas
(Sakamoto et al., 2001; Fig. I.14) y auxinas (Leyser, 2003) también tienen un papel
relevante en este proceso.
I.5.3.- Transición de la etapa vegetativa a la reproductiva. Inducción floral.
Las plantas con flores inician su desarrollo con un periodo de crecimiento
vegetativo. En Arabidopsis thaliana, esta fase consiste en la producción, de forma
reiterativa, de hojas sin alargamiento de los entrenudos. Cuando las condiciones son
favorables, se activan distintos mecanismos que dan lugar a un gran cambio en el modo
de desarrollo de la planta. Se inicia la fase de crecimiento reproductivo. A este conjunto
de cambios se le denomina transición floral. El meristemo apical varía su morfología y
sufre una reprogramación que desencadena su transformación en meristemo de
inflorescencia. A partir de éste se desarrollarán los meristemos florales, que finalmente
darán lugar a las flores. En plantas como Arabidopsis thaliana, en las que las flores se
desarrollan en una inflorescencia, se producen dos transiciones: una que genera la
formación del meristemo de inflorescencia seguida de la que induce la producción de
flores. En ambas los mecanismos genéticos que subyacen difieren y se pueden distinguir
(Lyndon, 1990; Fosket, 1994; Howell, 1998).
El análisis genético, molecular y fisiológico de un largo número de mutantes en
Arabidopsis thaliana con alteraciones en la transición de la fase vegetativa a la
reproductiva, ha permitido la disección de diversas rutas de señalización que responden
tanto a factores externos como endógenos de la planta. Se ha podido determinar la
existencia de cuatro rutas principales que median la transición hacia la etapa reproductiva.
Una de ellas está mediada por la temperatura (vernalización), otra por la luz (fotoperiodo),
una tercera por las hormonas vegetales giberelinas y la última la constituye la ruta
autónoma (Martínez-Zapater y Somerville 1990; Blázquez et al., 2001; Mouradov et al.,
2002; Simpson y Dean, 2002). Existen evidencias de la interconexión entre estas vías,
que confluyen finalmente en los denominados “elementos integradores de la floración”,
como por ejemplo FLOWERING LOCUS C (FLC), un factor de transcipción de la familia
MADS que actúa como represor de la floración (Moon et al., 2003). Los genes de la ruta
Introducción 30
autónoma actúan reduciendo la cantidad de transcrito de FLC (Michaels y Amasino, 1999,
2001; Sheldon et al., 2000). Los mutantes en estos genes, presentan un fenotipo de
floración tardía.
La regulación postranscripcional durante la transición floral adquiere gran
relevancia (Cheng y Chen, 2004). Muchos de los productos codificados por los genes
implicados en la regulación del tiempo de floración presentan dominios de unión a RNA.
FLOWERING LOCUS K (FLK) codifica una proteína con dominios KH (Lim et al., 2004);
FY está involucrado en el procesamiento de la región 3’ del mRNA de FCA (Simpson et
al., 2003), FPA y FCA codifican proteínas con motivos de reconocimiento de RNA (RRM;
Recognition RNA Motifs), ejerciendo este último la autorregulación del procesamiento de
sus intrones (MacKnight et al., 1997; Schomburg et al., 2001; Quesada et al., 2003).
I.5.4.- Desarrollo floral.
I.5.4.1.- El meristemo floral.
A partir del meristemo de inflorescencia, se desarrollan los meristemos florales.
Ambos son muy similares en estructura pero muestran una diferencia fundamental entre
ellos. El meristemo floral es determinado y tras producir un número finito de órganos se
detiene su crecimiento. Esto implica el cese de la actividad de las células meristemáticas
indiferenciadas y su incorporación a los primordios de los órganos florales (Okamuro et
al., 1996; Pouteau et al. 1997; Washburn y Thomas 2000; Zik y Irish, 2003).
A
B
Meristemo de Inflorescencia
Meristemo floral
Figura I.15.- Meristemos de inflorescencia y floral en Arabidopsis thaliana. A) Microscopía electrónica de
barrido de un meristemo de inflorescencia, rodeado por meristemos florales. B) Sección longitudinal de una
flor en desarrollo donde se pueden observar los primordios de los órganos florales. Se: sépalos; Pe: pétalos;
St: estambres; Ca: carpelos. Figuras tomadas con modificaciones de Lenhard y Laux, 1999 (A), y Carles y
Fletcher, 2003 (B).
Los meristemos florales se desarrollan alrededor del meristemo de inflorescencia
(Fig. I.15 A). En los primeros, los primordios de los órganos florales se disponen de forma
Introducción 31
concéntrica a lo largo del eje central del meristemo, en los denominados verticilos, que
darán lugar a los órganos florales (sépalos, pétalos, estambres y carpelos; Fig. I.15 B;
Steeves y Sussex, 1989; Carpenter et al., 1995; Fletcher, 2003).
En Arabidopsis thaliana, la determinación del meristemo floral, así como la
especificación de la identidad de ciertos órganos florales, dependen en gran medida de la
actividad del gen AGAMOUS (AG), un factor de transcripción de tipo MADS (Bowman et
al., 1989; Yanofsky et al., 1990). La existencia de varios ortólogos en otras especies
indica la conservación de su función entre las angiospermas (Pnueli et al., 1994; Mena et
al., 1996; Yu et al., 1999; Washburn y Thomas, 2000; Kapoor et al., 2002). La actividad de
AG parece ser suficiente para conferirle al meristemo floral su naturaleza determinada
(Mizukami y Ma, 1997).
La expresión de AG se inicia en etapas muy tempranas del desarrollo floral,
restringiéndose al ápice del meristemo (Fig. I.16 A y B), en las células que formarán los
estambres y los carpelos (Drews et al., 1991). La regulación del patrón de expresión de
AG recae sobre WUS y LEAFY (LFY). Conjuntamente, activan la transcripción de AG (Fig.
I.16 A) uniéndose de forma independiente a secuencias reguladoras adyacentes (Hempel
et al., 1997; Hempel et al., 2000; Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001).
AG
A
AP1
+WUS
AP1
+WUS
AP3
LFY +UFO
LFY
B
AG
C
D
Figura I.16.- Interacciones génicas en el meristemo floral. A) y B) Expresión e interacciones génicas que se
producen durante la determinación del meristemo floral. C) y D) Relaciones génicas producidas durante el
mantenimiento de la identidad del meristemo floral y la inducción de la formación de los primordios. AG:
AGAMOUS; AP1: APETALA1; AP3: APETALA3; LFY: LEAFY; UFO: UNUSUAL FLOWER ORGANS; WUS:
WUSCHEL. A partir de Carles y Fletcher, 2003 (A y B) y Zik y Irish, 2003 (B y D).
Un vez activada la expresión de AG, éste reprime la expresión de WUS a través de
una vía, en parte, independiente de la ruta CLAVATA, lo que limita su expresión a la
Introducción 32
región central. Por tanto, la determinación del meristemo depende de una activación
progresiva de la expresión de AG que da lugar a la represión de WUS (Fig. I.16 C y D;
Busch et al., 1999; Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001).
Mientras que WUS se expresa tanto en el meristemo vegetativo como en el
meristemo floral, LFY es específico del meristemo floral. Su expresión se inicia durante la
etapa de transición floral y se mantiene durante todo su desarrollo, induciendo la
expresión de genes implicados en la formación de los órganos florales (Fig. I.17; Weigel et
al., 1992; Mayer et al., 1998; Wagner et al., 1999; Blázquez y Weigel, 2000; Lohmann et
al., 2001).
I.5.4.2.- Genes de identidad de los órganos florales. Modelo ABC.
Quizás uno de los procesos más estudiados en Arabidopsis thaliana sea el
desarrollo floral, por lo que muchas de las actividades génicas que regulan este proceso
han sido identificadas (Weigel, 1995).
Tal como sucede con los factores de transcripción HOM/Hox, que controlan la
identidad de estructuras durante el desarrollo animal (Castelli-Gair, 1998; Verakasa et al.,
2000), existe un conjunto de reguladores transcripcionales que determinan la identidad de
cada uno de los órganos en los cuatro verticilos de la flor (Wolpert et al., 1998). Las
variaciones en los niveles o en los patrones de expresión de estos genes provocan la
transformación homeótica de órganos florales. El análisis genético de estos mutantes en
Arabidopsis thaliana y Antirrhinum majus permitió elaborar el modelo ABC, considerado
hoy en día uno de los dogmas de la Biología del desarrollo vegetal (Carpenter y Coen,
1990; Bowman et al., 1991; Coen y Meyerowitz, 1991; Meyerowitz et al., 1991; Coen,
1992; Weigel y Meyerowitz, 1994). La validez del modelo se pone de relieve debido a que
ha podido ser exportado a otras angiospermas, tanto monocotiledóneas como
dicotiledóneas (Ambrose et al., 2003; Fornara et al., 2003).
El modelo propone que la combinación de tres actividades A, B y C especifica
cada uno de los órganos florales de los verticilos (Fig. I.17). La actividad A especifica los
sépalos, A + B los pétalos, B + C los estambres y solamente C los carpelos (Fig. I.17 B y
C). El modelo propone que las actividades de A y C se excluyen mutuamente. En
ausencia de C, la actividad A está presente en toda la flor, y viceversa, no viéndose
afectada la función B. En ausencia de la función C, el meristemo floral se transforma en
indeterminado generando una repetición continua de órganos con alternancia de sépalos
y pétalos (Fig. I.17 D).
Introducción 33
AEstambres
C
Estigma
Carpelos
Pétalos
Sépalos
Pedicelo
B
D
E
F
G
H
Figura I.17.- Modelo ABC. A) Flor silvestre de Arabidopsis thaliana donde se indican los órganos florales. B)
Esquema del modelo ABC. Se indican los verticilos en una sección transversal de una flor silvestre de
Arabidopsis thaliana. Las funciones A y C se excluyen mutuamente. C) Representación del modelo ABC en la
flor de Arabidopsis thaliana. La función A está implicada en la formación de sépalos (primer verticilo); A + B
forman pétalos (segundo verticilo); B + C estambres (tercer verticilo) y sólo C, carpelos (cuarto verticilo). se:
sépalos; pe: pétalos; st: estambres; ca: carpelos. Flores de los mutantes ag (D); ap1 (E); ap2 (F); ap3 (G) y pi
(H). B y C tomado de http://www.salk.edu/labs/pbio-w/gallery.html y modificado.
En Arabidopsis thaliana los genes APETALA1 (AP1) y APETALA2 (AP2)
pertenecen a la clase A (Irish y Sussex, 1990; Bowman et al., 1993). El gen AP1 codifica
un factor de transcripción de tipo MADS (Mandel et al., 1992) y actúa, junto con AG, WUS
y LFY confiriendo identidad al meristemo floral (Fig. I.17 A y C). Inicialmente se expresa
en todo el meristemo y en etapas posteriores se restringe su expresión al primer y
segundo verticilo (sépalos y pétalos). AP2 también está implicado en la regulación de la
identidad del meristemo floral, así como en el desarrollo de la semilla. Codifica una
proteína de unión a DNA de tipo EREBP (Ethylene Responsive Element Binding Protein;
Riechmann y Meyerowitz, 1998). AP2 regula negativamente a AG, restringiendo su
Introducción 34
expresión al tercer y cuarto verticilo, de acuerdo con el modelo. Sin embargo, aún
presentando un papel en el primer y segundo verticilo, el transcrito de AP2 se localiza en
los cuatro verticilos, lo que supondría una excepción a la regla del modelo.
Rrecientemente se ha descrito su regulación postranscripcional mediante microRNA
(miRNA). El microRNA miR172 se localiza en el tercer y cuarto verticilo e impide la
traducción del transcrito de AP2, apoyando el modelo ABC (Chen, 2004; Jack, 2004). Con
AP2 cooperan otros factores que, en su conjunto, regulan negativamente la expresión de
AG en los verticilos uno y dos (Klucher et al., 1996; Krizek et al., 2000).
Los genes de la clase B en Arabidopsis thaliana, APETALA3 (AP3) y PISTILLATA
(PI) especifican identidad de pétalos y estambres en el meristemo floral. Codifican
factores de transcripción de tipo MADS que pueden formar heterodímeros entre sí (Jack
et al., 1992; Riechmann et al., 1996). El complejo AP3-PI se une a regiones promotoras
de AP3 manteniendo sus niveles y patrón de expresión (Hill et al., 1998; Tilly et al., 1998;
Honma y Goto, 2000). El gen SUPERMAN (SUP) también presenta un papel en la
especificación de función B. Su actividad es necesaria para el mantenimiento de la
expresión de AP3. La desregulación de PI y/o AP3 genera la formación de pétalos y
estambres en cualquier parte de la flor (Fig. I.17 G y H; Jack et al., 1992; Goto y
Meyerowitz, 1994; Krizek y Meyerowitz, 1996).
El gen de la clase C, AG en Arabidopsis thaliana, se expresa en el tercer y cuarto
verticilo, confiriendo la identidad de carpelo y estambre. La expresión ectópica de AG es
suficiente para la formación de carpelos y estambres en el primer y segundo verticilo, (Fig.
I.18 D). Algo similar sucede en los mutantes ap2, donde AG se encuentra desreprimido
(Mandel et al., 1992; Mizukami y Ma, 1995; Mizukami y Ma, 1997; Jack, 2004).
I.5.4.2.1.- Redefinición del modelo. Genes de la clase E.
Recientemente, se ha descrito un cuarto grupo de mutantes que son capaces de
transformar tejidos florales en tejidos vegetativos. Los genes de tipo MADS box
SEPALLATA (SEP1, SEP2 y SEP3; Pelaz et al., 2000; Pelaz et al., 2001a) son
redundantes, por lo que sólo el triple mutante muestra un fenotipo claro que consiste, en
la formación únicamente de sépalos (Fig. I.18 B). Este rasgo indica que la función de los
genes SEP es necesaria en la determinación de la identidad de pétalos, estambres y
carpelos. De este resultado se deduce que los genes de las clases B y C necesitan de la
actividad de los genes SEP para realizar su función. De otra parte, la sobreexpresión de
Introducción 35
estos genes en combinación con genes de la regla ABC genera una transformación de
hojas vegetativas en órganos florales (Honma y Goto, 2001; Pelaz et al., 2001b).
A
Reguladores del meristemo floral
B
Genes del patrón ABC
Formación de complejos multiproteicos
Generación de la identidad de
los órganos florales
Figura I.18.- Revisión del Modelo ABC. Inclusión de la función de los genes SEP (función E) en el modelo
ABC. Inicialmente los genes LFY, UFO y WUS se expresan en dominios específicos del meristemo floral. Esta
expresión desencadena la activación de genes implicados en la determinación de la identidad de cada órgano
floral. Esto junto con la represión de AP1 por AG, da lugar al patrón ABC en la flor. La función de los genes
SEP se restringiría al segundo, tercer y cuarto verticilo, colaborando en la generación de identidad. Se cree
que las proteínas SEP forman complejos proteicos con los productos de los genes de identidad B y C. AG:
AGAMOUS; AP1: APETALA1; AP3: APETALA3; LFY: LEAFY; PI: PISTILLATA; SEP: SEPALLATA; UFO:
UNUSUAL FLORAL ORGANS; WUS: WUSCHEL. Se. Sépalos; Pe: Pétalos; St: Estambres; Ca: Carpelos.
El descubrimiento de la importancia de los genes SEP ha provocado la revisión del
modelo ABC (Fig. I.18 A), incorporando su participación. Los genes SEP han pasado a
denominarse genes de la clase E (Goto et al., 2001; Theissen, 2001; Theissen y Saedler,
2001; Jack, 2004).
I.5.5.- Desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana.
Durante las últimas dos décadas el estudio del desarrollo floral ha experimentado
un gran avance, gracias al análisis genético y molecular de diversos mutantes afectados
Introducción 36
en el proceso (Ma, 1994). El conocimiento es mucho menor acerca de los genes
implicados en la regulación del crecimiento, diferenciación y forma de estos órganos
florales una vez ya formados. Sin embargo, en los últimos años se ha aislado un número
considerable de mutantes que está permitiendo comenzar a comprender el desarrollo del
gineceo (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999).
I.5.5.1.- Estructura del fruto en Arabidopsis thaliana.
Anatómicamente se define a un fruto como un ovario maduro que típicamente
incluye, de forma total o parcial, tejidos correspondientes a los carpelos. El fruto es un
órgano altamente especializado y complejo desde el punto de vista histológico y funcional,
y presenta distintas formas dentro de las angiospermas. Su función final es albergar y
proteger a los óvulos y semillas durante su desarrollo, para su posterior dispersión
(Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999).
A
Estigma
Estilo
Valvas
Ovario
B
Estg
Estl
O
v
a
r
i
o
Replum
Entrenudo
Nectarios
Figura I.19.- Morfología del fruto de Arabidopis thaliana. A) Microscopía electrónica de barrido de un fruto
silvestre (estadio 13) de Arabidopsis thaliana en el que se indican las distintas regiones del fruto que se
observan externamente. B) Secciones longitudinales de un fruto polinizado. En la parte inferior de cada
sección histológica se representa un dibujo con la localización del eje de corte. (Estg.: estigma; Estl.: estilo).
Figuras tomadas de Ferrándiz, 2002 (A) y Bowman et al., 1999 (B) con modificaciones.
El fruto de Arabidopsis thaliana, al igual que el de las más de 3.000 especies de
Brasicáceas, es una silicua. Su morfología es muy similar a la que presentan los frutos de
otras familias como las leguminosas. En Arabidopsis, los frutos se desarrollan a partir de
Introducción 37
un gineceo bicarpelar. Tras la polinización, en la etapa de antesis, podemos distinguir el
estigma, el estilo, el ovario y el ginóforo o entrenudo (Fig. I.19 A). En el estigma
encontramos
unas
células
epidérmicas
alargadas
que
constituyen
las
papilas
estigmáticas. Su función es la adhesión de los granos de polen y promover su
germinación para la fecundación de los óvulos (Kandasamany et al., 1994). Este tejido es
rico en polisacáridos y guía el crecimiento del tubo polínico (Ferrándiz et al., 1999; Fig.
I.19 B ).
El estilo se localiza entre el estigma y el ovario. Presenta una simetría radial, y en
su interior se distingue una zona central, por la que discurre el tracto transmisor rodeado
por el clorénquima. Su superficie la forma una única capa epidérmica con células
cuadrangulares entre las que se encuentran estomas (Sessions y Zambrisky, 1995). En el
estilo se desarrolla una corona de haces vasculares correspondientes al xilema y al
floema (Fig. I.19 B).
El ovario de Arabidopsis thaliana está formado por dos carpelos fusionados
postgenéticamente, que en el fruto maduro derivan en las valvas y los repla (singular,
replum; Bowman et al., 1999). Internamente, el ovario se divide en dos lóculos laterales
mediante un falso septum, ya que no se corresponde con las paredes laterales de los
carpelos fusionados, sino con extensiones de sus márgenes. A lo largo de la capa interna
del septum, discurre el tracto transmisor (Fig. I.22).
A
B
Figura I.20.- Células de la superficie de la valva y del replum en los frutos de Arabidopsis thaliana. A) Vista
lateral de un fruto silvestre de Arabidopsis thaliana en el que se pueden observar las diferencias de tamaño y
morfología entre las células del replum y de la valva, en la que aparecen estomas. B) Detalle de la aparición
de estomas en las valvas. Barras de escala 100 µm.
Las células del replum son mucho más compactas y pequeñas; las de la valva son
de mayor tamaño y poseen estomas entre ellas (Fig. I.20). Tras la maduración del fruto, la
Introducción 38
zona de dehiscencia que se interpone entre ambas regiones se lignifica. Las valvas y el
replum se separan dando lugar a la dispersión de las semillas (Fig. I.21; Ferrándiz, 2002).
A
B
valva
Figura I.21.- Dehiscencia de los frutos. A) Fruto cerrado. B) Dehiscencia en el fruto. Las flechas indican la
dirección de separación de las valvas. Las regiones coloreadas indican lignificación durante el desarrollo final
del fruto. ena: endocarpo interno; enb: endocarpo externo. DZ: zona de dehiscencia; LC: capa de células
lignificadas en el margen de la valva. SL: Zona de separación. Tomado y modificado de Ferrándiz, 2002.
En la valva podemos distinguir 6 capas celulares (Fig. I.22). Desde la más externa
a la más interna encontramos la epidermis abaxial o exocarpo, formada por células
alargadas, entre las que se localizan estomas. Estas células se encuentran recubiertas
por ceras. Por debajo de esta capa encontramos el mesocarpo compuesto por el
clorénquima, constituido por tres capas de células isodiamétricas de pequeño tamaño. A
través de estas capas, se desarrollan haces vasculares que finalizan en la zona del estilo
formando una “corona”.
La zona más interna, el endocarpo o epidermis adaxial, la conforman dos capas de
células que presentan distinta morfología y disposición. La capa más interna (ena, Fig.
I.22) está formada por células isodiamétricas de pared fina y alargadas en el plano lateral.
Las células de la subepidermis adaxial (enb; Fig. I.22) son de menor tamaño y están más
empaquetadas, alargándose longitudinalmente (Kandasamany et al., 1994; Ferrándiz et
al., 1999).
En el interior del ovario, los óvulos están dispuestos longitudinalmente en cuatro
filas entre la intersección de la valva y el septum. Los funículos son las estructuras
encargadas de conectar a los óvulos con el tejido de la placenta. El óvulo presenta una
estructura compleja, formada por la nucela, en la cual se encuentra el saco embrionario,
Introducción 39
que, a su vez, queda englobada por dos integumentos y el funículo (Bowman, 1994;
Bowman et al., 1999).
Por último, el ginóforo o entrenudo, es la zona encargada de conectar el gineceo
con el receptáculo floral (Fig. I.19 A; Bowman et al., 1999).
Figura I.22.- Sección tranversal de un fruto en
antesis. Se indican las distintas capas
celulares. ex: exocarpo; ms: mesocarpo; enb:
capa más externa del endocarpo; ena: capa
interna del endocarpo. En cada uno de los dos
lóculos (lc) se observan los óvulos (o) en
desarrollo. El tracto transmisor (tt) se localiza
en la zona media del septum (sp). Se indica la
localización de los vasos laterales (lv) en las
valvas, y los medios (mv) en el replum (rp).
Barra de escala 50 µm. Tomado de Ferrándiz
et al., 1999.
I.5.5.2.- Estadios de desarrollo del gineceo y del fruto de Arabidopsis thaliana.
La morfogénesis floral se divide en distintos estadios atendiendo a las
características morfológicas que presenta durante su desarrollo (Fig. I.23; Smyth et al.,
1990; Sessions, 1997; Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999; Ferrándiz, 2002).
Inicialmente, desde la formación del meristemo floral hasta la antesis, se describen 13
estadios de desarrollo. Posteriormente, tras la fertilización, siguen 7 etapas hasta culminar
con la deshiscencia del fruto (Fig. I.23). En la Tabla I.2 se recogen estas etapas haciendo
mención a los rasgos más característicos de cada una de ellas.
Introducción 40
Tabla I.2.- Estadios de desarrollo floral asociados al desarrollo del gineceo.
Estadio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Rasgos morfológicos en la flor
Inicio de la formación del
meristemo floral.
Separación del meristemo floral
del tallo y la inflorescencia.
Aparición de los primordios
de los sépalos.
Los sépalos recubren el
meristemo floral.
Aparición de los primordios
de pétalos y estambres.
Los sépalos encierran las
yemas de los primordios.
Crecimiento de los estambres.
Aparecen los lóculos en los
estambres
Los primordios de los pétalos
se estrechan en la base.
Los pétalos se sitúan por
encima de los estambres
Las papilas estigmáticas
inician su desarrollo.
Los estambres se sitúan por
encima de los pétalos.
Antesis.
Rasgos morfológicos en el gineceo
Se inicia la formación del gineceo con la
aparición de los primordios de los carpelos.
Alargamiento del pistilo
como un cilindro hueco.
Diferenciación de los vasos y del tejido
de la placenta.
Aparece el primordio del óvulo. Cada carpelo
se diferencia en endocarpo, mesocarpo, y
exocarpo.
El gineceo se cierra por su parte apical.
Formación del septum
El estilo se diferencia del resto del ovario.
El endocarpo se diferencia en dos capas
(ena y enb). Desarrollo del funículo en el
óvulo.
Crecimiento general del fruto. El tracto
transmisor se diferencia.
Polinización.
Etapas tras la fertilización
14
15
16
17 A
Las anteras se extienden por el
estigma.
El estigma crece entre
las anteras.
Senescencia de pétalos y
sépalos.
Caída de sépalos, pétalos y
estambres.
17 B
18
Crecimiento final de la silicua.
Amarilleamiento de la silicua
(inicio de la senescencia).
19
20
Separación de las valvas de la silicua.
Dispersión de las semillas.
Fertilización. Se observa la sutura entre las
valvas y el replum (zona de dehiscencia).
Lignificación del xilema.
Crecimiento general del fruto.
Las células de la capa enb se desarrollan en
esclerénquima. El exocarpo desarrolla una
cutícula.
La capa enb inicia su lignificación.
La capa ena desaparece. Se completa la
lignificación de la capa enb. El mesocarpo se
deshidrata.
Introducción 41
Figura I.23.- Estadios de desarrollo
fruto tras la fertilización. Tomado
Ferrándiz et al., 1999. En la base
cada fruto se indica el estadio
desarrollo que se corresponde con
que se describen en la Tabla I.2.
del
de
de
de
los
I.5.5.3.- Genes implicados en el desarrollo del fruto en Arabidopsis thaliana.
Muy pocos son los genes cuyas mutaciones afectan sólo al desarrollo del pistilo o
del fruto. La inmensa mayoría de los genes están implicados en diferentes vías de
desarrollo. Evolutivamente, los frutos derivan de meristemos vegetativos (Lenhard et al.,
2001, Lohmann et al., 2001) y de hojas modificadas (Bowman et al., 1999), por lo que es
normal que genes implicados en la formación y desarrollo de éstos puedan participar en la
morfogénesis del fruto. El grado de redundancia funcional que sugiere el análisis de los
distintos genomas secuenciados (Mewes et al., 1997) y, en concreto, el de Arabidopsis
thaliana (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), también puede contribuir a esta
situación (Bowman et al., 1999).
La mayoría de los genes que, directa o indirectamente, ejercen una función
durante el desarrollo del fruto, poseen actividades reguladoras de la expresión génica o
son elementos de una ruta de transducción de señales (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et
al., 1999).
I.5.5.3.1.- AG: un gen clave en la especificación de los carpelos.
La pérdida de función de AG genera la pérdida completa de los carpelos en el fruto
(I.5.3.2.), generándose un patrón reiterativo de sépalos y pétalos. Los estudios de
sobreexpresión indican que AG es suficiente para la especificación de los carpelos
(Mandel et al., 1992). Los sépalos adquieren una morfología carpeloide y los pétalos
Introducción 42
presentan rasgos de estambres, una fenocopia de los mutantes ap2 (Mizukami y Ma,
1992).
Durante el desarrollo del gineceo, el transcrito de AG se detecta en los estambres
y carpelos, consistentemente con el fenotipo observado. Durante el estadio 9 la expresión
de AG se hace patente en el óvulo, y a medida que se desarrolla el fruto disminuye en
gran medida su expresión en el ovario, el estilo y la placenta, al contrario que en las
papilas estigmáticas y el óvulo en desarrollo (Bowman et al., 1991; Ferrándiz et al., 1999).
I.5.5.3.1.1.- Nuevos miembros de la ruta de AG. Genes HUA y HEN.
Durante el escrutinio de elementos intensificadores del fenotipo de un alelo débil
de ag (ag-4), se identificaron nuevos elementos que actúan de forma redundante en la
ruta de AG. Las mutaciones en los genes HUA1 y HUA2 provocan un aumento en el
fenotipo de las plantas ag-4, como consecuencia de una pérdida de identidad carpelar,
siendo similar el fenotipo al de los alelos fuertes (ag-1, Chen y Meyerowitz, 1999). Ambos
genes codifican proteínas nucleares. HUA1 codifica una proteína CCCH con dedos de
zinc, capaz de unirse a ácidos nucleicos de cadena simple (Liu et al., 2001). Por su parte
HUA2 codifica una proteína con un hipotético dominio activador de la transcripción sin
ninguna similitud con otras proteínas de las bases de datos (Chen y Meyerowitz, 1999).
Los mutantes simples hua1 o hua2 sólo muestran fenotipo cuando les acompaña la
mutación ag, (Chen y Meyerowitz, 1999). Los individuos hua1 hua2 presentan una
transformación débil de estambre a pétalo y de carpelo a sépalo y sus frutos se engrosan
en el ápice. Estas plantas muestran otras alteraciones en el crecimiento general de la
planta que indican su participación en el desarrollo vegetativo y que no se restringen al
desarrollo floral. De acuerdo con un fenotipo pleiotrópico, los RNA de HUA1 y HUA2 se
localizan en distintos órganos (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001; Jack, 2002).
Sobre un fondo hua1 hua2 se identificaron mutaciones intensificadoras del fenotipo
de este doble mutante, produciendo fenotipos similares a ag. En todos los casos, los
genes correspondientes a las mutaciones hen1, hen2 y hen4 (hua enhancer 1, 2 y 4)
codifican elementos implicados en el metabolismo de RNA.
Los mutantes hen2 presentan alteraciones en el patrón de filotaxia y un aumento
en el número de flores en la inflorescencia. Teniendo en cuenta las alteraciones
fenotípicas que presenta hen2 en combinación con hua1 y hua2, se le asigna a HEN2 una
papel en el mantenimiento de las funciones B y C. HEN2 codifica una helicasa de tipo
DexH (Western et al., 2002).
Introducción 43
La mutación hen1 provoca, en un fondo hua1 hua2, una pérdida de la función C
que genera trasformaciones homeóticas similares a las de plantas ag. Las plantas hen1
presentan fenotipos vegetativos, como por ejemplo hojas incurvadas (Chen et al., 2002).
El gen HEN1 codifica una proteína que junto con CARPEL FACTORY regula el
metabolismo de miRNA implicados en el silenciamiento postranscripcional (Park et al.,
2002; Boutet et al., 2003). Se supone que la ausencia de determinados miRNA en hen1
podría ser la causa de la pérdida de especificación de la identidad de órganos florales,
como sucede en la regulación del transcrito de AP2 por el miRNA miR172 (Chen, 2004).
Los individuos hua1 hua2 hen4 muestran transformaciones de estambres a
pétalos. El gen HEN4 codifica una proteína nuclear con dominios KH de unión a RNA
(Cheng et al., 2003). La localización conjunta de HEN4, HUA1 y, quizá HEN2, inclina a
pensar que actúan regulando el procesamiento del mRNA de AG. Por esta razón, la
ausencia de HEN4 y HUA1 genera una disminución del transcrito correctamente
procesado y sin intrones de AG, lo que provoca la aparición del fenotipo mutante (Cheng
et al., 2003). En la Figura I.24 se muestran los fenotipos de distintas combinaciones
mutantes.
A
E
B
F
C
D
Figura I.24.- Fenotipos de los mutantes involucrados en la
ruta de AG. A) ag-1. B) ag-4. C) ag-4 hua1 hua2. D) hua1
hua2 hen1. E) hua1 hua2 hen2. F) De izquierda a derecha
hua1 hua2; hua1-1 hua2-1 hen4-1; hua1-1 hua2-1 hen4-2.
En determinadas combinaciones mutantes se ve alterada
la morfología del fruto o se producen transformaciones
homeóticas. Figuras tomadas de Chen y Meyerowitz, 1999
(B y C); Chen et al., 2002 (D); Western et al., 2002 (E) y
Cheng et al. 2004 (F).
I.5.5.3.2.- FRUITFULL: un gen que determina la identidad de la valva.
El gen FRUITFULL (FUL) fue previamente identificado por su similitud con AG
(AGAMOUS-LIKE8, AGL8, Mandel y Yanofsky, 1995). Sus mutaciones de pérdida de
Introducción 44
función interfieren con el desarrollo apropiado de las células de la valva (Gu et al., 1999),
sin afectar a otras regiones del fruto. Estos fallos en la diferenciación de las células de la
valva se pueden detectar ya durante la etapa de desarrollo del pistilo, aunque estas
anomalías se acentúan tras la fertilización y el desarrollo posterior. En los mutantes ful,
las células de la valva no se alargan tras la fertilización, dando lugar a un fruto pequeño
repleto de semillas viables pero de pequeño tamaño. En estos mutantes, tanto el septum
como el replum continúan su normal desarrollo, adquiriendo éste un típico crecimiento en
zig-zag como consecuencia de la falta de alargamiento del fruto (Gu et al., 1999). La
expresión de FUL se localiza en todas las capas celulares de la valva.
El mutante ful no presenta una pérdida total de la valva, sino una alteración en la
maduración de ésta. Además, la sobreexpresión de FUL no es suficiente para conferir
identidad de valva en otros tejidos del fruto, con la excepción del replum. Estos hechos
ponen de manifiesto, simultáneamente, el papel de FUL en la identidad de la valva y el
requerimiento de otros factores que han de estar presentes para que se pueda llevar a
cabo esta transformación (Ferrándiz et al., 2000).
A
B
Figura I.25.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ful-1. A) fruto silvestre
de Arabidopsis thaliana (estadio 13). B) ful-1 (estadio 17). Barras de
escala en A 500 µm y en B 100 µm.
El solapamiento en los patrones de expresión de FUL y AG en el cuarto verticilo, la
necesidad de AG en la correcta formación del carpelo y la expresión de AG en las
estructuras carpeloides derivadas de la sobrexpresión de FUL, sugieren que FUL es un
gen situado aguas abajo de AG. Sin embargo, en el mutante AG se detecta expresión de
FUL, por lo que deben existir otros factores que regulen la expresión de este último en
ausencia de AG (Ferrándiz et al., 1999).
Introducción 45
El RNA de FUL también se acumula en los meristemos florales, así como en las
hojas caulinares, en la vasculatura del tallo y en el pedicelo floral. De acuerdo con este
patrón de expresión, la mutación ful ocasiona hojas caulinares anormales y afecta a la
arquitectura global de la planta, poniendo de manifiesto las múltiples funciones que
ejecuta este gen durante el desarrollo. (Gu et al., 1999; Ferrándiz et al., 2000a).
I.5.5.3.3.- Los genes SHATTERPROOF1 y SHATTERPROOF2 están implicados en la
dehiscencia del fruto.
Pertenecientes también a la familia de los MADS box, SHATTERPROOF1 (SHP1)
y SHATTERPROOF2 (SHP2) se denominaron inicialmente como AGL1 y AGL5,
respectivamente por su similitud con AG (Ma et al., 1991). Ambos presentan un patrón de
expresión indistinguible el uno del otro. De acuerdo con lo anterior, los mutantes simples
shp1 o shp2 no presentan un fenotipo distinto del silvestre. Por otro lado, la similitud de
sus secuencias nucleotídicas sugiere la existencia de una duplicación génica reciente
(Savidge et al., 1995; Flanagan et al., 1996; Liljegren et al., 2000).
El doble mutante shp1shp2 presenta alteraciones en el margen de las valvas. Se
produce una pérdida de la zona de dehiscencia y una disminución drástica de la
lignificación de esta región, necesaria para la apertura del fruto (Liljegren et al., 2000).
A
B
C
D
zd
Figura I.26.- Fenotipo del doble mutante shp1shp2. A) y C) Frutos silvestre donde se aprecia la zona de
dehiscencia, indicada en C como zd. B) y D) Fenotipo del doble mutante donde ha desaparecido la zona de
dehiscencia entre la valva y el replum. Barras de escala 100 µm. Tomado con modificaciones de Liljegren et
al., 2000.
Tanto SHP1 como SHP2 parecen ser dianas de AG. Presentan un solapamiento
inicial en su patrón de expresión, quedando luego restringidos a la zona de dehiscencia
(Savidge et al., 1995; Flanagan et al., 1996).
Introducción 46
La sobreexpresión constitutiva de SHP1 y SHP2 provoca una transformación de
valva en margen de valva o zona de dehiscencia, reduciéndose el diámetro de los frutos.
Algunas de las características de estos frutos son similares a las que presenta ful
(Liljegren et al., 2000). De hecho, se comprobó que FUL actúa regulando negativamente a
los genes SHP en las valvas. Por otro lado, la sobreexpresión de FUL presenta fenotipos
algo más severos que shp1shp2, lo que sugiere la necesidad de otros factores en este
mantenimiento de dominios (Ferrándiz et al., 2000b; Ferrándiz, 2002). Todos estos genes
se encuentran bajo la regulación de AG, por lo que, de forma indirecta, AG estaría
regulando la formación de estos territorios.
I.5.5.3.4.- Papel de INDEHISCENT (IND) y ALCATRAZ (ALC) en el desarrollo del fruto.
Al igual que los dobles mutantes shp, tanto indehiscent (ind) como alcatraz (alc)
presentan una dehiscencia deficiente. Los genes correspondientes codifican factores de
transcripción de tipo básico hélice-bucle-hélice (bHLH, basic helix-loop-helix; Liljegren et
al., 2004; Rajan y Sundaresan, 2001). SHP, IND y ALC están encargados de especificar
el margen de la valva (Liljegren et al., 2004).
F
valva
valva
G
valva
valva
Figura I.27.- Fenotipo en el fruto de los mutantes ind y alc. A) Dehiscencia de una silicua silvestre. Pérdida de
la capa de separación (sl) en ind-2 (B) e ind-1 (C), lo que impide la dehiscencia de los frutos. Secciones
transversales del silvestre (D) y del mutante ind-2 (E). En F) se muestra la sección transversal de un fruto
silvestre en estadio 17 y en G la de un fruto alc en el mismo estadio. NLC: capa de células no lignificadas. sl:
capa de separación. v: valva. r: replum. Barras de escala 100 µm.
En gran medida, el fenotipo que presentan los mutantes ful se debe a la expresión
ectópica de ALC, IND y SHP, y no a la mera pérdida de función de FUL. De hecho, FUL
regula negativamente a estos genes, restringiendo su expresión a la región del margen de
la valva. Por lo tanto, FUL no se requiere para la especificación de todas las células de la
Introducción 47
valva sino para impedir la adopción de identidad de células del margen de valva por parte
del resto de células de la valva (Liljegren et al., 2004).
I.5.5.3.5.- REPLUMLESS (RPL) especifica la región del replum.
La función del gen REPLUMLESS (RPL) es requerida para la correcta formación
del replum (Roeder et al., 2003). El gen RPL pertenece a la familia de factores de
transcripción con homeodominio BELL1. Se expresa en todos los órganos de la planta y,
de acuerdo con este patrón de expresión, presenta otras alteraciones al margen de las
descritas en el fruto, como llamativos errores en el patrón de filotaxia (Byrne et al., 2003;
Smith y Hake, 2003).
En el fruto de los mutantes rpl se reduce drásticamente el tamaño del replum (Fig.
I.28). RPL esta implicado en la represión de los genes de identidad de margen de valva
(IND y SHP) en el replum (Roeder et al., 2003).
Figura I.28.- Fenotipo en el fruto del
mutante rpl. A) fruto silvestre Ler. B)
Microscopía electrónica de barrido de
Ler donde se indican las valvas (v), el
replum (r) y el margen de la valva (vm).
C) Sección transversal de un fruto
silvestre. D) Fruto rpl-1. E) Reducción
notable de la región del replum en rpl.
F) sección transversal de un fruto rpl
donde se aprecia la diferencia de
tamaño. Barras de escala 1 mm en A y
D; y 20 µm en D, C, E y F. Imágenes
tomas y modificadas de Roeder et al.,
2003.
silvestre
rpl-1
I.5.5.3.6.- SPATULA (SPT) actúa independientemente de AG en la diferenciación de
tejidos del fruto.
Las mutaciones en el gen SPATULA (SPT) provocan alteraciones fenotípicas que
se restringen únicamente al gineceo. spt presenta fallos en la fusión apical de los
carpelos, con una disminución en la cantidad de tejido estigmático y la desaparición del
tracto transmisor, lo que en su conjunto provoca una reducción de la fertilidad (Fig. I.29 B;
Introducción 48
Álvarez y Smyth, 1999). EL gen SPT codifica un factor de transcripción de tipo bHLH
(Heisler et al., 2001). El análisis genético ha evidenciado que la ausencia de la función
SPT provoca una reducción de los rasgos carpeloides que adoptan las estructuras florales
como consecuencia de la expresión ectópica de AG. Por otro lado, la expresión ectópica
de SPT genera la adquisición de rasgos carpeloides en otras estructuras de la flor,
independientemente de la función de AG. Por tanto, resulta verosímil que SPT actúe
paralelamente a AG en la generación de la identidad carpelar (Álvarez y Smyth, 1998).
Se ha demostrado que los tratamientos con inhibidores de auxinas rescatan el
fenotipo silvestre en los frutos spt, lo que indica un papel importante de estas hormonas
en esta ruta (Nemhauser et al., 2000).
A
B
C
Figura I.29.- Fenotipo de los mutantes crc y spt.
Obsérvese la falta de fusión en la región apical del fruto
en los mutantes spt (A) y crc (B). En C) fenotipo del
doble mutante crc spt. A y B tomadas de Ferrándiz et al.,
1999. C de Álvarez y Smyth, 1999. Barras de escala 500
µm.
I.5.5.3.7.- La función de CRABS CLAW (CRC) en la diferenciación de los carpelos.
Los frutos de los mutantes crc son de pequeño tamaño y de fertilidad reducida
(Fig. I.29 A). Presentan una reducción del tejido del estilo y deficiencias en la fusión apical
de los frutos. La diferenciación de las células de la valva es anormal (Bowman y Smyth,
1999). El gen CRC codifica un miembro de la familia YABBY de factores de transcripción
específicos de plantas, implicados en la generación de polaridad abaxial-adaxial en los
órganos laterales (Sawa et al., 1999; Seigfried et al., 1999).
Junto con AG y SPT, CRC es un gen necesario en la determinación de los
carpelos, así como de otras estructuras como los nectarios (Álvarez y Smyth, 1999). Una
Introducción 49
importante función de CRC es la determinación de la polaridad abaxial en las valvas y el
replum (Eshed et al., 1999; Kerstetter et al., 2001).
I.5.5.3.8.- Los genes TOUSLED (TSL), STYLISH1 (STY1) y STYLISH2 (STY2) están
implicados en la formación de tejidos apicales del gineceo.
Los genes STYLISH1 (STY1) y STYLISH2 (STY2) actuan junto con SPT y CRC en
la formación de los tejidos de la región apical del gineceo (Kuusk et al., 2002).
Stg
Stl
Val
Figura I.30.- Fenotipo de los frutos en los mutantes tsl, sty1 y sty2. A la izquierda un fruto en estadio 17 del
mutante tsl en el que se observa la pérdida de tejidos apicales. El panel de la derecha muestra las diferencias
existentes en la región apical de los frutos sty1 y del doble mutante sty1 sty2 respecto de su ancestro silvestre
(puntas de flecha). La imagen de la izquierda tomada de Ferrándiz et al., 1999. El panel de la derecha de
Kuusk et al., 2002. En la imagen de la izquierda la barra de escala indica 500 µm, y en el panel de la derecha
100 µm.
El estudio de los mutantes simples sty1 y sty2, y del doble mutante sty1 sty2, pone
de manifiesto que STY1 y STY2 presentan funciones parcialmente redundantes en la
especificación del estilo, ya que el fenotipo de los dobles mutantes es más severo que el
de los mutantes simples. La expresión ectópica de estos genes genera una
transformación del tejido de la valva en estilo, lo que apoya la idea de que ambos genes
regulan la identidad de los tejidos del estilo. Las proteínas STY1 y STY2 presentan un
dominio de localización nuclear y un motivo de interacción con otras proteínas C3HC4
RING con dedos de zinc (zinc binding C3HC4 RING finger motif).
El gen TOUSLED (TSL) codifica una kinasa de Ser/Tre (Roe et al. 1993)
perteneciente a una familia conservada entre plantas y animales (Yamakawa et al., 1997;
Introducción 50
Shalom et al., 1999; Sillje et al., 1999; Li et al., 2001; Zhang y Liu, 2001). Los individuos tsl
presentan una reducción en los tejidos de la región apical del gineceo, desapareciendo la
zona de fusión del septum y el estilo, donde se localiza su expresión. Mediante el análisis
de interacciones génicas, se ha visto que su modo de actuación en el gineceo es
independiente de AG y AP2, aunque su función se requiere para la formación de tejidos
carpeloides ectópicos (Roe et al., 1997).
I.5.5.3.9.- El gen ETTIN (ETT) está relacionado con la regionalización del gineceo.
En los mutantes ettin (ett) (Fig. I.31) se reduce enormemente el tejido
correspondiente a las valvas, desarrollándose mucho más que en el silvestre la región
correspondiente al tejido estigmático. Las anomalías se hacen evidentes en etapas muy
tempranas del desarrollo del gineceo, lo que se corresponde con su temprana expresión
en los primordios florales (Sessions y Zambryski, 1995; Sessions, 1997).
Figura I.31.- Fenotipo de los frutos en los mutantes ett. Se observan distintas alteraciones en la distribución
de tejidos y en la diposición de los órganos en los gineceos ett. A) Fruto silvestre. B) ett-2. C) ett-3. D) ett-1.
Tomado de Sessions y Zambryski, 1995. La barra de escala en A corresponde a 153 µm; en B 109 µm; en C
295 µm y en D 132 µm.
El gen ETT codifica un factor de transcripción de respuesta a auxinas (ARF3,
Auxin Response Transcription Factor 3). El tratamiento de alelos débiles de ett (ett-2) con
inhibidores del transporte polar de esta hormona, genera la aparición de fenotipos
similares al de los alelos fuertes. Por lo tanto, a ETT se le asigna la función de interpretar
las señales generadas por las auxinas en la regionalización del gineceo.
Introducción 51
I.5.5.3.11.- Los genes CLV y el número de carpelos en el gineceo.
Como hemos mencionado en apartados anteriores, las mutaciones en los genes
CLV, impiden el mantenimiento de un equilibrio entre la actividad mitótica del meristemo y
la incorporación de las células a los primordios de los órganos. Esto genera una
acumulación de células indiferenciadas en el meristemo que altera su homeostasis celular
(Clark, 2001). Como consecuencia, los mutantes clv, entre otras alteraciones, desarrollan
un mayor número de valvas en el fruto (Clark et al., 1993; Clark et al., 1995; Kayes y
Clark., 1998; Brand et al., 2000).
Estas anomalías de los mutantes clv se detectan ya en etapas muy tempranas,
con el desarrollo de varios carpelos rodeando la región meristemática a modo de anillo
(Clark et al., 1993). En ocasiones, esta región meristemática genera un quinto verticilo
que presenta proliferación de células indiferenciadas (Clark et al., 1995).
A
B
C
Figura I.32.- Aparición de valvas
extra en los frutos de los mutantes
clv. A) clv1. B) clv2. C) clv3.
Frutos en estadio 17. Barras de
escala 1 mm.
I.5.5.3.12.- La familia de genes ERECTA (ER) en el desarrollo del gineceo.
El gen ER codifica un receptor de membrana con dominio kinasa relacionado con
CLV1 (Torii et al., 1996).
Los mutantes er presentan una reducción en el número de células, lo que genera
entre otros defectos, el desarrollo de inflorescencias compactas y silicuas de una longitud
inferiores a las del silvestre. En estos frutos se reduce la longitud de la región del estilo
(Fig. I.33) Este hecho implica a ER en la promoción de la proliferación celular en el
crecimiento de todos los órganos (Torii et al., 1996).
Introducción 52
Las mutaciones en dos parálogos funcionales ERL1 y ERL2 (ERECTA-LIKE
KINASE) intensifican el fenotipo del mutante simple er, reduciendo aún más la longitud de
las silicuas, indicando la redundancia funcional existente entre estas kinasas (Shpak et al.,
2004).
A
B
Figura I. 33.- Fenotipo en el fruto
generado por la mutación er. A) fruto
silvestre. B) Región apical de un fruto de
una planta er. Frutos en el estadio 15.
Barras de escala 1 mm.
II.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
Antecedentes y Objetivos 54
II.- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
Desde siempre, numerosos investigadores se han visto interesados por el estudio
de los procesos biológicos que tienen lugar en las plantas. En los últimos tiempos, la
Biología Vegetal ha experimentado un avance vertiginoso, que ha conducido a una visión
mucho más detallada de los distintos procesos analizados. En la actualidad, además de
las metodologías clásicas (pruebas bioquímicas, descripciones morfológicas,...), se han
incorporado definitivamente las herramientas genéticas y moleculares.
Los
fenómenos
de
división,
expansión,
y
diferenciación
celular,
o
el
establecimiento de patrones que se producen durante el desarrollo, se encuentran bajo un
estricto control genético. Por tanto es fundamental identificar, mediante el aislamiento y
caracterización de sus mutaciones, los genes que rigen estos procesos (Wolpert et al.,
1998; Gilbert, 2000).
La planta modelo Arabidopsis thaliana posee propiedades que hacen de ella un
organismo ideal para la disección genética y molecular de procesos biológicos complejos,
como la formación de tejidos y órganos (Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). El
fruto es un órgano que suscita un gran interés, tanto básico como aplicado. El fruto de
Arabidopsis thaliana es una silicua, y ya desde los momentos más tempranos de su
desarrollo, inmediatamente después de la fertilización, se distingue del pistilo por la
aparición de estomas en la superficie del ovario (Bowman, 1994), presentando
características morfológicas y fisiológicas comparables a las de muchos frutos (Barendse
et al., 1986). Existen indicios de que hay una etapa inicial de divisiones celulares
(Martínez et al., 1992) y que la mayor contribución al tamaño final corresponde al
crecimiento longitudinal de las células (Bowman, 1994; Bowman et al., 1999; Ferrándiz et
al., 1999).
Cabe esperar que las características que muestran a la silicua de Arabidopsis
como un fruto típico, junto a las que hacen de esta planta un organismo ideal para la
disección genética y molecular de fenómenos biológicos, permita la elaboración de
modelos aplicables a otros vegetales que expliquen, mediante la expresión de sus genes
y la función de sus productos, de qué manera se regulan los procesos morfogenéticos que
dan lugar a la formación del pistilo y del fruto.
Antecedentes y Objetivos 55
Una vía para comprender cómo se forma el fruto de Arabidopsis es la obtención de
mutantes sin frutos o con su morfología alterada para, a continuación, clonar los genes
responsables. De esta manera, se han caracterizado una serie de genes "maestros" en la
jerarquía de la formación del fruto, como los factores de transcripción AP2 (Drews et al.,
1991; Jofuku et al., 1994), AG (Yanofsky et al., 1990), FUL (Gu et al., 1999), LUG (Chen
et al., 2000; Conner y Liu, 2000), ANT (Liu et al., 2000; Nole-Wilson y Krizek, 2000) RPL
(Roeder et al., 2003), SHP1 y SHP2 (Liljegren et al., 2000), SPT (Heisler et al., 2001) o
CRC (Bowman y Álvarez, 1999; Álvarez y Smyth, 1999) entre otros, y quinasas que
participan en las rutas de señalización entre los que podemos destacar a los genes CLV1
y CLV2 (Kayes y Clark, 1998; Stone et al.,1998; Jeong et al., 1999; Clark, 2001), PID
(Benjamins et al., 2001), TSL (Roe et al., 1993; Roe et al., 1997) o ER (Torii et al., 1996).
Recientemente, se han sumado a esta lista una serie de actividades génicas con un papel
en la regulación postranscripcional de algunos de lo genes anteriormente mencionados,
como HUA1 (Liu et al., 2001), HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999), HEN1 (Chen et al.,
2002), HEN2 (Western et al., 2002), HEN4 (Cheng et al., 2003) o CARPEL
FACTORY/DICER LIKE (CAF/DCL; Jacobsen et al., 1999).
A pesar de los progresos realizados, aún quedan por identificar numerosos genes
implicados en los procesos de morfogénesis del pistilo y fructificación. El escrutinio y
análisis de nuevos mutantes con frutos anormales permitirá identificar estas nuevas
funciones y contribuirá a la elaboración de un modelo sobre la construcción de este
órgano. Con estos antecedentes, nos planteamos una serie de objetivos a realizar en la
presente Tesis.
Un primer objetivo lo constituyó el análisis y evaluación de una colección española
de T-DNA de reciente creación en el momento del inicio de este trabajo. Se planteó la
obtención de nuevos mutantes afectados en la morfología del fruto, junto con la
caracterización fenotípica y genética de los mutantes obtenidos. Un aspecto importante de
este objetivo es la determinación del ligamiento de la mutación al hecho de inserción de TDNA.
Dada la supuesta sencillez de la clonación de genes señalizados mediante
inserciones de secuencia conocida, una finalidad obvia de esta Tesis consistía en la
identificación de las actividades génicas afectadas por las mutaciones.
Nuestro tercer objetivo era la confirmación de la identidad de los genes definidos
por las distintas mutaciones mediante complementación funcional.
Antecedentes y Objetivos 56
Con el propósito de obtener una información inicial sobre el papel que pudieran
desempeñar estos genes en la morfogénesis de la planta, se planteó el estudio del patrón
espacio-temporal de expresión de los genes caracterizados.
Nuestro último objetivo consistía en llevar a cabo un análisis de las interacciones
de nuestros mutantes con otros previamente caracterizados, lo que permitiría obtener
información sobre las rutas o procesos de desarrollo en los que participan los genes
identificados durante este trabajo.
Toda esta información, en su conjunto, debería contribuir a un mejor entendimiento
de los procesos y mecanismos que tienen lugar durante la morfogénesis del fruto.
III.- MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos 58
III.- MATERIALES Y MÉTODOS
III.1.- ORGANISMOS UTILIZADOS.
III.1.1.- Estirpes de Arabidopsis thaliana.
El NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Center, Norwich, Reino Unido) y el ABRC
(Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Estados Unidos) tienen
como misión el mantenimiento y la distribución de semillas y clones de DNA de Arabidopsis
thaliana. Las distintas estirpes reciben un código de identificación, que en el caso del NASC
se inicia con una N y un número, o CS y ese mismo número, en el caso del ABRC. Así por
ejemplo, la estirpe mutante ap1-1 se identificaría como N28 a través del NASC y CS28 a
través del ABRC.
III.1.1.1.- Estirpes silvestres.
Las estirpes silvestres utilizadas en esta Tesis son Landsberg erecta (Ler, NW20 o
CS20), Columbia-0 (Col-0, N1092 o CS1092) y Wassilewskija-2, (Ws-2, N1601 o CS1601).
III.1.1.2.- Estirpes mutantes.
III.1.1.2.1.- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes, mutaciones,
fenotipos e individuos aislados durante el escrutinio de colecciones de mutantes.
Durante la realización del presente trabajo se han seguido las directrices propuestas
por Meinke y Koornneef (1997) para Arabidopsis thaliana respecto a la denominación de
genes, mutantes y fenotipos. De forma continua, podemos encontrar actualizaciones de esta
normativa en la dirección de Internet http://mutant.Lse.okstate.edu/genepage/namerule.html.
Los alelos de un gen se indican mediante una abreviatura de su nombre formada por
tres letras en cursiva, con mayúsculas en el caso del alelo silvestre, y minúsculas si se trata
de un alelo mutante. Los distintos alelos mutantes de un gen se denotan utilizando números
separados por un guión que habitualmente indican el orden de aislamiento. En el caso de
que alguno de estos alelos mutantes sea dominante respecto del silvestre, se añade una D
en cursiva (D). Por ejemplo, phb-1D es un alelo mutante y dominante del gen PHABULOSA.
Materiales y Métodos 59
La proteína codificada por el gen se indica mediante la misma abreviatura con letras
mayúsculas y en tipografía normal. Para referirnos a un fenotipo mutante, se escribe la
abreviatura del gen en tipografía normal y con la letra inicial en mayúscula.
-
PEP1: Gen.
-
pep1-1: alelo mutante del gen PEP1.
-
PEP1: proteína codificada por el gen PEP1.
-
Pep1: fenotipo de los mutantes pep1.
Los mutantes aislados en nuestro laboratorio han recibido, inicialmente, el nombre de
SJF (San Juan Fruto) seguido de dos números, correspondiendo el primero de ellos al grupo
parental al que pertenece la planta aislada, y el segundo al orden de aislamiento. Por
ejemplo, SJF25-2 hace referencia al grupo parental 25 y al aislado número 2. Esta
denominación es transitoria hasta la aplicación de las directrices anteriormente
mencionadas.
La anotación de los genes en el genoma de Arabidopsis thaliana se ajusta a la
nomenclatura determinada por el AGI (Arabidopsis Genome Initiative). Por ejemplo,
At4g26000 hace referencia al gen numerado como 26.000 en el cromosoma IV de
Arabidopsis thaliana. Versiones actualizadas de las anotaciones se pueden encontrar en
http://www.arabidopsis.org/info/guidelines.jsp#alia.
III.1.1.2.2.- Procedencia de los mutantes.
Las estirpes mutantes que se han utilizado en este trabajo pueden dividirse en tres
grandes grupos teniendo en cuenta su origen. Al primer grupo pertenecen aquellos mutantes
aislados durante el presente estudio a partir del escrutinio de una colección española de
mutantes obtenida mediante mutagénesis insercional de T-DNA (Dr. J. Paz Ares, C.N.B.,
Madrid). El segundo de ellos englobaría a las estirpes mutantes ya aisladas y caracterizadas
por autores anteriores (Tabla III.1).
El tercer grupo lo constituyen líneas de T-DNA donde se ha determinado
previamente qué genes se hallan afectados por el hecho insercional.
Tabla III.1.- Estirpes mutantes utilizadas.
Acceso
Ler
Gen afectado
CLAVATA1
Alelo
clv1-1
Ler
CLAVATA1
clv1-6
Fenotipo
Aparición de órganos
supernumerarios
Aparición de órganos
supernumerarios
Referencia
Clark et al, 1993
Dievart et al., 2003
Materiales y Métodos 60
Tabla III.1.- Estirpes mutantes utilizadas. Continuación.
Acceso
Ler
Gen afectado
CLAVATA2
Alelo
clv2-1
Ler
CLAVATA3
clv3-1
Ler
CLAVATA3
clv3-2
Ler
Ler
HUA1
HUA2
hua1-1
hua2-1
Fenotipo
Aparición de órganos
supernumerarios
Aparición de órganos
supernumerarios
Aparición de órganos
supernumerarios
Alteraciones florales
Alteraciones florales
Ler
HUA
ENHANCER2
FRUITFULL
WUSCHEL
hen2-1
Alteraciones florales
Ler
Ler
ful-1
wus-1
Referencia
Kayes et al., 1998
Clark et al., 1995
Clark et al., 1995
Liu et al., 2001
Chen y Meyerowitz,
1999
Western et al., 2002
Valvas y replum del fruto alterados. Gu et al., 1999
El meristemo apical es
Laux et al., 1996
rudimentario. En ocasiones se
desarrollan inflorescencias donde
aparece una flor terminal con sólo
un estambre.
En esta Tesis se han analizado líneas de las colecciones de semillas de dominio
público procedentes del Salk Institute for Genomic Analysis Laboratory (SIGnAL),
popularmente conocidas como líneas SALK y así referidas en este trabajo, y de la compañía
Syngenta, o líneas SAIL (Syngenta Arabidopsis Insertion Library). Todas las líneas de estas
colecciones se han generado utilizando como fondo genético el acceso Columbia-0. En la
Tabla III.2 se muestran las líneas utilizadas.
Tabla III.2.- Líneas de T-DNA de las colecciones de dominio público.
Línea
Colección
Gen afectado
Alelo
SJF20-15
Españolaa
At4g26000 (PEP1)
pep1-1
F09_517
SAILb
At4g26000 (PEP1)
pep1-2
pep1-3
G12_1249
SAIL
At4g26000 (PEP1)
SALKc
At4g26000 (PEP1)
pep1-4
SALK_055265
SALK_036321
SALK
At5g65390 (AGP7d)
SALK_036324
SALK
At5g65390 (AGP7)
SALK_099106
SALK
At5g65390 (AGP7)
SALK_039285
SALK
At5g65390 (AGP7)
SALK_058288
SALK
At4g26010 (PXDe)
SALK_058547
SALK
At4g26010 (PXD)
SALK_048558
SALK
At4g24190 (SHDf)
SALK_076031
SALK
At4g24190 (SHD)
SALK_076127
SALK
At4g24190 (SHD)
SALK
At3g04610 (FLKg)
SALK_001523
a
Esta Tesis. bSessions et al., 2002. cAlonso et al., 2003. d Majewska-Sawka
y Nothnagel (2000). ePresunta peroxidasa. f Ishiguro et al., 2002. g Lim et al.,
2004.
Materiales y Métodos 61
III.1.2.- Estirpes de Escherichia coli.
Se utilizaron las estirpes DH10β (Choi et al., 1995) y DH5α (Hanahan et al., 1983) de
E. coli. Ambas permiten la selección blancas/azules (Φ80dlacZ∆M15) y son incapaces de
recombinar (recA-). Los experimentos de transformación se llevaron a cabo mediante
choque térmico (DH5α) o electroporación (DH10β).
La estirpe DH10β es portadora de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome,
Shizuya et al., 1992) procedentes de la genoteca IGF (Institut für Genbiologische Forschung,
Berlin GMBH), depositadas en el ABRC. Los clones F20B18 y MNA5, se generaron
utilizando el vector pBeloBAC-Kan (Mozo et al., 1998) que confiere resistencia al antibiótico
kanamicina.
III.1.3.- Estirpes de Agrobacterium tumefaciens.
Se han utilizado en este trabajo dos estirpes de Agrobacterium tumefaciens: C58C1
(Zambrisky et al., 1983; Koncz et al., 1986) y LBA4404 (Hoekeman et al., 1983). La primera
carece de plásmido Ti, mientras que la segunda presenta modificaciones respecto a la
estructura original del mismo. Dado que ambas estirpes tienen resistencia cromosómica a la
rifampicina, siempre se cultivaron en presencia de este antibiótico, impidiendo así la
proliferación de otro tipo de microorganismos. Se generaron células competentes de ambas
estirpes para someterlas a transferencia de DNA mediante electroporación (Calvin y
Hanawalt, 1988).
La estirpe C58C1 se utilizó en la transferencia de construcciones de sobreexpresión
génica. La estirpe LBA4404, en cambio, se utilizó en experimentos de transformación con
clones genómicos.
III.2.- VECTORES. PLÁSMIDOS Y CONSTRUCCIONES.
En este apartado se incluyen los vectores utilizados en los trabajos rutinarios de
clonación y los empleados en experimentos de transformación de plantas, tanto en la
creación de las distintas colecciones de mutantes por mutagénesis insercional de T-DNA
(generadas en otros laboratorios) como en los experimentos llevados a cabo durante esta
Tesis.
En todos los experimentos de subclonación o transcripción in vitro se han empleado
los plásmidos pGEM-3Zf(+) y pGEM-T (Promega, U.S.A., Fig. III.1).
Materiales y Métodos 62
B
A
pGEM-3Zf(+)
(3.197 pb)
pGEM-T
(3.000 pb)
Figura III.1.- Plámidos pGEM-3Zf(+) y pGEM-T. A) pGEM-3Zf(+). Derivado del plásmido pGEM-3Z. B) pGEM-T.
Generado a partir del plásmido pGEM-5Zf(+) tras linearizar con EcoRV y añadir un nucleótido de timina (T) en los
extremos 3’. Esto permite la clonación directa de productos de PCR utilizando polimerasas de DNA
termoestables que generan extremos compatibles colocando un nucleótido de adenina (A) en posición 3’
terminal, lo que incrementa la eficacia en la ligación entre inserto y vector y evita la recircularización. Ambos
r
plásmidos confieren resistencia a la ampicilina (Amp ), presentan un sitio de clonación múltiple dentro del gen de
la β-galactosidasa (LacZ) y poseen promotores para las polimerasas de RNA de los bacteriófagos T7 y SP6. El
origen de replicación en ambos se indica como ori.
El plásmido pGKB5 (Bouchez et al., 1993) fue empleado en la mutagénesis
insercional para la elaboración de la colección española de semillas mutagenizadas
mediante T-DNA (Dr. J. Paz Ares). Este T-DNA presenta genes de resistencia al antibiótico
kanamicina (neomicina fosfotranferasa II, nptII) y al herbicida Basta (glufosinato amónico,
Bastar). También contiene el gen testigo que codifica la enzima β-glucuronidasa (GUS), cuya
expresión puede estar dirigida ocasionalmente por regiones reguladoras del gen en el cual
se encuentra insertado este elemento.
El plásmido pROK2 (Baulcombe et al., 1986) fue la herramienta elegida en la
obtención de la colección de inserciones SALK (Alonso et al., 2003). Confiere a las plantas
portadoras resistencia a la kanamicina, propiciada por el gen nptII.
Para la elaboración de la colección SAIL (Sessions et al., 2002) se utilizó el T-DNA
presente en el plásmido pDAP101 que confiere resistencia al herbicida Basta a las plantas
portadoras.
En la Figura III.3 se presentan los vectores utilizados en los experimentos de
transformación de plantas mediante infiltración con Agrobacterium tumefaciens. Dentro de
este grupo se encuentran el sistema binario denominado pGreen, formado por los plásmidos
pSoup y pGreenII0179 (Fig. III.3 A y B, Hellens et al., 2000a y 2000b). El plásmido pSoup
Materiales y Métodos 63
contiene todas las funciones trans necesarias para la integración del T-DNA que porta el
plásmido pGreenII0179.
El plásmido pBIN-JIT (Fig. III.3 C, Van Engelen et al. 1995) contiene tanto las
funciones para la integración como el T-DNA. Este último presenta dos copias del promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor (35S CaMV), apropiado para experimentos de
sobreexpresión génica en plantas.
pGKB5
KanR
A
GUS
BastaR
RB
LB
uidA
1
XbaI
BamHI
2
3
EcoRV EcoRV
bar
nptII P nos P 35S
nos 3’ ocs 3’
4
5
6
EcoRI
3’g7
7 Kb
EcoRV KpnI
KpnI
HindIII
pROK2
KanR
B
RB
LB
nos 3’
P 35S
1
BglII
EcoRI
XbaI
SacI
KpnI
SmaI
BamHI
C
nos 3’ nptII
2
P nos
3
4 Kb
BglII
HindIII
pDAP101
Basta
R
RB
LB
bar nos 3’
P 35S
1
pBluescriptII
2
HindIII
EcoRV
BglII
XbaI
SbfI
PstII
3
4 Kb
ScaI
NcoI
NsiI
Psu 10I
Figura III.2.- Esquema de la estructura de los T-DNA que se han empleado en la obtención de las tres
colecciones de mutagénesis insercional empleadas en la elaboración de este trabajo. A) pGKB5, empleado en la
obtención de la colección española. B) pROK2, utilizado en la obtención de la colección SALK. C) pDAP101,
empleado en la obtención de la colección SAIL.
Materiales y Métodos 64
A
B
Sitio de
clonación
múltiple
C
pGreenII 0179
(5.139 pb)
pBIN-JIT
(13 Kb)
Figura III.3.- Vectores para la transformación de Arabidopsis thaliana. A) pSoup. En rojo se indica el gen de
r
resistencia a la tetraciclina (Tet ) y en amarillo los orígenes de replicación para Agrobacterium y E.coli. B)
pGreenII 0179. En amarillo y violeta se indican los orígenes de replicación. En el T-DNA se encuentra el gen
LacZ, interrumpido por el sitio de clonación múltiple, lo que permite realizar una selección azul-blanco de
r
colonias. El gen Hyg (en rojo), bajo el control del promotor 35S, confiere a los individuos transformantes
resistencia a la higromicina. C) pBIN-JIT. Vector de 13 Kb derivado del pBIN19. Incorpora un T-DNA modificado
que presenta dos copias del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35SCaMV) y el terminador del gen
de la nopalina sintetasa (nosT) flanqueando el sitio clonación (recuadro rojo). El gen nptII (neomicina
fosfotransferasa II) confiere resistencia a la kanamicina. En B) y C) se indican como RB y LB los bordes derecho
e izquierdo del T-DNA, respectivamente.
Materiales y Métodos 65
III.3.- OLIGONUCLEÓTIDOS EMPLEADOS COMO CEBADORES.
Todos los oligonucléotidos empleados en esta Tesis han sido sintetizados en la
empresa TIB-MOL-BIOL (Alemania) en la escala 0,01 µM, con grado de purificación máximo
(HPR3).
Tabla III.3.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis.
Nombre
ACT2-f
ACT2-r
d
AD1
d
AD2
d
AD3
AT1
AT2
AT3
AT4
AT5
AT6
AT7
AT8
AT9
AT10
AT11
AT12
AT13
AT14
AT15
AT16
AT17
CIW7-f
CIW7-r
ERA1
ERA2
FUP1-1
FUP1-2
FUP1-3
FUP1-4
FUP1-5
FUP1-6
FUP1-7
FUP1-8
FUP1-9
FUP1-10
FUP1-11
FUP1-12
FUP1-13
FUP1-14
Secuencia (5’
3’)
Clon (plásmido o
BAC)
a
CTCTTAACCGTAAAGCTAACAG (f)
b
AGTGAGAATCTTCATGAGTGAG (r)
NTCGASTWTSGWGTT
NGTCGASWGANAWGAA
WGTGNAGWANCANAGA
CGGACTCCAGGGCGTGTGCC (f)
CGGAATAGTTTTGGCCAGACC (r)
CAGACGCGTGGTTACAGTC (r)
CCGCATCGAAACGCAGCAC (r)
GTCTGGATCGCGAAAACTGTG (f)
ACCACCTGTTGATCCGCATCACG (r)
CATACGCGTCTAGGATCCGATGG
TGTATTCCACCCACCGAC
CTGTTGCCGGTCTTGCGATG
TCATGCGATCATAGGCGTCTCG
TCAAAAGTCGCCTAAGGTCAC
TCGGCAGAGGCATCTTGAACG
AGGCTGTAGCCGACGATGGTGC
TGAGACTCTAATTGGATACCGAG
TGGCACACGCCCTGGAGTCCG (r)
TCTGCACCATCGTCAACCAC
ACGCTCTTGAAGCCCTGTGC
AATTTGGAGATTAGCTGGAAT (f)
CCATGTTGATGATAAGCACAA (r)
CTAATGTAGTGATCTGCGAGGTAA-TC (f)
GAGTTTATTCTGTGCCAAGTCCCT-G (r)
TAACTCTGACAGCTATCTCC (r)
CTTAAGAAAGATAGAGAGTGAAGC (f)
ACCTAATACATGCTATATGGAC
CACCAGAGTTCTCTATAGAC (r)
TGTTGCTAGTAACAAGAG (f)
TTTCGTATGATCGTTCCGGTG (f)
ATGCCGGTGACATGTAGGCCTC (r)
GAGATAGAGATACTAACGATGCGA-TCG (r)
ACGCACCGGAACGATCATACG (r)
CTGGCAATTTTGACTGCAGCCGAA-GC (r)
TCATCCTCTAGGAATCCCACACTG (r)
TGTAGGTATAGTGTATAATCGTC (r)
TAGAGCTCACGTGGTGTTTTCCTT-TACACTAG (f)
TAGTCGACTCAACGGAATCTGCGA-CGGC (r)
Posición
BAC MYH9
BAC MYH9
(nucleótidos)
5.997-6.019
6.319-6.340
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
pGKB5
BAC F17L22 (IV)
BAC F17L22 (IV)
6.875-6.895
6.704-6.724
1.223-1.241
891-908
702-722
1.286-1.308
6.484-6.497
7.183-7.201
2.548-2.568
3.450-3.571
4.575-4.595
5.686-5.705
2.465-2.486
4.495-4.518
6.875-6.895
5.992-6.011
6.277-6.294
56.159-56180
56.268-56.289
BAC T1D16 (II)
7.205-7.231
BAC T1D16 (II)
BAC MNA5 (V)
BAC MNA5 (V)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC MNA5 (V)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
7.685-7.710
42.145-42.164
41.204-41.227
34.858-34.882
35.857-35.880
42.121-42.142
35.283-35.303
35.678-35.700
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
35.413-35.434
35.286-35.306
BAC MNA5 (V)
BAC MNA5 (V)
BAC MNA5 (V)
42.757-42.783
42.639-42.663
42.398-42.420
BAC F20B18 (IV)
32.401-32.425
BAC F20B18 (IV)
35.064-35.084
Enzimac
SacI
SalI
Materiales y Métodos 66
Tabla III.3.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis. Continuación
Nombre
FUP1-16
Secuencia (5’
3’)
Clon (plásmido o
BAC)
FUP1-33
FUP1-34
FUP1-35
FUP1-36
TACCCGGGTCAAAGATTATAACTG-CTGTAGCCACC (r)
TGTACTGCACCGGCTCTGTG (r)
GCTAATATAGCCTATATCCGTCG (f)
ATAGGAAATGACTGG (r)
TATCGATATGAATACG (f)
TTAGATTGATGCTCC (r)
AAATGTATTGGAGTG (f)
TCGTATTGAATGAGTC (r)
TCGTACGTATACACG (f)
ACTCAATCATATGTGG (r)
CTGTGGATATCCATCG (f)
ATGTCGACCTTTAGCTATCTTTTTTG-TGTTACC (f)
ATCCCGGGTGACCAGAAACGTAGT-GTGAC (r)
TTTATTAGTTGCTTCAACGCAG (f)
CACCGTTTTATGCTGCACAG (r)
TCCTGGCGAGTTTGAGAGAC (f)
ATCATTATCAGGCAACCCTG (r)
R11187
pda04780
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
RAFL08-13-K20
(pda04780)
RAFL08-13-K20
(pda04780)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
FUP1-37
TCTGCTTTTGTGACACAGGTATCT (f)
BAC F20B18 (IV)
FUP1-38
CCTTGTGATTGATGATGAACTCTTG………………………………………….-A (r)
TCCTCCGTCTTCAGCTCCTT (r)
BAC F20B18 (IV)
FUP1-17
FUP1-18
FUP1-19
FUP1-20
FUP1-21
FUP1-22
FUP1-23
FUP1-24
FUP1-25
FUP1-26
FUP1-27
FUP1-31
FUPS351
K3-1
K3-2
LBTM1
CTGATCTTCAGCTTCAGCCAT (r)
TGGTTCAAGAGTCGGATCTG (F)
GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGC-CTTGCTTCC (r)
LBTM3
TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCT-CGATACAC (r)
M13F
GTAAAACGACGGCCAGTG (f)
M13R
GGAAACAGCTATGACCATG (r)
MBK21p28 CATGTAAGCCTAGACAATG (f)
MBK21p28 GCAGCATAAAAAACTCAGCT (r)
MKD15p31 TAAGGTCTGTTCCATTCTG (f)
MKD15p7-2 TGCTCCTTTGTCTTATTCTCA (r)
MNA5-1
TACGAGGAAAACATCTAACAGTC (f)
MNA5-2
AAAAGTCCCAACTCCAAATACC (r)
OCF1
GTCGACCGGTTCAAATGGC (f)
OCF2
CACCTAAAACATAACATTGAGC (r)
OCF3
GCTCAATGTTATGTTTTAGGTGCAT-CGGGAGTATTAAC (r)
OCF4
GGATCCGTCGCAGATTCCGTT (f)
OCF10
CTAGACCGCTATTGAACGGGCTTT-G (f)
GTCGACGGAGAGTGAGAGAAAGAGOCF11
-AGTC (f)
OCF12
CTAGACTTATTTGACCAGAAACGT-AGTG (r)
OCF13
CTTGAGTTGTGATCAT (f)
OCF14
GCTGCACAGGATGAGA (f)
OCF15
CTGTCTGCCAGACACT (f)
OCF16
GCGACGTGGCATTGTA (f)
Posición
Enzimac
(nucleótidos)
1.494-1.521
SmaI
37.173-37.192
36.770-36.790
33.119-33.134
33.011-33.027
33.607-33.622
33.563-33-577
34.158-34.173
34.094-34.109
34.634-34.649
34.561-34.575
2-26
SalI
1.751-1.771
SmaI
BAC MNA5 (V)
35.798-35.820
36.070-36.089
36.306-36.326
35.734-35.753
36.535-36.552
y
36.711-36.717
36.898-36.902
y
37.042-37.063
40.966-40.986
BAC F7O18
BAC F7O18
pDAP101
32.615-32.636
32.440-32.460
-
pDAP101
Universal
Universal
BAC T2E22 (III)
BAC T2E22 (III)
BAC MYJ24 (V)
BAC MYJ24 (V)
BAC MNA5 (V)
BAC MNA5 (V)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
2.717-2.736
3.797-3.817
57.425-57.444
54.754-57.775
35.043-35.062
35.633-35.654
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
35.396-35.412
35.065-35.080
BAC MNA5 (V)
40.004-40.022
BAC F20B18 (IV)
32.799-32.821
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
BAC F20B18 (IV)
37.496-37.518
35.527-35.542
36.081-36.096
36.496-36.502
36.945-36.960
XbaI
SalI
XbaI
Materiales y Métodos 67
Nombre
Secuencia (5’
3’)
Clon (plásmido o
BAC)
Posición
Enzimac
(nucleótidos)
GGATCCAATTCAAAGATTATAACT (r)
BAC F20B18 (IV)
37.303-37.326
CTCCGCTTCTTGCACG (r)
BAC F20B18 (IV)
36.789-36.803
CTTGCTTTCAGCTAAG (r)
BAC F20B18 (IV)
36.331-36.348
TGAAGAGAAGACACTTC (r)
BAC F20B18 (IV)
35.775-35.792
e
CGGCAACAGGATTCAATC (r)
pBINJIT
TGTTTCACTAGTGGGCCATCG (r)
pBIN-ROK
416-437
AACCAGCGTGGACCGCTTGCTG (r)
pBIN-ROK
222-243
GCTCGTCCTTTCCACGACGTCCABAC T4E14 (II)
86.198-86.223
-GC (f)
T4E14p50 GCGTCCATCATTCTGGTCTTCTTC-CTGTC (r)
BAC T4E14 (II)
86.770-86.598
a, b
c
Se indica con (f) la orientación sentido y con (r) la antisentido de la secuencia de los oligonucleótidos. A
d
algunos cebadores se les ha añadido la diana para alguna endonucleasa de restricción. A los cebadores
degenerados AD1, AD2 y AD3 no se les asigna ninguna posición (N denota cualquier base; S es G o C,
e
mientras que W indica A o T. Tampoco se les asigna posición a aquellos cebadores situados en los plásmidos
de los que no se dispone de su secuencia.
OCF17
OCF18
OCF19
OCF20
OCF21
SALKLBa1
SALKLBb1
T4E14p50
III.4.- MEDIOS DE CULTIVO, DISOLUCIONES Y TAMPONES.
Para la preparación de las distintas soluciones se ha empleado en todo momento
agua desionizada, obtenida con una resistividad de 15 MΩ mediante un purificador Millipore
(MilliRX).
Para la esterilización se ha utilizado un autoclave Presoclave 75 (Selecta)
sometiendo las soluciones a una presión de 1 atmósfera y 121ºC durante 20 min. Para la
esterilización de las soluciones termolábiles se empleó filtración mediante filtros Millipore de
0,45 µm, 0,22 µm y 0,025 µm.
III.4.1.- Medios de cultivo
III.4.1.1- Medios de cultivo en Arabidopsis thaliana.
III.4.1.1.1.- Medio de cultivo líquido (Medio mínimo ATM).
Los cultivos en maceta se irrigaron con medio mínimo ATM, cuya composición es la
siguiente: KNO3 5mM; KH2PO4 2,5 mM; MgSO4 2 mM; Ca(NO3)2 2 mM; FeNaEDTA 51 mM;
H3BO3 70 mM; MnCl2 14 mM; CuSO4 0,5 mM; ZnSO4 1 mM; NaMoO4 0,2 mM; NaCl 10 mM;
CoCl2 0,01 mM (Kanz y Kirchheim, 1987).
III.4.1.1.2.- Medio de cultivo sólido (Medio GM).
Para la preparación de medio de cultivo sólido, se añadió agar bacteriológico
europeo (Scharlau, concentración final de 0,8% m/v) al resto de los componentes. Tras su
Materiales y Métodos 68
esterilización en autoclave, se dejó atemperar el medio a 55ºC, se agregaron los antibióticos
en aquellos casos en los que fue necesario, y se realizó el vertido en placas de Petri. Las
placas se almacenaron precintadas a 4ºC.
Medio GM: NH4NO3 10,3 mM; H3BO3 50,1 mM; CaCl2 1,5 mM; CoCl2·6H2O 50 nM;
Na2EDTA 55,4 µM; MgSO4 0,75 mM; MnSO4·H2O 50 µM; NaMoO4·2H2O 0,5 µM; KNO3 9,4
mM; KH2PO4 0,62 mM; ZnSO4·7H2O 15 µM; sacarosa 29,2 mM; MES [ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico] 2,3 m; pH 5,7; agar 0,8% m/v.
III.4.1.2.- Medios de cultivo para microorganismos.
III.4.1.2.1.- Medios de cultivo líquido.
LB (Luria-Bertani): 1% NaCl (m/v), 0,5% extracto de levadura (m/v, Scharlau), 1%
bacto-triptona (m/v, Scharlau), pH 7,5. Para el cultivo de Agrobacterium tumefaciens, se
enriqueció el medio con glucosa (0,5% m/v).
III.4.1.2.2.- Medios de cultivo sólido.
Para la elaboración de medios de cultivo sólido se agregó agar bacteriológico
europeo (Scharlau) a una concentración final del 1,5% (m/v). Las placas se almacenaron
precintadas a 4ºC.
III.4.1.2.3.- Medios de cultivo con antibióticos.
En determinadas ocasiones, se añadió antibiótico (Tabla III.4) a los medios de
cultivo. Ls antibióticos que se han utilizado en esta Tesis se muestran en la Tabla III.4.
Tabla III.4.- Antibióticos utilizados.
a
Antibiótico
Solvente
Ampicilina
Carbenicilina
Kanamicina
Tetraciclina
Cloranfenicol
Rifampicina
Higromicina
H2O
H2O
H2O
H2O
Etanol
DMSOa
H2O
Dimetil Sulfóxido
Concentración de la
solución madre (mg/ml)
100
50
50
12,5
150
50
20
Concentración final
(µg/ml)
100
50
50
12,5
150
50
20
Temperatura de
almacenamiento (ºC)
-20
-20
-20
-20
-20
-20
4
Materiales y Métodos 69
III.4.2.- Disoluciones y tampones.
III.4.2.1.- Disoluciones de uso común.
SDS 20%
20X SSC: NaCl 3 M, 0,3 M citrato sódico, pH 7,0.
TE pH 8: Tris-HCl 10 mM pH 8, Na2EDTA 1 mM pH 8.
III.4.2.2.- Disoluciones para el aislamiento de DNA genómico.
10X tampón de lisis: 3,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM Na2EDTA pH 8.
Tampón de extracción: Tampón de lisis 1X, Na2EDTA 50 mM pH 8, urea 7 M, 2 %
sarkosyl (N-dodecanoil-N-metilglicina, sal sódica). Se prepara inmediantamente antes de su
uso.
III.4.2.3.- Disoluciones empleadas en el aislamiento de DNA plasmídico.
STE: NaCl 0,1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 8) y Na2EDTA 1 mM (pH 8).
Solución I o de resuspensión: glucosa 50 mM; Tris-HCl 25 mM, Na2EDTA 10 mM.
Solución II o de lisis: Preparada en el momento de su utilización. SDS 1% (v/v);
NaOH 0,2 M.
Solución III o de neutralización: acetato potásico 3 M, ácido acético 11,5 % (v/v).
III.4.2.4.- Disoluciones para el aislamiento de RNA.
III.4.2.4.1.- Disoluciones para el aislamiento de mRNA (poliA+).
Para la preparación de estas soluciones se utilizó agua tratada con dietil
pirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich).
Tampón de lisis y unión: Tris-HCl, LiCl 0,5 M, Na2EDTA 15 mM, 1,4-ditiotreítol
(DTT) 2,5 mM y sal de litio lauril sulfato (LiDS, Sigma-Aldrich) 0,1 % (m/v). pH 7,5.
Tampón de lavado A: Tris-HCl 10 mM, LiCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM y LiDS 0,1%
(m/v).
Tampón de lavado B: Tris-HCl 10 mM, LiCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM, pH 7,5.
Tampón de elución: Tris-HCl 10 mM pH 7,5.
Tampón de reacondicionamiento de las esferas magnéticas: NaOH 100 mM.
Tampón de almacenamiento de las esferas magnéticas: Tris-HCl 250 mM,
Na2EDTA 20 mM, Tween-20 0,1% (v/v), azida sódica 0,02% (m/v) pH 7,5.
Materiales y Métodos 70
III.4.2.4.2.- Disoluciones para el aislamiento de RNA total.
Todas la soluciones utilizadas se comercializan junto con el kit utilizado de
aislamiento de RNA total denominado RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc).
III.4.2.5.- Disoluciones utilizadas en electroforesis.
50X TAE: Tris-HCl 2 M; ácido acético 5,71%, EDTA 50 mM, pH 8,0.
10X TBE: Tris-HCl 0,89 M, BO3H3 0,89 M, Na2EDTA 20 mM, pH 8,0.
Tampón de carga para electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes: glicerol al 30% (v/v); azul de bromofenol 0,25% (m/v), xilene de cianol
0,25% (m/v), formamida desionizada 50% (v/v).
Tampón de carga para electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida en
condiciones no desnaturalizantes: glicerol al 30% (v/v); azul de bromofenol 0,25% (m/v),
xilene de cianol 0,25% (m/v).
III.4.2.6.- Disoluciones para el análisis Southern.
HCl 250 mM.
Solución de desnaturalización: NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M.
Solución de neutralización: NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5.
Solución de prehibridación: Na2HPO4 250 mM, SDS 7%, EDTA 1 mM, “agente
bloqueante” 0,5% (m/v, Roche Diagnostics), pH 7,2.
Solución de hibridación: Idéntica a la anterior junto a la sonda de DNA a una
concentración 40 ng/ml.
Tampón maleico: ácido maleico 150 mM; NaCl 125 mM, Tween 20 (v/v, SigmaAldrich) 0,3%, pH 8.
Solución bloqueante: “agente bloqueante” 0,5% (m/v, Roche Diagnostics) en
tampón maleico.
Tampón para la detección quimioluminiscente y colorimétrica: Tris-HCl 0,1 M,
NaCl 0,1 M, MgCl2 50 mM, pH 9,5.
III.4.2.7.- Disoluciones empleadas en la identificación de clones bacterianos mediante
hibridación.
Solución de lavado: 2X SSC, 0,1% SDS.
Solución de desnaturalización: NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M.
Solución de neutralización: NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5.
Materiales y Métodos 71
Solución de prehibridación: Se utilizó la misma solución que la empleada en el
análisis de tipo Southern.
Solución de hibridación: solución de prehibridación junto a una sonda de DNA a
una concentración de 20 ng/ml.
Tampón maleico: idéntico al descrito en el apartado III.4.2.6.
Solución bloqueante: idéntica a la descrita en III.4.2.6.
Tampón de detección colorimétrica: idéntico al descrito en el apartado III.4.2.6.
III.4.2.8.- Disoluciones utilizadas en la hibridación in situ de tejidos.
20X SSC.
Solución para el anticuerpo y los lavados: 1X TBS, BSA 5% (m/v), Tritón X-100
0,3% (v/v).
Solución de prehibridación: 6X SSC, SDS 1,5% (m/v), formamida 50% (v/v), tRNA
de levadura (100 µg/ml).
Solución de hibridación: Solución de prehibridación junto a una ribosonda a una
concentración particular.
20X PBS: NaCl 2,75 M, KCl 50 mM, Na2HPO4 200 mM y KH2PO4 35 mM (pH 7,4).
Tampón para proteinasa K (5X): Tris-HCl 0,5 M, Na2EDTA 250 mM, pH 8,0.
10X TBS: Tris-HCl 1 M, NaCl 4 M, pH 7,5.
Solución bloqueante con TBS: 1X TBS y “agente bloqueante” 0,5% (m/v, Roche
Diagnostics).
Tampón de detección A 10X: Tris-HCl 1 M, NaCl 1M, pH 9,5.
Tampón de detección B 10X: MgCl2 0,5 M.
Tampón de detección: 1X tampón A + 1X tampón B.
III.4.2.9.- Disolución para infiltración de plantas con Agrobacterium tumefaciens.
Se resuspendieron los cultivos bacterianos en sacarosa 5% (m/v, preparada
inmediatamente antes de su uso) hasta alcanzar una A600 de 0,8 y se añadió el detergente
Silwet-L77 0,035% (v/v, Lehle Seeds).
III.4.2.10.- Solución de esterilización de semillas de Arabidopsis thaliana.
NaClO 5% (v/v, a partir de lejía comercial), Tritón X-100 0,003% (v/v).
Materiales y Métodos 72
III.4.2.11.- Sustrato para cultivo de Arabidopsis thaliana en maceta.
Perlita (granulometría de 1 a 3 mm; 105-125 kg/m3; Asfaltex S.A.), vermiculita
(granulometría de 0 a 3 mm; 80-100 kg/m3; Asfaltex S.A.), y turba no fertilizada (turba rubia
de musgo Sphagnum de estructura gruesa; Kekkilä OY, Tuusula, Finlandia) en proporción
2:2:1. La mezcla se esterilizó en el autoclave.
III.5.- CONDICIONES Y MÉTODOS DE CULTIVO.
III.5.1.- Condiciones y métodos de cultivo para Arabidopsis thaliana.
III.5.1.1.- Cultivos en placas de Petri.
Tras esterilizar las semillas (8 min en la solución de esterilización reseñada en el
apartado III.3.2.11 y tres enjuagues con agua estéril), éstas se dispusieron regularmente en
placas de Petri de 150 mm con medio sólido GM estéril. Las semillas se estratificaron a 4ºC
durante 24 h y se trasladaron a incubadores Sanyo MLR-350H, en unas condiciones de
20±1ºC, 60-70% de humedad relativa y con iluminación continua de 7.000 lux (tubos
fluorescentes Toshiba FL40SS·W/37). Después de un periodo de entre 15 y 22 días, las
plantas se trasplantaron a macetas o bandejas completando su ciclo de vida en la cámara
climática.
III.5.1.2.- Cultivos en maceta.
Se utilizaron bandejas de plástico de 28 x 50 cm con 42 alveolos de 5 x 5 cm (altura
x diámetro) con un orificio en la parte inferior, o macetas cuadradas de 12 x 12 x 5 cm con
pequeños orificios, dispuestas en el interior de cubetas de plástico. En los alveolos se
colocaron cestillos de plástico con rejilla rellenos de la mezcla de sustrato. En las macetas
cuadradas, el sustrato se dispuso directamente en su interior. Como solución nutritiva se
utilizó ATM (III.4.1.1.1) mediante subirrigación.
Se trasplantó a cada cestillo una sola planta procedente de las placas de Petri. En el
caso de las macetas, se trasplantaron entre 25 y 40 plantas por maceta. En ocasiones, se
sembraron semillas directamente sobre el sustrato sin necesidad de esterilización. En
ambos casos, se taparon las cubetas con plástico transparente de uso alimentario
agujereado en varios puntos con el fin de evitar la vitrificación de las plantas por un exceso
de humedad. El plástico se eliminó a los 3 días tras el trasplante o bien a los 10 días tras la
siembra directa en el sustrato. En el caso de la siembra en cestillo, tras eliminar el plástico
se colocaron soportes y cilindros de plástico del sistema aracon (Arabidopsis condom, Beta
Materiales y Métodos 73
Tech, Bélgica), que separan unos individuos de otros. En el caso de la siembra directa en
maceta, las semillas se incubaron a 4ºC durante las 48 h iniciales.
Las plantas se mantuvieron en la cámara climática a una temperatura de 20ºC±1ºC,
60-70% de humedad relativa y 7.000 lux de iluminación continua generada por tubos
fluorescentes Philips F72T12/D/VHO 160 W 1500 SF (luz blanca fría), y bombillas
incandescentes de filamento de tungsteno de 60 W (luz roja). Durante las dos primeras
semanas de crecimiento en la cámara climática, se regaron las plantas con solución nutritiva
ATM, y posteriormente con agua potable de la red.
III.5.1.3.- Realización de cruzamientos.
En la realización de cruzamientos entre distintas estirpes de Arabidopsis thaliana,
inmediatamente antes del estadio de antesis, a las flores de plantas que actuaron como
parental femenino se les retiraron sépalos, pétalos y estambres con ayuda de pinzas de
cirugía y una lupa de 2,5 aumentos con iluminación, o bien una lupa binocular (Leica Zoom
2000). Posteriormente, se pusieron en contacto las anteras maduras del donante de polen
(parental masculino) con el pistilo de la planta aceptora. Las semillas resultantes se
almacenaron a 4ºC.
III.5.2.- Condiciones y métodos de cultivo para Escherichia coli y Agrobacterium
tumefaciens.
Los cultivos se efectuaron a 28ºC en el caso de Agrobacterium tumefaciens, o a 37ºC
para el crecimiento de Escherichia coli y se mantuvieron en agitación continua (E. coli a 225
rpm; Agrobacterium tumefaciens a 270 rpm) en un incubador con agitación orbital Sanyo
MIR222-RL. Para la realización de microcultivos (de 200 µl a 1 ml de cultivo) se utilizó un
agitador para tubos eppendorf con control de temperatura (Thermomixer Compact,
Eppendorf, Alemania). El cultivo en presencia de antibióticos se realizó con las
concentraciones reflejadas en la Tabla III.4.
Para la conservación de estirpes bacterianas, a 1 ml de cultivo en medio líquido con
LB (y el correspondiente antibiótico, en caso de ser necesario) se le añadieron 500 µl de
glicerol al 80% (v/v) y se almacenó a –80ºC.
Materiales y Métodos 74
III.6.- ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E HISTOLÓGICAS.
En este apartado se describen las técnicas utilizadas en la realización de los estudios
fenotípicos, tanto macro- como microscópicos, de las plantas de Arabidopsis thaliana
analizadas.
III.6.1.- Fotografía a bajo aumento.
Para obtener imágenes a bajo aumento de los distintos rasgos fenotípicos se han
utilizado las cámaras digitales Mavica FD-877 (Sony) y CoolPix 5400 (Nikon).
En los exámenes preliminares de las características fenotípicas, se utilizó una lupa
binocular Leica Zoom 2000. Para los análisis pormenorizados de características fenotípicas
resaltables, nos servimos de las lupas binoculares Nikon SMZ 800 y Nikon SMZ 1500,
provistas de una unidad de iluminación externa de luz blanca fría (Volpi Intralux 5000-1) y
conectadas a una cámara digital DXM1200F (Nikon) para la captura de imágenes.
III.6.2.- Microscopia óptica.
III.6.2.1.- Inclusión en resina JB4.
Para la inclusión en resina se ha utilizado el sistema denominado JB-4 (Polyscience),
compuesto de tres elementos: A, la resina; B, un agente polimerizador y C, el catalizador. La
resina es miscible en agua lo que permite el procesado completo de la muestra sin su total
deshidratación.
Las muestras se trataron con el fijador FAA/Tritón-X100 (ácido acético glacial 5%,
formalina 1,75%, etanol 50%, Tritón-X100 1%) y se sometieron a vacío (500 mb, 45 min). Se
reemplazó el fijador por otro recién preparado y se dejó a temperatura ambiente durante 1 h.
Para la deshidratación se eliminó el fijador y se trató con etanol 70% durante toda la noche a
4ºC. Se prosiguió el tratamiento sometiendo las muestras a series de 2 h en etanol en
concentraciones crecientes (80%, 90% y 95%). Para la tinción, se añadió safranina (0,5%
m/v, Sigma-Aldrich) en etanol al 95%, dejando de nuevo a 4ºC durante toda la noche. Para
eliminar la sobretinción, se lavaron las muestras con etanol 95% durante 2 h a temperatura
ambiente. Posteriormente, se preparó la solución de la resina activa disolviendo 1,25 g del
catalizador C (peróxido de benzoilo, Polyscience) en 100 ml de la solución de la resina (A),
con agitación. A continuación se elaboró una mezcla 1:1 de etanol 95% y solución de resina,
añadiéndola a las muestras tras eliminar el etanol 95%. Se incubó a temperatura ambiente
durante 3 h, se sustituyó esta mezcla por solución de resina activa y se mantuvo de nuevo a
temperatura ambiente durante 3 h. Se mezclaron 25 ml de resina activa con 1 ml de solución
Materiales y Métodos 75
de polimerización (B) en un tubo falcon de 50 ml, y se añadió a los moldes (Polyscience) en
los que se encontraba la muestra tras ser incubada con la resina activa. Los moldes se
incubaron a 55ºC envueltos en plástico transparente de uso alimentario en un horno de
hibridación, favoreciendo así la polimerización. Los moldes se pegaron en la orientación
adecuada en cilindros de aluminio con un adhesivo instantáneo (Loctite, Henkel). Las
secciones histológicas obtenidas en el microtomo (2050 Supercut, Reichert-Jung,
Cambridge Instruments Gmbh) se tiñeron con azul de toluidina (Sigma-Aldrich) al 1% y ácido
bórico al 0,6%.
Para la visualización se utilizó un microscopio Nikon Eclipse E-800, realizando el
montaje con una gota de Eukitt (O.Kindler GMBH & Co.). Las imágenes correspondientes se
obtuvieron con una cámara digital DXM1200F (Nikon) acoplada al microscopio.
III.6.2.2.- Inclusión en parafina.
Tras la fijación inicial de las muestras (sometidas a vacío a 100 mb durante 10 min
en etanol 50%, ácido acético glacial 5%, formaldehído 3,7%), se reemplazó la solución de
fijación por otra recién preparada y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Se
deshidrataron las muestras (etanol 70% 30 min, etanol 95% 30 min) y se efectuó la tinción
con Eosina Y 0,2% (m/v, Sigma-Aldrich) en etanol 95% durante 2 h a temperatura ambiente,
y a continuación toda la noche a 4ºC. La aclaración o diafanización del tejido (imbibición del
tejido en una sustancia miscible en parafina para facilitar su inclusión) se llevó a cabo con
Histoclear (National Diagnostics) que, esencialmente, se compone de limoneno. Durante la
diafanización se incubaron a temperatura ambiente las muestras en las siguientes
soluciones durante 2 h:
1)
Etanol 100% de gran pureza (dos incubaciones sucesivas).
2)
Histoclear 25% y etanol 75%.
3)
Histoclear 50% y etanol 50%.
4)
Histoclear 75% y etanol 25%.
5)
Histoclear 100% (dos incubaciones sucesivas).
Una vez realizados estos pasos, se vaciaron a la mitad los recipientes con las
muestras y se añadió parafina Paraplast-Plus (Sherwood Medical) fundida a 60ºC, dejando
toda la noche a dicha temperatura. Se realizaron varios cambios de parafina para permitir su
penetración en el tejido y la eliminación del Histoclear.
Materiales y Métodos 76
Se confeccionaron bloques de parafina con las muestras. En una placa calefactora
(Plactronic, Selecta) a 55ºC, se realizó el montaje empleando moldes metálicos con una
zona cóncava (Selecta) rellena de parafina fundida, en la que se depositaron las muestras
en la orientación deseada. Tras enfriarse la parafina, se desmontaron los bloques. Se
efectuaron los cortes en el microtomo y se dispusieron en un baño a 42ºC. Las secciones se
desparafinaron con Histoclear y se montaron añadiendo una gota de Eukitt. Se utilizó el
microscopio Nikon Eclipse E-800 con iluminación de campo claro, con una cámara digital
acoplada DXM1200F (Nikon) para la obtención de imágenes.
III.6.3.- Microscopía electrónica de barrido (SEM).
Las muestras se trataron con la solución fijadora FAA/Tritón X-100, sometiéndolas a
vacío (90 min, 500 mb). Se sustituyó el fijador por otro fresco incubando a temperatura
ambiente durante 1 h. Tras decantar el fijador se incubó en etanol 70% toda la noche a 4ºC.
Se deshidrataron las muestras en series crecientes de etanol (80%, 90%, 95% y 100%)
durante 2 h en cada una. Tras la deshidratación se realizó el punto crítico (critical point
drying), consistente en la desecación completa de la muestra sustituyendo el etanol por CO2
con un aparato EM5850 (Electron Microscopy Sciences). Para la colocación de las muestras
en los pedestales metálicos, se utilizó cinta de carbono adhesiva por ambas caras (Electron
Microscopy Sciences). Posteriormente, las muestras se recubrieron con oro utilizando un
recubridor Sputter Coater SCDOO4 (Balzers). Las muestras se observaron y fueron
fotografiadas en un microscopio electrónico de barrido JEOL modelo JSM-840 conectado a
un ordenador para el almacenamiento de la captura de las imágenes.
III.6.4.- Microscopía electrónica de barrido de baja temperatura (LTSEM).
Basado en el principio de microscopia electrónica de barrido, este método permite
obtener imágenes de muestras en fresco sin necesidad de ser fijadas. Se puede aplicar en
aquellas situaciones en las que la muestra presente un elevado grado de fragilidad, o en los
casos en los que la fijación resulta demasiado agresiva para su estructura.
Para su preparación, se adhirió el espécimen a una cinta adhesiva de cobre y se
transfirió rápidamente en fresco a la precámara del microscopio, donde se congeló con
nitrógeno líquido y se transfiere a una cámara donde un haz de electrones bombardea la
muestra y se genera una imagen tridimensional que puede ser captada utilizando un sistema
de análisis de imagen. Se utilizó un microscopio Hitachi S-9000.
Materiales y Métodos 77
III.7.- AISLAMIENTO Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
III.7.1.- Preparaciones de DNA genómico de Arabidopsis thaliana.
Hemos seguido el método de obtención de DNA genómico de Arabidopsis thaliana
desarrollado por Dean et al. (1992) y modificado por Li et al. (1999).
El material vegetal se congeló con nitrógeno líquido y se homogeneizó en presencia
de tampón de extracción (apartado III.4.2.2). Se incubó durante 10 min a 37ºC y 225 rpm. A
continuación, se añadió 1/2 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:25:1) y, de
nuevo, se incubó 10 min a 37ºC y 225 rpm, tras lo cual se centrifugó durante 10 min a
13.000 rpm. A la fase acuosa se le añadió aproximadamente un volumen de isopropanol y
1/10 de volumen de NaOAc 3M. Tras precipitar unos minutos en hielo, se centrifugó la
muestra durante 15 min a 13.000 rpm. El precipitado se lavó con etanol absoluto y se
resuspendió en agua estéril. A continuación, se dializaron las muestras durante 15 min
utilizando un filtro de nitrocelulosa (Millipore) de 0,025 µm de diámetro de poro, sobre el que
se depositaron las muestras. Tras la diálisis se cuantificó el DNA en un espectrofotómetro
Biophotometer (Eppendorf, Alemania), midiendo una dilución 1:50 de cada preparación.
III.7.2.- Obtención de RNA Arabidopsis thaliana.
Durante el desarrollo de los experimentos con RNA se han seguido las precauciones
convencionales para conseguir un ambiente libre de ribonucleasas (Blumberg, 1987).
III.7.2.1.- Obtención de mRNA (poliA+).
Para el aislamiento del RNA poliadenilado o RNA-poliA, se utilizó el kit Dynabeads
Oligo (dT)25 (Dynal Biotech).
Con este kit se lleva a cabo un aislamiento rápido a partir de una pequeña cantidad
de material, sin necesidad de un aislamiento previo de RNA total u otro tipo de
purificaciones. La extensión poli-A+ de muchos de los RNA mensajeros se une al oligo-(dT)25
que se encuentra adherido a la superficie de las esferas magnéticas que caracterizan a este
kit. Una ventaja de este sistema es la posibilidad de poder utilizar el mRNA unido a las
esferas magnéticas en reacciones de RT-PCR, sin necesidad de elución previa. Se
siguieron las instrucciones del proveedor partiendo de 100 mg de material vegetal. Las
extracciones se almacenaron a –80ºC. El rendimiento de ácidos nucleicos se midió como en
el apartado II.7.1.
Materiales y Métodos 78
III.7.2.2.- Obtención de RNA total.
Para el aislamiento del RNA total, hemos utilizado el sistema RNeasy Mini Kit
(Qiagen Inc) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Este kit está basado en la capacidad selectiva de unión a RNA que presentan las
membranas de las columnas de purificación. Tras la elución, se añadió a cada una de las
muestras 1 µl (10 U) de DNasa (Roche Diagnostics), junto con 20 U (0,5µl) de inhibidor de
Rnasas (RNasin, Roche Diagnostics) con el fin de eliminar las trazas de DNA. Las muestras
se incubaron a 37ºC durante 45 min. Se realizaron dos extracciones con cloroformo,
centrifugando 5 min a 13.000 rpm, y se precipitó con etanol y NaOAc 3M. Tras resuspender,
se cuantificó el rendimiento de las muestras de igual forma que en el apartado III.7.1.
III.7.3.- Obtención de DNA plasmídico.
Para la obtención de preparaciones a pequeña escala (minipreps) de DNA
plasmídico de pequeño tamaño, se partió de cultivos bacterianos de 3-10 ml de medio
líquido LB. Empleamos el kit Concert Rapid Plasmid Miniprep System (Gibco BRL), basado
en el método clásico de la lisis alcalina, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se verificó
el rendimiento de la extracción mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido
con bromuro de etidio. El rendimiento de ácidos nucleicos se midió como en el apartado
III.7.1.
En los aislamientos de DNA plásmídico a mayor escala y en la obtención de BAC de
estirpes de Escherichia coli, se empleó el método de lisis alcalina, realizando la precipitación
con polietilénglicol y NaCl de acuerdo con Sambrook y Russell (2001). Finalmente, se
resuspendió el precipitado en 100 µl de TE pH pH 7,6 o en agua y se realizó una
cuantificación espectrofotométrica como en el apartado III.7.1. La integridad de los BAC se
verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Las preparaciones obtenidas se
almacenaron a –20ºC.
III.7.4.- Tratamiento de DNA con enzimas de restricción.
Se procuró utilizar una relación de 1 U de enzima por cada µg de DNA a digerir,
durante un tiempo que varió de 2 h a toda la noche. Las enzimas se inactivaron por
incubación a 70ºC durante 15 min y se verificó el resultado de la digestión mediante
electroforesis en gel de agarosa.
Materiales y Métodos 79
III.7.5.- Reacciones de ligación de DNA.
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 10 a 15 µl, en el caso de
tratarse de ligaciones intermoleculares, o 250 µl para reacciones intramoleculares, usando
de 1 a 2,5 U de enzima ligasa del bacteriófago T4 (Fermentas). En los ensayos de clonación
de un inserto en un plásmido se utilizó un relación molar vector:inserto de entre 1:3 a 1:6.
Los tubos de reacción se incubaron 3 h a temperatura ambiente o toda la noche a 16ºC.
III.7.6.- Transformación bacteriana.
III.7.6.1.- Transformación por choque térmico.
Para la obtención de células competentes partimos de la estirpe DH5α de E. coli y se
siguió el protocolo descrito en Sambrook
y Russell (2001). Las cantidades de DNA
empleadas para transformar oscilaron entre 1 y 10 ng.
III.7.6.2.- Electroporación.
Se utilizó esta técnica en aquellos casos donde se requería un elevado número de
transformantes o en el caso de Agrobacterium tumefaciens, donde fue el método rutinario de
transferencia. Las cepas bacterianas utilizadas con este procedimiento fueron DH10β (E.
coli), y LBA4404 y C58C51 (Agrobacterium tumefaciens). Las muestras de DNA se
dializaron con membranas de nitrocelulosa de 0,025 µm de diámetro de poro durante 15
min. Utilizamos un electroprador modelo Electroporator 2510 (Eppendorf, Alemania). Se
utilizaron cubetas Eppendorf de 2 mm de paso con los siguientes parámetros: 2.500 V de
descarga, 10 µF y 330 Ω de resistividad.
III.7.7.- Técnicas electroforéticas.
III.7.7.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE).
III.7.7.1.1.- Condiciones no desnaturalizantes.
Empleamos esta técnica para el análisis de moléculas de DNA de muy pequeño
tamaño en geles de entre el 6 y el 8% de acrilamida (Pronadisa, acrilamida:bisacrilamida
29:1) con tampón 1X TAE. Las bandas de ácidos nucleicos se observaron mediante tinción
convencional con bromuro de etidio e iluminación con luz ultravioleta (312 nm). Para la
visualización se utilizó una lámpara ultravioleta acoplada a un documentador de geles
GeneDOC con cámara digital (Vilmer Lourmat).
Materiales y Métodos 80
III.7.7.1.2.- Condiciones desnaturalizantes.
Este tipo de electroforesis se utilizó en el análisis de las reacciones de transcripción
in vitro para la obtención de ribosondas. Se emplearon geles del 6% de acrilamida
(acrilamida:bisacrilamida, 29:1) en presencia de 0,5X TBE y urea 8 M. Para la visualización
de las bandas se procedió como en el apartado anterior.
III.7.7.2.- Electroforesis en geles de agarosa.
III.7.7.2.1.- Condiciones no desnaturalizantes.
Se prepararon geles con agarosa de punto medio de electroendósmosis (Ecogen) y
un rango de concentración comprendido entre 0,8% y 2,5% (m/v), empleando como
electrolito 1X TAE. Los geles contenían bromuro de etidio (0,5 µg/ml) lo que permitió, la
visualización inmediata de los ácidos nucleicos con iluminación con luz ultravioleta.
III.7.8.- Recuperación de DNA a partir de geles de agarosa.
Para este fin se siguió un procedimiento basado en la fusión de la agarosa,
cromatografía en una matriz de sílice y posterior elución siguiendo las instrucciones
proporcionadas por el fabricante (GENE-CLEAN, BIO-101).
Se verificó el éxito del procedimiento mediante electroforesis en gel de agarosa
(apartado
III.7.7.2.1).
Se
diluyeron
las
muestras
(1:50)
y
se
cuantificaron
espectrofotométricamente.
III.7.9.- Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
III.7.9.1.- PCR convencional.
Las amplificaciones mediante PCR (Mullis et al., 1986) se llevaron acabo partiendo
de una cantidad de DNA molde comprendida entre 5 ng y 40 ng, en presencia de 0,3 µM de
cada uno de los oligonucleótidos y 0,8 mM de una mezcla equimolar de cada
desoxirribonucleótido (dNTP; 0,2 mM de cada uno de ellos). Se añadió 1 U/µl de reacción de
Taq polimerasa (EcoGen). En aquellas situaciones en las que se requería una elevada
fidelidad de copia se utilizó una mezcla de polimerasas con actividad correctora de prueba
(High Fidelity, Roche Diagnostics). En cada uno de los casos se siguieron las condiciones
indicadas por el proveedor. Se usaron tubos eppendorf de pared fina (0,2 ml y 0,5 ml). Los
perfiles de reacción se programaron en termocicladores Eppendorf Mastercycler y
Eppendorf Mastercycler Personal.
Materiales y Métodos 81
Las muestras se sometieron a 2 min de desnaturalización inicial a 93-95ºC, 20-35
ciclos de 20-45 s de desnaturalización a 93-95ºC, 20-30 s de apareamiento a 45-70ºC y un
periodo de extensión a 72ºC de 20 s a varios minutos. La temperatura de hibridación (Tm,
melting temperature o annealing temperature) utilizada fue siempre 5-10ºC inferior a la
resultante de aplicar la siguiente fórmula con cada oligonucleótido empleado:
Tm = 69,3 + 0,41·[%(G + C) del cebador] – (650/L)
L= longitud del cebador en pb
En aquellos casos en los que se añadió una diana para endonucleasa de restricción
en el extremo 5’ del cebador, la secuencia correspondiente no computó en el cálculo de la
Tm. Las reacciones se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa o
poliacrilamida no desnaturalizantes.
III.7.9.2.- PCR de asimetría térmica entrelazada o TAIL-PCR.
La TAIL-PCR (Thermal Asymetric Interlaced PCR) permite la obtención de
secuencias desconocidas adyacentes a una región de secuencia conocida. Por este motivo
constituye una metodología de gran utilidad en la caracterización de las secuencias
genómicas que flanquean al T-DNA (Liu et al., 1995; Singer et al., 2003). Consiste en la
utilización de tres oligonucleótidos imbricados consecutivos de secuencia conocida
(oligonucleótidos específicos, OE) y correspondientes a la secuencia conocida (el T-DNA en
nuestro caso), con temperaturas de hibridación decrecientes desde el situado más en 5’ al
situado más hacia 3’ (el primer oligonucleótido tiene mayor temperatura de hibridación que
el segundo y éste que el tercero). Estos cebadores se enfrentan de manera secuencial a un
oligonucleótido de pequeño tamaño y arbitrariamente degenerado (AD) en tres series
consecutivas de reacciones de PCR con ciclos complejos (ver Tabla III.5), estando la
eficacia de amplificación de los productos, tanto específicos como no específicos, controlada
por la temperatura (Liu et al., 1995).
En el proceso, el primero de los oligonucleótidos específicos (OE) se enfrenta a tres
cebadores degenerados (AD1, AD2 y AD3) en distintas reacciones en paralelo de 20 µl. Se
tomó 1 µl de una dilución 1:50 (v/v) de las primeras reacciones como molde en la siguiente
tanda de reacciones (20 µl). Los mismos oligonucleótidos degenerados se enfrentaron al
segundo OE.
Materiales y Métodos 82
Estas nuevas reacciones de PCR se diluyeron de igual modo y constituyeron los
moldes para la tercera ronda de amplificación entre el tercero de los OE y los
oligonucleótidos degenerados inespecíficos. En esta última amplificación el volumen de
reacción fue de 100 µl. Tanto las primeras como las segundas rondas de amplificación se
realizaron bajo unas condiciones de reacción muy restrictivas, siendo en la tercera fase
donde se reduce el rigor de las mismas (ver Tabla III.5). En cada una de las rondas de
amplificación se utilizaron concentraciones de cebadores diferentes.
Tabla III.5.- Características y perfiles de las reacciones de TAIL-PCR.
Reacción primaria
Reacción secundaria
Reacción terciaria
Condiciones de cebadores
AD1= 1,5 µM
AD2 y AD3= 2 µM
OE-1a= 0,2 µM
Condiciones de cebadores
AD1= 1,5 µM
AD2 y AD3= 1,5 µM
OE-2= 0,2 µM
Condiciones de cebadores
AD1= 1,5 µM
AD2 y AD3= 1,5 µM
OE-3= 0,2 µM
Perfil
Perfil
1º) 93ºC ------ 1 min
1º) 94ºC ------ 10 s
2º) 95ºC ------ 1 min
2º) 64ºC ------ 1 min
3º) 94ºC ------ 30 s
3º) 72ºC ------ 2 min 30 s
4º) 62ºC ------ 1 min
4º) 94ºC ------ 10 s
5º) 72ºC ------ 2 min 30 s
5º) 64ºC ------ 1 min
6º) 94ºC ------ 30 s
6º) 72ºC ------ 2 min 30 s
5 ciclos del paso 5º) al 3º).
7º) 94ºC ------ 10 s
8º) 44ºC ------ 1 min
7º) 25ºC ------ 3 min
9º) 72ºC ------ 2 min 30 s.
Se incrementa de forma
12 ciclos desde el paso 9º
paulatina la temperatura
al 1º.
desde 25ºC
hasta 72ºC en un intervalo 10º) 72ºC ------ 7 min
de 3 min (15ºC/min).
11º) 4ºC ------ ∞
8º) 72ºC ------ 2 min 30 s
9º) 94ºC ------ 10 s
10º) 68ºC ------ 1 min
11º) 72ºC ------ 2 min 30 s
12º) 94ºC ------ 10 s
13º) 68ºC ------ 1 min
14º) 72ºC ------ 2 min 30 s
15º) 94ºC ------ 10 s
16º) 44ºC ------ 1 min
17º) 72ºC ------ 2 min 30 s
Se repite 15 veces desde el
paso 17º al 10º.
18º) 72ºC ------ 7 min
19º) 4ºC ------ ∞
a
Cebador específico de cada reacción.
Perfil
1º) 94ºC ------ 2 min
2º) 94ºC ------ 15 s
3º) 44ºC ------ 1 min
4º) 72ºC ------ 2 min 30 s
25 ciclos desde el paso 4º al
2º.
5º) 72ºC ------ 7 min
6º) 4ºC ------ ∞
Materiales y Métodos 83
El resto de los componentes de la reacción se mantuvieron en las mismas
condiciones establecidas en el apartado III.7.9.1. Se examinó 1/10 de cada una de las
reacciones mediante electroforesis en gel de agarosa.
III.7.9.3.- PCR inversa (IPCR).
La técnica de PCR inversa también permite el aislamiento de secuencias
desconocidas adyacentes a una región ya caracterizada (Ochman et al., 1988; Triglia et al.
1988; Hartl et al., 1996). Se digiere completamente una muestra de DNA con una sola
endonucleasa de restricción. El conjunto de moléculas resultante es sometido a una ligación
intramolecular para su circularización, utilizándose una alícuota de esta ligación como molde
en una reacción de PCR que utiliza dos cebadores adyacentes y divergentes en el territorio
de secuencia conocida.
En nuestro laboratorio, la técnica de IPCR ha sido empleada en el estudio de las
secuencias adyacentes a los bordes derecho (RB) e izquierdo (LB) de las inserciones de TDNA pGKB5 (ver Figura III.2). Se realizaron los siguientes pasos:
1) Digestión en un volumen de reacción de 50 µl utilizando, en este caso, 2 µg de DNA
genómico y 30 unidades de la restrictasa correspondiente (EcoRI, NdeI, HindIII,
ApaI, BglII y SalI, Roche-Diagnostics), y comprobación mediante electroforesis en
geles de agarosa.
2) Ligación de los productos de restricción durante toda la noche a 16ºC, utilizando 10
unidades de la ligasa del fago T4 (Fermentas) y 25 µl de cada restricción en un
volumen final de reacción de 250 µl.
3) Extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitación con
etanol absoluto en presencia de acetato sódico 0,3 M para, finalmente, resuspender
en 10 µl de agua destilada o TE.
4) Reacción de PCR en un volumen final de reacción de 50 µl utilizando como molde 1
µl de la resuspensión anterior.
5) Electroforesis en gel de agarosa y extracción de las bandas para su secuenciación.
III.7.9.4.- Retrotranscripción y PCR (RT-PCR).
La primera hebra de cDNA se obtuvo partiendo de 1 µg de RNA poliadenilado
(apartado III.7.2.1) o 5 µg de RNA total (apartado III.7.2.2), 40 U mA260 de oligo(dT)15 como
cebador (Roche Diagnostics) y 1 mM de cada uno de los dNTPs. La mezcla de reacción se
Materiales y Métodos 84
incubó durante 5 min a 70ºC y, posteriormente, se añadieron 40 U de retrotranscriptasa (MMuLV, Roche Diagnostics) y 30 U de inhibidor de RNasa (Roche Diagnostics), incubándose
a 37ºC durante 1 h. El volumen empleado en cada reacción fue de 20 µl.
En la siguiente etapa se utilizaron 5 µl de la retrotranscripción como molde en
reacciones de PCR de 25 µl. Se comprobó el resultado mediante el examen de 2,5 µl de la
reacción por electroforesis en gel de agarosa.
III.7.10.- Secuenciación de DNA.
Las reacciones de secuenciación se efectuaron en un termociclador Eppendorf
MasterCycler aplicando las condiciones propuestas en el kit ABI PRISM BigDye Terminator
Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction (Perkin Elmer). Las electroforesis de los productos
de reacción se realizaron en un secuenciador automático ABI PRISM 377 (Perkin Elmer).
III.7.11.- Análisis y tratamiento informático de las secuencias de ácidos nucleicos y
proteínas.
El análisis de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas se realizó, de forma
interactiva a través de Internet, en los distintos bancos de datos internacionales utilizando
los programas BLAST (Altschul et al., 1997; Tatusova y Madden, 1999) de las siguientes
direcciones http://www.ebi,ac.uk/blast2/index.html (EBI, European Bioinformatic Institute del
European
Molecular
Biology
Laboratory,
http://www.arabidopsis.org/wublast/index2.jsp
EMBL;
(TAIR,
The
Rodríguez-Tome,
Arabidopis
2001),
Resource)
y
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ (NCBI, National Center for Biotechnology Information,
Benson et al., 2002). También se usó el programa FASTA (Pearson, 1994) a través de la
dirección http://www.ebi.ac.uk/fasta/index.html (EBI). Para los alineamientos de secuencia
se utilizó el programa CLUSTAL-W (Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996) a través del
servidor del EMBL. Para el alineaminto de secuencias de aminoácidos se usó el programa
CLUSTAL X 1.5b (Thompson et al., 1997).
El análisis de posibles dominios o secuencias específicas, así como la búsqueda de
determinadas
familias
proteicas
se
realizó
a
través
de
la
dirección
http://au.expasy.org/prosite/ donde se encuentra alojada la base de datos PROSITE
(Bairoch, 1991; Hulo et al., 2004).
Materiales y Métodos 85
III.8.- TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN MOLECULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
III.8.1.- Transferencia de DNA a membranas para análisis por hibridación Southern.
III.8.1.1.- Obtención de la sonda marcada.
En todos los casos se utilizaron sondas de DNA generadas por PCR. Como molécula
trazadora se utilizó digoxigenina en forma de digoxigenina-11-dUTP presente en la mezcla
de didesoxi-nucleótidos trifosfato (7 TTP : 1 DIG 11-UTP). Una vez comprobada la reacción,
se precipitó en presencia de etanol y cloruro de litio 0,4 M. Se centrifugó y se resuspendió la
muestra en el volumen deseado.
III.8.1.2.- Transferencia e inmovilización del DNA.
Tras la separación electroforética del DNA en gel de agarosa, se fotografió éste
tomando las referencias pertinentes. Se depurinó el DNA con HCl (250mM) durante 15 min.
Seguidamente, se realizaron dos lavados consecutivos con la solución de desnaturalización
(apartado III.3.2.6), se enjuagó el gel con agua bidestilada estéril y se efectuaron dos
lavados consecutivos con la solución de neutralización. Tras lavar con agua, se procedió a
transferir el DNA a una membrana de nailon (Hybond-N, Amersham Biosciences) en
presencia del tampón de transferencia 20X SSC durante, como mínimo, 12 h.
La membrana se enjuagó con una solución 2X SSC, se dejó secar a temperatura
ambiente, y se irradió con luz UV (crosslinker, UniEquip Research, 120mJ/cm2).
III.8.1.3.- Tratamientos de prehibridación, hibridación con la sonda y lavado de la
membrana.
La prehibridación tuvo lugar con la membrana sumergida en solución de
prehibridación (apartado III.3.2.6) durante 2 h a 65ºC. Se sustituyó la solución de
prehibridación por otro volumen de la misma conteniendo la sonda (previamente
desnaturalizada por calentamiento a 90ºC durante 10 min). La concentración de sonda fue
de 40 ng/ml. La hibridación tuvo lugar durante un mínimo de 12 h a 65ºC.
Tras la hibridación, para eliminar el exceso de sonda, la membrana se lavó dos
veces con 2X SSC y 0,1% SDS a temperatura ambiente seguidos de otros dos con una
solución 0,1X SSC y 0,1% SDS a 65ºC.
III.8.1.4.- Detección quimioluminiscente.
Empleamos un anticuerpo contra la digoxigenina conjugado a una fosfatasa alcalina
(anti-DIG, Roche Diagnostics). Ésta desfosforila al sustrato CSPD, nombre comercial del 3-
Materiales y Métodos 86
(4-metoxiespiro{1, 2-dioxietano-3, 2’-(5’-cloro)triciclo[3.3.1.13.7] decan}-4-il) fenil fosfato
disódico. La desfosforilación genera un compuesto inestable que se descompone emitiendo
luz (λ 466 nm) que puede detectarse con una película fotográfica. Para la detección se
siguieron los pasos que a continuación se detallan:
1)
Equilibrado de la membrana con tampón maleico (III.4.2.6) durante 5 min.
2)
Tratamiento de la membrana con la solución bloqueante (III.4.2.6) durante 1 h.
3)
Incubación de la membrana con una dilución 1:5000 (150 mU/ml) del anticuerpo en
tampón maleico durante 45 min.
4)
Tres lavados de 20 min con tampón maleico para eliminar el exceso de anticuerpo.
5)
Equilibrado de la membrana con la solución para detección quimioluminiscente
(III.4.2.6) durante 5 min, e incubación con esta misma solución y el sustrato (dilución
1:200 v/v) durante 10 min a 37ºC.
6)
Exposición con la película fotográfica (Hyperfilm MP, Amersham Biosciences)
durante al menos 1 h. Para el revelado y fijado de la película se utilizó una dilución
1:50 del revelador RODINOL (AGFA) y 1:8 del fijador AGFA-FIX (AGFA).
III.8.2.- Identificación de clones bacterianos mediante hibridación en colonia.
Debido a la semejanza del procedimiento con el desarrollado en la técnica de
Southern, sólo se describen en detalle los apartados en los que difieren.
III.8.2.1.-Obtención de sonda.
Se procedió del mismo modo que se detalla en el apartado III.8.1.1.
III.8.2.2.- Transferencia del DNA a una membrana de nailon.
Las colonias a estudiar se replicaron de forma uniforme en placas de Petri de 90 mm,
utilizando una plantilla patrón a fin de colocar al menos 60 clones por placa, y se dejaron
crecer durante 12 h. Tras poner en contacto la superficie de la placa con una membrana de
nailon, ésta quedó impregnada con las colonías. Las membranas se incubaron 5 min sobre
varias capas de papel GB002 saturadas en solución de desnaturalización (III.4.2.7) durante
5 min, a continuación en varias capas saturadas en solución de neutralización otros 5 min y,
por último, en capas de papel saturadas en 20X SSC 5 min. A continuación se inmovilizó el
DNA (III.8.1.2.) y se eliminaron los residuos bacterianos incubando la membrana en una
solución 2X SSC y 0,1% de SDS a temperatura ambiente.
Materiales y Métodos 87
III.8.2.3.- Tratamiento de la membrana e hibridación:
Se siguieron los mismos pasos que se describen en el apartado III.8.1.3., salvo que
en este caso el tiempo de hibridación osciló entre 6 y 8 h.
III.8.2.4.- Lavado de membrana.
De forma idéntica a la descrita en III.8.1.4.
III.8.2.5.- Detección colorimétrica de la señal.
La fosfatasa alcalina, conjugada al anticuerpo anti-DIG, es capaz de desfosforilar al
compuesto 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de toluidino, que se comercializa con el nombre
de BCIP (Roche Diagnostics) y que, en presencia de NBT (cloruro de azul nitro-tetrazoilo,
Roche Diagnostics), da lugar a la formación de un precipitado visualizable de color ocre.
Se procedió como en el apartado III.8.1.5 pero sustituyendo el sustrato en la solución
de detección por 0,375 ng/ml de NBT y 0,19 ng/ml de BCIP. Se incubó en oscuridad,
durante al menos 1 h, y se comprobó la aparición de manchas de color ocre que indicaron la
posición de los clones positivos.
III.8.3.- RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR).
La RT-PCR semicuantitativa o SQRT-PCR (Semiquantitative RT-PCR) permite tener
una estima grosso modo de los niveles de expresión de un determinado transcrito en
momentos previos al efecto meseta (plateau) que se produce durante una reacción de PCR.
En este punto existe teóricamente una relación lineal entre la cantidad de RNA (input) y el
producto final de amplificación por PCR. Resulta una técnica sustitutiva de la hibridación
northern (Kolls et al., 1993) en ciertos aspectos.
Como molde de la reacción de retrotranscripción para la obtención de la hebra de
cDNA se utilizaron 5 µg de RNA total (apartado III.7.2.1). Se emplearon las condiciones
descritas en el apartado III.7.9.4 con la salvedad de que sólo se realizaron 20 ciclos de
amplificación por PCR. Se sometió a electroforesis 1 µl de una dilución 1/250 de cada una
de las reacciones de PCR. Tras la separación en agarosa se transfirieron los ácidos
nucleicos a una membrana de nailon tal y como se describe en el apartado III.8.1.2. Se
siguieron las pautas descritas en III.8.4 para prehibridación, hibridación y lavados de la
membrana. La sonda utilizada se generó mediante PCR y se marcó con digoxigenina
(III.8.1.1). Se efectuó detección quimioluminiscente como en el aparatado III.8.1.4.
Materiales y Métodos 88
III.8.4.- Análisis de la expresión mediante hibridación in situ en tejidos vegetales.
III.8.4.1.- Obtención y marcaje con digoxigenina de la sonda de RNA.
El plásmido pGEM-T posee los promotores para las polimerasas de RNA de los
bacteriófagos SP6 y T7, por lo que se usó como molde de transcripción in vitro tras clonar
en él el inserto deseado. Se linearizó el plásmido recombinante (5 µg) con la enzima
apropiada, se precipitó con acetato sódico 3,2 M pH 5,2 y etanol, y se resuspendió en agua.
Se usaron 2 µg de plásmido cortado como molde para una reacción de 20 µl en presencia
de digoxigenina-11-dUTP de la mezcla DIG-RNA labelling mix (Roche Diagnostics), 1 µl (40
U) de inhibidor de RNasas, 2 µl de la polimerasa de RNA (T7 o SP6 10U/µl, Roche
Diagnostics) y 2 µl del tampón 10X de la enzima correspondiente (Roche Diagnostics). La
reacción tuvo lugar a 37ºC durante 90 min. Paralelamente, se realizaron reacciones control
en las mismas condiciones pero sin digoxigenina. Ambos tipos de reacción se verificaron
mediante electroforesis.
Tras la incubación se añadió 1 µl de DNasaI libre de RNasas (10 U/µl, Roche
Diagnostics) a la mezcla de reacción y se mantuvo 15 min a 37ºC. Se analizó una alícuota
mediante electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE, 6%, III.8.7.1.2).
Se precipitó la sonda con tRNA de levadura (1 µg/µl, Roche Diagnostics); acetato amómico
0,6 M y 220 µl de etanol absoluto, y se almacenó a –20ºC hasta el momento de cuantificar el
rendimiento del marcaje de la sonda.
III.8.4.2.- Cuantificación de la sonda.
Se centrifugó la sonda a 4ºC y 13.000 rpm durante 15 min, se eliminó el
sobrenadante, se lavó el precipitado con etanol 70%, se dejó secar al aire y se resuspendió
en 10 µl de agua tratada con DEPC. Con 1 µl de esta disolución se prepararon las diluciones
empleadas
en
la
cuantificación
(1/20,
1/250,
1/1000
y
1/2500).
Determinamos
empíricamente la concentración de sonda a utilizar en cada caso. De cada una de las
diluciones anteriores se aplicó 1 µl a una membrana de nailon (dot blot) que, tras secarse,
se irradió con luz UV. El revelado de esta membrana se realizó junto con una tira control con
distintas concentraciones de RNA marcado con digoxigenina (RNA scripts Test, Roche
Diagnostics). Se mojaron las tiras en 1X TBS durante 2 min y 10 min en solución bloqueante
con 1X TBS (apartado III.4.2.9).
Materiales y Métodos 89
Tira
control
*
Figura III.4.- Cuantificación simultánea de distintas ribosondas.
En la parte superior aparece una tira control que contiene
cantidades estandarizadas de RNA marcado con digoxigenina
que nos sirven para determinar la concentración de la sonda a
utilizar. La concentración de sonda cuya mancha se aproxime al
penúltimo punto de la tira (asterisco rojo) es, en principio, la más
adecuada.
III.8.4.3.- Obtención y procesamiento histológico de las muestras.
Se fijaron inflorescencias, con el fin de poder estudiar la expresión en distintos
estadios del desarrollo de la flor y del pistilo, así como frutos en diferentes etapas tras la
fertilización. Los procedimientos histológicos se detallan en el apartado III.5.2.2., salvo que,
en lugar de portaobjetos convencionales en esta ocasión se emplearon portaobjetos ProbeOn-Plus (Fisher), tratados en origen de forma que el tejido queda fuertemente adherido. Los
moldes de parafina con las muestras, se almacenaron a 4ºC hasta su utilización.
III.8.4.4.- Prehibridación e hibridación de la sonda.
En esta etapa tiene lugar el acceso de la ribosonda al interior celular mediante la
desparafinización de las muestras, hidratación y permeabilización parcial de la membrana y
la pared celular.
Se desparafinó el tejido con dos tratamientos sucesivos con Histoclear (10 min cada
uno). Se rehidrataron los tejidos con series decrecientes de etanol de 2 min cada una: dos
veces en etanol absoluto, una vez en etanol 95%, 70%, 50%, 30%, y dos en agua. En este
punto se realizó la hidrólisis ácida del tejido con HCl 0,2 N durante 20 min a temperatura
ambiente. Se prosiguió con un lavado de 5 min con agua, 5 min en 2X SSC y nuevamente 5
min con agua. A continuación, se incubaron los portaobjetos con el tejido en presencia de
proteinasa K (1µg/µl) durante 15 min a 37ºC. Se lavaron durante 2 min con 1X PBS y se
bloqueó la acción de la proteinasa K incubando 2 min en 1X PBS con glicina (0,2% m/v).
Tras dos lavados con 1X PBS de 2 min cada uno, se refijó el tejido con una solución de 1X
PBS y formaldehído (3,7% v/v) a temperatura ambiente durante 10 min, seguido de dos
Materiales y Métodos 90
pasos de 5 min con 1X PBS. Se prosiguió con la deshidratación del tejido en series
crecientes de etanol de 2 min cada paso hasta llegar al etanol absoluto. Tras secar un poco
los portas, se sometieron a vacío durante 20 min a una presión de 100 mb.
Para la hibridación, se precalentaron los portas con el tejido en una placa calefactora
(Selecta) a 45ºC durante unos minutos. Mientras tanto, se prepararon las diluciones de la
sonda en tampón de hibridación, desnaturalizando a 80ºC. Se aplicaron 300 µl de la
solución de hibridación a cada porta con su muestra correspondiente, disponiéndose éstos
enfrentados dos a dos. Gracias al sistema Probe-On-Plus, entre los tejidos de ambos portas
se genera un espacio donde discurre la solución de hibridación en contacto con el tejido. Los
portas apareados se guardaron en una cámara húmeda toda la noche a 52ºC.
III.8.4.5.- Lavados e inmunodetección colorimétrica de la señal.
Tras realizar dos lavados de 90 min en una solución 2X SSC y formamida (50% v/v),
se desarrolló la inmunodetección.
Los portas se incubaron en 1X TBS durante 5 min, 1 h con solución bloqueante con
1X TBS, 30 min en 1X TBS, Tritón X-100 (0,3% v/v) y BSA (1% m/v). A continuación, se
incubaron 90 min con el anticuerpo anti-DIG (dilución 1:3.000) en esta última solución. Se
realizaron tres lavados de 20 min cada uno con la misma solución sin anticuerpo con el fin
de eliminar su exceso. Para alcalinizar el medio incubamos con el tampón de detección sin
sustratos durante 5-10 min (III.3.2.6.). Esta solución se reemplazó por el tampón de
detección con los sustratos. Por cada 100 ml de solución de detección se añadieron 150 µl
de NBT (III.8.2.5., 100 mg/ml) y otros 150 µl de BCIP (III.8.2.5., 50 mg/ml). Se incubó en
oscuridad durante un periodo que osciló entre 12 y 18h. La reacción se detuvo
reemplazando la solución de detección por agua.
En el montaje de los portas se deshidrató el tejido en series de etanol crecientes de
forma rápida (2 min cada una), tras lo cuál se añadió una gota de Eukitt al portaobjetos y se
dispuso el cubreobjetos. Las muestras se visualizaron utilizando un microscopio Eclipse E800 de Nikon con cámara digital ColorViewII (Nikon) conectada a un ordenador con el
sistema de análisis de imágenes AnalySiS (Nikon).
III.9.- TRANSFORMACIÓN DE Arabidopsis thaliana.
Hemos transformado plantas con estirpes de Agrobacterium tumefaciens portadoras
de T-DNA modificados como vehículo de introducción de construcciones exógenas.
Materiales y Métodos 91
III.9.1.- Transformación con clones de sobreexpresión.
El cDNA completo del gen At4g26000 de Arabidopsis thaliana se obtuvo a partir de la
colección de clones de cDNA de Arabidopsis thaliana generada en el Instituto RIKEN
Biosource Center (Experimental Plant División, Tsukuba, Japón), y se clonó en el plásmido
pBINJIT portador de dos copias en tándem del promotor constitutivo 35S del virus del
mosaico de la coliflor (35SCaMV) en la orientación adecuada para su expresión. Esta
construcción se introdujo en la estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens mediante
electroporación (III.7.6.2).
III.9.2.- Transformación con clones genómicos.
Mediante PCR con la mezcla de polimerasas High Fidelity (Roche Diagnostics), se
obtuvo el fragmento genómico correspondiente al gen At4g26000, que incluye su secuencia
estructural y diversas regiones reguladoras adyacentes. Tras verificar su secuencia, el
fragmento se clonó en el plásmido pGEM, y de ahí en el plásmido vector pGreenII0179. Éste
se introdujo mediante electroporación en la estirpe LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens,
portadora del plásmido auxiliar pSOUP.
III.9.3.- Infiltración con Agrobacterium tumefaciens.
El presente protocolo está basado en el de Clough y Bent (1998) que es, a su vez,
una modificación simplificada del desarrollado por Bechtold (1993). Este procedimiento no
requiere la utilización de hormonas ni de vacío para llevar a cabo la infiltración.
A una bolsa de sustrato esterilizada se le añadió medio ATM hasta humedecerla
completamente. El sustrato se dispuso en macetas cuadradas de 12 x 12 x 12 cm (largo x
ancho x alto) y se envolvieron por completo con plástico transparente de uso alimentario, al
que se le practicaron de 25 a 30 agujeros, donde se trasladaron plántulas de 15 días
cultivadas en placas de Petri. Se cultivaron las plantas hasta que se desarrollaron las
inflorescencias y aparecieron las primeras flores en antesis y algún fruto en desarrollo, los
cuales se eliminaron previamente a la infiltración.
Se prepararon cultivos de Agrobacterium tumefaciens de 10 ml con masilla
bacteriana del clon de interés, cultivado recientemente en placa de Petri, y se incubó a 28ºC
y 270 rpm durante 24-48 h. Se tomó un 1 ml de este cultivo y se inocularon 500 ml de LB
enriquecido con glucosa al 0,5% (m/v). Se incubó a 270 rpm y 28ºC hasta llegar a una A600
de entre 0,8 y 1,2. En este momento se centrífugo el cultivo a 7.500 rpm durante 15 min a
4ºC. El precipitado resultante se resuspendió en solución de infiltración (III.4.2.9) hasta
Materiales y Métodos 92
obtener una A600 de 0,8. A continuación, se añadió Silwet L-77 (Lehle Seeds). Esta solución
se dispuso en bandejas de 15 x 20 x 5 cm (largo x ancho x alto) sumergiendo (floral dipping)
y agitando las inflorescencias de las plantas unos segundos. Las plantas infiltradas se
trasladaron a la cámara climática hasta completar su ciclo y recoger las semillas.
III.9.4.- Selección de transformantes.
Con el fin de identificar los individuos transformantes, las semillas resultantes de la
plantas infiltradas se sembraron de forma masiva en placas de Petri (1.000-1.500 semillas
por placa) con medio de cultivo GM (III.4.1.1.2) en presencia del antibiótico al cual el T-DNA
confiriera resistencia.
III.10.-
CARTOGRAFÍA
GÉNICA
MEDIANTE
ANÁLISIS
DE
LIGAMIENTO
A
MARCADORES SSLP.
Se obtuvo una población cartográfica a partir de la progenie F2 procedente del
cruzamiento entre la planta portadora de la mutación estudiada y un acceso silvestre
polimórfico respecto al fondo genético donde se hallara la mutación. Se obtuvieron muestras
de DNA genómico de los individuos F2 mutantes (III.6.1).
Se han empleado marcadores moleculares polimórficos de tipo SSLP (Simple
Sequence Lenght Polymorphisms) diseñados sobre el genoma de Arabidopsis thaliana. Tras
la amplificación mediante PCR, los productos se visualizaron mediante electroforesis en gel
de agarosa. Utilizamos los SSLP CIW7 (oligonucleótidos CIW7-f y CIW7-r, Tabla III.3) y
MNA5 (oligonucleótidos MNA5-1 y MNA5-2, Tabla III.3) correspondientes a los cromosomas
IV y V, respectivamente. El marcador CIW7 se localiza en la posición de 81,9 cM del
cromosoma IV. A partir de DNA genómico de Col-0 el producto de amplificación mediante
PCR es de 130 pb. En el caso de Ws-2, de 150, y en el de Ler de 123 pb. El SSLP MNA5
(Dr. J. L. Micol) genera un producto de amplificación en Ws-2 de 148 pb y de 165 pb en el
caso de Ler. Este SSLP recibe el nombre del BAC donde se localiza.
III.11.- GENOTIPADO MOLECULAR DE ESTIRPES DE Arabidopsis thaliana.
III.11.1.- Genotipado molecular de los alelos pep1.
Como consecuencia de las inserciones de T-DNA de cada uno de los alelos de pep1,
se generaron polimorfismos moleculares de tipo SSLP. En el caso de los alelos pep1-2,
Materiales y Métodos 93
pep1-3 y pep1-4 se diseñaron dos cebadores que flanquean el punto de inserción, y otro
situado en el borde izquierdo de cada T-DNA. De esta manera, en los individuos
heterocigóticos se amplifican dos bandas (Tabla III.6). El mutante pep1-1 es portador de una
reorganización cromosómica. En este caso, utilizamos dos oligonucleótidos que amplifican
el gen de resistencia a la kanamicina (nptII) del T-DNA, y dos oligonucleótidos
pertenecientes a la secuencia genómica perturbada por la reorganización cromosómica, de
forma que estos últimos sólo rinden producto de amplificación sobre un cromosoma silvestre
(Tabla III.6.).
Tabla III.6.- Genotipado molecular de los alelos pep1.
Alelo
Cebadores genómicos
Tamaño de los producto
de amplificación en pb
(silvestre/mutante)
939/1.100
pep1-1
FUP1-1; FUP1-2
Cebador en el
T-DNA
AT15; AT16
pep1-2
OCF12; OCF16
LBTM1
573/498
pep1-3
OCF12; OCF16
LBTM1
573/495
pep1-4
FUP1-4; FUP1-6
SALKLBb1
598/398
pep1-5
FUP1-34; FUP1-35
SALKLBb1
257/381
III.11.2.- Genotipado molecular de otras estirpes mutantes utilizadas.
Hemos utilizado los marcadores polimórficos moleculares de tipo CAPS (Cleaved
Amplified Polymorphic Sequence) generados en el laboratorio de la Dra. Xuemei Chen, para
la identificación de los alelos mutantes hua1-1, hua2-1 y hen2-1 (Tabla III.7).
Para la identificación de los alelos de clv3 nos hemos servido del CAPS ERA
estrechamente ligado a la mutación (Tabla III.7).
Tabla III.7.- Genotipado molecular de estirpes mutantes.
MBK21p28; MBK21p31
Tipo de
marcador
CAPS
Producto de
PCRa
1.150
hua2-1
MKD15p31; MKD15p7-2
CAPS
hen2-1
T4E14p50; T4E14p51
clv3
flk
Enzima
Silvestre/Mutanteb
HphI
500+300+350/800+350
330
PstI
275+55/330
CAPS
400
AciI
200+200/400
ERA1; ERA2
CAPS
500
DdeI
500/360+140
K3-1; K3-2; SALKLBb1
SSLP
-
-
235/478
Alelo
Cebadores
hua1-1
a, b
Tamaño en pb del fragmento o fragmentos.
Materiales y Métodos 94
En el caso de la identificación del alelo flk-3, generamos un marcador de tipo SSLP
en nuestro laboratorio (Tabla III.7).
III.12.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE χ2.
El valor de χ2 se obtuvo tras contrastar los datos obtenidos en las segregaciones con
las hipótesis de partida. No se rechazaron las hipótesis cuyo valor de χ2 fue inferior al
existente con un grado de significación del 95%. En la Tabla III.8 se muestran los valores del
estadístico para distintos grados de libertad, correspondiendo éstos a las clases fenotípicas
menos uno.
Tabla III.8.- Valores del estadístico χ2 con distintos grados
de libertad (GL).
χ20,95
Grados de Libertad
1
2
3
3,84
5,99
7,82
IV.- RESULTADOS
Resultados 96
IV.- RESULTADOS
IV.1.- ESCRUTINIO Y AISLAMIENTO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana
AFECTADOS EN LA MORFOLOGÍA DEL FRUTO.
IV.1.1.- Escrutinio de una colección de inserciones de T-DNA.
Los hechos de inserción de T-DNA pueden afectar a funciones génicas concretas,
derivando ocasionalmente en fenotipos alterados que, comúnmente, se transmiten de
manera recesiva. Existen diversos métodos moleculares que permiten, dado que
conocemos la secuencia del T-DNA, clonar con relativa facilidad las regiones genómicas
adyacentes. Esto permitiría una rápida identificación del gen perturbado por la inserción,
hipotéticamente responsable del fenotipo, sin necesidad de un prolongado esfuerzo de
clonación posicional. En el momento de iniciar este trabajo, tal era el planteamiento
experimental en nuestro grupo, así como en muchos otros laboratorios.
Siguiendo este criterio, y como paso inicial en nuestro estudio acerca de la
morfogénesis del fruto, decidimos llevar a cabo un escrutinio de mutantes de T-DNA de
Arabidopsis thaliana. Utilizamos una colección española (Dr. J. Paz Ares, C.N.B., Madrid)
de reciente creación en el momento en que se planteó este trabajo. Durante el escrutinio
se adoptaron como criterios de búsqueda la presencia de frutos de morfología anormal,
de tamaño reducido, o bien plantas sin frutos. Se examinaron plantas T3 derivadas de
semillas sembradas directamente en bandejas de plástico con sustrato (III.5.1.2).
Previamente a la siembra, se calculó el porcentaje de germinación en placa de Petri con
el fin de someter a escrutinio un mínimo de 1.000 semillas de cada grupo parental. Esto
supone el escrutinio de 20 semillas, como promedio, por cada transformante
independiente, lo que se traduce en una elevada probabilidad de obtener en homocigosis
cualquier alelo recesivo. Analizamos más de 27.000 plantas T3 de un total de 27 grupos
parentales cada uno de ellos proveniente de la descendencia de 50 plantas T2
independientes. Eliminamos aquellas plantas que no mostraban rasgos diferentes a los de
su ancestro silvestre Ws-2.
Se desecharon aquellos individuos cuyo fenotipo, una acusada reducción en el
tamaño del fruto, era consecuencia de problemas de androesterilidad. En estos casos, la
polinización de los pistilos mutantes con polen silvestre restablece el crecimiento del fruto
Resultados 97
hasta su tamaño normal, lo que permite descartar una alteración intrínseca al desarrollo
del pistilo o del fruto como causa del fenotipo.
Durante esta búsqueda se aislaron una serie de mutantes presumiblemente
afectados en el desarrollo del fruto. Se sometieron a un estudio inicial en el que se
comprobaron aspectos como la heredabilidad del fenotipo, su modo de herencia, la
resistencia a la kanamicina conferida por el T-DNA, la determinación del número de
inserciones de T-DNA y el ligamiento ocasional entre mutación e inserción.
IV.1.2.- Aislamiento y estudio preliminar de mutantes.
Se aislaron inicialmente 21 presuntos mutantes. Dos de ellos se descartaron tras
comprobar que se trataba de mutaciones de esterilidad masculina. Las 19 líneas restantes
se autofecundaron y se comprobó la heredabilidad del fenotipo analizando varias decenas
de individuos de su progenie. De hecho, 6 de estas líneas fueron completamente
estériles, mientras que en otras 7 el fenotipo no se heredó o fue muy sutil en la siguiente
generación.
Ws-2
Frutos mutantes
Figura IV.1- Frutos de individuos aislados
durante el escrutinio. A la izquierda de la
imagen se muestra un fruto del acceso
silvestre Ws-2. A la derecha aparecen
frutos de distintos individuos aislados
durante el escrutinio de la colección de TDNA. Barra de escala 2 mm.
Debido a la transmisión de su fenotipo a la siguiente generación sin ningún tipo de
ambigüedad, concentramos nuestros esfuerzos en las otras 6 líneas, originalmente
denominadas como SJF5-3, SJF8-6, SJF9-9, SJF15-18 SJF20-15 y SJF25-20 (sección
III.1.1.2.1 de Materiales y Métodos).
Resultados 98
Tabla IV.1.- Estudio de la heredabibilidad del fenotipo y de la resistencia a la
kanamicina en los individuos T4.
Línea mutante
Fenotipo de las plantas T4
SJF1-6
SJF3-2
SJF5-3
SJF5-4
SJF7-12
SJF8-6
SJF8-8
SJF10-5
SJF9-9
SJF9-10
SJF11-4
SJF12-8
SJF12-13
SJF17-13
SJF20-15
SJF20-16
SJF21-17
SJF21-18
SJF22-20
SJF23-19
SJF26-22
Estéril
Estéril
Heredable
Estéril
Fenotipo sutil
Heredable
Fenotipo sutil
Androestéril
Heredable
Estéril
Androestéril
Fenotipo sutil
Estéril
Fenotipo sutil
Heredable
Estéril
Fenotipo sutil
Heredable
Heredable
Fenotipo sutil
Fenotipo sutil
Resistencia a la
Kanamicina
n.e.
n.e.
Resistente
n.e.
n.e.
Resistente
n.e.
n.e.
Resistente
n.e.
n.e.
n.e.
n.e.
n.e.
Resistente
n.e.
n.e.
Sensible
Sensible
n.e.
n.e.
n.e.: no examinado.
Se sembraron varias decenas de descendientes en placas de Petri en presencia de
kanamicina. Dos de estas líneas (SJF21-18 y SFJ22-20) mostraron sensibilidad total por
lo que, presumiblemente, carecen de T-DNA o presentan una versión truncada o
silenciada del mismo. Proseguimos nuestro estudio con las cuatro líneas que sí exhibieron
resistencia total al antibiótico.
Tras verificar la heredabilidad de los fenotipos y la resistencia a la kanamicina, estas
cuatro líneas se cruzaron con su ancestro silvestre Ws-2 para determinar los patrones de
herencia de las mutaciones. El análisis de las familias F2 permitió concluir que las cuatro
mutaciones se transmiten siguiendo un patrón monogénico recesivo (tres plantas
silvestres por cada planta mutante). Los cruzamientos se realizaron en ambos sentidos
(resultados no reflejados en la Tabla IV.2) y no se apreció ningún efecto del sexo de los
parentales sobre la transmisión de los alelos.
Simultáneamente, se cultivaron las familias F2 en presencia de kanamicina. En los
cuatro casos se obtuvo una segregación de tres plantas resistentes por cada individuo
sensible. Además, dentro de las poblaciones de individuos resistentes, la proporción de
plantas silvestres frente a mutantes se ajustó a una relación 2:1, congruente con la
presencia, en cada caso, de una inserción única ligada al fenotipo mutante observado.
Resultados 99
Tabla IV.2.- Segregaciones fenotípicas de las generaciones F2.
F2
Clases fenotípicas
Cruzamientoa
F1
(fenotipo)
Silvestres
Mutantes
χ2
KanR
KanS
χ2
SJF5-3 x Ws-2
Silvestre
140
50
0,1908
162
58
0,2181
SJF8-6 x Ws-2
Silvestre
156
42
1,1362
152
52
0,0257
SJF9-9 x Ws-2
Silvestre
155
52
0,0014
170
50
0,6470
SJF20-15 x Ws-2
Silvestre
298
100
0,0033
159
54
0,0139
a
En el cruzamiento se anota en primer lugar la estirpe utilizada como parental femenino. Se indica el
número de individuos de cada clase fenotípica en la segregación de las familias F2 estudiadas en
presencia y ausencia de kanamicina. El valor del estadístico en cada caso indica el ajuste de los datos
obtenidos en las poblaciones F2 a la segregación fenotípica esperada 3:1. KanR: resistente a kanamicina.
S
Kan : sensible a kanamicina.
Con objeto de verificar esta observación, se realizaron familias F3, tras la
autofecundación de plantas F2 mutantes cultivadas en ausencia de kanamicina. Se cultivó
un gran número de individuos F3 en presencia del antibiótico (Tablas IV.3 y IV.4). En tres
de las cuatro líneas estudiadas, la ausencia de individuos sensibles indicó el ligamiento
total entre el fenotipo y la inserción.
Tabla IV.3.- Análisis de las segregaciones de familias F3 en presencia de
kanamicina de los mutantes SJF8-6, SJF9-9 y SJF20-15.
Línea mutante
nº de familias F3 examinadas
SJF8-6
SJF9-9
SJF20-15
15
13
20
Se examinaron como promedio 20 individuos de cada familia.
En una de las familias F3 correspondientes al mutante SJF5-3 aparecieron cuatro
recombinantes resistentes a la kanamicina y de fenotipo silvestre, lo que sugiere que el TDNA, aunque muy cercano, no es responsable de la perturbación molecular que ocasiona
el fenotipo de esta línea (Tabla IV.4). Tras este resultado, detuvimos el estudio de la
misma.
Resultados 100
Tabla IV.4.- Segregación de la resistencia a la kanamicina en la progenie F3
del mutante SJF5-3.
Clases fenotípicas
Familias F3
Individuos resistentes
Individuos sensibles
1
2
3
4
21
18
23
18
0
0
0
4
IV.2.- CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA LÍNEA SJF20-15. LA MUTACIÓN
pepper1-1.
IV.2.1. Análisis macroscópico.
De entre las tres líneas “supervivientes” de nuestra criba, nos decidimos por el
mutante SJF20-15 para llevar a cabo un análisis pormenorizado. Esta decisión se
fundamentó en sus características de expresividad poco variable y penetrancia completa
y, básicamente, en la singularidad del fenotipo que exhiben sus frutos. Su semejanza con
pequeños pimientos (bell pepper) motivó que adquiriera la denominación pepper1 (pep1).
En previsión de obtener nuevos alelos en un futuro, precisamos aún más denominándola
pep1-1.
La mutación pep1-1 es pleiotrópica (Fig. IV.2 A), afectando a diversos aspectos del
desarrollo de la planta. Sus frutos son de pequeño tamaño, no llegando en la mayoría de
los casos a la mitad de la longitud de un fruto silvestre Ws-2 (Fig. IV.2 B). El estigma es
conspicuo a lo largo de gran parte de su desarrollo (Fig. IV.2 D), presumiblemente como
consecuencia de una reducción en la fertilidad. Consecuentemente, se llevaron a cabo
ensayos de cruces recíprocos con el silvestre. Éstos mostraron que la fertilización con
polen silvestre compensa, sólo en parte, la reducción de longitud en el fruto, lo que podría
indicar cierto grado de implicación del polen en el fenotipo. Sin embargo, la fertilización de
pistilos silvestres con polen pep1-1 da lugar a frutos que se desarrollan normalmente, lo
que avala, esencialmente, su viabilidad (Fig. IV.2 C).
No obstante, el rasgo fenotípico que más atrajo nuestra atención fue la presencia
de más de dos valvas en sus frutos, circunstancia ajena a las silicuas propias del silvestre
(Fig. IV.2 B y D). La dehiscencia de estos frutos no parece verse afectada (Fig. IV.2 E).
Tras analizar con mayor detalle los mutantes pep1-1, comprobamos que no todos
los frutos de una misma planta presentan valvas extra, mostrando expresividad variable a
Resultados 101
este respecto. La penetrancia es completa, todas las plantas presentan frutos con valvas
supernumerarias. Efectuamos un recuento en el que pudimos comprobar que el número
de valvas oscila entre 2 y 6, aunque este último valor se da con muy poca frecuencia
(Tabla IV.5 y Fig. IV.3).
Ws-2
A
B
Ws-2
Ws-2
Ws-2 x pep1-1
C
pep1-1 x Ws-2
pep1-1
pep1-1
pep1-1
D
E
Ws-2
pep1-1
*
*
*
*
*
*
Figura IV.2.- Fenotipo de pep1-1. A) Porte de una planta silvestre Ws-2 y otra pep1-1 de 40 días tras la
germinación. B) Se observa una acusada diferencia de tamaño de los frutos pep1-1 respecto del silvestre. C)
Cruzamientos recíprocos entre Ws-2 y el mutante pep1-1. D) Detalle de ambos lados de un fruto pep1-1 en
estadio 17 (según Ferrándiz et al., 1999). Los asteriscos rojos señalan las valvas. E) Frutos del silvestre Ws-2
y de pep1-1 tras haberse producido la dehiscencia. Barras de escala: A) 5 cm; B) y C) 2 mm; D) y E) 1mm.
Tabla IV.5.- Recuento del número de valvas en frutos pep1-1.
2
3
número de valvas en los frutos
4
5
6
frutos
%
frutos
%
frutos
%
frutos
%
frutos
%
46
30,67
57
38
40
26,67
4
2,66
3
2
Se examinaron un total de 150 frutos procedentes de 15 plantas pep1-1.
Resultados 102
100
90
80
% de frutos
70
60
50
40
30
20
10
0
2
3
4
5
6
nº de valvas
Figura IV.3.- Recuento del número de valvas en pep1-1. Se contabilizaron un total de 150 frutos procedentes
de 15 plantas pep1-1.
Decidimos comprobar si la mutación ocasionaba órganos florales supernumerarios
de manera indiscriminada, por lo que también contabilizamos sépalos, pétalos y
estambres en el silvestre y en el mutante. No se apreció ninguna diferencia significativa
(Tabla IV.6). Por consiguiente, el efecto de la mutación pep1-1 parece restringirse al
gineceo, al menos en cuanto a la aparición de órganos extra.
Tabla IV.6.- Número de órganos florales en pep1-1 y Ws-2.
Número de órganos florales
Flores pep1-1
Sépalos
Pétalos
Estambres
3,97±0,077 3,97±0,076 5,87±0,083
Sépalos
4±0
Flores Ws-2
Pétalos
Estambres
4±0
5,95±0,081
Medias obtenidas del recuento en 300 flores de pep1-1 y en 300 flores de Ws-2,
respectivamente.
Una anomalía que sí afecta usualmente a los frutos pep1-1 es una clara
disposición asimétrica de las valvas, muy evidente en frutos con sólo dos (ver Figura IV.10
en sección IV.2.2).
Resultados 103
7
6
número
5
4
Mutante
Silvestre
3
2
1
0
Sépalos
Pétalos
Estambres
Figura IV.4.- Representación del recuento del número de sépalos, pétalos y estambres en individuos pep1-1 y
Ws-2. Se examinaron 30 plantas del mutante y 30 plantas del silvestre analizando 10 flores en cada individuo.
No se apreció ningún tipo de transformación homeótica entre órganos
pertenecientes a distintos verticilos florales. Ocasionalmente, en las plantas pep1-1 se
observan alteraciones en la disposición de las flores, como la aparición de flores y frutos
pedunculados que surgen en un verticilo exterior sin sustituir a ningún órgano (Fig. IV.5), o
el desarrollo de dos frutos desde un mismo botón floral, estando fusionados por la base
(ver Fig. IV.16 D en sección IV.2.4)
Figura IV.5.- Flores del silvestre y de pep1-1. A la izquierda de la imagen se
ve una flor silvestre Ws-2 con un fruto en desarrollo en estadio 17. A la
derecha, una flor pedunculada en el mutante pep1-1 que surge desde una
posición correspondiente a un verticilo exterior de otra. Barra de escala 2
mm.
Otras características reseñables de este mutante se relacionan, básicamente, con
su desarrollo vegetativo. Las plantas pep1-1 presentan, generalmente, menor porte que el
silvestre y reducción de la dominancia apical (Fig. IV.2 A). En ocasiones, tanto el tallo
principal como las coflorescencias secundarias aparecen fasciados. Asociadas a estas
anomalías aparecen, a veces, inflorescencias terminales anormales (Fig. IV.6).
Un rasgo definitivamente característico de las plantas pep1-1 es la abundancia de
situaciones anómalas en el patrón de filotaxia. Las plantas pep1-1 presentan gran
Resultados 104
profusión de alteraciones en la disposición de las ramificaciones (inflorescencias
secundarias), así como de flores y frutos (Fig. IV.7).
A
Figura IV.6.- Tallos fasciados y alteraciones
en las inflorescencias de pep1-1. A)
Alteraciones de las inflorescencias (flecha
amarilla) y tallos faciados (flecha roja). B)
Aparición de flores en ramillete (flecha
amarilla) en la inflorescencia de un tallo
fasciado (flecha roja). Barras de escala, 1 cm.
B
El patrón filotáctico de Arabidopsis thaliana es de tipo decusado durante la etapa
vegetativa juvenil, siendo sustituido por una disposición helicoidal durante la fase
vegetativa adulta y la fase reproductiva. Sin embargo, en el mutante encontramos
inflorescencias secundarias que surgen a partir del mismo nudo, al igual que ocurre en
numerosas ocasiones con dos flores o frutos. A veces, surgen del mismo nudo una
inflorescencia secundaria junto con una flor o fruto. Ocasionalmente son tres o más
órganos laterales los implicados en la anomalía. También se observan inflorescencias sin
la aparición concomitante de una hoja caulinar en su base (Fig. IV.7).
A
B
Figura IV.7. Comparación
entre la disposición de
órganos en el silvestre y en el
mutante pep1-1. A) Silvestre.
En B) se muestran algunas
de las alteraciones filotácticas
de pep1-1 descritas en el
texto. Barras de escala 5 mm.
Resultados 105
En placas de Petri pudimos comprobar que las plantas pep1-1 poseen una roseta
basal de menor tamaño que el silvestre, con hojas más lanceoladas y un color algo menos
intenso (Fig. IV.8). La presencia de kanamicina en el medio induce en ocasiones la
aparición de fenotipos no heredables por lo que repetimos el cultivo en placas sin este
antibiótico, corroborando la apreciación anterior. También observamos la presencia
circunstancial de plantas con sólo un cotiledón o con una única hoja terminal tras la
expansión de los cotiledones.
Advertimos un cierto retraso en la aparición de las hojas respecto al silvestre. Esta
alteración heterocrónica persiste durante la formación de los primeros pares de hojas,
pero se atenúa progresivamente, a medida que se desarrolla la roseta basal. De hecho, el
mutante acaba invirtiendo más tiempo en florecer que el silvestre, lo que se ve
acompañado por la generación de un mayor número de hojas en el momento en el que
surge la primera inflorescencia. No se llevó a cabo un estudio sistemático del tiempo de
floración por tratarse de una tarea que excedía los planteamientos iniciales de este
trabajo.
A
B
Figura IV.8.- Rosetas de Ws-2 y pep1-1. A) Roseta de Ws-2 20 días tras la germinación. B) Roseta de pep1-1
de la misma edad. Barras de escala 2 mm.
IV.2.2.- Estudio morfológico de los frutos pep1-1 mediante microscopía electrónica
de barrido (SEM).
Para examinar con mayor precisión el fenotipo de los frutos del mutante pep1-1,
los analizamos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Verificamos de nuevo
la aparición de frutos con valvas supernumerarias (Fig. IV.9 B, F y H). En muchos de los
frutos pep1-1 examinados se puede observar como las valvas extra se extienden a lo
largo de todo el fruto, como ocurre con las valvas de los frutos silvestres (Fig. IV.9 B). En
otras ocasiones, estas valvas adicionales se extienden en menor medida a lo largo del eje
Resultados 106
longitudinal del fruto (Fig. IV.9 F), alcanzando tan sólo la mitad de éste o menos. En
cualquier caso, siempre se inician desde el extremo apical, nunca desde abajo, una
circunstancia común a otros mutantes con fenotipos comparables descritos en la
bibliografía (Clark et al., 1993; Wilkinson y Haughn, 1995; Fletcher et al., 1999; Jeong et
al., 1999).
B
A
* *
*
C
*
D
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
I
E
F
*
*
v
H
G
*
r
*
*
* *
v
J
v
r
v
Figura IV.9.- Microscopía electrónica de barrido de los frutos pep1-1. A) Fruto silvestre Ws-2, 3 dpa (días post
antesis). B) Frutos pep1-1, 3 dpa. C) Detalle de la región apical de un fruto silvestre. D) Detalle de la región
apical de un fruto pep1-1. E) Fruto pep1-1 con dos valvas. F) fruto pep1-1 con tres valvas, donde la tercera
valva no recorre toda la longitud del fruto. La flecha roja señala un replum ensanchado atípico. El recuadro
rojo delimita la región donde convergen los repla. G) Detalle de la convergencia de los repla. H) Fruto pep1-1
con, al menos, cinco valvas. I) Magnificación de un fruto silvestre donde pueden observarse las regiones del
replum y de la valva. J) Magnificación de un fruto pep1-1 equivalente a la del panel I. Los asteriscos violeta
indican la presencia de valvas mientras que los de color azul señalan la posición de los repla. v, valva; r,
replum. Barras de escala: A), B), E), F) y H) 1mm; C), D) y G) 100 µm; I) y J) 50 µm.
Resultados 107
La zona del replum, es mucho más ancha en la región donde finaliza la valva
ectópica y se produce la convergencia de lo que, en realidad, son dos repla que discurren
en paralelo hasta ese punto (Fig. IV.9 F y G).
Las células que conforman el replum en los frutos silvestres se caracterizan por
poseer, por norma general, una forma más o menos rectangular además de presentar una
mayor compacidad que las de la valva. En cambio, las células de la superficie de la valva
exhiben formas más irregulares y es típica la aparición de estomas entre ellas. El examen
de las células de la valva en pep1-1 no mostró diferencias significativas a excepción de su
menor tamaño y sus formas aún más irregulares. Las células del replum en pep1-1
aparecen menos compactadas que en el silvestre y con una morfología normal (Fig. IV.9 I
y J). Nunca se observó la aparición de estomas en los repla de los frutos pep1-1
examinados. La asimetría en la disposición de las valvas, de modo particular en los frutos
con sólo dos, se observa claramente en las micrografías de barrido. En la Figura IV.10 se
aprecia como las valvas pueden incluso situarse por encima del estilo. El tamaño, así
como el aspecto general, que presentan las semillas de pep1-1 no revela diferencias
respecto a las semillas de su ancestro silvestre Ws-2 (Fig. IV.11).
A
B
Figura IV.10.- Asimetría en la disposición de las valvas en pep1-1. A) Se muestra la región apical de un fruto
pep1-1 con dos valvas. Las valvas se disponen ocupando la región del estilo. B) Región inferior de un fruto
pep1-1 donde se evidencia la disposición asimétrica de las valvas. Barras de escala 100 µm.
A
B
Figura IV.11.- Semillas
Ws-2 y pep1-1. Semillas de
frutos silvestres Ws-2 (A) y
de pep1-1 (B). No se
aprecian diferencias entre
ambos tipos de semillas.
Barras de escala 100 µm.
Resultados 108
IV.2.2.1.- Estudio comparativo de la ontogenia de los pistilos silvestres y de pep1-1.
Con objeto de comprobar a partir de qué etapa se manifiestan las anomalías que
diferencian a los frutos de pep1-1 de los del silvestre, decidimos estudiar la ontogenia de
los pistilos de ambas estirpes.
El pistilo silvestre presenta, durante las etapas tempranas de su desarrollo, una
morfología similar a un tubo cilíndrico abierto en su parte superior (Fig. IV.12 A-D), la cual
se cierra completamente hacia el estadio 10. En esta etapa, las papilas estigmáticas son
más evidentes y comienza a percibirse la sectorialización del ovario asociada a las dos
futuras valvas (Fig. IV.12 E). Con el alargamiento posterior del pistilo se distingue con más
claridad la región del estilo (Fig. IV.12 G y H).
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura IV.12.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas silvestres Ws-2. A) Pistilo en estadio 9
(Smyth et al., 1990; Bowman, 1994; Ferrándiz et al., 1999). B) Detalle de la región apical abierta del fruto
mostrado en A). C) Pistilo en estadio 10, se inicia el desarrollo de las papilas estigmáticas y el cierre de la
zona apical. D) Detalle del fruto mostrado en C). E) y F) Estadio 11 de desarrollo. El estilo comienza a
diferenciarse claramente de la región del ovario. G) y H) Estadio 12. Barras de escala: A, B, C, E, F, G y H 100
µm; D 50 µm.
Resultados 109
En los pistilos de plantas pep1-1, la aparición de valvas extra se percibe desde
etapas muy tempranas de su desarrollo, particularmente en la zona superior (Fig. IV.13 BD).
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Figura IV.13.- Distintos estadios en el desarrollo del pistilo en plantas pep1-1. A) Estadio 8 de desarrollo
(Smyth et al., 1990, Bowman, 1994; Ferrándiz et al., 1999). B) Estadio 9. Se comienzan a apreciar las valvas
extra. C) y D) Pistilo en estadio 10 con cuatro valvas en desarrollo. E) y F) Estadio 11. Se observan
claramente las papilas estigmáticas. La aparición de valvas extra dificulta el cierre en la región apical del
pistilo. G) y H) Estadio 12. Aún se aprecia un orificio en la región central del estigma. I)-L) Distintos ejemplos
de frutos pep1-1 donde el cierre apical del pistilo no se ha producido correctamente, observándose en algunos
de ellos una pequeña cavidad en la zona superior. Barras de escala 100 µm.
Resultados 110
Esta situación, presumiblemente, interfiere con la coordinación normal en el
desarrollo del pistilo, de manera que dificulta la fusión de órganos en su zona apical.
Como resultado, se produce un retraso en la oclusión final del ápice del pistilo pep1-1 con
respecto al silvestre. En la Figura IV.13 H, se observa como en un pistilo en el estadio 12,
con valvas supernumerarias, aún no se ha producido una fusión completa y todavía se
puede apreciar una cavidad entre las papilas estigmáticas en desarrollo.
Esta rápida manifestación de los rasgos que caracterizan al gineceo de pep1-1,
desde luego muy anteriores a la etapa posterior a la fertilización, indica de manera
evidente que se trata de una mutación que afecta a la ontogenia del pistilo,
predeterminando el posterior desarrollo del fruto tras la polinización.
IV.2.3.- Análisis histológico de las silicuas de pep1-1.
Con la intención de complementar las observaciones sobre el fenotipo externo,
llevamos a cabo un análisis de la organización tisular en los frutos de pep1-1. Se
examinaron secciones transversales de frutos mutantes y del silvestre (Ws-2). Se
recolectaron silicuas de 5 dpa y se incluyeron en resina JB-4 para efectuar los cortes
histológicos (sección III.6.2.1). También en su estructura interna se aprecia la singularidad
del fruto de pep1-1. La Figura IV.14 muestra la presencia de valvas extra, delimitadas
cada una de ellas por repla adicionales.
En las valvas de los frutos silvestres de Arabidopsis thaliana es típica la presencia
de 6 capas de células con distintas morfologías (sección I.5.5.1; Fig. IV.14 A). Las células
del exocarpo de pep1-1 presentan tamaños algo más irregulares que en el silvestre (Fig.
IV.14 B-D). Este hecho podría relacionarse con la irregularidad de formas existente en la
superficie de la valva (sección IV.2.2; Fig. IV.9). En el clorénquima encontramos el mismo
número de capas celulares que en el silvestre, pero con un menor grado de compacidad.
Queda por establecer si esta situación es debida a un menor número de células o a un
tamaño inferior de éstas. Las células de la capa más externa del endocarpo no presentan
una morfología distinta a las del silvestre, mientras que las células más internas parecen
en ocasiones más oblongas. En las valvas supernumerarias de los frutos pep1-1, los
vasos conductores discurren, al igual que en las valvas del silvestre, a través del
clorénquima, localizándose en posiciones similares.
El número de valvas en el mutante se corresponde con el número de territorios
ocupados por un replum. De este modo, encontramos tres repla flanqueando a tres valvas
(Fig. IV.14 B), o cuatro repla delimitando cuatro zonas de valva (Fig. IV.14 C y D). De
Resultados 111
igual forma sucede con los frutos con más valvas. La estructura de estos repla no parece
ser distinta de la que se genera en el silvestre, y vimos que la dispersión de las semillas
en los frutos pep1-1 tiene lugar mediante una dehiscencia normal (sección IV.2.1, Fig.
IV.2 E). Esto indica una correcta especificación de las zonas de lignificación en las
regiones situadas entre replum y valva.
R
A
B
V
R
S
V
V
V
x
n
c
R
R
V
R
C
V
R
V
D
V
R
R
V
R
*
R
R
R
V
V
V
V
R
Figura IV.14.- Histología de frutos de 5 dpa silvestres (Ws-2) y mutantes pep1-1. A) Corte transversal de un
fruto silvestre. En B), C) y D) frutos pep1-1 con 3 y 4 valvas respectivamente. En C se indica, con un asterisco
rojo, la formación de un gran lóculo central. V: valva; R: replum; S: septum; x: exocarpo; c: clorénquima; n:
endocarpo. Barra de escala 200 µm.
Resultados 112
El replum se prolonga hacia el interior del fruto por medio del septum, formando
dos lóculos en el fruto silvestre. Debido a la existencia de septa extra es lógica, por tanto,
la aparición en pep1-1 de más de dos lóculos (Fig. IV.14 B-D). En ocasiones los lóculos
adicionales no aparecen como compartimentos completamente separados. El septum
extra aparece como una estructura discontinua, tal vez fragmentado por la presión
ejercida por la semilla durante su crecimiento (Fig. IV.14 C y D). Como norma general, en
los frutos pep1-1 con cuatro o más valvas, se observa un gran lóculo central,
presumiblemente como consecuencia de la ruptura de cada uno de los septa (Fig. IV.14
C). Sin embargo, el funículo, la estructura que conecta el óvulo con el septum, así como
los propios óvulos, no presentan irregularidades en pep1-1 (Fig. IV.14 C y D).
A
B
*
*
Figura IV.15.- Fruto pep1-1 con dos repla fusionados. A) Corte transversal de un fruto pep1-1 de tres valvas.
En la parte superior se muestran dos repla adyacentes y dos septa que se proyectan casi paralelamente hacia
el interior del fruto. B) Detalle de los dos repla adyacentes que aparecen en A), indicados por asteriscos de
color violeta. Barras de escala: A) 200 µm y B) 50 µm.
Algunos cortes de frutos examinados muestran dos repla unidos y aparentemente
normales (Fig. IV.15). Este hecho tiene su origen en la confluencia de dos repla en
aquellos frutos en los que el crecimiento de las valvas extra no es total y sólo alcanza
parte de su longitud (Figura IV.9 F y G apartado IV.2.2). Es muy probable que la imagen
mostrada en la Figura IV.15 se corresponda con una de esas zonas de convergencia
IV.2.4.- Introgresión de pep1-1 en otros fondos silvestres.
El fenotipo ocasionado por las mutaciones es, en muchas ocasiones,
estrechamente dependiente del fondo genético de la estirpe utilizada (Koornneef et al.,
1995; Sanda y Amasino, 1996; Nadeau, 2003). Mediante series sucesivas de
cruzamientos con otros accesos, se puede trasladar la mutación original a un entorno
Resultados 113
genómico que cada vez se asemeje más al de la estirpe “destinataria” de dicha mutación.
Idealmente, la mutación se considera finalmente trasladada a un fondo homogéneo
perteneciente a la segunda estirpe. El término introgresión hace referencia a este traslado
progresivo de un fondo genético a otro.
La colección de mutantes insercionales de T-DNA donde se aisló pep1-1 se
generó utilizando el acceso silvestre Ws-2. Entre otras diferencias, este fondo genético
presenta una deleción de 15 nucleótidos y una inserción de una G en el gen que codifica
la apoproteína del fitocromo D (PHYTOCHROME D, PHYD) de Arabidopsis thaliana
(Aukerman et al., 1997). Debido al comportamiento pleiotropico de la mutación pep1-1,
decidimos examinar el efecto del fondo genético mediante su introgresión en estirpes
silvestres de uso común en los estudios con Arabidopsis, como son Col-0 y Ler.
Por otra parte, la mayoría de los mutantes de Arabidopsis se encuentran en fondo
Col-0 o Ler. También la mayoría de colecciones de mutantes de T-DNA se han realizado
sobre un fondo Col-0, sobre todo las de dominio público, por lo que la aparición de nuevas
mutaciones insercionales, alélicas a pep1-1, cabría esperarlas sobre este fondo.
Ya desde el primer cruzamiento con Col-0, los individuos pep1-1 presentaron
como promedio un mayor porte, la aparición de tallos fasciados se vio drásticamente
reducida y aumentó su fertilidad. Este último rasgo se correlacionó con una reducción del
estigma y un mayor tamaño de los frutos, aún cuando no se alcanzaran las dimensiones
del silvestre (Fig. IV.16 A y E).
La presencia de valvas extra persiste (Fig. IV.16 F), no apreciándose diferencias
cuantitativas con los datos expuestos anteriormente (apartado IV.2.1). Tampoco se
observa ningún efecto del proceso de introgresión sobre los errores en el patrón de
filotaxia, o el desarrollo de flores fusionadas (Fig. IV.16 A, D). Sin embargo, el fenotipo de
las rosetas sí disminuyó (Fig. IV.16 B, C) en relación al observado inicialmente en un
fondo Ws-2 homogéneo (Fig. IV.8). No obstante, se conservan la aparición heterocrónica
de las primeras hojas y un cierto retraso en la floración. Hasta el momento de la
realización de esta memoria, hemos efectuado un total de 5 series de cruzamientos con el
fondo silvestre Col-0 (pep1-1 5XCol).
Resultados 114
A
B
Ws-2
E Ws-2
Col
pep1
(3xCol)
Col
pep1-1
C
pep1-1
(3xCol)
F
D
pep1-1
*
* *
Figura IV.16.- Introgresión de pep1-1 en Col-0. A) Comparación del porte de plantas silvestres y pep1-1 antes
y después de 3 cruzamientos con Col-0. La flecha roja indica una clara alteración en la filotaxia. B) Roseta
Col-0 de 14 días. C) Roseta de pep1-1 (3xCol) de 20 días. D) Aparición de dos frutos a partir de un mismo
botón floral. E) Incremento en la longitud de los frutos pep1-1 tras 3 cruzamientos con Col-0. F) Fruto pep1-1
(3xCol) con tres valvas (asteriscos rojos). Barras de escala: en A 5 cm y B-F 1 mm.
Tras el primer cruzamiento de pep1-1 con Ler, las plantas mutantes alcanzaron un
porte mucho menor que el observado originalmente (no mostrado). No resulta
sorprendente ya que la faceta más característica de este fondo es la mutación erecta (er;
Torii et al., 1996), la cual compromete el número de divisiones celulares en determinados
ejes, produciendo un acortamiento de los entrenudos y de los órganos laterales (Torii et
al., 1996). El fenotipo de pep1-1 en la roseta se atenuó considerablemente (no mostrado)
hasta el punto de dificultar en ocasiones su identificación en esta etapa del desarrollo de
la planta. Los frutos, más cortos y con el ápice romo, como es característico de los frutos
Ler, conservan la aparición de valvas extra (Fig. IV.17). El estilo es algo más alargado que
en Ler. Hasta el momento de la elaboración de esta memoria, realizamos 2 cruzamientos
con Ler.
Resultados 115
A
B
Figura IV.17.- Introgresión de pep1-1 en Ler. A) Fruto Ler. Estos frutos
son de menor tamaño y más romos que en Ws-2 o que en Col-0. B)
Aparición de valvas extra (flecha roja) en los frutos de plantas pep1-1
(2xLer). Barras de escala 1 mm.
Conjuntamente, el comportamiento de la mutación pep1-1 sugiere que parte de su
fenotipo se debe a variantes en genes modificadores dependientes de la estirpe silvestre
utilizada.
IV.3.- CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL MUTANTE pep1-1.
IV.3.1.- Determinación del número de copias de T-DNA en el mutante.
Los datos obtenidos durante el análisis de las poblaciones F2 y F3 sugieren la
presencia en pep1-1 de una única inserción ligada al fenotipo. No obstante, y previamente
al intento de clonación de las secuencias genómicas, realizamos experimentos de
hibridación Southern (sección III.8.1) con el propósito de determinar el número de copias
de T-DNA.
Llevamos a cabo digestiones enzimáticas de DNA genómico de plantas pep1-1
con EcoRI y KpnI. En la Figura IV.18 se muestra una estructura esquemática del T-DNA
presente en pep1-1, donde se indican las posiciones relativas de las dianas de estas
enzimas.
La sonda, obtenida por PCR, comprende la región situada entre los oligos AT10 y
AT11 (fragmento de 1,1 Kb, Tabla III.3), localizados en el gen de resistencia a kanamicina
(nptII).
La obtención de una única banda en ambos casos habría corroborado sin
ambigüedades la presencia de una inserción simple. Sin embargo, tanto con EcoRI como
con KpnI detectamos tres bandas. Este resultado apunta a la presencia de al menos tres
copias del gen de resistencia a la kanamicina y, por lo tanto, de al menos tres T-DNA.
Resultados 116
pGKB5
A
KanR
GUS
BastaR
RB
LB
nos 3’ ocs 3’
uidA
1
2
XbaI
EcoRV EcoRV
BamHI
3
EcoRI
B
1,636 Kb
bar
nptII P nos P 35S
4
5
sonda
3’g7
6
7 Kb
KpnI
EcoRV KpnI
HindIII
C
~ 8,5 Kb
~ 5,2 Kb
~ 4,1 Kb
~ 12,5 Kb
~ 10 Kb
~ 6 Kb
1,636 Kb
Figura IV.18.- Detección del T-DNA en pep1-1 mediante hibridación Southern. A) Esquema del T-DNA
pGKB5 en el que se indican algunas de las dianas para enzimas de restricción, así como la posición relativa
de la sonda utilizada. B) Hibridación Southern. De izquierda a derecha, carril correspondiente a los
marcadores de peso molecular, DNA genómico de Ws-2 digerido con EcoRI, y DNA genómico de pep1-1
digerido con EcoRI. C) Hibridación Southern. De izquierda a derecha, calle correspondiente a los marcadores
de peso molecular y DNA genómico de pep1-1 digerido con KpnI.
Los datos de segregación de la resistencia encajan con la existencia de un sólo
hecho insercional. La presencia de varias copias de T-DNA en tándem, o diversos hechos
de inserción en loci muy próximos explicarían esta aparente discrepancia con los estudios
de segregación de la resistencia al antibiótico. La identificación de las secuencias
genómicas adyacentes a la inserción debiera contribuir a aclarar esta cuestión.
IV.3.2.- Clonación de las regiones genómicas adyacentes a la inserción.
Con la intención de clonar las regiones genómicas adyacentes a los bordes de TDNA, empleamos PCR inversa (I-PCR, III.7.9.3, Ochman et al., 1988; Triglia et al., 1988;
Hartl y Ochman, 1996) y PCR de asimetría térmica entrelazada (TAIL-PCR, III.7.9.2, Liu et
al., 1995; Singer et al., 2003).
Para IPCR se utilizaron dos cebadores adyacentes en orientación divergente en el
borde derecho (RB) denominados AT4 y AT5 (Tabla III.3; Fig. IV.19), y otros dos en el
borde izquierdo (LB), denominados AT2 y AT15 (Tabla III.3; Fig. IV.19). Para la clonación
Resultados 117
de las regiones genómicas de pep1-1 adyacentes al borde derecho, su DNA se digirió
con EcoRI. En el caso del borde izquierdo, la digestión se realizó con HindIII.
Simultáneamente, se llevaron a cabo reacciones de TAIL-PCR con tres
oligonucleótidos imbricados correspondientes a secuencias del borde derecho (AT3, AT4
y AT6, Tabla III.3) y otros tres del borde izquierdo (AT1, AT2 y AT7; Tabla III.3).
GUS
pGKB5
KanR
BastaR
RB
LB
uidA
nos 3’ ocs 3’
Cebadores TAIL-PCR:
nptII P nos P 35S
bar
3’g7
Cebadores IPCR:
Figura IV.19.- Esquema de las posiciones relativas, respecto al T-DNA pGKB5, de los cebadores utilizados en
TAIL-PCR e IPCR.
Mediante el análisis de los distintos fragmentos amplificados, comprobamos que
las secuencias contiguas a los bordes del T-DNA pertenecían a dos cromosomas distintos
de Arabidopsis thaliana, en concreto a los cromosomas IV y V. Verificamos este extremo
tras amplificar con cebadores de los bordes del T-DNA y de las regiones genómicas
adyacentes reveladas por los ensayos de IPCR y TAIL-PCR, y secuenciar los fragmentos
obtenidos.
Este resultado podría significar la presencia de varios hechos de inserción
independientes. Sin embargo, los datos de segregación de la resistencia a la kanamicina
y el ligamiento total entre ésta y el fenotipo contradicen tal posibilidad.
Las secuencias pertenecientes al cromosoma IV se corresponden a la posición de
15.499 Kb del BAC F20B18. Las del cromosoma V corresponden a la posición 25.465 Kb
del BAC MNA5. Teniendo en cuenta todos los datos obtenidos, la explicación más
verosímil para la mutación pep1-1 parece una reorganización cromosómica generada por
el hecho insercional, como una translocación recíproca entre ambos cromosomas (Fig.
IV.20 y IV.21).
Resultados 118
A
IV
V
B
IV-V
V-IV
Figura IV.20.- Estructura esquemática de los cromosomas IV y V de Arabidopsis thaliana. En A) se
representan los cromosomas de individuos silvestres. B) Cromosomas translocados IV-V y V-IV en pep1-1.
Los rectángulos amarillos indican los puntos de translocación. Los centrómeros se representan en negro.
Las translocaciones recíprocas son las reorganizaciones cromosómicas más
comunes, consistentes en un intercambio de segmentos entre dos cromosomas no
homólogos (Griffith et al., 2002). Este hecho concuerda con el ligamiento entre el fenotipo
mutante y las distintas copias de T-DNA evidenciadas mediante el experimento de
Southern. El patrón de bandas obtenido podría surgir de una disposición de copias de TDNA en cada cromosoma como la que se muestra en el esquema hipotético de la Figura
IV.21. La inviabilidad de las plantas que heredan en homocigosis sólo uno de los
cromosomas derivados explicaría el ligamiento entre el fenotipo y la resistencia a la
kanamicina.
IV-V
RB
LB LB
LB
RB
RB RB
LB
V-IV
Figura IV.21.- Esquema hipotético de la estructura de los T-DNA en los cromosomas derivados en pep1-1. El
rectángulo amarillo marca el punto de la translocación. Los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) del T-DNA
se marcan en rojo y verde respectivamente.
Resultados 119
IV.3.3.- Ligamiento de pep1-1 a marcadores moleculares de tipo SSLP.
Con objeto de disipar dudas acerca de posibles artefactos en nuestros resultados
moleculares, y para verificar o no la presencia de una translocación, emprendimos un
análisis de ligamiento de la mutación pep1-1 a marcadores moleculares de tipo SSLP
localizados en los cromosomas IV y V.
V
MNA5
IV
CIW7
Figura IV.22.- Localización de los marcadores SSLP utilizados en pep1-1. En negro se indica el centrómero
del cromosoma. El rectángulo amarillo en cada cromosoma indica los puntos de translocación entre ambos
cromosomas.
Se generó una población cartográfica F2 mediante el cruce entre el mutante pep1-1
(en fondo Ws-2) y Ler. Se genotiparon 55 individuos mutantes (110 cromosomas) para los
marcadores CIW7 (cromosoma IV; Fig. IV.22) y MNA5 (cromosoma V; Fig. IV.22). La
mutación mostró ligamiento absoluto a ambos marcadores, lo que refuerza la presencia
de una translocación recíproca entre ambos cromosomas.
IV.3.4.- Estudio de la fertilidad en heterocigotos pep1-1.
En los individuos portadores de una translocación recíproca en homocigosis no se
producen, en principio, problemas en su fertilidad, ya que poseen una dotación completa
del material genético propio de su especie. Sin embargo, es característico en los
individuos heterocigóticos la existencia de semiesterilidad. Esto es debido a que la mitad
de los productos meióticos presentan duplicaciones de unas regiones y deleciones de
otras, dando lugar a productos inviables. El resto de los gametos es viable, o bien se trata
de gametos normales, o bien de gametos balanceados (Griffith et al., 2002).
El examen directo de silicuas de plantas heterocigóticas para la mutación pep1-1
mostró que en su interior aparecían semillas abortadas en una proporción muy cercana al
50% (156 de 300; Fig. IV.23). La disminución en la fertilidad también se produce en
individuos heterocigóticos que presentan otros tipos de aberraciones cromosómicas
(deleciones e inversiones) aunque una reducción del 50% es característica de
Resultados 120
translocaciones recíprocas (Griffith et al., 2002). Verificamos estos resultados examinando
silicuas F1 (PEP1/pep1-1) de cruzamientos con el silvestre, reforzándose la interpretación
de una reorganización cromosómica como la descrita para pep1-1.
A
B
*
*
Figura IV.23.- Semiesterilidad en los heterocigotos pep1-1. Fotografías de LTSEM. A) Semillas de una silicua
silvestre Ws-2. B) Semillas abortada (asterisco rojo) junto a una que se desarrolla normalmente (asterisco
blanco) en pep1-1. Barras de escala: A) 200 µm; B) 100 µm.
IV.3.5.- pep1-1 es una mutación compleja que puede afectar a diversas funciones
génicas.
En su conjunto, los resultados expuestos en las secciones IV.3.1 a IV.3.4 indican
que, muy probablemente, el fenotipo de la mutación pep1-1 es el resultado de una
constelación de alteraciones genéticas, lo que dificulta la identificación de su naturaleza
molecular de forma inequívoca y, sobre todo, directa. En sintonía con esta situación,
hemos comprobado un efecto importante de factores genéticos modificadores
dependientes del fondo genético utilizado.
De forma paralela a la realización de nuestro trabajo, se acumuló información,
cada vez más frecuente en la bibliografía, relativa a importantes reorganizaciones
cromosómicos originados por las inserciones, (Nacry et al., 1998; Laufs et al., 1999; Tax y
Vernon, 2001), lo que ha contribuido a aminorar la predilección por el T-DNA como agente
mutagénico.
En cualquier caso, nos propusimos iniciar una búsqueda de funciones génicas
responsables de aquellos aspectos del fenotipo de pep1-1 que nos resultaban más
interesantes, fundamentalmente el mayor número de carpelos en sus pistilos.
Resultados 121
IV.4.-
ESTUDIO
DE
GENES
POTENCIALMENTE
AFECTADOS
POR
LA
TRANSLOCACIÓN.
Las secuencias adyacentes a los bordes del T-DNA de pep1-1 se localizan en los
cromosomas IV y V. En el cromosoma V, la inserción se sitúa en una región comprendida
entre dos genes en orientación divergente, a 660 pb del punto de inicio de la traducción
del gen AGP7, que codifica un pequeño polipéptido de pared o membrana (Kreuger y Van
Holst, 1996; Schultz et al., 1998; Majeskawa-Sawka y Nothangel, 2000), y a 1.200 pb de
un gen que codifica una proteína de función desconocida. En el cromosoma IV las
secuencias obtenidas desde los bordes del T-DNA se sitúan entre dos genes que, al igual
que en el caso anterior, se encuentran en orientación divergente. La inserción está a tan
sólo 18 pb del codón de inicio de un gen que codifica un polipéptido con tres dominios de
unión a RNA del tipo KH, y a 3,7 kb del otro gen, la función de cuyo producto se
desconoce. Aún con dicha información, no se podían descartar otros genes más alejados,
pues existen precedentes de mutaciones ocasionadas por el T-DNA al margen de la mera
interrupción de secuencias (Tax y Vernon, 2001). Se confeccionó una lista inicial de genes
a explorar, compuesta por los genes mencionados, más el gen SHEPHERD, alejado del
punto de inserción pero cuyas mutaciones también generan pistilos con valvas
supernumerarias (Ishiguro et al., 2002) y un gen próximo que codifica una peroxidasa.
Ambos genes pertenecen al cromosoma IV (Tabla IV.7). Esta selección no pretendía ser
definitiva sino tan sólo reunir un conjunto preliminar de genes a analizar.
Tabla IV.7.- Líneas de inserción analizadas y utilizadas en el ensayo de
complementación con el mutante pep1-1.
Cromosoma
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
V
V
V
V
a
Gen
At4g24.190
At4g24.190
At4g24.190
At4g26000
At4g26000
At4g26000
At4g26000
At4g26.010
At4g26.010
At5g65.390
At5g65.390
At5g65.390
At5g65.390
Línea
Colección de T-DNA
SALK_048558 (SHDa)
SALK
SALK_076031(SHDa)
SALK
SALK
SALK_076127(SHDa)
SAIL
F09_517 (KHb)
G12_1249 (KHb)
SAIL
SALK
SALK_055265 (KHb)
SALK
SALK_081555 (KHb)
SALK_058288 (POXc)
SALK
SALK_058547(POXc)
SALK
SALK_036321(AGP7d)
SALK
SALK_036324 (AGP7d)
SALK
SALK_099106 (AGP7d)
SALK
SALK_039285 (AGP7d)
SALK
b
c
SHEPHERD, Ishiguro et al., (2002); proteína con dominios KH, esta tesis; presunta
d
peroxidasa; ARABINOGALACTAN-PROTEIN 7, Majewska-Sawka y Nothangel (2000).
Resultados 122
Realizamos una búsqueda de líneas de inserción de T-DNA correspondientes a
dichos genes a partir de distintas colecciones de dominio público (Tabla IV.7).
IV.4.1.- Estudio fenotípico de líneas de inserción correspondientes a genes
potencialmente afectados por la translocación de pep1-1. Nuevos alelos de pep1.
Se sembraron las líneas de inserción mostradas en la Tabla IV.7 y seleccionamos
supuestos homocigotos para las inserciones correspondientes, en función de la
segregación o no de plantas sensibles al herbicida Basta (líneas F09_517 y G12_1249), o
a la kanamicina (resto de líneas). Mediante cruzamiento con Col-0, obtuvimos
segregaciones F2 que indicaban la presencia de una única inserción en todos los casos.
Este dato fue confirmado por la presencia de una única banda en hibridaciones
Southern (datos no mostrados). Se utilizaron sondas complementarias al gen de
resistencia a kanamicina (nptII) o al de resistencia a Basta (BaR), generadas por PCR con
los cebadores AT10 y AT11 en el primer caso, y AT16 y AT17 en el segundo (Tabla III.3).
El examen de los homocigotos para las líneas de inserción del gen SHEPHERD y
el gen que codifica una presunta peroxidasa no reveló ningún fenotipo destacable. Las
líneas correspondientes al gen AGP7 mostraron un fenotipo consistente en un menor
tamaño y un color verde menos intenso que el silvestre Col-0 (datos no mostrados).
Examinamos cuatro líneas homocigóticas para inserciones en el gen que codifica
una presunta proteína de unión a RNA con tres dominios KH (At4g26000). Las líneas
F09_517 y G12_1249 se nombraron como pep1-2 y pep1-3, respectivamente, ya que
observamos en ellas frutos con valvas extra (Fig. IV.24), aunque con una penetrancia
bastante menor que en pep1-1. Un rasgo consistente fue la presencia de alteraciones en
el patrón de filotaxia, de carácter muy similar a las detectadas en pep1-1 (Fig. IV.24 y Fig.
IV.25 A-C). En plantas pep1-2 observamos, al igual que en pep1-1, algunos frutos con
disposición asimétrica de las valvas o bien, con un mayor crecimiento de una respecto a
la otra (Fig. IV.24 C y D).
Resultados 123
A
C
B
D
*
*
*
*
E
F
*
*
G
Figura IV.24.- Fenotipo de los alelos pep1-2 y pep1-3. A) Fruto con más de dos valvas en pep1-2 (estadio 14;
Ferrándiz et al., 1999). B) y C) Detalles de valvas extra en pep1-2. Se indican las valvas con asteriscos rojos.
D) Valvas de muy distinta longitud en un fruto pep1-2 (estadio 15, Ferrándiz et al., 1999). E) Disposición
asimétrica de las valvas en pep1-3 (estadio 15). Las flechas rojas indican el término de cada una de las
valvas. Alteraciones en las inflorescencias de pep1-2 (F) y de pep1-3 (G). Barras de escala: A) 2mm. B) y C)
0,5mm. D) y E) 200 µm. F) 1 mm G) 300 µm.
Las líneas SALK_055265 y SALK_081555 se denominaron como pep1-4 y pep1-5,
respectivamente. Estas plantas muestran frutos, de fenotipo Pep1, con una penetrancia
muy baja, menor incluso que en pep1-2. Sin embargo, los errores en el patrón de filotaxia
son consistentes (Fig. IV.25 D-F). Ocasionalmente, también en pep1-4 se han podido
detectar frutos con una disposición asimétrica de sus valvas.
El tamaño de los frutos en los nuevos alelos es muy similar al que presenta el
silvestre Col-0, y no se aprecia ninguna diferencia de fertilidad respecto a éste.
Tanto los individuos pep1-2 como los pep1-4 mostraron un moderado retraso en la
floración con respecto al silvestre, así como una aparición heterocrónica de los primeros
pares de hojas de la roseta, siendo más pronunciado este efecto en el alelo pep1-2 (Tabla
IV.8). Estos rasgos reflejan una clara similitud con el alelo original pep1-1 y refuerzan el
Resultados 124
punto de vista según el cual el gen At4g26000, que codifica una proteína con dominios
KH, está relacionado con el fenotipo observado en el mutante original.
A
B
C
E
F
D
Figura IV.25.- Alteraciones en el patrón de filotaxia en los alelos pep1. A) pep1-2. B) Aparición de dos
inflorescencias y un fruto desde un mismo punto en pep1-2. C) Desarrollo de dos frutos desde un mismo nudo
en pep1-2. D) La misma alteración que en C) en pep1-4. E) y F) crecimiento de varias inflorescencias desde
un mismo punto en pep1-4. Barras de escala: A) 1 cm. B) 2 cm. En C), D), E) y F) 5 mm.
Tabla IV.8.- Aparición de las hojas de la roseta en plantas Col-0 y pep1-2.
Días tras la
siembra
9 días
14 días
a
Col-0
pep1-2
Col-0
pep1-2
46
40
40
40
3,95±0,72
1,84±0,67
7,97±0,65
5,77±0,57
Moda
4
2
8
6
Valores
extremos
2-5
0-3
6-9
4-6
Individuos
examinados
Media (nº de
hojas por
individuo)
a
Se contabilizaron como plantas sin ninguna hoja aquellas que germinaron y desplegaron los
cotiledones
Otro rasgo común entre pep1-1 y otros alelos pep1, particularmente pep1-2, es la
aparición ocasional de plantas con un sólo cotiledón o con una única hoja terminal. Este
alelo muestra además un fenotipo en la roseta claramente distinguible del silvestre (Fig.
IV.26) y que también guarda cierta reminiscencia con el de las plantas pep1-1 (Fig. IV.8 y
IV.16). Sus hojas son más puntiagudas y exhiben marcadas protuberancias laterales
correspondientes a los hidatodos u órganos de gutación. Su vasculatura, de un color
Resultados 125
verde más intenso, destaca en la superficie del limbo, la cual muestra un color más pálido
(Fig. IV.26). Cuando son muy jóvenes, las hojas se muestran algo más recurvadas hacia
la superficie adaxial que en el caso del silvestre y, a medida que crecen, esta diferencia
se reduce. De hecho, todos estos rasgos propios de la roseta basal de pep1-2 disminuyen
a medida que ésta se desarrolla, asemejándose cada vez más a Col-0.
A
B
Figura IV.26.- Diferencias en la roseta basal entre plantas Col-0 y pep1-2. A) Rosetas de 10 días de Col-0 (a
la derecha, cuatro hojas) y pep1-2 (izquierda, 3 hojas). B) Rosetas de 14 días de plantas Col-0 (derecha) y
pep1-2 (derecha), donde se aprecian 7 y 6 hojas respectivamente. En pep1-2 las hojas son puntiagudas, con
protuberancias laterales y una venación marcada. Barras de escala 0,5 mm.
En conjunto, los indicios aportados por los diversos alelos del gen At4g26000,
denominados pep1-2 a pep1-5, sugieren que la interferencia en su actividad es uno de los
factores capitales del fenotipo en las plantas pep1-1.
A la espera de una cuantificación exhaustiva, los rasgos fenotípicos señalados
(valvas extra, alteraciones filotácticas, fenotipo en la roseta, etc.) señalan al alelo pep1-2
como el más fuerte de la serie, si exceptuamos a la mutación compleja pep1-1.
Analizamos, mediante RT-PCR, la expresión de At4g26000 (PEP1) en las plantas
pep1-1. El gen ACTIN2 (ACT2), de expresión constitutiva en Arabidopsis (An et al., 1996),
se utilizó como control. La inserción de T-DNA en pep1-1 interrumpe el gen PEP1 a tan
sólo 18 pb del inicio de la traducción (Sección IV.4 y Fig. IV.33), por lo que resulta muy
verosímil que impida su transcripción. La Figura IV.27 muestra, efectivamente, la ausencia
del transcrito PEP1 en plantas pep1-1. Este dato señala a pep1-1 como un alelo nulo
respecto a PEP1, lo que resulta coherente con su intervención en el fenotipo mutante de
esta estirpe.
Resultados 126
Ws-2 pep1-1
DNA genómico
DNA genómico PEP1
cDNA PEP1
DNA genómico ACT2
cDNA ACT2
Figura IV-27.- Análisis de la expresión, mediante RT-PCR, de At4g26000 (PEP1) y ACT2 en plantas pep1-1 y
su ancestro silvestre Ws-2. Como molde para la síntesis de cDNA se utilizó RNA poliadenilado de
inflorescencias de Ws-2 y de pep1-1 (apartado III.7.2.1). La PCR se efectuó según III.7.9.4. Se utilizaron los
oligonucleótidos FUP1-17 y FUP1-18 (Tabla III.3), que rinden un fragmento de 283 pb a partir del cDNA
silvestre. El producto genómico de amplificación presenta un tamaño de 422 pb debido a la presencia del exón
5. La amplificación del gen ACT2 genera un fragmento de 260 pb a partir del cDNA, y de 343 pb a partir del
DNA genómico. Los cebadores utilizados fueron ACT2-f y ACT2-r (Tabla III.3).
IV.4.2.- Análisis de complementación entre pep1-1 y líneas de inserción procedentes
de las colecciones de dominio público.
Efectuamos cruzamientos entre pep1-1 y algunas de las líneas expuestas en la
Tabla IV.7. Los individuos F1 mostraron características silvestres en los cruces con las
líneas representantes de los genes SHD, AGP7 y el que codifica una hipotética
peroxidasa (Tabla IV.7).
El cruce entre pep1-1 y pep1-2 tuvo como resultado la obtención de individuos F1
transheterocigóticos que mostraban muchas de las anomalías descritas para el primer
alelo. El patrón de filotaxia exhibió el mismo tipo de alteraciones y el fenotipo de la roseta
basal fue muy similar al de pep1-2 (datos no mostrados). Sin embargo, el dato más
elocuente es la presencia en todas las plantas de frutos con valvas extra, de un tamaño
igual o algo inferior al silvestre (Fig. IV.28). La expresividad de este rasgo es variable,
pero la penetrancia se puede considerar completa.
La descendencia F2 de este cruzamiento no reveló ninguna sorpresa, rindiendo
plantas pep1-2 sensibles a kanamicina, mientras que las plantas de genotipo pep1-1 y los
transheterocigotos pep1-1/pep1-2 se seleccionaron en este antibiótico. Tras verificar
molecularmente el genotipo de estas últimas, comprobamos que reproducían los rasgos
de sus progenitores.
Resultados 127
B
A
C
D
*
*
*
E
Figura IV.28- Fenotipo de los frutos en los transheterocigotos pep1-1/pep1-2. A) Fruto pep1-1/pep1-2. Los
asteriscos y las líneas discontinuas señalan y delimitan las valvas, respectivamente. Micrografía electrónica de
barrido de las zonas apical (B) y basal (C). D) Sección transversal E) Detalle de la región del replum, donde se
observa uno de los septa extra interrumpido. Barra de escala: A) 1 mm. B) y C) 100 µm. D) y E) 500 µm.
A la espera de una confirmación definitiva mediante la recuperación del fenotipo
silvestre con una construcción transgénica, la no complementación entre pep1-1 y pep1-2
supone un importante aval para considerar a las mutaciones en el gen At4g26000 o PEP1
como un agente causal del fenotipo observado.
IV.5.- ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN At4g26000 (PEP1).
IV.5.1.- Estructura del gen PEP1.
El gen At4g26000 se encuentra en la posición 88,7 cM del cromosoma IV, estando
incluido en el clon F20B18 (codón de inicio de la traducción en la posición 35.058 pb y
codón de parada en la posición 37.317 pb). Las distintas bases de datos (NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; y TAIR, http://www.arabidopsis.org/) indican que la unidad
de transcripción de este gen presenta un tamaño de 2.590 pb, en la que se incluyen 6
exones y 5 intrones, así como una secuencia líder de 24 pb en 5’ y otra de 304 pb en su
región 3’ no traducida (Fig. IV.29).
Adquirimos clones de cDNA completo del gen (RAFL08-13-K20 y RAFL09-64-E03;
RIKEN Biosource Center, Experimental Plant Division, Tsukuba, Japón). Estos clones
corroboran las posiciones de todas las facetas estructurales anteriormente descritas. La
región codificante de PEP1 tiene un tamaño de 1.485 pb. El correspondiente producto
proteico cuenta con 495 aa y un peso molecular de 54,02 kDa.
Resultados 128
A
atcttttttgtgttaccggttcaa ATG GCC GCC GTC GCA GAT TCC GTT GAG AAC AAC GGT TCC ATA AAC
M
A
A
V
A
D
S
V
E
N
N
G
S
I
N
69
15
CTC CCT GAG AAT GAA AAC CTT ATA CCG GCG GGA TTC AGT GCC GCC GCA TTG CTT GAC GAA AAC
L
P
E
N
E
N
L
I
P
A
G
F
S
A
A
A
L
L
D
E
N
132
36
TCT GGC GCT TTC CCT GAA TTG AAT CAG CCC GAT AGC TTA GCT GCT GCT GAG ACT ACC TTC CCC
S
G
A
F
P
E
L
N
Q
P
D
S
L
A
A
A
E
T
T
F
P
195
57
GAT ACG AAC GAT TCC GCG GAG GAG AGG TGG CCA GGT TGG CCT GGT GAT TGC GTG TTT CGT ATG
D
T
N
D
S
A
E
E
R
W
P
G
W
P
G
D
C
V
F
R
M
258
78
ATC GTT CCG GTG ACT AAA GTC GGA GCT ATT ATT GGA CGC AAA GGT GAC TTT ATA AAG AAG ATG
I
V
P
V
T
K
V
G
A
I
I
G
R
K
G
D
F
I
K
K
M
321
99
TGT GAG GAG ACT CGT GCT CGT ATC AAA GTC CTT GAT GGT CCT GTT AAT ACT CCC GAT CGC ATC
C
E
E
T
R
A
R
I
K
V
L
D
G
P
V
N
T
P
D
R
I
384
120
gttagtatctctatctccttctacgtgatttactgtgttcaaagctaattcgaatttggggatttttaatttctatttctaggg
468
tttcttaatcataagtaggaagattcttgagttgtgatcattaaagttgtgaacttttatcccctagttgtgcaatttgattac
552
tttatggttccaattatagtttgaagtgttcactaagttaattacttgctcaatgttatgttttag GTG TTA ATA TCT
V
L
I
S
630
124
GGT AAG GAA GAA CCA GAG GCC TAC ATG TCA CCG GCA ATG GAC GCA GTG TTG AGG GTG TTT AGA
G
K
E
E
P
E
A
Y
M
S
P
A
M
D
A
V
L
R V
F
R
693
145
CGT GTT TCA GGG TTG CCT GAT AAT GAT GAT GAT GAT GTT CAA AAC GCT GGA AGT GTC TTC TCT
R
V
S
G
L
P
D
N
D
D
D
D
V
Q
N
A
G
S
V
F
S
756
166
TCA GTG CGT TTA TTA GTT GCT TCA ACG CAG GCG ATT AAT TTG ATT GGA AAA CAA GGA TCT TTG
S
V
R
L
L
V
A
S
T
Q
A
I
N
L
I
G
K
Q
G
S
L
819
187
ATT AAG TCT ATA GTA GAG AAC TCT GGT GCA TCA GTT CGT ATT TTA TCA GAA G gtattatctatcat
I
K
S
I
V
E
N
S
G
A
S
V
R
I
L
S
E
E
885
205
ctgcagttttctgtttttacctaattgatctctttgtttgtgattgttaaagtttagtttttgctatttcaattcatgtctgtt
969
tttttttctaaaattggtgtctttgttgccagtttcttatttctctacttttttctgccag AG GAA ACA CCG TTT TAT
E
T
P
F
Y
1.047
210
GCT GCA CAG GAT GAG AGG ATA GTG GAT TTG CAA GGG GAA GCT TTA AAG ATT CTT AAA GCA TTA
A
A
Q
D
E
R
I
V
D
L
Q
G
E
A
L
K
I
L
K
A
L
1.110
231
GAA GCC ATT GTT GGA CAC CTT AGG AGA TTT TTA GTT GAC CAT ACT GTT GTC CCT CTC TTC GAG
E
A
I
V
G
H
L
R
R
F
L
V
D
H
T
V
V
P
L
F
E
1.173
252
AAG CAA gtaagcttgcttgtttcaatcgagattattcctttcccttttttttcttttctgaattattgttatcttttcttat
K
Q
1.255
254
cttcag TAT CTA GCT AGG GTC TCT CAA ACT CGC CAG GAA GAA CCG TTA GCT GAA AGC AAG TCA
Y
L
A
R
V
S
Q
T
R
Q
E
E
P
L
A
E
S
K
S
1.318
273
TCT CTG CAT ACT ATT TCG TCA AAT CTA ATG GAG CCT GAT TTC TCC CTC TTA GCA CGG AGG GAA
S
L
H
T
I
S
S
N
L
M
E
P
D
F
S
L
L
A
R
R
E
1.381
294
CCT TTG TTT CTG GAG CGC GAT TCT CGG GTG GAC TCA CGT GTT CAG CCT TCG GGA GTT TCT ATC
P
L
F
L
E
R
D
S
R
V
D
S
R
V
Q
P
S
G
V
S
I
1.444
315
TAC AGT CAG GAT CCT GTA CTG TCT GCC AGA CAC TCC CCA GGT CTT GCT CGG GTT TCT TCT GCT
Y
S
Q
D
P
V
L
S
A
R
H
S
P
G
L
A
R
V
S
S
A
1.507
336
Resultados 129
TTT GTG ACA CAG gtagattcccttaaatacaacatcagctcctgaaaacgagtttagcgatatcatcttacttgttatg
F
V
T
Q
1.586
340
attagtcttccagcagtgattttgatcttaacacatctaacttgtttctctgaactagtagtgacgtttctataatggattctc
1.670
ttactag GTA TCT CAA ACG ATG CAA ATA CCA TTC TCC TAT GCA GAG GAT ATT ATT GGT GTA GAA
V
S
Q
T
M
Q
I
P
F
S
Y
A
E
D
I
I
G
V
E
1.734
359
GGA GCT AAT ATA GCC TAT ATC CGT CGA AGA AGC GGA GCT ACC ATA ACC ATT AAA GAG AGT CCG
G
A
N
I
A
Y
I
R
R
R
S
G
A
T
I
T
I
K
E
S
P
1.797
380
CAT CCT GAT CAA ATC ACA GTG GAA ATC AAA GGC ACA ACT TCT CAA GTA CAA ACT GCT GAG CAA
H
P
D
Q
I
T
V
E
I
K
G
T
T
S
Q
V
Q
T
A
E
Q
1.860
401
CTA ATT CAA gtaagaacacattcgatctgtatatatatatatatactttctgcgacgtggcattgtataaacactaagatt
L
I
Q
1.941
404
atgcttgctttgcatcctaccccgcctgcttcatcataaccgtattcttttgtttacgtgtgtgtag GAG TTC ATC ATC
E
F
I
I
2.020
408
AAT CAC AAG GAA CCA GTT TCG GTA TCA GGG GGA TAT GCC AGA ATC GAC TCT GGA TAT GTA CCT
N
H
K
E
P
V
S
V
S
G
G
Y
A
R
I
D
S
G
Y
V
P
2.083
429
GCA TAT CCT CCT CAG CTA AGT AAC CGT CAA GAG CCG CTC CCG AGC ACC TAC ATG GGC ACA GAG
A
Y
P
P
Q
L
S
N
R
Q
E
P
L
P
S
T
Y
M
G
T
E
2.146
450
CCG GTG CAG TAC AGA CCA ACA GCA TAC TCT CAG CTG GGG GGT CCT TCT ACC TAC ACA CCG ACC
P
V
Q
Y
R
P
T
A
Y
S
Q
L
G
G
P
S
T
Y
T
P
T
2.209
471
CTG ACT GGG CAA ACT TAT GGT TCG GAA TAT AGA CCA GCT TCT GAT GTT GGT GGC TAC AGC AGT
L
T
G
Q
T
Y
G
S
E
Y
R
P
A
S
D
V
G
G
Y
S
S
2.272
492
TAT AAT CTT TGA attggttgctgtgtttaagtttatttgcagattaatttctctttagagaaaggctcatttataatata
Y
N
L
*
2.352
495
atagagagggaaaaggaacaagttctagagagccaatgtagttgttggaatgtgtaatgtaaatctaggtgccctttttttttt
2.436
tttttttcatacctcgatatatgtcacactacgtttctggtcaaataagaacatgttttttctttcttttttgtatgaatttgt
2.520
ttatcagaagtcagaatgattcagttttaagaaatttttagttaacgttttacaacaata
2.590
B
100 pb
5’
3’
ATG
TGA
Figura IV.29.- Secuencia y estructura del gen PEP1. A) Secuencia nucleotídica y peptídica del gen PEP1. Los
exones se indican en mayúscula y los intrones en minúscula. Los aminoácidos aparecen debajo de la
secuencia codificante. La numeración aparece a la derecha de la secuencia. B) Estructura esquemática de la
unidad de trancripción de PEP1. Los exones se representan en azul. La orientación de la flecha indica el
sentido de la transcripción.
Resultados 130
IV.5.2.- PEP1 es una proteína con dominios KH.
El análisis bioinformático de la secuencia proteica de PEP1 indica la existencia de
tres dominios de unión a ácidos nucleicos del tipo KH (K homology, Aasheim et al., 1994).
El dominio KH, inicialmente identificado en la ribonucleoproteína heterogénea nuclear
humana (hnRNP-K, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-K, Aasheim et al., 1994), es
el segundo motivo más abundante de unión a RNA (Lorkovic y Barta, 2002).
Los dominios KH comprenden regiones de alrededor de 70 aa donde se sitúa una
secuencia consenso de 9 aa. Esta estructura se conserva entre los distintos miembros de
esta familia de proteínas (Fig. IV.30; Burd y Dreyfuss, 1994; Musco et al., 1997; Adinolfi et
al., 1999; Grishin, 2001). Existen dos tipos de dominio KH (tipo I y II), en función de la
estructura terciaria que la proteína adopta (Castiglione et al., 1995). En PEP1, los
dominios KH pertenecen a la clase I y se sitúan entre las posiciones aminoacídicas 73 a
140, 165 a 234, y 340 a 403, respectivamente (Fig. IV.30).
NH3
KH
KH
COOH
KH
1
495 aa
73
140
165
340
403
234
VIGXXGXXI
Figura IV.30.- Estructura esquemática de la proteína PEP1. Los dominios KH se representan como recuadros
verdes, indicando su posición en la proteína. En el recuadro inferior aparece la secuencia consenso del
dominio KH.
Encontramos miembros de esta familia de proteínas tanto en procariotas (Yersinia
pestis, Streptomyces
coelicolor; http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov)
como
en
eucariotas
(Sacharomyces cerevisiae, Tripanosoma brucei, Caenorhabditis elegans, Drosophila
melanogaster, Danio rerio, Xenopus laevis, Mus musculus, Homo sapiens, inter alia;
Chekanova et al., 2002). Un ejemplo notable lo constituye la proteína FMR-1 (Familial
Mental Retardation), cuya deficiencia genera el síndrome del X-frágil (Gibson et al., 1993;
Siomi et al., 1994), una de las causas más frecuentes de retraso mental (Cummings,
2002). Mediante ensayos in vitro, se comprobó que las proteínas KH mayoritariamente se
unen a RNA (Musco et al., 1997; Baber et al., 1999), aunque existe un caso descrito de
Resultados 131
unión a DNA de cadena sencilla (Braddock et al., 2002a; Braddock et al., 2002b), y la
proteína hnRNP K, que interacciona con la cromatina (Bomsztyk et al., 2004).
Tabla IV.9.- Proteínas que presentan dominios KH en Arabidopsis thaliana.
Gen
At2g03110
At1g09660
At5g06770
At3g12130
At2g38610
At5g04430
At5g56140
At3g08620
At5g08420
At1g33680
At1g14170
At4g26000
At4g26480
At5g09560
At5g15270
At3g04610
At3g32940
At4g18375
At1g51580
At2g25970
At5g46190
At2g22600
At5g53060
At4g10070
At5g51300
At5g64390
a
b
Tamaño de la
proteína
155
163
240
248
286
313
315
319
391
407
479
495
555
567
568
577
590
606
621
632
644
649
660
748
804
833
Tipo de dominios y
organización
KHa
KH
C3Hb; KH; C3H
C3H; KH; C3H
KH
3 KH
KH
KH
KH
KH
3 KH
3 KH
KH
2 KH
4 KH
3 KH
KH
5 KH
5 KH
2 KH
5 KH
4 KH
3 KH
2 KH
KH; 2C2HCc; RRMd
4 KH/5 KH
c
Producto
Referencia
PEP1
Esta Tesis
FLK
Lim et al., 2004
HEN4
Cheng et al., 2003
d
Motivo KH. Dedos de zinc de tipo C3H. Dedos de zinc de tipo 2C2HC Motivo de reconocimiento de
RNA (RNA Recognition Motif).
Los dominios KH se han descrito en proteínas implicadas en distintos procesos del
metabolismo del RNA regulando su estabilidad, transporte, represión traduccional o
procesamiento de intrones (Gibson et al., 1997; Ostareck-Lederer et al., 1998; Krecic y
Swanson, 1999; Lee y Schedl, 2001; Cheng et al., 2004). Las mutaciones en algunos de
los genes correspondientes pueden provocar importantes alteraciones en distintos
procesos del desarrollo animal (Ebersole et al., 1996; Aaron et al., 1997; Nabel-Rosen et
al., 1998; Zhu y Chen, 2000; Lee y Schedl, 2001; Labourier et al., 2002; Nancy et al, 2002;
Perrone-Bizzozero y Bolognani, 2002; Pilotte et al., 2001; Marin y Evans, 2003).
Las proteínas KH también son ubicuas en las plantas, aparecen tanto en
monocotiledóneas como en dicotiledóneas. En Arabidopsis thaliana se han descrito 26
Resultados 132
miembros de la familia (Tabla IV.9; Lorkovic y Barta, 2002), las cuales deben cumplir
papeles muy similares a los ya descritos en otros organismos, aunque sólo a dos de estas
proteínas
se
les
ha
asignado
una
función.
La
proteína
HEN4
regula
postranscripcionalmente a AG (Cheng et al., 2003) y el producto del gen FLOWERING
LOCUS K (FLK) modula el procesamiento del mRNA de FLOWERING LOCUS C (FLC),
un regulador del tiempo de floración (Lim et al., 2004).
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY474
MAEAEDQQNFVAHNGDQVPDQGSDELHNGLPYQVHDETLVHQPYEVEDPILEPQQYEVPD
------------MDG-LVENFDADDLG-EMPQNHYNEEQLIPYSDVSHPYNE-------------------------MAAVADSVENNGSINLPENENLIPAGFSAAALLD----------------------------MADPA----------------AAAAAAEFGD-------:*
:
60
38
34
15
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
PTLEPQQYEVPDQTLEPQQYEVDDQLEYHQYQLQDQANEDVQDHSQDDLQYQPQNQEQFQ 120
---EPD--------------NMDNVEEGNPYIQQ------VSLYSEE-----PENQ---- 66
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
LQDEAHDQAQYQAQGDVQDHNGDEVQDKVEDEEGIPEHLESLQKSEPEEDATVGGEEKRW 180
YNEEPSNPYQEESD---NAYNG-----EVKQQDSLPVEAD-----------------KKW 101
-ENSGAFPELNQPDS--LAAA----------ETTFPDTNDS--------------AEERW 67
-PDSPPAPAAEEAEA--AAAVG---------EEAVPAAEAA--------------AAKRW 49
:.
:.:
: .*
::*
FLK
OSQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
PGWPGETVFRMLVPAQKVGSIIGRKGDVIKKIVEETRARIKILDGPPGTTERAVMVSGKE
PGWPGESVFRILIPAQKVGAIIGRKGEFIKKMCEESKARIKILDGPPGVPERTVMISAKD
PGWPGDCVFRMIVPVTKVGAIIGRKGDFIKKMCEETRARIKVLDGPVNTPDRIVLISGKE
PGWPGDSVFRLVVPVLKVGSIIGRKGELIKRLVEETKAKVRVLEGPVGATERIVLVSGKE
*****: ***:::*. ***:******:.**:: **::*::::*:** ...:* *::*.*:
240
161
127
109
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
EPESSLPPSMDGLLRVHMRIVDGLDGEASQAPP-PS-KVS-TRLLVPASQAGSLIGKQGG
EPDAPISPAMDGLFRVYKRITDGSDGDSGQPERNIS-NVGPTRLLVPASQAGSLIGKQGA
EPEAYMSPAMDAVLRVFRRVSGLPDNDDDDVQNAGS-VFSSVRLLVASTQAINLIGKQGS
DPALELPPAMDALMRVFKRVSGITDGAAEGTQAATAPGVCAARLLVPGAQAINLIGKQGA
:*
:.*:**.::**. *: . *.
: . .****..:** .******.
297
220
186
169
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
TVKAIQEASACIVRVLG--SEDLPVFALQDDRVVEVVGEPTSVHRALELIASHLRKFLVD
TIKSIQDSSKSIVRIV----ETLPLVALNDDRVVEIQGEPVGVQKALESIASHLRKFLVD
LIKSIVENSGASVRILS--EEETPFYAAQDERIVDLQGEALKILKALEAIVGHLRRFLVD
SIKAIQEGTGATIRVISIDERERPFYVIEDERIVEIQGETEKVLKALQAVSNHLRKFLVD
:*:* : : . :*::
. *. . :*:*:*:: **. : :**: : .***:****
355
276
244
229
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
RSIIPFFENQMQKPTRQMDHMPPPHQSWGPPQ--GHAPS-VGGGGYGHNPPPYMQPPPRH
RSVLPLFEGQMKMHNAQREQAMAAPQPWGPPQPWGPPPSHLPPGGPGYGGHPQFMPPRPQ
HTVVPLFEKQYLARVSQTRQEEPLAESKSSLH---TISSNLMEP--------DFSLLARR
HSVLPLFEKTN-ATVTQDRSTDAWTD-ISHPS---IVSAQINQPPPVVD---EYILPMKR
::::*:**
*
. : .
.: :
:
412
336
293
281
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
DSYYPPPEMRQPPMEKQPHQGISAYGREPPMNVHVS--SAP----PMVAQQVTQQMQIPL
DNYYPPPDV--PSMEKQPHYGISAYGREAPTGVSASGNQPP----SHVASQVTHNMQIPL
EPLFLERDS--RVDSRVQPSGVSIYSQDPVLSARHSPGLAR--VSSAFVTQVSQTMQIPF
DPLFLEREP--LIDHNIHRSGVSLYGRDPALSTLRTSGIHGGGPGGPLLSQITQTMQIPL
: :
:
.
*:* *.::. .. :
. *::: ****:
466
390
349
339
Resultados 133
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
SYADAVIGTSGSNISYTRRLSGATVTIQETRGVPGEMTVEVSGTGSQVQTAVQLIQNFMA
SYADAVIGAAGASISYIRRHSGATVTIQESRGAPGEMTVEIIGSASQVQTAQQLVQNFMA
SYAEDIIGVEGANIAYIRRRSGATITIKESP-HPDQITVEIKGTTSQVQTAEQLIQEFII
TYAEDIIGVKGANIAYIRANSGAVVTIQESLGSPDDITVEMKGTSSQVQAAYQLIQDSLA
:**: :**. *:.*:* * ***.:**:*:
*.::***: *: ****:* **:*: :
526
450
409
399
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
EA--GAPAP-------AQPQTVAPEQQG------YNPY----------ATHGSVYAAAPT
EAPQGPPPP-------ASNPPAPAVDLS------YGSYPPPY-----GASYGSAASGAGP
NHKEPVSVSGGYARIDSGYVPAYPPQLSNRQEPLPSTYMGTEPVQYRPTAYSQLGGPSTY
AHRDSVRSS--YAGLDPVYRPSYSQYGS-------STYPSSS-----LPSYSSMDGGGYS
.
.
. .
.
..*
.::.. . .
561
492
468
445
FLK
OsQ8W5C2
PEP1
OsQ9AY47
NPP--G-GYATDYSSG---YGY-------------------------------------APHNGG-SYGGTTYPS---YGY-------------------------------------TPTLTGQTYGSEYRPASDVGGYSSYNL--------------------------------SSGLGG--YGSSYR-------Y-------------------------------------.
* *.
*
577
510
495
458
Figura IV.31.- Alineamiento de las secuencias peptídicas de PEP1, FLK y sus respectivos ortólogos en arroz.
Con letras blancas sobre fondo negro se anotan los aminoácidos idénticos en las cuatro proteínas, y los
similares en negro sobre fondo gris. Las proteínas de arroz aparecen con su número de acceso en las bases
de datos.
PEP1 posee un ortólogo en arroz (Q9AY47) cuya similitud es superior al 75%, con
una identidad cercana al 48%. Posee una gran semejanza estructural con 3 dominios KH
situados en posiciones equivalentes. Su gen también presenta 6 exones y 5 intrones. Este
elevado índice de conservación entre monocotiledóneas y dicotiledóneas debe constituir
el reflejo de una importante función que necesita ser preservada (Fig. IV.31 y IV.32).
KH
PEP1
KH
KH
495
1
OsQ9AY47
KH
(48%)
KH
1
458
KH
FLK
(42,4%)
KH
KH
KH
1
577
OsQ8W5C2
(38%)
KH
1
KH
KH
510
Figura IV.32.- Alineamiento estructural de PEP1, FLK y sus respectivos ortólogos. Se ordenan de arriba abajo
en función de su grado de identidad con PEP1. En los 4 polipéptidos, los dos primeros motivos KH se sitúan
en posiciones cercanas.
Resultados 134
El parálogo más cercano a PEP1 en el genoma de Arabidopsis thaliana es
precisamente FLK (Lim et al., 2004), el cual posee un ortólogo en arroz con una relación
estructural muy similar a la que existe entre PEP1 y su ortólogo en esta misma especie
(Fig. IV.31 y IV.32). FLK también presenta 3 motivos KH, 6 exones y 5 intrones, pero su
grado de homología con PEP1 es menor (42,4% de identidad) que con respecto a su
ortólogo en arroz.
El grado de semejanza de PEP1 con otras proteínas KH de Arabidopsis thaliana
es mucho menor. Con respecto a HEN4, la identidad es de tan sólo el 23%. Con respecto
a las proteínas KH de metazoos, PEP1 presenta grados de homología inferiores al 30%.
IV.6.- LOCALIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN LOS ALELOS DE pep1.
El gen PEP1 presenta 6 exones y 5 intrones. En la Figura IV.33 se representa, de
forma esquemática, la localización de las inserciones de T-DNA en cada una de las líneas
examinadas. Las posiciones exactas de las inserciones se verificaron mediante PCR y
secuenciación.
pep1-3
PEP1
T-DNA
Borde izquerdo
(LB)
Borde derecho
(RB)
*
pep1-4
pep1-5
pep1-2
Figura IV.33.- Localización de las inserciones de los alelos pep1 en el gen PEP1. Se señala la orientación del
T-DNA en cada caso. La flecha y el asterisco rojos indican el punto de la inserción en pep1-1. La orientación
de la flecha de trazo grueso indica el sentido de la trancripción.
IV.6.1.- Expresión de PEP1 en los alelos mutantes.
Llevamos a cabo experimentos de RT-PCR para comprobar la expresión de PEP1
en los alelos pep1-2 y pep1-4. Se realizaron reacciones en paralelo a partir de cDNA de
Col-0 y pep1-1. Utilizamos el mismo control de expresión que en el apartado IV.4.1 (Fig.
IV.34).
Resultados 135
-1 1-2 1-4
0
1
p
p
p
l
Co pe pe pe
0 ep1-1 ep1-2 ep1-4
l
p
p
Co p
500 pb
PEP1
ACT2
Figura IV.34.- Análisis de la expresión en los alelos pep1-2 y pep1-4. A la izquierda, expresión de PEP1 en
pep1-1, pep1-2, pep1-4 y Col-0. A la derecha, expresión de ACT2. Se utilizaron como molde 5 µg de RNA
total de inflorescencias. Los cebadores utilizados en la amplificación por PCR fueron FUP1-37 y FUP1-38
(Tabla III.3) que dan lugar a un fragmento de cDNA de 244 pb.
De nuevo, no detectamos expresión en el alelo pep1-1 (Fig. IV.34), así como en
pep1-4, lo que indica que debe tratarse de un alelo nulo. Por el contrario, se detecta la
presencia del transcrito en el RNA de pep1-2. La inserción de T-DNA en este alelo se
localiza a tan sólo 15 pb antes del codón de parada (Fig. IV.33), no impidiendo la
transcripción del correspondiente mRNA. Ignoramos si esta situación provoca un
transcrito funcional, o si compromete su estabilidad o su traducción.
Resulta paradójico que el alelo aparentemente más débil de los examinados,
pep1-4, es con toda probabilidad nulo, mientras que no podemos precisar acerca de
pep1-2, supuestamente el alelo más fuerte con la excepción de pep1-1 (sección IV.4.1).
Tal vez, el alelo pep1-2 dé origen a una cierta cantidad de un producto con propiedades
ligeramente antimorfas, lo que podría explicar su fenotipo.
IV.7.-
OBTENCIÓN
DE
CONSTRUCCIONES
Y
GENERACIÓN
DE
PLANTAS
TRANGÉNICAS.
Para confirmar que las mutaciones en At4g26000 son responsables del fenotipo
Pep1 planteamos ensayos de complementación funcional o rescate fenotípico.
Resultados 136
IV.7.1.- Generación de las contrucciones.
IV.7.1.1.- Construcción genómica de PEP1.
Mediante PCR, obtuvimos un fragmento de 5.111 pb a partir del BAC F20B18
(cebadores OCF11 y OCF12; Tabla III.3). Este fragmento contiene la región codificante
del gen At4g26000, así como 2.656 pb de la región 5’ y 195 pb del extremo 3’ no
traducido, incluyendo el sitio de poliadenilación. Se utilizó una mezcla de polimerasas de
DNA con actividad correctora de prueba (High-Fidelity, Roche Diagnostics). Inicialmente,
estos fragmentos se clonaron en el vector pGEM-3Zf(+) utilizando las enzimas SalI y XbaI,
presentes tanto en el plásmido como en el extremo 5’ de los cebadores utilizados. Se
seleccionaron clones positivos de E. coli y se verificó su identidad mediante
secuenciación. Uno de los 15 clones resultantes se denominó pGEM:gOCF11~12, se
liberó su inserto con SalI y XbaI, y se introdujo en el plásmido pGreenII0179 previamente
digerido con las mismas enzimas.
Los nuevos clones en E. coli se denominaron pGreenII0179:gOCF11~12 (Fig.
IV.35). Con su DNA plasmídico, se transformó la estirpe LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens, portadora del plásmido pSOUP (Sección III.2). Mediante PCR determinamos
la integridad del transgén en los clones positivos de Agrobacterium tumefaciens, utilizando
los cebadores M13F y M13R. En todos los casos, el producto de PCR presentó el tamaño
esperado.
IV.7.1.2.- Construcción de sobreexpresión 35S::PEP1.
Amplificamos mediante PCR toda la región codificante comprendida entre los
oligonucleótidos FUP1-27 y FUP1-31 (Tabla III.3) a partir del clon RAFL08-13-K20
(AY056288), portador del cDNA de PEP1. El fragmento resultante de 1.715 pb contenía
una porción de 32 pb anteriores al codón de inicio y 136 pb de la región 3’. El fragmento
se clonó directamente en pGEM-T y se secuenciaron distintos clones obtenidos en E. coli,
denominándolos pGEM-T:cFUP1-27~31. El inserto se liberó con SalI y SmaI, presentes
en los cebadores utilizados en la amplificación, y se clonó en el T-DNA del plásmido
pBINJIT (Sección III.2), con el que se transformó la estirpe C58C1 de Agrobacterium
tumefaciens. En este caso, identificamos los clones positivos mediante hibridación en
colonia. La sonda utilizada (región del cDNA entre los cebadores FUP1-17 y FUP1-18;
Tabla III.3) se generó mediante PCR. Los clones positivos obtenidos (pBINJIT:cFUP127~31, Fig. IV.35) se verificaron mediante secuenciación.
Resultados 137
2,48 Kb
A
SalI
XbaI
OCF11
OCF11
Diana para SalI
Diana para XbaI
B
SalI
SmaI
FUP1-27
FUP1-31
Diana para SalI
Diana para SmaI
Figura IV.35.- Esquemas de las construcciones transgénicas. A) Esquema de la construcción con el clon
genómico pGreenII0179:gOCF11~12. B) Esquema de la construcción de sobreexpresión génica
pBINJIT:cFUP1-27~31. Las flechas negras indican el sentido de la transcripción.
Resultados 138
IV.7.2.- Transferencia de transgenes y selección de transformantes.
Se infectaron entre 100 y 250 plantas (individuos T1) mediante inmersión floral
(floral dipping). Se sembraron semillas descendientes de las plantas T1 (semillas T2) en
placas de Petri con una densidad media de 2.500 semillas por placa. El medio se
enriqueció con higromicina en el caso de la construcción pGreenII0179:gOCF11~12, y con
kanamicina en el de pBINJIT:cFUP1-27~31.
Se obtuvieron un total de 22 individuos transformantes pep1-2 y 8 Col-0,
portadores de la construcción genómica pGreenII0179:gOCF11~12, de entre cerca de
30.000 y 13.000 semillas examinadas, respectivamente. En el caso del clon de
sobreexpresión pBINJIT:cFUP1-27~31 se obtuvieron 6 líneas en fondo Col-0 y 4 líneas en
pep1-2 a partir, en cada caso, de 15.000 semillas sembradas.
IV.7.3.- Fenotipo de las plantas transgénicas.
IV.7.3.1.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon genómico.
Se transformaron plantas mutantes pep1-2 y de su ancestro silvestre Col-0. En
ambos casos se transmitió a la progenie la resistencia a la higromicina. La presencia de
esta construcción en el silvestre no parece inducir la aparición de ninguna anomalía
detectable, mientras que su presencia en pep1-2 determina la desaparición de su fenotipo
mutante. Desde el inicio del desarrollo vegetativo, estas plantas muestran características
silvestres, recuperando el aspecto y el ritmo de aparición de las hojas de su roseta
(plastocrono), tal como se aprecia en la Figura IV.36. Tampoco se detectan errores en la
filotaxia ni frutos con valvas extra (resultados no mostrados), aunque la ausencia de este
último rasgo se debe interpretar con cautela debido a su penetrancia incompleta en este
mutante. Todas estas características se transmitieron a la descendencia. De estas
observaciones se desprende el funcionamiento de nuestra construcción y que At4g26000
es PEP1.
Una verificación adicional obvia a este punto es la recuperación del fenotipo
silvestre en plantas pep1-1. Hemos realizado cruces entre diversas líneas pep1-2,
portadoras de la construcción genómica, y pep1-1. En el momento de elaboración de esta
memoria, podemos atestiguar el fenotipo silvestre de las plantas F1 de estos
cruzamientos. La roseta, a diferencia de lo ocurrido en el transheterocigoto pep1-1/pep1-2
(sección IV.4.2), no presenta fenotipo mutante, ni tampoco se observan alteraciones en la
filotaxia o en los frutos. Queda para un examen posterior el análisis del fenotipo de las
plantas F2 pep1-1/pep1-1 portadoras de esta construcción transgénica.
Resultados 139
B
A
Figura IV.36.- Fenotipo de las plantas pep1-2 portadoras de la construcción genómica. A) A la izquierda una
roseta pep1-2 de 10 días tras la germinación, portadora de la construcción genómica, con una clara
recuperación del ritmo de aparición de las hojas. A la derecha una roseta de la misma edad de pep1-2. B)
Rosetas de 14 días tras la germinación. A la izquierda una planta transgénica y a la derecha una roseta de
pep1-2. Barras de escala 1 cm.
IV.7.3.2.- Fenotipo de las plantas transformadas con el clon de sobreexpresión.
Las líneas pep1-2 portadoras de la construcción de sobreexpresión manifiestan
fenotipo silvestre, en unos términos equivalentes a los descritos para el clon genómico
(sección IV.7.3.1 y datos no mostrados). En el momento presente ignoramos el grado de
expresión del transgén en estas construcciones, por lo que no podemos establecer
comparaciones con los transformantes con el clon genómico. En cualquier caso, la
resistencia al antibiótico kanamicina se transmitió a la progenie, sugiriendo la estabilidad
de los transformantes.
Como en el caso anterior, la transformación de plantas silvestres con el transgén
no indujo la aparición de ningún rasgo particular. Una excepción notable la constituye una
línea que mostró un fenotipo consistente en diversas alteraciones del desarrollo
vegetativo (roseta con muchas hojas pálidas y picudas), inflorescencias ahiladas y frutos
diminutos muy poco fértiles, rasgos que en su conjunto recuerdan el fenotipo del aislado
original pep1-1 (Fig. IV.37). Una interpretación verosímil para el fenotipo de esta línea es
un fenómeno de cosupresión desencadenado por la sobreexpresión de PEP1.
Las líneas transgénicas portadoras del vector sin la correspondiente construcción,
no presentan ningún fenotipo aparente.
Resultados 140
Figura IV.37.- Selección de
transformantes resistentes a la
kanamicina
(plantas
Col-0
portadoras de la construcción para
la sobreexpresión de PEP1). A)
Transformante
rodeado
de
individuos sensibles. Escala 1
mm. B) Posible efecto de
cosupresión en una de las líneas
transformantes. Barra de escala 1
cm.
B
A
IV.8.- ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN PEP1.
IV.8.1.- Detección del transcrito de PEP1 en distintos órganos de la planta mediante
RT-PCR semicuantitativa (SQRT-PCR).
Para tener una estima de los niveles relativos de expresión de PEP1 en distintos
órganos de la planta realizamos ensayos de SQRT-PCR (III.7.9.5). Se analizó su
expresión en raíces, tallo, hojas, flores y frutos de Col-0 (Fig. IV.38).
A
Col-0
R
T
H
Fl
Fr
PEP1
ACT2
Figura IV.38.- Niveles de expresión de PEP1 en distintos órganos del silvestre. Se efectuó SQRT-PCR a partir
de 5 µg de RNA total y amplificando con los cebadores FUP1-37 y FUP1-38, que generan un fragmento de
cDNA de 244 pb. Como control, utilizamos el gen ACT2. Ambos productos (PEP1 y ACT2) se amplificaron
independientemente y se usaron como sondas. R: raíz; T: tallo; H: hoja; Fl: Flores; Fr: fruto.
El transcrito de PEP1 se detecta en la raíz y en todas las zonas aéreas
examinadas, aunque sus niveles difieren. Su expresión en las raíces es aparentemente
menor que en el resto de órganos examinados. Tanto en el tallo principal, como en las
flores, su abundancia es mayor y similar entre sí. En hojas y frutos, PEP1 se expresa en
Resultados 141
menor medida. La expresión ubicua de este gen es consistente con el grado de
pleiotropía observado en el fenotipo Pep1.
IV.8.2.- Localización del mRNA de PEP1 mediante hibridación in situ.
Analizamos la expresión de PEP1 mediante hibridación in situ en flores y frutos
silvestres, tal como se describe en el apartado III.8.4 de Materiales y Métodos. Las
ribosondas sentido y antisentido se obtuvieron tras clonar en pGEM-T una secuencia de
368 pb correspondiente al cDNA entre los cebadores FUP1-4 y FUP1-6 (Tabla III.3).
El mRNA de PEP1 se detecta en las regiones laterales del meristemo floral.
Durante el desarrollo de la flor, detectamos el transcrito en los estambres y carpelos en
crecimiento (Fig. IV.39 A). Tras la antesis, la expresión se localiza en regiones
correspondientes al replum (Fig. IV.39).
A
B
r
v
s
r
Figura IV.39.- Localización del mRNA de PEP1. A) Flores silvestres. B) Sección transversal de un fruto
silvestre. Las flechas señalan las regiones donde se detecta la señal. v: valva, r: replum, s: septum. El tamaño
de las barras de escala se indica en cada una de las imágenes.
IV.9.- ANÁLISIS DE LAS INTERACCIONES GENÉTICAS DE PEP1
El análisis genético nos permite realizar inferencias acerca de las funciones
génicas implicadas en un determinado proceso biológico. Con la intención de obtener
indicios sobre cuáles son los mecanismos y vías de desarrollo en los que participa PEP1,
estudiamos las interacciones de sus alelos mutantes con los de otros genes que actúan
en distintos procesos del desarrollo de Arabidopsis thaliana.
La elección inicial se basó en criterios de supuesta afinidad de acción molecular,
similitud de secuencia y fenotipo observado en dichos mutantes, particularmente en el
Resultados 142
pistilo. Analizamos posibles interacciones entre alelos pep1 y mutaciones en los genes
CLV1 (Clark et al., 1993) CLV2 (Kayes y Clark, 1998), CLV3 (Fletcher et al., 1999), WUS
(Laux et al., 1996), FUL (Gu et al., 1999), HEN2 (Western et al., 2002), HUA1 (Liu et al.,
2001), HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999) y FLK (Lim et al., 2004)
IV.9.1.- Dobles y triples mutantes con hua1, hua2 y hua enhancer2 (hen2).
Los genes HUA1 y HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001) participan en
la ruta de maduración del mRNA de AGAMOUS (AG), y se demostró la capacidad de
HUA1 de unirse a RNA (Cheng et al., 2003). Las mutaciones hua, por separado, no
generan ningún fenotipo destacable en la planta. En cambio, los dobles mutantes hua1-1
hua2-1 presentan ciertas interacciones florales muy leves y una gran reducción de su
porte, lo que evidencia su papel en el desarrollo vegetativo (Chen y Meyerowitz, 1999).
Los dobles mutantes hua1-1 pep1-2, así como hua2-1 pep1-2, no muestran ningún
fenotipo reseñable. En el triple mutante, no obstante, se aprecia una cierta reducción
adicional del porte de la planta con respecto al doble mutante hua1-1 hua2-1 (resultados
no mostrados), lo que insinúa una interacción de PEP1 con estos genes durante el
desarrollo vegetativo.
La mutación hen2 causa una disminución en el tamaño de la planta, mayor número
de flores en las inflorescencias y errores ocasionales de filotaxia (Western et al., 2002).
En las flores se observa un aumento en el número de pétalos, y frutos más pequeños y
ensanchados que en el silvestre. El gen HEN2 codifica una helicasa de tipo DExH. Se ha
argumentado que las proteínas con dominios KH requieren la función de una helicasa
para poder llevar a cabo su actividad. Teniendo en cuenta este razonamiento, obtuvimos
el doble mutante pep1-2 hen2-1. No se observó ningún indicio de interacción entre ambas
mutaciones, salvo una incidencia en las alteraciones de la filotaxia ligeramente superior a
cualquiera de los mutantes simples (no mostrado).
IV.9.2.- Doble mutante con fruitfull (ful).
Las plantas ful presentan frutos de reducido tamaño como resultado de la
supresión del alargamiento de las células de la valva y, como consecuencia, el replum de
estos frutos se dispone en zig-zag (Gu et al., 1999). El gen FUL, codifica un factor de
transcripción de tipo MADS-box. Su función principal es la especificación de la identidad
de las células de la valva, especialmente tras la polinización.
Resultados 143
ful-1 es un alelo producido por la inserción de un transposón y confiere resistencia
a la kanamicina. Usando plantas ful-1 como parental masculino, realizamos cruzamientos
con pep1-2. El cultivo posterior en kanamicina nos permitió verificar la autenticidad de la
generación F1 y seleccionar en la generación F2 individuos portadores de este alelo. El
doble mutante se identificó mediante el genotipado molecular de pep1-2 (Tabla III.6) y la
observación del fenotipo Ful. La progenie F3 de estos individuos fue homogénea. Estas
plantas muestran la aditividad de fenotipos como errores de filotaxia, roseta típica de
pep1-2, y la aparición de frutos Ful. No se aprecian diferencias entre los frutos ful-1 y los
del doble mutante (Fig. IV.40). Este resultado puede indicar la falta de interacción entre
ambas actividades génicas, o bien la existencia de otras funciones redundantes con
PEP1.
A
B
Figura IV.40.- Fenotipo del doble mutante ful-1 pep1-2. A) Fruto ful-1. B)
Fruto ful-1 pep1-2. Barras de escala 1 mm.
IV.9.3.- Doble mutante con flowering locus K (flk).
El parálogo más cercano a PEP1 es el gen FLK (sección IV.5.2 y Fig. IV.31 y
IV.32). Recientemente se ha descrito su papel durante la inducción floral a través de la
ruta autónoma (Lim et al., 2004). El rasgo fenotípico más característico de estos mutantes
es un retraso muy acusado de la floración (Lim et al., 2004).
La similitud estructural se corresponde en muchas ocasiones con fenómenos de
redundancia o solapamiento funcional (Liljegren et al., 2000b; Hawley y Walker, 2003).
Con esta idea, decidimos construir el doble mutante flk pep1. Utilizamos una línea de
inserción en el gen FLK (SALK_001523; Tabla III.2) procedente de la colección SALK de
Resultados 144
T-DNA, a la que hemos denominado flk-3 de manera provisional. La inserción se localiza
en el primer exón, a pocos nucleótidos del inicio de la traducción, por lo que resulta muy
verosímil que se trate de un alelo nulo. De hecho, el fenotipo de retraso de la floración que
muestran los individuos homocigóticos es totalmente acorde al descrito en Lim et al.
(2004). No obstante, un rasgo no descrito con anterioridad y observado en nuestro
laboratorio consiste en la aparición ocasional de anomalías en la disposición filotáctica, no
observándose alteraciones en sus frutos.
El alelo pep1-4 manifiesta un fenotipo más suave que pep1-2 respecto al patrón de
filotaxia, además de facilitar la selección de individuos mediante el cultivo en kanamicina,
razones por las que elegimos este alelo para construir el doble mutante con flk-3. Los
genotipos de los individuos en la segregación F2 se establecieron mediante genotipado
molecular (Tablas III.6 y III.7).
A
B
C
D
E
Figura IV.41.- Interacción entre flk y pep1-4. A) De izquierda a derecha, plantas flk-3, dos individuos FLK/flk-3
pep1-4 y un individuo pep1-4. Los individuos flk-3 muestran un retardo muy acusado de la floración. Las
plantas FLK/flk-3 pep1-4 presentan un menor retraso de la floración. B) Planta flk-3 (izquierda) y FLK/flk-3
pep1-4 (derecha). Se recuadra una alteración muy aparente de la filotaxia de la que se muestra una
ampliación en (C). D) Disposición filotáctica anormal de los frutos en un individuo FLK/flk-3 pep1-4. E)
Distintas alteraciones (flechas rojas) en el patrón de filotaxia en una planta FLK/flk-3 pep1-4. En todos los
casos, plantas de 50 días tras la germinación.Barras de escala: A y B 5 cm; C-E 1 cm.
Los individuos flk-3 manifiestan una gran demora en la transición floral (Fig. IV.41
A y B), mientras que el comportamiento de los individuos heterocigotos FLK/flk-3 es
Resultados 145
completamente silvestre, en consonancia con datos anteriores (Lim et al., 2004). Sin
embargo, en un fondo mutante pep1-4 la mutación flk-3 parece seguir una pauta
semidominante. Los individuos FLK/flk-3 pep1-4 presentan un retraso moderado de la
floración (Fig. IV.41 A), alcanzando finalmente un porte comparable con el silvestre. No
obstante, el rasgo más llamativo de estas plantas es la gran profusión de perturbaciones
en su filotaxia (Fig. IV.41 C-F), mucho más numerosas que las que presentan cada uno
de los mutantes simples. Este resultado sugiere la existencia de una interacción entre
ambas proteínas KH en la determinación de las posiciones de aparición de los órganos
laterales. Por otro lado, algunos frutos presentan una diferencia de tamaño muy evidente
entre una valva y otra (Fig. IV.42).
A
B
Figura IV.42.- Fenotipo de los frutos en individuos FLK/flk-3 pep1-4. A)
Frutos de FLK/flk-3 pep1-4 con una clara diferencia entre el tamaño de
sus dos valvas. B) Se muestra la diferencia de las valvas en la zona
basal. C) Disposición de las valvas en el silvestre. Barras de escala 1
mm.
C
Los alelos pep1 y flk son absolutamente recesivos (esta memoria; Lim et al.,
2004). Un indicio suplementario de interacción entre dos genes en un mismo proceso
biológico es la manifestación de haploinsuficiencia combinada (Hawley y Walker, 2003).
Por tanto, examinamos el fenotipo de los dobles heterocigotos, comprobando la presencia
ocasional de alteraciones filotácticas (datos no mostrados). Este resultado se basa en la
observación de un número limitado de plantas, por lo que debe interpretarse con cautela.
Debido al retraso en la floración, tan acusado en los individuos de genotipo flk/flk,
no ha sido posible estudiar el fenotipo de los individuos flk-3 pep1-4 durante el transcurso
del presente trabajo. El alelo pep1-4 produce un retraso leve en el tiempo de floración, por
lo que es plausible que la mutación flk-3 sea epistática sobre aquella en este aspecto del
fenotipo, aunque a priori no se pueden descartar otros tipos de interacción.
Resultados 146
IV.9.4.- Interacciones de pep1 con los genes de la ruta de los genes CLAVATA.
Los genes CLAVATA (CLV1, CLV2 y CLV3) intervienen en la ruta de señalización
que lleva su nombre restringiendo el número de células en estado indiferenciado en los
meristemos apical y floral (Rojo et al., 2002). Las mutaciones de pérdida de función en
cualquiera de estos genes produce meristemos agrandados, lo que provoca un aumento
del número de hojas en la roseta, errores de filotaxia, flores adicionales y órganos florales
supernumerarios, siendo su rasgo más característico la aparición de frutos con un número
de valvas superior al silvestre (Clark et al.,1993, 1995; Kayes y Clark, 1998). El gen CLV3
codifica un pequeño péptido de localización extracelular que activa a receptores de tipo
LRR codificados por los genes CLV1 y CLV2, iniciando la transmisión de señal que regula
el crecimiento del meristemo (Rojo et al., 2002). Por consiguiente, analizamos las
interacciones entre alelos de pep1 y los de clv1, clv2 y clv3.
IV.9.4.1.- Interacciones con clavata3 (clv3).
Efectuamos el cruzamiento de pep1-4 con plantas clv3-2 como donante de polen.
El alelo clv3-2 es el más fuerte de su serie y es completamente recesivo (Clark et
al.,1995). Seleccionamos en kanamicina individuos F2 resistentes, con fenotipo Clv3 y
cuya progenie F3 no segregara individuos sensibles al antibiótico. El fenotipo de las
plantas clv3-2 pep1-4 es indistinguible del mutante simple clv3-2 (Fig. IV.43).
Figura IV.43.- Fenotipo de los dobles mutantes clv3-2
pep1-4. Barra de escala 1 mm.
clv3-2
clv3-2 pep1-4
Sin embargo, advertimos la presencia de frutos con valvas extra en plantas
CLV3/clv3-2 en un fondo mutante pep1-4, lo que podría sugerir que esta mutación
intensifica el efecto del alelo clv3-2. Analizamos individuos de la siguiente generación,
corroborando la observación anterior. El ancestro silvestre del mutante clv3-2 es Ler. Los
Resultados 147
genes CLV3 y ER se encuentran a tan solo 2,6 cM en el cromosoma II, por tanto
utilizamos el marcador ERA asociado a la mutación er (TABLA III.7) para identificar la
presencia de este alelo, como un indicio de la presencia del alelo clv3-2. La segregación
de plantas Clv3 y silvestres en la siguiente generación confirmó su genotipo. En estas
plantas detectamos un número considerable de frutos con más de dos valvas (Fig. IV.44)
y una incidencia de alteraciones filotácticas superior a la observada en plantas pep1-4
(datos no mostrados).
A
B
Figura IV. 44.- Frutos de individuos CLV3/clv3-2
pep1-4. A) A la izquierda un fruto de Col-0. A la
derecha un fruto CLV3/clv3-2 pep1-4. B) Fruto
CLV3/clv3-2 pep1-4. La flecha roja indica la
aparición de la valva extra. Barras de escala
1mm.
Durante este análisis, aislamos un individuo recombinante clv3-2/clv3-2 ER/er, a
partir del cual se obtuvieron plantas clv3-2/clv3-2 ER/ER. El fenotipo de estas plantas
evidencia el efecto de la mutación er sobre clv3-2. En su ausencia, los frutos, aún con
varias valvas, son más estilizados, guardando cierta similitud con los frutos de los
individuos CLV3/clv3-2 ER/er pep1-4 (Fig. IV.45).
El alelo clv3-2 es considerado un alelo totalmente recesivo (Clark et al.,1995). A
pesar de ello, cruzamos plantas Col-0 con clv3-2 y seleccionamos heterocigotos
CLV3/clv3-2 entre los individuos F2 para comparar la incidencia de frutos con valvas
supernumerarias con respecto a los heterocigotos en un fondo homocigótico pep1-4
(Tabla IV.10).
Resultados 148
A B
C
D
Figura IV.45.- Ausencia de la mutación er en plantas clv3-2. A) Fruto
Col-0. B) Fruto de una planta F2 CLV3/clv3-2 procedente del
cruzamiento Col-0 x clv3-2. No se observa la aparición de valvas
extra. C) Fruto clv3-2 ER. D) Fruto de un individuo CLV3/clv3-2
ER/er pep1-4. Barra de escala 1 mm.
Tabla IV.10.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV3/clv3-2 PEP1 y CLV3/clv3-2 pep1-4.
Genotipos analizados
CLV3/clv3-2 PEP1
Nº de frutos en cada clase
Porcentaje (%)
CLV3/clv3-2 pep1-4
2 valvas
3 o más valvas
2 valvas
3 o más valvas
475
5
178
22
98,95
1,05
89
11
Total de frutos examinados
480
200
Nº de plantas analizadas
10
6
Los datos de la Tabla IV.10 indican que la aparición ocasional de frutos con valvas
extra en plantas CLV3/clv3-2 es un hecho, a pesar de la información disponible (Clark et
al.,1995). No obstante y pese al discreto número de plantas examinadas, de la tabla se
desprende que la aparición de frutos con más valvas es un suceso más probable si la
heterocigosis del alelo clv3-2 tiene lugar en un fondo homocigótico pep1-4. Aunque de
manera moderada, la pérdida de función de PEP1 parece inducir o incrementar una tenue
semidominancia para la mutación clv3-2.
IV.9.4.2.- Interacciones con clavata2 (clv2).
El alelo clv2-1 se encuentra en fondo Ler y es completamente recesivo (Kayes y
Clark, 1998). Realizamos cruzamientos entre este mutante y plantas pep1-4 como
Resultados 149
parental femenino, de manera análoga a la descrita en la sección anterior.
Simultáneamente, efectuamos cruzamientos entre el silvestre Col-0 y clv2-1.
En este caso, las mutaciones clv y er segregan con facilidad dado que CLV2 se
encuentra en el cromosoma I, por lo que pudimos observar la interacción entre clv2-1 y
pep1-4 en presencia y en ausencia de la mutación erecta (Fig. IV.46), si bien se debe
esperar una generación para confirmar el genotipo con respecto al gen CLV2. En ambos
casos, no se observa diferencia alguna entre el mutante simple clv2-1 (Fig. IV.46 A) y el
doble mutante clv2-1 pep1-4 (datos no mostrados). Por contra, el heterocigoto
(CLV2/clv2-1) sí difiere dependiendo de la presencia o no del alelo pep1-4 en
homocigosis. En las plantas CLV2/clv2-1 pep1-4 se apreció la presencia de un número
considerable de frutos con valvas supernumerarias (Fig. IV.46 y Tabla IV.11).
A
B
Ler
CLV2/clv2-1
pep1-4
C
clv2-1
Figura IV.46.- Interacciones entre clv2-1 y pep1-4. A) Fenotipo de un fruto Ler, frutos CLV2/clv2-1 pep1-4 y
del mutante simple clv2-1. Los individuos CLV2/clv2-1 pep1-4 presentan frutos con varias valvas. Todas las
plantas son homocigóticas para la mutación er. B) Fruto de un individuo CLV2/clv2-1 pep1-4 ER. C) Detalle
del fruto mostrado en B en el que se aprecian las valvas extra. Barras de escala 1 mm.
Pudimos comprobar que la presencia de frutos con valvas extra en el heterocigoto
CLV2/clv2-1 es comparable a la de plantas silvestres, mientras que en un fondo
homocigótico para pep1-4 se incrementa hasta un 15% su aparición (Tabla IV.11). Estos
datos son más sólidos que los observados respecto a clv3-2, pero cualitativamente
coincidentes.
Resultados 150
Tabla IV.11.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV2/clv2-1 PEP1 y CLV2/clv2-1 pep1-4.
Genotipos analizados
CLV2/clv2-1 PEP1
CLV2/clv2-1 pep1-4
2 valvas
3 o más valvas
2 valvas
3 o más valvas
Nº de frutos en cada clase
1297
3
275
50
Porcentaje (%)
99,76
0,24
84,61
15,39
Total de frutos examinados
1300
325
Nº de plantas analizadas
27
11
IV.9.4.3.- Interacciones con clavata1 (clv1).
Las observaciones realizadas en el estudio de interacciones entre pep1-4 y los
mutantes clv2 y clv3 nos impulsaron a extender este análisis al gen CLV1, situado
también en el cromosoma I. Utilizamos inicialmente el alelo clv1-1 (fondo Ler), definido
como el más fuerte de su serie (Diévart et al., 2003). De hecho se le ha atribuido un
carácter semidominante (Clark et al., 1995), recientemente asignado a un efecto
dominante negativo (Diévart et al., 2003).
A
B
C
D
E
F
Figura IV.47.- Interacciones entre clv1-1 y pep1-4.
A) pep1-4. B) CLV1/clv1-1. C), D) y E) CLV1/clv1-1
pep1-4. F) clv1-1 er. Barra de escala 1 mm.
Por este motivo, reviste particular importancia el análisis previo del alelo clv1-1 en
heterocigosis en ausencia de cualquier otra mutación. Como en las secciones anteriores
Resultados 151
(IV.9.4.1 y IV.9.4.2), se efectuaron cruzamientos entre plantas clv1-1 como donantes de
polen, y el silvestre Col-0 y el mutante pep1-4 como parentales femeninos. Al igual que en
el caso de clv2, verificamos la segregación en la descendencia confirmando el genotipo
con respecto al gen CLV1.
Como sucede con clv3-2 y clv2-1, el doble mutante clv1-1 pep1-4 es indistinguible
del mutante simple clv1-1, con un fenotipo equiparable al de los frutos clv3-2 (Fig. IV.43 y
datos no mostrados). Igualmente, la aparición de frutos con valvas extra fue mucho mayor
en el caso de las plantas CLV1/clv1-1 pep1-4 que en las plantas CLV1/clv1-1 (Fig. IV.47 y
Tabla IV.12).
Tabla IV.12.- Aparición de valvas extra en frutos de plantas CLV1/clv1-1 PEP1 y CLV1/clv1-1 pep1-4.
Genotipos analizados
CLV1/clv1-1 PEP1
Nº de frutos en cada clase
Porcentaje (%)
CLV1/clv1-1 pep1-4
2 valvas
3 o más valvas
2 valvas
3 o más valvas
864
6
165
95
99,31
0,69
63,43
36,57
Total de frutos examinados
870
260
Nº de plantas analizadas
17
8
Los datos de la Tabla IV.12 muestran una elevada proporción de frutos de más de
dos valvas en los individuos heterocigóticos para clv1-1 y homocigóticos para pep1-4.
Estos resultados se deben interpretar con precaución debido al carácter semidominante
atribuido con anterioridad a clv1-1 (Clark et al., 1995; Diévart et al., 2003). Esta propiedad
de clv1-1 podría estar contribuyendo al elevado número de frutos anómalos detectados en
CLV1/clv1-1 pep1-4. Sin embargo, los datos del heterocigoto simple CLV1/clv1-1 no se
ajustan a lo esperado para un alelo claramente semidominante (Diévart et al., 2003). Una
posibilidad para explicar esta aparente discrepancia podría radicar en el comportamiento
de esta mutación tras un cruzamiento con el acceso Col-0. En cualquier caso, su
comportamiento es análogo al descrito en las secciones IV.9.4.1 y IV.9.4.2 para clv3-2 y
clv2-1, respectivamente.
Una aproximación complementaria al estudio de la interacción entre los genes
CLV1 y PEP1 fue la utilización de uno de los alelos más débiles, clv1-6, de carácter
recesivo (Diévart et al., 2003). Las plantas portadoras de este alelo se cruzaron, como
donantes de polen, con plantas pep1-2. Se seleccionaron aquellas plantas F2 cuya
Resultados 152
homocigosis para pep1-2 se determinó mediante genotipado molecular (Tabla III.6), y
mostraban fenotipo Clv en todos sus frutos. Como muestra la Figura IV.48 el fenotipo
moderado de los mutantes simples clv1-6 se incrementa, aparentemente como
consecuencia de la homocigosis para pep1-2. No obstante, este es un resultado
preliminar donde aún no se ha podido descartar el efecto de un fondo genético
heterogéneo (Ler/Col-0) sobre las mutaciones.
A
Ler
clv1-6 pep1-2
B
Figura IV.48.- Interacción entre clv1-6 y pep1-2. A)
Fenotipo del mutante simple clv1-6, del doble mutante
clv1-6 pep1-2 y del acceso silvestre Ler. B) Ampliación de
uno de los frutos clv1-6 mostrados en A. Todos los frutos
mostrados en esta Figura se encuentran en homocigosis
para la mutación er. Barras de escala 1 mm.
clv1-6
Conjuntamente, los resultados de las interacciones entre los alelos pep1, clv1,
clv2, y clv3 están en consonancia con el desempeño de algún tipo de función por parte de
PEP1 en la ruta de señalización de los genes CLAVATA. Sobre qué punto de la ruta actúa
PEP1 y si esta acción es directa o indirecta, o qué otras funciones génicas adicionales se
requieren son cuestiones completamente abiertas.
IV.9.5.- Doble mutante con wuschel-1 (wus-1).
El gen WUSCHEL codifica un factor de transcripción con homeodominios (Mayer
et al., 1998) necesario para el mantenimiento de la población de células indiferenciadas
en el meristemo, siendo sus mutaciones epistáticas sobre las de los genes CLAVATA
(Laux et al., 1996; Schoff et al., 2000). En estos mutantes, las células del meristemo
apical son incapaces de proliferar provocando una terminación prematura del mismo y la
incapacidad de generar órganos laterales. La actividad de otros genes acaba induciendo
la aparición adventicia de órganos (Laux et al., 1996; Mayer et al., 1998; Lenhard et al.,
2002). Debido a las interacciones descritas entre las mutaciones clv y pep1, examinamos
la interacción entre las mutaciones wus-1 y pep1-1 por producir esta última un fenotipo
fuerte y completamente penetrante. Se realizó el cruzamiento utilizando plantas
Resultados 153
heterocigóticas wus como parental masculino. Como cabría esperar, comprobamos que la
mutación wus-1 es epistática sobre pep1-1 salvo en las hojas, que presentan el fenotipo
característico de pep1-1. Los dobles mutantes exhiben el típico crecimiento alternativo
(stop and go) característico del mutante wus-1 (Fig. IV.48; Laux et al., 1996).
A
B
Figura IV.48.- Interacción wus-1
pep1-1. A) Planta mutante wus-1
de 90 días tras la germinación. B)
Planta doble mutante wus-1 pep11 de 47 días tras la germinación.
Figura A tomada de Laux et al.,
1996. Barras de escala 2 cm.
V.- DISCUSIÓN
Discusión 155
V.- DISCUSIÓN
V.1.- ESCRUTINIO DE MUTANTES DE Arabidopsis thaliana AFECTADOS EN EL
DESARROLLO DEL FRUTO EN UNA COLECCIÓN ESPAÑOLA DE INSERCIONES DE
T-DNA.
Durante la realización de esta Tesis se ha llevado a cabo un escrutinio de
mutantes de Arabidopsis thaliana a partir de una colección española de inserciones de TDNA. Se ha estudiado una nueva mutación compleja, caracterizada por la presencia de
más de dos valvas en sus frutos, identificando un gen con motivos de unión a RNA de
tipo KH, cuyas disfunciones están involucradas en este fenotipo.
La utilización del T-DNA como agente mutagénico viene avalada por la
caracterización de numerosos hechos de inserción en cromosomas de varias especies
vegetales como arroz, tabaco o Arabidopsis thaliana, y la existencia de un gran número
de mutantes aislados (Castle et al., 1993; Feldmann et al., 1994; Ohba et al., 1995;
Takano et al., 1997). La generación de alelos mutantes, mayoritariamente nulos, mediante
este agente ha permitido asignar funciones a secuencias génicas concretas (Roe et al.,
1993; Torii et al., 1996; Zeidler et al., 2001; Ishiguro et al., 2002; Smith y Hake, 2003; Lee
et al., 2004; Yoo et al., 2004). Otro factor que ha contribuido a popularizar este sistema ha
sido el desarrollo de técnicas moleculares progresivamente más eficaces en la
identificación de las secuencias adyacentes a la inserción (Ochman et al. 1988; Triglia et
al., 1988; Liu et al., 1995; Hartl et al., 1996; Krysan et al., 1999; Singer et al., 2003). En el
caso de Arabidopsis thaliana, estas estrategias se ven facilitadas por la disponibilidad de
la secuencia de su genoma (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Además, las
colecciones de inserciones de T-DNA de dominio público se han convertido en un recurso
rápido para la genética inversa y la obtención de nuevos alelos (Sessions et al. 2001;
Alonso et al., 2003; Rosso et al., 2003; Strizhov et al., 2003)
Idealmente, los mutantes de T-DNA presentarían hechos de inserción únicos con
sólo una copia de T-DNA, lo que facilitaría la asignación de una función a un gen
específico (Krysan et al., 1999). Pese a estas bondades, existen numerosos casos en los
que este análisis se ve dificultado como consecuencia de la generación de alteraciones
cromosómicas estructurales asociadas a la inserción del T-DNA. En la mayoría de estos
Discusión 156
casos, están involucradas varias copias de T-DNA que pueden dar lugar a deleciones,
inversiones, duplicaciones y translocaciones (Nacry et al., 1998; Laufs et al., 1999; Tax y
Vernon, 2001). La influencia de estos eventos, en un cromosoma o varios, puede
traducirse en una modificación de la actividad de uno o más genes, produciendo
mutaciones complejas, difíciles de analizar (Nacry et al., 1998; Tax y Vernon, 2001). De
hecho, el T-DNA empleado en la generación de la colección estudiada en este trabajo
(pGKB5, III.2) ha propiciado una publicación específica sobre las aberraciones
cromosómicas que produce este vector (Nacry et al., 1998).
V.2.- EL MUTANTE pep1-1 ES PORTADOR DE UNA TRANSLOCACIÓN RECÍPROCA
Y PRESENTA ALTERACIONES EN LA MORFOLOGÍA DEL FRUTO.
Mediante diversos métodos moleculares y genéticos, hemos demostrado que las
plantas pep1-1 son portadoras de una translocación recíproca en la que se ven implicados
los cromosomas IV y V de Arabidopsis thaliana. Como en la mayoría de los casos donde
se producen reorganizaciones cromosómicas, los resultados de Southern en pep1-1 (Fig.
IV.18) indican la participación de varias copias de T-DNA.
Los frutos del mutante pep1-1 son de reducido tamaño y presentan valvas extra
con una histología aparentemente normal. Esta situación es análoga a la observada en
los mutantes clv, entre otros (Clark et al., 1993, Kayes y Clark, 1998; Trotochaud et al.,
1998; Clark, 2001). Este rasgo tiene un origen muy temprano durante el desarrollo del
pistilo (Fig. IV.13) predeterminando la estructura del fruto tras la fertilización. Resulta muy
problemático diferenciar entre genes cuya deficiencia afecta exclusivamente al desarrollo
del pistilo, de aquellos relacionados únicamente con el desarrollo del fruto (Bowman et al.,
1999). Por lo general, las mutaciones que afectan a la morfogénesis del pistilo tienen
consecuencias en el posterior desarrollo del fruto. Así, por ejemplo, las mutaciones en el
gen CRC perturban el desarrollo del gineceo desde etapas muy tempranas de su
desarrollo, lo que se traslada como una anomalía evidente en el fruto (Bowman y Smyth,
1999).
El resto de los órganos florales de pep1-1 parecen silvestres tanto en número
como en apariencia. Sin embargo, presenta un fenotipo pleiotrópico que se detecta desde
el inicio de su desarrollo vegetativo, con una morfología y ritmo de aparición foliar
característicos, así como alteraciones en la filotaxia (Fig. IV.6 y 7). Esta situación no es
privativa de pep1-1. En Arabidopsis, las mutaciones implicadas en un único proceso del
Discusión 157
desarrollo son muy escasas (Bowman et al., 1999). Diversas mutaciones que afectan a
genes implicados en el desarrollo del pistilo también muestran alteraciones en órganos
vegetativos de la planta. El mutante ful, al margen de frutos anormales, presenta
alteraciones en las hojas caulinares y en la arquitectura general de la planta (Gu et al.,
1999; Ferrándiz et al., 2000a). En lugar de la pérdida de identidad del replum, la filotaxia
anormal es tal vez la carácterística más visible de rpl (Byrne et al., 2003; Roeder et al.,
2003; Smith y Hake., 2003). Los mutantes sty muestran hojas algo aserradas (Kuusk et
al., 2002); y las mutaciones en los genes CLV provocan filotaxia alterada y tallos
fasciados (Clark, 2001).
En nuestro caso, el grado de pleiotropía de pep1-1 puede estar también influido
por la reorganización cromosómica detectada. En una translocación recíproca pueden
verse afectados varios genes presentes en las regiones implicadas. Por consiguiente,
resulta de una gran dificultad asignar el fenotipo observado a la disfunción de una
actividad génica en particular. Sin embargo, una situación como ésta puede revelar
fenotipos no observables por la perturbación de una única función génica. En cierto modo,
esta circunstancia sería análoga a la que se persigue en las mutagénesis sobre fondos
mutantes establecidos (second site mutagenesis) que revelan interacciones génicas
desconocidas (Page y Grossniklaus, 2002; Hawley y Walker, 2003).
Por otra parte, la actividad de genes modificadores propios de una estirpe de
referencia concreta puede influir, ostensiblemente, sobre el efecto fenotípico de muchas
mutaciones (Koornneef et al., 1994; Sanda y Amasino, 1996; Nadeau, 2001; Buchner et
al., 2003; Nadeau, 2003). Hemos comprobado que existe un importante grado de
modulación del fenotipo de la mutación pep1-1, identificada en un fondo Ws-2, cuando se
realiza su introgresión en Col-0 o Ler.
V.3.- NUEVOS ALELOS DE pep1.
En pep1-1, el análisis de las secuencias genómicas interrumpidas por el T-DNA
señaló a varios genes como potencialmente afectados por la translocación, tanto en el
cromosoma IV como en el cromosoma V. Buscamos presuntos mutantes simples de estos
genes, siendo la vía más directa las colecciones de T-DNA de dominio público (SALK,
Alonso et al., 2003; SAIL, Sessions et al., 2002). Tras crear los correspondientes
homocigotos para las diversas inserciones, realizamos cruzamientos entre estas líneas y
pep1-1. Estos ensayos de complementación arrojaron un dato muy significativo. El
Discusión 158
mutante pep1-1 es completamente recesivo, sin embargo el cruzamiento con la línea
F09_517 produjo plantas F1 con frutos con valvas supernumerarias, errores de filotaxia y
hojas vegetativas anormales (sección IV.4.1; Fig. IV.24 y IV.25), lo que sugiere que esta
línea es portadora de una mutación implicada en el fenotipo de pep1-1. El gen afectado,
situado en el cromosoma IV (At4g26000), codifica un polipéptido con tres dominios KH de
unión a RNA (Grishin, 2001). Denominamos a esta línea como pep1-2.
El fenotipo de pep1-2 per se, es semejante al de la mutación pep1-1. Ambos
mutantes poseen hojas vegetativas con características similares que surgen de manera
heterocrónica, presentan cierto retraso en la floración, sus errores de filotaxia son
equivalentes y, aunque con menor penetrancia, pep1-2 también presenta frutos con
valvas extra. Además, pep1-1 es un mutante amorfo para el gen At4g26000, como revela
la ausencia de su transcrito en experimentos de RT-PCR (Fig. IV.27), una circunstancia
coherente con estas observaciones.
Se obtuvieron nuevos alelos pep1 mediante la adquisición y análisis de otras
líneas de inserción en el gen At4g26000. Al igual que en pep1-2, estas líneas muestran
retraso en la floración, fallos en el patrón de filotaxia y ocasionalmente frutos con más de
dos valvas, aunque con menor penetrancia. El alelo pep1-4 es hipotéticamente nulo en
virtud de la posición del T-DNA (interrumpe el segundo exón; Fig. IV.33) y de la ausencia
de su transcrito (Fig. IV.34). Sin embargo, su fenotipo es notoriamente más débil que el de
pep1-2, cuyo transcrito es detectable (Fig. IV.34). El producto proteico de pep1-2 podría
poseer un carácter antimorfo, lo que explicaría su fenotipo más severo que el de un alelo
nulo, pero de una forma muy moderada, congeniando así con su carácter recesivo. PEP1
es un polipéptido con dominios de unión a RNA y que presumiblemente actúa formando
complejos con otras proteínas requeridas para la ejecución o modulación del mismo
proceso (Tarun y Sachs, 1996; Fedoroff, 2002). La mutación pep1-2 consiste en la
interrupción del gen a falta de tan sólo 15 pb antes del codón de parada, perdiendo
únicamente 5 aa. Es concebible, por tanto, la transcripción a partir de un lugar críptico de
poliadenilación, seguida de la producción de una proteína ligeramente alterada en su
extremo carboxilo terminal. Esta nueva versión de PEP1 podría causar perturbaciones en
aquellos complejos de los que forme parte. No obstante, este efecto debe ser moderado,
puesto que una única dosis de la versión normal del gen es suficiente para subvertir esta
situación y retornar al fenotipo silvestre, como demuestra el fenotipo del heterocigoto.
Otro factor que tal vez contribuye a explicar este comportamiento, a la par recesivo
y moderadamente antimorfo, es el solapamiento funcional que caracteriza a muchos
Discusión 159
genes implicados en el metabolismo del RNA (Lorkovic y Barta, 2002; Chkheidze y
Liebhaber, 2003; Cheng y Chen, 2004). Es razonable, no obstante, que la redundancia
funcional se refleje más claramente en el fenotipo suave de los alelos nulos de PEP1.
V.4.- RESCATE FENOTÍPICO DE pep1.
El rescate fenotípico, o complementación funcional, mediante la transformación del
organismo mutante con una copia silvestre del gen candidato se considera la prueba
definitiva para documentar que se ha clonado el gen definido por ese mutante.
Idealmente, se ha de disponer de diversos transformantes independientes con el mismo
efecto sobre líneas homocigóticas de más de un alelo (Hawley y Walker, 2003). En el
momento de elaborar esta memoria disponemos de 30 líneas independientes de
transformantes con el clon genómico de PEP1, tanto en un fondo silvestre Col-0, como en
un fondo mutante pep1-2. Simultáneamente, se han generado 10 líneas independientes
de transformantes con el clon de sobreexpresión en los mismos fondos.
La transformación de plantas pep1-2 con un clon genómico correspondiente al gen
At4g26000 recupera el fenotipo silvestre en este mutante de una manera estable, lo que
demuestra el funcionamiento adecuado de la construcción utilizada. Podemos concluir,
por tanto, que Atg426000 es PEP1. Estas plantas presentan una morfología normal tanto
en las hojas de la roseta como en la arquitectura general de la planta, restaurándose el
ritmo silvestre de aparición de las hojas de la roseta. Sus frutos no muestran valvas extra
pero, como ya se comentó en la sección IV.4.1 de resultados, la escasa penetrancia del
rasgo en esta estirpe no aconseja adoptar este aspecto del mutante como una referencia
en experimentos de rescate fenotípico. La caracterización del gen PAUSED (PSD) de
Arabidopsis guarda cierto paralelismo. El mutante psd carece de la función de una
exportina-t, lo que causa un incremento del fenotipo en alelos débiles de ag, aunque como
mutante simple resulta complicado detectar sus anomalías en el gineceo. También
produce errores de filotaxia. Sin embargo, el criterio utilizado para evaluar la recuperación
del fenotipo silvestre mediante una construcción transgénica fue la pérdida de la
heterocronía en la aparición de sus hojas, así como la eliminación del fenotipo de éstas
(Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003).
La transformación directa de plantas pep1-1 no se intentó, debido a su baja
fertilidad. Aún el heterocigoto no es adecuado para un esfuerzo de este tipo ya que, como
se recordará, la presencia de la translocación recíproca reduce drásticamente la
Discusión 160
producción
de
semillas
viables,
comprometiendo
las
posibilidades
de
lograr
transformantes. Por estos motivos, decidimos transformar la estirpe pep1-2, así como el
silvestre Col-0 para, posteriormente, introducir el transgén en pep1-1 mediante
cruzamientos. La confirmación definitiva de la recuperación del fenotipo silvestre en los
frutos de pep1-1 deberá esperar a la consecución de individuos F2 portadores de ambos
cromosomas derivados y de una copia del transgén (verificable en la generación F3).
Debido precisamente a la translocación, es razonable prever dificultades en la obtención
de recombinantes en los cromosomas IV y V (Atherly et al. 1999; Griffith et al., 2002). Esto
no debe suponer un inconveniente, ya que resulta inverosímil que el creciente número de
transformantes independientes obtenidos porten en estos cromosomas todos los hechos
de inserción.
En cualquier caso, la recuperación del fenotipo silvestre en los frutos se
comprobará en breve. Un resultado alentador proviene del análisis de las plantas F1 del
cruzamiento entre pep1-1 y un homocigoto pep1-2 portador de un transgén con el clon
genómico de PEP1. Estas plantas no se distinguen en absoluto del silvestre, a diferencia
de los resultados obtenidos en los ensayos de complementación entre estas dos estirpes
sin el concurso del transgén (sección IV.4.2 y Fig. IV.28). En opinión de Hawley y Walker
(2003), la prueba de rescate fenotípico por transgénesis, a fin de cuentas, sólo es un caso
particular del ensayo de complementación.
En la transformación de plantas con la construcción de sobreexpresión
dependiente del promotor 35S, procedimos de igual forma. Transformamos individuos
silvestres (Col-0) y mutantes pep1-2. La apariencia de estos últimos es silvestre, en
concordancia con los resultados obtenidos con el clon genómico, lo que también es un
argumento a favor del funcionamiento del transgén. Las plantas Col-0 transformadas,
pese a la expresión ectópica o a la sobreabundancia del transcrito de PEP1, no
manifiestan ningún rasgo fenotípico que las distinga de sus progenitores. Sin embargo,
uno de los transformantes mostró un fenotipo pleiotrópico consistente en una roseta con
mayor número de hojas de apariencia lanceolada y de un color más pálido, menor
estatura y una considerable reducción del tamaño de sus frutos y de su fertilidad. Este
conjunto de rasgos se asemeja al fenotipo de pep1-1 y, en menor medida, al de pep1-2.
Es tentador especular que este fenotipo se deba a un efecto de cosupresión, motivado por
la sobreexpresión de PEP1 (Cluster et al., 1996; Jorgensen et al., 1996; Gallie, 1998;
Matzke y Matzke, 1998; McConnell et al., 2001). No obstante, una cuantificación de los
niveles de expresión de PEP1 en las distintas líneas de sobreexpresión podría aportar
Discusión 161
una información relevante a este respecto. La influencia del lugar de inserción del
transgén puede afectar a sus niveles de expresión. Las regiones conocidas como de
unión a la matriz nuclear (Matrix attachment regions), son ricas en AT (más del 70%) y
suelen circundar a genes que se expresan activamente (Gallie, 1998). La inserción de un
transgén en una de estas regiones puede contribuir a una mayor estabilibilidad de su
expresión (Matzke y Matzke, 1998), pero también puede provocar un incremento en los
niveles de su RNA de hasta 140 veces (Gallie, 1998). No se puede descartar, al menos
desde un punto de vista formal, que el fenotipo observado sea producto de una mera
mutación insercional, aunque esto sea mucho menos probable. En cualquier caso, habrá
que esperar a la obtención de más líneas transgénicas.
V.5.- PAPEL DE LAS PROTEÍNAS CON DOMINIOS KH EN EL DESARROLLO.
Los factores de transcripción se han considerado tradicionalmente como los
elementos principales de la regulación de la expresión génica. No obstante, en los últimos
años se han descrito una gran cantidad de proteínas con actividad de unión a RNA, que
desempeñan un papel crítico en el desarrollo, determinando los niveles de expresión de
un elevado número de genes (Perrone-Bizzozero y Bolognani, 2002). Una vez que el RNA
se transcribe, las proteínas de unión a RNA controlan todos los pasos posteriores en la
expresión génica, desde la escisión alternativa de intrones hasta la traducción, o su
estabilidad y transporte (Fedoroff, 2002; Perrone-Bizzozero y Bolognani, 2002; Cheng y
Chen, 2004). Este tipo de regulación adquiere una importancia especial en algunos
procesos de desarrollo tan relevantes como el establecimiento de los patrones espacial y
temporal de expresión génica durante el desarrollo neuronal (Perrone-Bizzozero y
Bolognani, 2002), o el control del tiempo de floración (Cheng y Chen, 2004).
Una categoría especial de proteínas con capacidad de unión a RNA son las
proteínas con dominios KH (K Homology). El dominio KH es ubicuo por su presencia
desde procariotas hasta mamíferos y, junto con el dominio RRM (RNA Recognition Motif),
es el más frecuente en las proteínas de unión a RNA (Lorkovic y Barta, 2002; Bomsztyk et
al., 2004).
El gen PEP1 codifica una proteína con tres dominios KH, presumiblemente
implicada en el control postranscripcional, y muy conservada en especies tan alejadas
filogenéticamente como Arabidopsis thaliana y arroz (Oryza sativa L.), lo que induce a
pensar que su función no es irrelevante (sección IV.5.2). Pertenece a una familia de 26
Discusión 162
miembros identificados en Arabidopsis thaliana (Lorkovic y Barta, 2002), algunos de los
cuales también cuentan con claros ortólogos en otras especies vegetales (esta Tesis). El
más claro ejemplo es el gen FLK, el parálogo más cercano a PEP1 y cuya función es
fundamental en la ruta autónoma de floración (Lim et al., 2004), en la que, de hecho, las
actividades clave en su control son reguladores postranscripcionales (Macknight et al.,
1997; Schomburg et al., 2001; Simpson et al., 2003; Quesada et al., 2003). Es llamativo
que, tanto en el caso de PEP1 como en el de FLK, exista un mayor grado de homología
entre ortólogos que entre parálogos (sección IV.5.2). Esta situación pone de manifiesto la
importancia funcional de estas moléculas.
En Arabidopsis thaliana o, por extensión en las plantas, existen escasos ejemplos
en los que se haya podido asignar una función concreta a una proteína KH. Una de estas
proteínas fue identificada, mediante ensayos bioquímicos, como parte integrante del
exosoma de Arabidopsis thaliana (Chekanova et al., 2002), aunque se carece de
información procedente de una estirpe mutante. Sin embargo, se ha demostrado que
HEN4 (HUA ENHANCER4), una proteína con 5 dominios KH, participa en el
mantenimiento de la función C en el desarrollo de la flor de Arabidopsis a través de la
regulación de la escisión de intrones del transcrito de AG (Cheng et al., 2003). Es
destacable que las plantas mutantes simples hen4 no muestren ningún fenotipo, siendo el
efecto de esta mutación observable sólo en compañía de otras mutaciones en genes que
también participan en el mismo proceso (Cheng et al., 2003; Cheng y Chen, 2004). Dos
de estos genes son HUA1 y HUA2. El primero de ellos codifica una proteína con dominios
de unión a RNA de distinta naturaleza al dominio KH, mientras que se desconoce la
función molecular concreta de HUA2 (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001). Por
separado, la pérdida de función en ambos genes no produce ningún fenotipo observable,
y en el doble mutante el fenotipo floral resultante es muy sutil, pero se produce una
reducción importante del porte de la planta (Chen y Meyerowitz, 1999; Liu et al., 2001).
Una interpretación obvia para estos resultados es la existencia de redundancia o
solapamiento funcional con otras actividades génicas. Esta interpretación se adapta
también al moderado efecto fenotípico de la pérdida de función de PEP1, como se
manifiesta en el alelo pep1-4 (sección IV.4.1). Los genes SHP1 y SHP2 son
completamente redundantes en la especificación de la zona de dehiscencia, requiriéndose
la pérdida de función de ambos para producir un fenotipo en el fruto (Liljegren et al.,
2000). Otro ejemplo de redundancia funcional lo constituyen los genes STY1 y STY2, que
participan en la formación de tejidos apicales durante el desarrollo del fruto. El mutante
Discusión 163
sty1 presenta un fenotipo muy moderado y sty2 es completamente silvestre, mientras que
el doble mutante muestra un fenotipo mucho más intenso (Kuusk et al., 2002). En la
maduración del transcrito de AG participan distintas proteínas que interaccionan con este
mRNA, entre ellas HUA1, HEN4 y la helicasa HEN2 (Cheng et al., 2003). PEP1 puede
estar participando en complejos multiproteicos donde otros factores, con dominios KH o
sin ellos, serían capaces de suplir total o parcialmente la pérdida de su función. El
hipotético producto, moderadamente antimorfo, de pep1-2 supondría una perturbación
adicional sobre el complejo multiproteico que tendría un mayor efecto en el fenotipo.
El mutante hen2 carece de fenotipo en los órganos reproductivos pero es
fácilmente identificable por su fenotipo vegetativo (Western et al., 2002). Esta situación es
semejante a la descrita anteriormente para el mutante psd, inicialmente denominado hen5
(Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003). La conjunción de rasgos fenotípicos en el desarrollo
vegetativo y reproductivo de los mutantes psd, hen2, hua1 hua2 y pep1 indica que estos
genes están participando en diversas rutas de desarrollo (Western et al., 2002; Hunter et
al., 2003; Li y Chen, 2003; esta Tesis).
V.6.- INTERACCIONES DE pep1 CON OTROS MUTANTES.
Uno de los objetivos de partida era la determinación de las vías o procesos de
desarrollo en que pudieran participar las funciones génicas caracterizadas en el
transcurso de este trabajo. Para obtener una información preliminar acerca del papel de
PEP1, seguimos una estrategia basada en el análisis de las interacciones de los alelos
pep1 con otros mutantes previamente caracterizados. PEP1 es un gen que codifica,
hipotéticamente, una proteína de unión a RNA, y cuyos mutantes están afectados en la
morfología del fruto. Por tanto, realizamos cruzamientos con genes que alteran el
desarrollo del pistilo o bien presentan una gran similitud estructural con PEP1.
V.6.1.- Interacciones con ful, hua1, hua2 y hen2.
FUL es un factor de transcripción de tipo MADS que confiere la adquisición de
identidad de valva en el fruto, cuya deficiencia provoca una severa reducción de su
tamaño (Gu et al., 1999). El doble mutante ful-1 pep1-2 es indistinguible del mutante
simple ful-1. Por otra parte, los mutantes hua1, hua2 y hen2 participan en el
mantenimiento de la función C a través de la regulación de la maduración del transcrito de
AG (Jack, 2002). Los dobles mutantes entre hua1, hua2 y hen2 y los alelos pep1 no
Discusión 164
ofrecieron ningún fenotipo informativo. Una excepción la constituye el triple mutante hua1
hua2 pep1-2 que muestra una importante reducción del tamaño general de estos
individuos. Ya hemos mencionado que los mutantes simples hua1, hua2, hen2 y el propio
pep1 carecen de fenotipo en el fruto o éste es muy suave. A tenor de estos precedentes,
no se puede excluir el requerimiento de combinaciones de orden superior entre estos
mutantes para observar un fenotipo más severo.
V.6.2.- Interacciones con flk.
Un candidato obvio para explorar posibles interacciones de un gen determinado es
aquél que guarda con él una mayor homología estructural y de secuencia. FLK es la
molécula más parecida a PEP1 en el genoma de Arabidopsis thaliana. Durante el análisis
de la población F2 de un cruce entre flk-3 y pep1-4, observamos que el alelo flk-3 se
comporta de forma semidominante en homocigosis para pep1-4. Las plantas FLK/flk-3
pep1-4 presentan un tiempo de floración intermedio entre el homocigoto flk-3 y el
silvestre, y mucho más acusado que el del mutante simple pep1-4. Además, las plantas
FLK/flk-3 pep1-4 exhiben muchas más alteraciones en la arquitectura de la planta que
cualquiera de los mutantes simples, sugiriendo una interacción sinérgica en este aspecto
del fenotipo. Estos resultados, per se, son claramente sugerentes de una relación
funcional entre ambos genes. La primera demostración de la implicación de los genes
HUA en la ruta de AG se obtuvo a través de la comprobación de que los alelos débiles de
AG se comportan como alelos fuertes en homocigosis para hua1 y hua2, mientras que el
alelo fuerte ag-1 se convierte en semidominante en el mismo fondo (Chen y Meyerowitz,
1999; Jack, 2002; Cheng y Chen, 2004).
Un indicio previo de la interacción entre FLK y PEP1 se advierte en la aparición de
errores en el patrón filotáctico del doble heterocigoto. Este resultado puede estar
señalando un fenómeno de haploinsuficiencia combinada. En Arabidopsis thaliana una
situación de haploinsuficiencia combinada se produce entre los genes CLV1 y CLV3,
donde en el doble heterocigoto entre los alelos fuertes clv1 y clv3 se produce un fenotipo
similar al de los alelos débiles en homocigosis (Clark et al., 1995; Fletcher, 2002). En
Antirrhinum majus, los genes CYCLOIDEA (CYC) y RADIALIS (RAD) participan
secuencialmente en la ruta que establece la asimetría dorso ventral de su flor zigomorfa.
Las mutaciones de pérdida de función cyc y rad se comportan conjuntamente de forma
ligeramente semidominante (Revisado en Hudson, 2000).
Discusión 165
El estudio de la interacción entre FLK y PEP1 es una tarea inconclusa puesto que,
en el momento de elaborar esta memoria, carecemos de información del doble mutante.
Podemos especular que las mutaciones flk deben ser epistáticas sobre los alelos pep1
respecto al tiempo de floración, aunque no podemos descartar otros tipos de interacción.
Las plantas FLK/flk-3 pep1-4 muestran perturbaciones del patrón filotáctico muy
acusadas, por lo que es previsible que el fenotipo del doble mutante sea, al menos, como
el de aquellas, si no más intenso. Algunos frutos de las plantas FLK/flk en un fondo pep14 muestran una perturbación del crecimiento de una de sus valvas que conduce a una
diferencia de tamaño entre ambas. El examen del doble mutante permitirá verificar la
existencia o no de una interacción también en el fruto.
V.6.3.- Interacciones con los mutantes clv.
Las mutaciones de pérdida de función en los genes CLAVATA (CLV1, CLV2 y
CLV3) provocan la aparición de frutos con valvas supernumerarias debido a la producción
masiva de células indiferenciadas en el meristemo floral (Clark et al., 1993, 1995; Kayes y
Clark, 1998). Las interacciones entre la mutación pep1-4 y las mutaciones clv1-1, clv2-1 y
clv3-2 respectivamente, ofrecieron unos trazos comunes en los tres casos. Los alelos
clv2-1 y clv3-2 están descritos como recesivos (Clark et al., 1995; Kayes y Clark, 1998),
mientras que clv1-1 está considerado como un alelo dominante negativo (Diévart et al.,
2003). Cada uno de los dobles mutantes con pep1-4 es indistinguible del correspondiente
mutante simple clv. Sin embargo, la condición de homocigosis para este alelo de pep1
induce un comportamiento semidominante o incrementa el efecto de éste en los tres
mutantes clv mencionados (sección IV.9.4). Estos resultados, junto con la similitud del
efecto fenotípico en el fruto producido por las mutaciones en los cuatro genes, sugieren
una interacción de PEP1 con algún elemento de la ruta de transducción de señal de los
genes CLV. PEP1 podría actuar sobre el producto de alguno de los genes CLV u otros
componentes que participan en esta vía. SHEPHERD es una proteína de choque térmico
(heat shock protein) que supuestamente actúa promoviendo el correcto plegamiento de
las proteínas CLV. Las mutaciones en este gen también provocan la aparición de frutos
con valvas extra (Ishiguro et al., 2002). Otros factores que actúan en esta vía de
desarrollo tan sólo han sido caracterizados bioquímicamente y se desconoce el efecto
producido por la pérdida de su función (Li et al., 1998; Trotochaud et al., 1999; Li et al.,
2001). En cualquier caso, el mantenimiento de esta ruta debe contar con genes que
aseguren la correcta modulación postranscripcional de sus elementos, tal como se ha
Discusión 166
demostrado en el control de la floración, en el mantenimiento de la función C y en la
señalización por ácido abscísico (Cheng y Chen, 2004).
Nuestros resultados indican que, en heterocigosis y en ausencia de la mutación
pep1-4, clv3-2 ejerce un efecto más severo que la mutación clv1-1, a pesar del efecto
dominante negativo de esta última (Diévart et al, 2003). El mutante pep1-4 se encuentra
en fondo Col-0, el cual debilita los fenotipos Clv (Dr. Steve Clark, comunicación personal;
Diévart et al., 2003). Sin embargo, el doble mutante entre pep1-2 y clv1-6, uno de los
alelos más débiles de su serie, presenta un fenotipo similar al de los alelos fuertes (Fig.
IV.48). Aún así, no podemos descartar un efecto del fondo genético. Alternativamente, se
trataría de un efecto fenotípico del alelo pep1-2.
V.7.- PEP1, UN PRESUNTO REGULADOR POSTRANSCRIPCIONAL INVOLUCRADO
EN LA ONTOGENIA DEL PISTILO Y EN OTROS PROCESOS DEL DESARROLLO DE
Arabidopsis thaliana.
La ontogenia del gineceo comprende un complejo conjunto de operaciones
genéticas, y cada vez son más los genes identificados que participan en su organización
espacial y diferenciación regional, dando lugar a la formación de los distintos tejidos que
componen este órgano (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). Ya en la formación
de su meristemo, se pone de manifiesto que la generación del patrón de la flor y, por ende
del pistilo, es una adaptación evolutiva del mecanismo general del meristemo apical,
sistema ya presente en las plantas antes de que aparecieran las flores (Lenhard et al.,
2001; Lohmann et al., 2001). El gen AG establece un vínculo de retroalimentación
negativa con respecto a WUS, el cuál especifica el estado indiferenciado de ciertas
células del meristemo (stem cell identity) y activa al propio AG (Lenhard et al., 2001;
Lohmann et al., 2001). Parte de este circuito son los genes CLV y el resto de genes que
participan en su ruta (Fletcher, 2002; Sharma y Fletcher, 2002; Zik y Irish, 2003),
involucrados en este mantenimiento de células indiferenciadas en el meristemo y su
posterior incorporación a los primordios de los órganos (Clark, 2001). La perturbación de
su función produce un mayor número de órganos en la flor, característicamente carpelos
(Clark et al., 1997; Kayes y Clark, 1998; Fletcher et al., 1999, Clark, 2001).
La coincidencia de fenotipos en el pistilo y la aparente interacción genética con
estos genes señalan a PEP1 como parte integrante de esta ruta, muy probablemente
participando en la modulación postranscripcional de alguno (o algunos) de sus elementos.
Discusión 167
Curiosamente, incluso en pep1-1 no se detectan alteraciones en el número de otros
órganos florales al margen del pistilo. Es posible que PEP1 no participe en la
determinación del número de sépalos, pétalos y estambres y su acción en la flor esté
restringida a los carpelos. No obstante, parece improbable porque, al menos en los
estambres, se puede detectar la presencia de su transcrito (Fig.IV.39). Una explicación
alternativa sería una mayor presencia en los primordios de estos órganos de otras
actividades génicas solapantes con PEP1. Una posibilidad que resulta muy atractiva es
que esa diferencia se deba a una interacción adicional entre PEP1 y AG. Ciertos fenotipos
débiles Ag se manifiestan con la aparición de valvas extra (Sieburth et al., 1995). Esta es
una cuestión abierta que merece un próximo análisis.
Además de su efecto en el pistilo, PEP1 está involucrado en diversos procesos de
desarrollo. Esta noción se sustenta en la pleiotropía de su fenotipo, la ubicuidad de su
expresión y la diversidad de sus interaciones génicas. Sin embargo, el denominador
común de todos (o casi todos) los rasgos fenotípicos de las mutaciones pep1 es que
sugieren su vinculación con el funcionamiento de los meristemos, desde la aparición
ocasional de aberraciones tales como plantas con un solo cotiledón, cotiledones
fusionados o una única hoja terminal (Li y Chen, 2003; Para y Sundas-Larsson, 2003). La
formación heterocrónica de las hojas también puede estar ocasionada por mutaciones
que afectan a los meristemos (Hunter et al., 2003; Li y Chen, 2003). El gen SQUINT
(SQN) codifica un homólogo de la ciclofilina 40, un regulador del ciclo celular, cuyos
mutantes sqn presentan un retraso en la emergencia de sus hojas, ligeras alteraciones en
el patrón de filotaxia y la aparición ocasional de frutos con valvas extra (Berardini et al.,
2001).
El retraso en la floración, en ocasiones, puede ser reflejo de un mal
funcionamiento del meristemo apical (Simpson y Dean, 2002; Poethig, 2003). De todas
formas, hemos visto que PEP1 interacciona con FLK. Esto no es sorprendente ya que son
numerosos los ejemplos de reguladores postranscripcionales implicados en el control de
la transición floral (Macknight et al., 1997; Schomburg et al., 2001; Simpson et al., 2003;
Quesada et al., 2003; Cheng y Chen, 2004). Las causas que subyacen a la generación de
errores de filotaxia en las mutaciones pep1 pueden ser de origen muy diverso, pero no
necesariamente excluyentes. Por un lado, las alteraciones en el tiempo de floración
pueden tener como consecuencia una distorsión en la arquitectura general de la planta, lo
que puede incluir errores de filotaxia (Sung et al., 2003). Por otra parte, la interferencia de
las mutaciones pep1 con la ruta de transducción de señal de los genes CLV puede
Discusión 168
producir un incremento en la cantidad de células indiferenciadas, lo que se traduce en un
aumento del número de primordios de órganos laterales en posiciones anómalas
(Fletcher, 2002).
Al margen de pep1-1, la incidencia de los distintos rasgos fenotípicos Pep1 difiere
considerablemente entre los distintos alelos. Como ya se ha discutido, parte de esta
variabilidad se puede atribuir a la distinta naturaleza de las respectivas lesiones
moleculares. Salvo en pep1-1, la aparición de errores filotácticos tiene una mayor
penetrancia que las alteraciones en la morfogénesis del fruto. La participación de PEP1
en diferentes complejos multiproteicos en distintos órganos o etapas del desarrollo
también puede ser causa de este comportamiento.
Los diversos complejos multiproteicos en los que PEP1 participe contarán con
varios elementos, unos comunes y otros específicos. Una consecuencia de ello puede ser
la variación en el grado de solapamiento funcional entre los polipéptidos integrantes de
cada complejo.
En el control transcripcional se ha comprobado que la combinación de un número
limitado de factores puede hacer frente a las necesidades de transcripción requeridas en
los distintos procesos que tienen lugar durante el desarrollo de un organismo (Hodgkin,
1998). Como ejemplo podemos citar a los factores de transcripción de tipo MADS box
(West et al., 1997; Messenguy y Dubois, 2003), que en Arabidopsis thaliana o Antirrhinum
majus están implicados en la construcción de los órganos florales, entre otras actividades
(Jack, 2001; Ng y Yanofsky, 2001; Lohmann y Weigel, 2002). Distintas combinaciones de
estos factores activan las diferentes rutas que finalmente darán lugar a la formación de los
órganos florales, pudiendo algunos de ellos formar parte de distintos complejos
(Riechmann y Meyerowitz, 1997; West et al., 1998; Egea-Cortines et al., 1999; Yang et al.,
2003; Fig. I.20 de la sección I.5.4.2.1). Todo ello permite que una unidad de un complejo
determinado pueda presentar distintas funciones, dependiendo de los elementos que le
acompañen en el complejo (Hodgkin, 1998). Por tanto, resulta bastante verosímil que esta
estrategia haya sido también adoptada en los procesos de regulación postranscrional.
VI.- CONCLUSIONES
Conclusiones 170
VI.- CONCLUSIONES
I.- El número de genes identificados que participan, de una u otra forma, en el desarrollo
del pistilo y del fruto se encuentra en expansión. Pese a ello, aún son muchas las
funciones génicas relacionadas con el proceso que quedan por caracterizar.
II.- Se ha efectuado el escrutinio de una colección local de mutantes de inserción
mediante T-DNA de Arabidopsis thaliana. Los resultados que se han derivado de dicho
esfuerzo arrojan un pobre balance respecto al número de supuestos mutantes aislados
frente al total de individuos examinados.
III.- Como inconveniente adicional, en ocasiones, los individuos aislados son portadores
de reorganizaciones cromosómicas que causan mutaciones complejas difíciles de
abordar.
IV.- Durante este trabajo se identificó un mutante, denominado como pepper1-1 (pep1-1),
con un patrón de herencia recesivo ligado a la resistencia al antibiótico kanamicina,
aportada por un hecho de inserción aparentemente único. Este mutante presenta un
fenotipo pleiotrópico que incluye la aparición de pequeños frutos con valvas adicionales.
Este rasgo comienza a observarse desde etapas muy tempranas en el desarrollo del
pistilo, predeterminando la posterior morfología del fruto tras la polinización.
V.- El fenotipo de las plantas pep1-1 es el resultado de una mutación compleja generada
por una translocación recíproca entre los cromosomas IV y V e influida por genes
modificadores dependientes del fondo genético, como se ha puesto de manifiesto a través
de distintas estrategias moleculares y genéticas.
VI.- En el fenotipo de la línea pep1-1 desempeña un papel primordial la pérdida de
función del gen At4g26000, denominado PEP1 en este trabajo, tal como se desprende de
los ensayos de complementación funcional.
Conclusiones 171
VII.- El gen PEP1 codifica una proteína de unión a RNA con módulos KH de tipo I,
presuntamente implicada en procesos de control postranscripcional.
VIII.- Las relaciones de PEP1 con respecto a sus ortólogos en otras especies vegetales
indican un alto grado de conservación entre monocotiledóneas y dicotiledóneas, lo que
muy probablemente es un reflejo de la importancia de su función.
IX.- PEP1 se expresa de forma ubicua en toda la planta, lo que es coherente con el grado
de pleiotropía observado en sus mutantes.
X.- Las interacciones génicas estudiadas sugieren que PEP1 participa en la morfogénesis
de la planta a través de distintos procesos de desarrollo, como la vía de transducción de
señales CLAVATA, o la ruta autónoma de control del tiempo de floración.
VII.- BIBLIOGRAFÍA
Bibliografía 173
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Bibliografía 195
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Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J. 23: 1128.
VIII.- GLOSARIO
Glosario 197
VIII.- GLOSARIO
%: por ciento
h: Horas
ºC: Grados centígrados
Hygr: Resistencia a higromicina
µF: Microfaradios
Ka o KA: Kanamicina
µg: Microgramos
KanR o KanR: Resistencia a kanamicina
µJ: Microjulios
kb: Kilobases
µl: Microlitros
kDa: Kilodaltones
µM: Micromolar
kg: Kilogramos
Ω: Ohmios
LTSEM: Low Temperatura Scanning Electron
A: Adenina
Microscopy
aa: Aminoácidos
lx: Luxes
A. C.: Antes de Cristo
m/v: Masa por volumen
Amp: Ampicilina
m: Metros
Ampr: Resistencia a ampicilina
M: Molar
Arabidopsis: Arabidopsis thaliana
Mb: Megbases
C: Citosina
mb: Milibares
cDNA: DNA complementario
mg: Miligramos
cm: Centímetros
min: Minutos
cM: Centimorgans
ml: Mililitros
DEPC: Dietilpirocarbonato
mm: Milímetros
DNA: Ácido desoxirribonucleico
mM: Milimolar
DNasa: Desoxirribonucleasa
mRNA: RNA mensajero
dNTP: Desoxinucleósidos trifosfato
ms: Milisegundos
dpa: Días postantesis
N: Normal
Ed. o ed.: Edición
ng: Nanogramos
Eds. o eds: Editores
nm: Nanómetros
et al.: Y otros
nM: Nanomolar
Fig.: Figura
OD: Densidad óptica
g: Gramos
pág.: Página
G: Guanina
pb: Pares de bases
Glosario 198
PCR: Reacción en cadena de la
SEM: Scanning Electron Microscopy
polimerasa
T: Timidina
pM: Picomolar
TAE: Tris-acético-EDTA
pp: Páginas
TBE: Tris-borato-EDTA
RNA: Ácido ribonucleico
TE: Tris-EDTA
RNasa: Ribonucleasa
Tetr: Resistencia a tetraciclina
rNTPs: Ribonucleósidos trifosfato
tRNA: RNA de transferencia
rpm: Revoluciones por minuto
U: Unidades
RT-PCR: Retrotranscripción y PCR
UV: ultravioleta
SQRT-PCR: Retrotranscripción y PCR
v/v: Volumen por volumen
semicuantitativa
V: Voltios
s: Segundos
W: Vatios
SDS: Dodecil sulfato sódico